CN1252471C - 用于检测流体样品中的靶抗原的电化学装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量的、廉价的、一次性免疫传感器20,该传感器不需要洗涤步骤,因此不会产生液体废物。另外,在传感器20的优选实施方案中,用户不需要计时步骤,并且传感器20能够方便地适应广泛的动力学范围内的抗原-抗体相互作用。
Description
发明领域
本发明涉及用于进行免疫测定的装置和方法。所述装置包括一次性免疫传感器。
发明背景
生物医学传感器被用于报道多种分析物的存在和/或浓度。当所述分析物是蛋白时,所使用的传感元件通常是抗体,因为所述抗体与所述蛋白(抗原)的相互作用是非常特异的。这种类型的免疫测定通常被划分成两类:获得“是/否答案”,例如,通过简单的视觉检测,或者通过定量方法测定抗原的浓度。大多数定量方法涉及昂贵的设备部件,如闪烁计数器(用于监测放射性)、分光光度计、分光荧光计(例如,参见US5156972)、和表面等离子体共振仪(例如参见US5965456)等。因此,如果能开发出一种适合家庭或野外使用的既廉价使用起来又足够简单的定量免疫测定方法将是有利的。
常规免疫测定被划分成两种类型:竞争测定和夹心测定。在竞争测定中,将测试样品中的抗原与抗原-探针复合物混合,然后让该混合物竞争结合抗体。所述探针可以是酶、荧光团或生色团。其次,在夹心免疫测定中,让测试样品中的抗原与抗体结合,然后让第二种抗体-探针复合物与所述抗原结合。在上述现有测定方法中,通常需要一个或多个洗涤步骤。这些洗涤步骤使得测定过程变得复杂,并且会产生生物有害的液体废物。因此,如果能开发一种用于免疫测定的不需要任何洗涤步骤的装置将是有利的。所述装置必须被设计成使用一次的一次性装置。
本发明概述
提供了一种定量的、廉价的、一次性免疫传感器,该传感器不需要洗涤步骤,因此不会产生液体废物。另外,在所述传感器的优选实施方案中,用户不需要计时步骤,并且传感器能够方便地适应广泛的动力学范围内的抗原-抗体相互作用。
在一种实施方案中,提供了用于检测具有一定pH的流体样品中的靶抗原的一次性装置,该装置包括一个具有一个内表面,一个近端和一个远端的反应室;一种固定在所述反应室内的固定化抗体,所述抗体能够结合靶抗原;存在于所述反应室中的一种报道复合物,该复合物包括一种探针,该报道复合物能够与样品混合;一个具有一个壁、一个内表面,一个远端和一个近端的检测室;一个位于所述反应室远端的样品入口;以及一个位于所述反应室远端和所述检测室近端之间的样品通道。
在本实施方案的一个方面,在所述反应室中装有一种试剂,该试剂能够抑制蛋白与反应室内表面的非特异性结合。所述试剂可选自表面活性剂和诸如牛血清白蛋白的封闭蛋白。
在本实施方案的另一方面,所述报道复合物还包括能够与所述靶抗原竞争结合所述固定化抗体的第二种抗原,或能够结合所述靶抗原的第二种抗体。
在本实施方案的另一方面,所述探针选自生色团和荧光团。所述探针可以包括酶,如葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶。还可以包括酶底物,例如,诸如半乳糖、乙酸或葡萄糖的可氧化的底物。
在本实施方案的另一方面,所述检测室还包括一种介体。所述介体可以包括二氯靛酚、过渡金属和含氮杂原子物质的复合物或氰铁酸盐。
在本实施方案的一个方面,所述装置还包括一种能调整样品pH的缓冲剂,如磷酸盐或柠檬酸盐。
在本实施方案的一个方面,所述固定化抗体和/或报道复合物被支持在反应室内表面上。所述报道复合物还可以与所述固定化抗体间隔小于大约1毫米。
在该实施方案的另一方面,所述装置还包括一种稳定剂,它能稳定抗原、酶、和抗体中的一种或多种。
在本实施方案的另一方面,所述酶底物被支持在检测室内表面上。
在本实施方案的另一方面,所述装置还包括一种支持材料。所述支持材料可以容纳在检测室内,并且可以将诸如酶底物、介体、和缓冲剂的一种或多种物质支持在所述支持材料上或包含在该支持材料内。所述支持材料还可以容纳在反应室内,并且可以将诸如固定化抗体、报道复合物、和能够抑制蛋白与反应室内表面非特异性结合的制剂的一种或多种物质支持在所述支持材料上或包含在所述支持材料内。所述支持材料可以包括纱布或纤维填充材料,包括选自下列一组的聚合物:聚烯烃、聚酯、尼龙、纤维素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、及其混合物;诸如多孔膜的多孔材料,包括选自下列一组的聚合材料:聚砜、聚二氟乙烯、尼龙、乙酸纤维素酯、聚异丁烯酸酯、聚丙烯酸酯、及其混合物;或烧结的粉末。
在本实施方案的另一方面,所述检测室包括至少两个电极。所述电极可以包括选自下列一组的材料:钯、铂、金、铱、碳、与粘合剂混合的碳、氧化铟、氧化锡、及其混合物。
在本实施方案的一个方面,所述检测室的壁对于由所述探针发射或吸收的射线来说是可穿透的,该射线是所述报道复合物在检测室中存在或缺乏的指标。
在本实施方案的一个方面,包括一个能够检测反应室基本上被充满的状态的检测仪。还包括一个能够在检测室远端形成一个检测室通气孔的穿孔工具。还可以包括位于反应室远端的反应室通气孔。
在第二种实施方案中,提供了一种生产用于检测具有一定pH的流体样品中的靶抗原的一次性装置的方法,该方法包括以下步骤:形成贯穿第一个片材的具有一个近端和一个远端的第一个孔,所述第一个孔确定反应室侧壁,一个检测室侧壁,以及位于反应室远端和检测室近端之间的第一个样品通道;在所述第一个片材的第一面上安装一个第一层,并且覆盖所述孔,以便确定第一反应室端壁和第一检测室端壁;在所述第一个片材的第二面上安装一个第二层,并且覆盖所述孔,以便形成基本上与所述第一层重叠对齐的第二反应室端壁和第二检测室端壁,从而由所述片材和层构成具有多个外表面的条(strip);形成贯穿所述条的外表面进入所述反应室远端的第二通道,由该第二通道确定一个反应室通气孔;形成贯穿所述条的外表面进入所述反应室近端的第三通道,由该第三通道确定一个样品入口;将一种抗体固定在所述反应室内;将一种包括探针的报道复合物放入所述反应室。
在本实施方案的另一方面,所述孔贯穿所述第一片材的近端,以便形成所述第三通道。
在本实施方案的另一方面,所述第一片材、第一层和第二层包括一种电阻材料,所述第一层包括一个第一电极,其中,第一电极朝向所述第一片材的第一面,而所述第二层包括一个第二电极,其中,第二电极朝向所述片材的第二面。至少有一个电极可以包括选自下列一组的材料:钯、铂、金、铱、碳、与粘合剂混合的碳、氧化铟、氧化锡、及其混合物。所述第一电极可以基本上覆盖所述第一检测室端壁,而所述第二电极基本上覆盖所述第二检测室的端壁。至少有一个电极可以是喷溅涂布的金属沉积物。所述第二电极可以与所述第一电极以相对的关系安装,二者的间距小于大约500微米;小于大约150微米;或者小于大约150微米,但大于大约50微米。
在本实施方案的另一方面,所述各层粘合在所述片材上,例如通过诸如热活化粘合剂、压敏型粘合剂、热固性粘合剂、化学固性粘合剂、热熔性粘合剂和热流粘合剂的粘合剂粘合。至少所述片材或所述层中的一个可以包括一种聚合材料,如聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃、及其混合物,或聚对苯二甲酸乙二醇酯。所述各层中的至少一个对于包括红外射线、可见光、和紫外线射线在内的射线的波长来说是可穿透的。
在本实施方案的另一方面,所述方法还包括提供一种酶底物和一种介体,其中,所述酶底物和介体被容纳在所述检测室中,其中,所述探针是一种酶,并且,所述介体能够介导所述酶和所述电极之间的反应,以便指示一种电化学反应的发生。
在本实施方案的另一方面,所述方法还包括提供一种缓冲剂的步骤,其中,所述缓冲剂能够调节样品的pH。
在第三种实施方案中,提供了一种生产用于检测具有一定pH的流体样品中的靶抗原的一次性装置的方法,该方法包括形成贯穿第一个电阻材料片的具有一个近端和一个远端的第一个孔,所述第一个孔具有一个第一孔反应室部分和第一孔检测室部分,并且确定反应室侧壁的第一部分,检测室侧壁,和位于所述反应室远端和检测室近端之间的样品通道;形成贯穿第二个电阻材料片的具有一个近端和一个远端的第二个孔,由所述第二个孔确定所述反应室侧壁的第二部分;形成贯穿第三个电阻材料片的具有一个近端和一个远端的第三个孔,由所述第三个孔确定所述反应室侧壁的第三部分;将所述第二片材的第一面安装在所述第一片材的第一面上,所述第二片材覆盖所述第一孔检测室部分,从而确定第一检测室端壁,基本上与反应室侧壁的第一部分对齐的反应室侧壁的第二部分;将所述第三片材的第一面安装在所述第一片材的第二面上,所述第三片材覆盖所述第一孔检测室部分,从而确定第二检测室端壁,基本上与反应室侧壁的第一部分对齐的反应室侧壁的第三部分;在所述第二片材的第二面上安装一个第一层,并且覆盖所述第二个孔,以便确定第一个反应室端壁;在所述第三片材的第二面上安装一个第二层,并且覆盖所述第三孔,以便确定基本上与所述第一薄层重叠对齐的第二反应室端壁,从而由所述片材和各层形成具有多个外表面的条;形成贯穿所述条的外侧进入所述反应室远端的第二通道,由第二通道确定一个反应室通气孔;形成贯穿所述条的外侧进入所述反应室近端的第三通道,由第三通道确定一个样品入口;将一种抗体固定在所述反应室内;将一种包括探针的报道复合物放入所述反应室。
在第四种实施方案中,提供了一种用于测定靶抗原在流体样品中存在或缺乏的方法,该方法包括提供一种一次性装置,该装置包括一个反应室,该反应室具有一个内表面,一个近端和一个远端,一种固定在所述反应室内的固定化抗体,所述抗体能够结合所述靶抗原,存在于所述反应室中的一种报道复合物,所述复合物包括一种探针,所述报道复合物能够与所述样品混合,具有一个壁、一个内表面、一个远端和一个近端的检测室,在所述反应室远端的之间一个样品入口,在所述反应室远端和所述检测室近端之间一个样品通道,其中,所述报道复合物还包括能够与所述靶抗原竞争结合所述固定化抗体的第二种抗原;让一种流体样品与所述样品入口接触;通过让所述流体样品由所述样品入口流向所述反应室,使该样品基本上将所述反应室充满;保持预定长度的时间,该时间足以在所述样品中缺少抗原的情况下基本上使所有报道复合物都结合在所述固定化抗体上。通过让所述流体样品由所述反应室经过所述样品通道流向所述检测室,使该样品基本上充满所述检测室;检测所述检测室中抗原-探针复合物的存在或缺乏,所述抗原-探针复合物的存在或缺乏,是所述抗原在所述样品中存在或缺乏的指标。
在本实施方案的一个方面,所述方法还包括在所述检测室壁上穿孔,以便在检测室远端形成一个检测室通气孔,所述穿孔步骤是在所述预定时间之后马上进行的。
在第五种实施方案中,提供了一种用于生产检测具有一定pH的流体样品中的靶抗原的一次性装置的方法,该装置具有多个外表面,该方法包括形成贯穿第一个电阻材料片的第一个孔,所述第一个孔具有一个检测室部分,并且确定检测室侧壁,所述检测室具有一个近端和一个远端;在所述第一片材的第一面上安装一个第一层,并且覆盖所述孔,以便确定第一检测室端壁;在所述第一片材的第二面上安装一个第二层,并且覆盖所述孔,以便确定基本上与所述第一层重叠对齐的第二检测室端壁,从而由所述片材和各层形成一个条;形成贯穿所述条的第二个孔;所述条具有一个近端和一个远端,所述第二个孔具有一个反应室部分,该反应室部分具有一个远端和一个近端,并且由所述第二个孔确定反应室侧壁和位于所述反应室远端和所述检测室近端之间的样品通道;将第三层的第一面安装在所述条的第一面上,所述第三层覆盖所述第二孔反应室部分,以便确定第一个反应室端壁;将第四层的第一面安装在所述条的第二面上,所述第四层覆盖所述第二孔反应室部分,以便确定基本上与所述第一反应室端壁对齐的第二个反应室端壁;形成贯穿所述装置的一个表面进入所述反应室远端的第三个孔,所述第三个孔确定一个反应室通气孔;形成贯穿所述装置的一个表面进入所述反应室近端的第四个孔,由所述第四孔确定一个样品入口;将一种抗体固定在所述反应室内,并且将包括一种探针的报道复合物放入所述反应室。
在本实施方案的一个方面,所述第一片材、第一层和第二层包括一种电阻材料,所述第一层包括一个第一电极,其中,所述第一电极朝向所述第一片材的第一面,所述第二层包括一个第二电极,其中,所述第二电极朝向所述电极的第二面。
附图简述
图1表示采用了一种电化学电池的免疫传感器的俯视图(不成比例)。
图2表示沿图1所示免疫传感器实施方案的线A-A’的横切面图(不成比例)
优选实施方案的详细说明
以下说明和实施例说明了本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是,在本发明的范围内包括本发明的多种改变和改进。因此,对优选实施方案的说明不应当被视为对本发明范围的限定。
公开了一种单一步骤的免洗免疫传感器。该传感器是仅使用一次的一次性装置,它采用了两个相邻的室,一个反应室和一个检测室。在所述反应室中,发生抗原-抗体反应,而在所述检测室中检测所述反应的结果,并且提示所述样品中抗原的存在或缺乏。
可以使用任何合适的检测方法。合适的检测方法包括,例如,视觉检测,其中,观察颜色的形成;或光谱检测,其中,利用反射光线或透射光线检测光吸收的改变。在一种优选实施方案中,所述检测方法是电化学方法,其中,检测直接由抗原/抗体反应产物所产生的电流或电位。
用于获得流体样品的电化学测定结果的方法和装置进一步公开于以下文献中:申请日为2000年7月14日的共同未决美国专利申请号09/616691,题为“抗氧化剂传感器”,申请日为2000年7月14日的共同未决美国专利申请号09/616512,题为“血红蛋白传感器”,以及申请日为2000年7月14日的共同未决美国专利申请号09/616556,题为“用于测定化学反应速度的电化学方法”,以上每一份专利申请以其全文形式收作本文参考。
各个检测阶段,即反应阶段和检测阶段的计时,可以通过人工完成。另外,计时还可以反应于在所述反应室被填充时所产生的启动信号自动进行。
在图1和2中示出了适用于电化学检测的传感器的一种实施方案。图1是所述传感器条的俯视图,而图2是横切面图,显示反应室和检测室的细节。
传感器
所述优选实施方案的免疫传感器可以用在制备电化学葡萄糖传感装置时所使用的众所周知的薄层装置生产技术制备(例如,参见US5942102,在此以全文形式收作本文参考)。所述技术在进行某些改进之后,同样可用于使用非电化学检测方法制备免疫传感器。
在图1和2所示的免疫传感器的一种优选实施方案中,检测室28包括一个电化学电池28。反应室22和检测室28是通过首先形成一个贯穿电阻材料片36的孔制备的。所述孔的形状是这样的:由它确定反应室22和检测室28的侧壁,以及位于室22和28之间的样品通道38。通过将所述孔由反应室22的近端24延伸通过片材37的边缘,还形成了样品入口24。在一种实施方案中,由片材36的厚度确定了反应室22和检测室28的整个高度,这两者是相等的。在另一种实施方案中,反应室22的高度大于检测室28的高度。通过将多个片材32、34和36层压在一起,制备高度大于检测室28高度的反应室22。如上文所述,所述层的中间片材36具有确定反应室22和检测室28的侧壁74和76的孔。然后将中间层36夹在两个或两个以上其他层32和34之间,所述其他层32和34具有仅确定反应室22的侧壁74的孔,由层32和34确定检测室28的端壁60和62。在本实施方案中,所述检测室的端壁60和62包括电极52和54,所述电极可以按以下方法制备。
在形成反应室22和检测室28的侧壁74和76之后,将第一个薄的电极层52安装在电阻片材36的一面70上,覆盖确定检测室28的孔,并且形成端壁60。可以将层52粘合在片材36上,例如,通过粘合剂粘合。合适的粘合剂包括,例如,热活化粘合剂、压敏型粘合剂、热固性粘合剂、化学固性粘合剂、热熔性粘合剂、和热流粘合剂等。所述电极层52是通过用诸如铂、钯、碳、氧化铟、氧化锡、混合的氧化铟/氧化锡、金、银、铱及其混合物等的合适金属对电阻材料片32进行涂布(例如,通过喷溅涂布)而制备的。适合用作电极52和54的材料与存在于传感器20中的试剂相容,即它们不会与试剂发生化学反应。
然后将第二个薄的电极层54安装在所述电阻材料36的相对一面71上,同样覆盖形成检测室28的孔,以便形成第二个端壁62。在一种优选实施方案中,电极层52和54是以相对的关系安装的,二者的间距小于大约500微米,更优选小于100微米,最优选50-150微米。如果还没有形成一个样品入口24的话,就提供一个这样的入口,例如,在装置20的边缘37上形成一个缺口,该缺口与反应室22的近端23相交。
给电极层52和54提供连接工具,以便将传感器20安装在测定电路中。电池28中的至少一个电极52或54是传感电极,即对于抗氧化剂来说是对还原的氧化还原试剂量敏感的电极,或者对于氧化剂来说是对氧化的氧化还原试剂敏感的电极。对于电位测定传感器20来说,其中,传感电极52或54的电位是分析物含量的指标,起着参考电极作用的第二个电极54或52提供参考电位。对于电流测定传感器20来说,其中,所述传感电极电流是样品中分析物含量的指标,存在至少一个其他电极54或52,该电极起着对电极的作用,以便使该电路完整。所述第二个电极54或52可以起着参考电极的作用。另外,可以由一个独立的电极(未示出)起着参考电极的作用。
如果免疫传感器20是以电化学电池28的形式工作的话,包含确定反应室22和/或检测室28的孔的片材32、34和36就应当包括电阻材料。例如,合适的电阻材料包括聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃及其混合物等。优选的聚酯是聚对苯二甲酸乙二醇酯。如果免疫传感器20是通过一种检测方法工作,而不是通过电化学检测方法工作的话,所述材料就不一定是电阻材料。不过,优选用上述聚合材料制造优选实施方案的免疫传感器,因为这些材料便于加工、成本低、并且不会与试剂和样品发生反应。对于涉及到特定频率光线的吸收、透射或发射的检测方法来说,端壁60和/或62以及位于检测室28的端壁上面的层32和46和/或层34和42对于所述光线频率而言应当是可穿透的。
可以将用于电池28中的试剂,例如固定化抗体、探针连接的抗原、缓冲剂和介体等支持在反应室22的壁40、48、和/或74上,或支持在检测室28的壁60、62和/或76上,支持在容纳于室内的独立的支持物上,或包含在一种基质内,或者是自我支持的。如果将所述试剂支持在电极52和54的所述室的壁上,可以采用本领域众所周知的印刷技术涂敷所述化合物,例如,喷墨印刷、丝网印刷、和平板印刷等。在一种优选实施方案中,将含有所述试剂的溶液涂敷在一个室内的表面上,并让它干燥。
除了将抗体44、探针连接的抗原50或其他化合物固定或干燥在反应室22或检测室28的表面40、48、60、62、74和/或76上之外,优选将其支持在一种或多种独立的支持物上或容纳在该支持物内,然后再将该支持物放入一个室。合适的独立支持物包括,但不限于纱布材料、无纺片材、纤维填充材料、大孔膜或烧结的粉末。独立支持物的优点包括具有较大的表面积,因此,如果需要的话,可以在反应室28中容纳更多的抗体和探针连接的抗原。在这样一种实施方案中,将抗体固定在一片多孔材料上,并将其放入第一反应室,并且将探针连接的抗原干燥在第二片多孔材料上,然后将该材料放入所述反应室。另外,如上文所述,可以将抗体或探针连接的抗原掺入多孔材料,而将其他成分支持在反应室的壁上。在另一种实施方案中,所述反应室的壁本身是多孔的,在这些孔中掺入所述抗体和/或探针连接的抗原。在本实施方案中,液体能够被吸入所述多孔的壁,但不会从特定部位泄露。这一目的是通过使用大孔膜形成反应室壁,并且将所述膜压缩在反应室周围,以便阻止样品从需要的部位泄露而实现的。
诸如纱布材料、无纺片材和纤维填充材料的合适的独立支持物包括聚烯烃、聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜及其混合物等。合适的大孔膜可以用聚合材料制备,这些材料包括聚砜、聚二氟乙烯、尼龙、乙酸纤维素酯、聚异丁烯酸酯、聚丙烯酸酯及其混合物等。
蛋白或抗体可以包含在诸如聚乙酸乙烯酯的基质内。通过改变所述基质在样品中的溶解特征,可以实现控制所述蛋白或抗体向样品中的释放。
在所有场合下,用于所述传感器中的材料都是适合大批量生产形式的,并且将电池本身设计成能够在一次实验中使用后就被丢弃。
在图1和2中示出了按上述方法生产的免疫传感器的一种优选实施方案。在该优选实施方案中,层32和34是用导电材料52和54涂布的基质。表面60或62上的导电材料52或54朝向检测室28,而涂在表面33或35上的粘合剂层(未示出)分别朝向层42或46。
使用所述传感器测定一种抗原的存在或缺乏
如图1和2所示,在一种优选实施方案中,传感器20是一种使用诸如葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶作探针的电化学电池28,图1是传感器20的俯视图,图2是通过线A-A’的该传感器的横切面图。在以下实施方案中了解一种分析物的存在或缺乏。
用户首先通过样品入口24将样品导入传感器20的反应室22。在毛细作用或灯芯作用的影响下将样品吸入反应室22。在填充反应室期间,通气孔26是与大气相通,以便使得由样品排出的空气能够逸出。样品会被吸入反应室22,直到充满到反应室通气孔26。然后就终止填充。选择反应室22的体积,以便其体积至少等于,并且优选大于检测室28的体积。
图1中用虚线划出的圆表示穿透层32、34和36,但没有穿透层42和46的孔30,层34上的孔通向检测室28。由于层42和46最初没有被刺穿,检测室28通向环境的唯一通道是通向反应室22的样品通道38。因此,当反应室22被样品所充满时,就阻断了通向检测室28的样品通道38。这样会将空气滞留在检测室28中,并且基本上能抑制其填充样品。在样品首次接触通向检测室28的开口38至样品接触开口38的远侧期间,会有少量样品进入检测室28。不过,一旦所述样品将通向检测室28的开口38完全湿润,就不再会发生检测室28的进一步填充。
用抗待检测抗原的抗体44包被构成反应室22底部的基质42的内表面40。通过吸附或其他方式将抗体44固定在基质42的表面40上,以便在测试期间抗体不会从基质42上排出。在将抗体44涂敷到基质42的内表面40上之后,可选择性地将一种被设计用于抑制蛋白与该表面的非特异性结合的试剂涂在该表面上(未示出)。本领域众所周知的这样一种试剂的例子是牛血清白蛋白(BSA)。还可以将非离子型表面活性剂用作所述试剂。例如由宾夕法尼亚州费城的Rohm&Haas生产的Triton X-100TM或由德拉华州维明顿市的ICI Americas生产的TweenTM。所选择的非离子型表面活性剂不会使蛋白变性。待检测状态的涂在基质42内表面40上的涂层44是干燥状态的。
由另一种基质46构成反应室22的上表面48。在基质46的内表面48上包被有与待检测抗原50连接的酶。合适的酶包括,但不限于葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶。将酶连接的抗原50干燥在基质66的内表面48上,以便当表面48被样品湿润时它能释放到样品中。因此,要选择用于涂敷酶连接抗原50的基质46的内表面和涂敷方法,以便在酶连接的抗原50和基质46的内表面48之间仅存在弱的结合。选择酶连接的抗原50从表面48上溶解的速度,以便在样品填充反应室22期间只会出现很少的溶解。这样,在填充之后,酶连接的抗原50就能均匀分布到反应室22的整个部位。
选择酶连接的抗原50和抗体44的相对量,以便抗体44的量略微超过酶连接的抗原50的量。在上下文中略微多于被定义为该多余量与样品中待检测的抗原分子的数量相比是小的。
因此,当样品填充反应室22时,酶连接的抗原50进入并且与所述样品混合。然后用足够的时间使酶连接的抗原与抗体44接触。因为存在多余的抗体44,如果样品中不存在抗原的话,基本上所有的酶连接的抗原50都能结合在抗体44上,并且被有效固定。如果样品中存在抗原,这些抗原小于酶连接的抗原50,并且业已存在于样品的所有体积中,这些抗原会在酶连接的抗原50接触抗体44之前接触并结合在抗体44上。因此,抗体44被封闭,并且不能结合酶连接的抗原50。因此,如果样品中原来存在抗原的话,在反应步骤结束时,酶连接的抗原50在样品中将保持移动性。如果在样品中最初不存在抗原的话,在反应步骤结束时,酶连接的抗原50就会固定在基质46的内表面上。
所述反应步骤的结束是在样品被导入反应室22之后的预定时间。设定所述预定时间,以便在当样品中最初不存在抗原的测试条件下,有足够的时间使基本上由酶连接的所有抗原50结合在抗体44上。
样品被导入反应室22的时间可以由用户确定,例如,通过按压与传感器20连接的仪表的按钮。这种动作被用于启动计时装置。对于视觉检测来说,不需要仪表装置。在这种实施方案中,用户手工计时反应时间。
在利用电化学检测检测抗体/抗原反应结果的情况下,显示样品业已导入反应室22的指示可以是自动化的。如上文所述,当样品填充反应室22时,在通向反应室开口38处的检测室28的小部分会被样品润湿。如果进行电化学检测的话,在检测室28中会存在至少两个电极52和54。如果电极52和54被安装在检测室28中,在填充反应室22期间每一个电极52和54的至少一部分会接触样品,样品的存在会连通电极52和54,并且产生一个可以被用来启动计时装置的电信号。
在经过由用户或自动启动所述计时装置的预定时间之后,该测试的抗体/抗原反应阶段就被认为已经结束。当所述测试的抗体/抗原反应阶段结束时,通向大气的通气孔56打开。例如,可以利用所述仪表上的由电池阀驱动的针刺穿层42或46或同时刺穿42和46,由此使得检测室28的远端58与大气相通。如在上面的例子中所述,所述穿刺可以是由所述仪表自动进行的,或者在不使用仪表通过视觉检测的情况下由用户用手穿刺,例如,用户将针插入层42和46,并由此形成通气孔56。
由于通气孔56与大气相通,这使得滞留在检测室28中的空气可以逸出,从而由来自反应室22的反应过的样品填充检测室28。由于检测室28中的毛细力比反应室22中的毛细力大,所述反应过的样品被吸入检测室28。在一种优选实施方案中,所述较大的毛细力是通过适当包被检测室28的表面60和62而产生的,或者更优选通过选择检测室28的毛细距离使其小于反应室22的毛细距离。在本实施方案中,毛细距离被定义为所述室的最小尺寸。
在检测室28中选择性地安装有干燥的试剂64,该试剂中含有能够与酶连接的抗原50的酶部分起反应以便产生可检测信号的酶底物和介体。如果存在酶底物和介体的话,其数量足以使得所存在的所有酶与酶底物64的反应速度是由所存在的酶的数量决定的。例如,如果所述酶是葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶的话,可以将合适的酶介体64和葡萄糖(如果样品中没有的话)安装到检测室28中。还可以包含缓冲剂,以便帮助调节检测室28中样品的pH。在使用电化学检测系统的实施方案中,氰铁酸盐是一种合适的介体。其他合适的介体包括二氯靛酚和过渡金属与含氮杂原子物质之间的复合物。所述葡萄糖、介体和缓冲试剂64具有足够的数量,以便所述酶与酶底物64的反应速度是由所存在的酶的浓度决定的。
当检测室28被充满时,试剂64就溶解到样品中。试剂64的酶成分与葡萄糖和介体起反应,产生还原的介体。这种还原的介体被在检测室28中起着阳极作用的电极52或54以电化学方式氧化,以便产生电流。在一种实施方案中,将该电流随时间推移改变的速度用作存在于反应样品中的酶的存在和数量的指标。如果电流的改变速度小于预定的阈值的话,就表明在反应的样品中不存在明显数量的酶连接的抗原50,表明在原始样品中缺乏抗原的存在。如果电流改变的速度大于所述阈值的话,就表明在反应的样品中存在酶连接的抗原50,并且所述样品中最初就也存在抗原。在一种实施方案中,电流的改变速度被用于提供最初存在于所述样品中的抗原的相对数量的指标。
在所述电化学检测系统的一种优选实施方案中,检测室28中的电极52和54是以包被在基质32和34内表面60和62上的导电层形式生产的,例如,通过公开于W097/18464中的喷溅技术生产。导电层52和54是不会与所存在的试剂发生化学反应的材料,并且可以在选择的电位下被用作电极52和54。合适材料的例子包括,但不限于钯、铂、金、铱、碳、与粘合剂混合的碳、氧化铟、氧化锡、和混合的氧化铟和氧化锡。
在本实施方案中,用一种惰性电绝缘层36分隔装有电极的基质32和34。绝缘层36优选起着保持层32和34具有预定间隔的作用。只要该间隔距离足够小,例如小于500微米,更优选50-150微米,在经过相对所使用的检测时间而言适当的短的时间之后,电极52和54之间的电流就直接与还原介体的浓度成正比。在本实施方案中,电流量直接与所述酶反应的速度相关,并因此与所存在的酶的数量相关。
在图1中示出了连接端66。检测室28中的电极54和56可以通过连接终端66与仪表(未示出)形成电连接。所述连接工具(未示出)通过导电电路(未示出)与检测室28中的电极54和56形成电连接。在图1所示的优选实施方案中,所述导电电路由包被在内表面32和34上的导体52和54的薄膜的延长部分构成。与所述连接部位66连接的仪表能够在检测室28中的电极52和54之间施加一个电位,分析所产生的电信号,显示反应结果,并选择性地将该反应结果保存在存储器中。
在使用电化学检测的其他实施方案中,在检测室的一个或两个内表面上使用导电材料条,其前提是存在至少两个电极,即一个传感电极和一个对电极/参考电极。选择性地包括被用作独立的参考电极的第三个电极。
在利用视觉检测或反射光谱分析作为检测方法的实施方案中,至少层32和46或34和42对于要观察的射线波长来说是可穿透的。在视觉检测的情况下,观察检测室28中的简单的颜色变化。在反射光谱分析中,检测光线是通过层32和46或层34和42照射进来的,并且分析由检测室28中的溶液反射的光线。在将透射光谱用作检测方法的情况下,至少层32、46、34和42对于选择的波长来说是可穿透的。光线通过检测室28中的样品照射,并且测定光束的减弱。
在制造传感器方法的一种优选实施方案中,层36包括一种基质,在其上表面70和下表面72上涂有一层粘合剂(未示出)。适合用作层60的基质的材料的例子包括聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃,并且优选聚对苯二甲酸乙二醇酯。合适粘合剂的例子有压敏型粘合剂、热和化学固性粘合剂以及热熔性和热流粘合剂。
用蜂毒肽作探针
常规ELISAs将一种抗原连接在一种酶上。不过,也可以将所述抗原连接在蜂毒肽上。蜂毒肽是存在于蜂毒中的多肽。在本实施方案中,探针连接的抗原包括可以干燥在反应室壁上的抗原-蜂毒肽复合物,如上文所述。检测室可以装有一种介体,包括存在于脂质体或脂类小泡中的氰亚铁酸盐。如果所述抗原-蜂毒肽复合物接触所述脂质体,脂质体就会破裂,并释放出氰亚铁酸盐。这样会导致信号的迅速放大,即少量的游离抗原与抗原-蜂毒肽复合物竞争结合抗体上的结合位点,并产生高浓度的氰亚铁酸盐。
在电化学测定中使用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶
常规ELISAs将辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)用作比色测定中的酶。不过,业已开发出了能够使这两种酶被用于电化学测定中的底物。
在本实施方案中,AP可以与对氨基苯基磷酸一起使用,而HRP可以与四硫富瓦烯一起使用。
用免疫传感器获得电化学测定结果
在某些实施方案中,可以用所述传感器获得与能产生至少一种电活性产物的化学反应的速度相关的信息,这一目的是通过确保所述化学反应位于远离用来与所述电活性产物发生电化学反应的电极的部位而实现的。
所述化学反应的部位与所述电极足够远,以至来自所述化学反应部位的所述电活性产物的向所述电极的质量转移在任何时间都能有效控制所述电极上的电流。这种结构能确保在所述化学反应部位和所述电极之间存在基本上为线性的电活性物质浓度梯度。通过在它上面所发生的电化学反应,将所述电极上的电活性物质的浓度有效保持为0。由于所述浓度大小随着时间的变化基本上仅仅是由所述化学反应位点上电活性物质的浓度随着时间的变化以及所述电活性反应产物在液体介质中的扩散系数决定的。因此,所述电极上的电流与该电极上所述电活性物质的浓度梯度成正比,该电流随时间的变化能体现发生在所述远处位置上的化学反应的时间变化。这样就可以将在所述电极上测定的电流(通过的电荷,如果所述电流是集成的)用作所发生的化学反应速度和进程的方便的指标。
用于确保所述化学反应远离工作电极的合适方法的一个例子是,将一种或多种反应成分固定在远离所述电极的固体表面上。可以通过将所述反应成分掺入聚合物基质中对其进行固定,所述成分通过干燥或以其他方式连接在所述固体表面上。还可以通过化学结合或物理结合将所述反应成分直接连接在所述固体表面上。或者将一种或多种所述反应成分简单地在所述固体表面上干燥,而不采用特殊固定措施。在这种情况下,所述一种或多种反应成分在填充电化学电池的液体基质中的迁移率足够低,就是说在能够有效监测电化学电流以便完成必要的测定的时间内,它不会从它所干燥的位置上发生明显的迁移。在这里,明显的迁移表示所述化学反应所需要的移动最缓慢的成分足够接近所述工作电极,以便Cottrell型消耗动力学开始在所述电极上实现电流的时间进程。
在优选实施方案中,所述化学反应部位和工作电极之间的间隔距离以小于大约1厘米为理想,优选小于5毫米,更优选为5、10、50、100、200、500微米至5毫米,更优选为5、10、50、100、200至500微米,最优选为5、10、50、100至200微米。
除了所述工作电极之外,提供至少一个与所述流体样品接触的对电极,以便使所述电化学电路完整。所述对电极可以选择性地起着对电极/参考电极的作用,或者提供一个独立的参考电极。在一种优选实施方案中,所述工作电极和对电极之间的间隔距离以不超过大约300微米为宜,优选不超过大约500微米,更优选大约500微米至10毫米,更优选大约500微米至1、2、5毫米,最优选1至2、5、10毫米。
所述工作电极优选是用这样的材料制成的:在使用期间它不会与所接触到的任何成分发生能干扰该电极电流反应程度的化学反应。如果所述工作电极被用作阳极的话,合适材料的例子是铂、钯、碳、与惰性粘合剂结合的碳、铱、氧化铟、氧化锡、氧化铟和氧化锡的混合物。如果所述工作电极被用作阴极的话,除了上面所列举的材料之外,其他合适材料有钢、不锈钢、铜、镍、银和铬。
适合用作对电极的材料的例子有铂、钯、碳、与惰性粘合剂结合的碳、铱、氧化铟、氧化锡、氧化铟和氧化锡的混合物、钢、不锈钢、铜、镍、铬、银和用基本上为不溶性的银盐包被的银,如氯化银、溴化银、碘化银、氰亚铁酸银、氰铁酸银。
化学反应的部位可以位于远离所述工作电极的裸露的壁或所述对电极上的。所述化学反应的部位可以在与工作电极相同的平面上,或者更优选位于朝向并且基本上平行于所述工作电极的平面上。
适用于某些实施方案的传感器包括安装在电绝缘基质上的工作电极和对电极。在第二种基质上安装有一层化学反应剂,其中至少一种反应剂基本上固定在该基质上。在使用时,在所述传感器的壁之间的空间中填充含有能够与所述试剂发生反应以便产生一种电活性物质的物质的液体。所述化学反应产物向工作电极扩散,在这里,所述电活性物质发生电化学反应,以便产生电流。然后可以用在特定时间的电流或通过的电荷的大小或电流或通过的电荷随时间的变化获得发生在所述反应剂层上的化学反应的速度或程度的指标。
在所述传感器的另一种实施方案中,所述反应剂存在于被安装在一种电阻基质上的对电极上。在该实施方案中,制造对电极的材料与存在于该电极上的反应剂的任何成分的反应都是惰性的。
获得上述电化学测定结果的方法应用于任何合适的电化学系统,包括电化学免疫测定系统。应用于典型的,但不是免疫测定的电化学系统的所述方法的一个例子,是用酶PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(GDHpqq)和氧化还原介体测定全血中的葡萄糖。在该反应中,血液中的葡萄糖与GDHpqq起反应,形成葡萄糖酸。在该过程中,所述酶的PQQ减少。然后诸如氰铁酸钾的介体氧化所述酶中的PQQ,并形成氰亚铁酸盐。然后所述氧化形式的酶能够与其他葡萄糖起反应。该反应的净结果是使发生反应的每一个葡萄糖分子产生两个氰亚铁酸盐分子。氰亚铁酸盐是一种电活性物质,因此能够在电极上被氧化,产生电流。适合该反应的其他酶是葡萄糖氧化酶(GOD)或NAD依赖型葡萄糖脱氢酶。对其他反应来说,可以使用乳酸脱氢酶和醇脱氢酶。其他合适的氧化还原介体包括ferrocinium、锇与二吡啶和二苯酮的复合物。
全血中葡萄糖与所述酶的反应可能是缓慢的,需要几分钟时间才能完成。另外,所述样品的血细胞比容越高,反应就越慢。血液的血细胞比容是红细胞在全血样品中所占的体积比例。例如,将含有50毫克/毫升GDHpqq、0.9M氰铁酸钾和50mM缓冲剂,pH6.5的溶液沉积在对电极上,并且除去水分,留下的干燥的反应剂层。在该层中,GDHpqq的量大到足以有效固定在对电极上,而所述氰铁酸盐能够更均匀地混合在所述电化学电池的液体中。将所述血液样品导入所述电池,并且马上在工作电极和对电极之间施加+300mV的电位。尽管对于氧化氰亚铁酸盐来说,+300mV的电位是最优选的,但所述电位以在+40至+600mV为宜,优选+50至+500mV,优选+100至+400mV。在所述电池上,工作电极由喷溅在一种聚酯基质上的一层金组成,而对电极由喷溅在一种聚酯基质上的一层钯组成。
记录具有不同血细胞比容的血液样品的电流量,发现在较低血细胞比容的血液中,即血液中的血细胞比容为20%、42%和65%时反应速度较快。每一种血液样品中的葡萄糖含量大体上相同,即65%血细胞比容样品的葡萄糖含量为5.4mM,42%血细胞比容样品的葡萄糖含量为5.5mM,而20%血细胞比容样品的葡萄糖含量为6.0mM。
测定的电流大体上可以用以下公式表示:
i=-FADC/L
其中,i是电流,F是法拉第常数(96486.7C/mol),A是电极面积,D是所述氰亚铁酸盐在样品中的扩散系数,C是氰亚铁酸盐在反应部位的浓度,而L是反应部位和电极之间的距离。因此,通过C随时间改变的速度表示的反应速度可以用以下公式表示:
dC/dt=-(L/FAD)di/dt
对于上述反应来说,在6-8秒之间,20%、42%和65%血细胞比容样品的平均di/dt分别为3.82、2.14和1.32毫安/秒。对20%、42%和65%血细胞比容的样品来说,氰亚铁酸盐的扩散系数分别为2.0×10-6,1.7×10-6和1.4×10-6平方厘米/秒。电极面积为0.1238平方厘米,而L为125微米。对于20%、42%和65%血细胞比容的样品来说,以上值所得到的反应速度分别为2.0、1.3和1.99mM/秒。
正如本领域技术人员可以理解的,可以对上述用于测定血液中葡萄糖反应的方法进行改进,以便应用于其他电化学系统,包括免疫测定系统,如抗原测定。
以上说明公开了本发明的若干种方法和材料。可以对本发明的所述方法和材料进行改进,并且改变生产方法和设备。本领域技术人员在阅读本说明书或本文所公开的本发明的实践之后能够理解所述改进。因此,并非要将本发明局限于本文所公开的具体实施方案,而是要包括根据体现在所附权利要求书中的本发明的实际范围和构思作出的所有改进和改变。
Claims (32)
1.一种用于检测流体样品中的靶抗原的电化学装置,该装置包括:
一个反应室,该反应室包括
a)一个内表面,一个近端和一个远端,
b)一种能够结合靶抗原的固定化抗体,和
c)能够与样品混合的报道分子;
一个检测室,该检测室包括
a)一个壁、一个内表面,一个远端和一个近端,
b)一个位于远端的样品入口,和
c)用于检测检测室中的电化学反应的电极;和
一个位于所述反应室远端和所述检测室近端之间的样品通道,
其中,流体样品中靶抗原的存在导致检测室中电化学反应的可测量改变。
2.如权利要求1的装置,其中,所述报道分子包括能够与靶抗原竞争结合固定化抗体的酶探针和抗原。
3.如权利要求2的装置,其中,所述反应室包含过量的抗体。
4.如权利要求2的装置,其中,所述酶包括葡萄糖氧化酶。
5.如权利要求2的装置,其中,所述酶包括葡萄糖脱氢酶。
6.如权利要求1的装置,其中,所述检测室还包含酶底物。
7.如权利要求6的装置,其中,所述酶底物是可氧化的底物。
8.如权利要求7的装置,其中,所述可氧化的酶底物选自半乳糖和乙酸。
9.如权利要求7的装置,其中,所述可氧化的酶底物包括葡萄糖。
10.如权利要求1的装置,其中,所述检测室还包含一种介体。
11.如权利要求10的装置,其中,所述介体选自二氯靛酚和过渡金属与含氮杂原子物质的复合物。
12.如权利要求10的装置,其中,所述介体包括氰铁酸盐。
13.如权利要求1的装置,其中,所述检测室还包含一种能调节样品pH的缓冲剂。
14.如权利要求13的装置,其中,所述缓冲剂包括磷酸盐。
15.如权利要求13的装置,其中,所述缓冲剂包括柠檬酸盐。
16.如权利要求1的装置,还包括容纳在所述反应室中的一种试剂,该试剂能够抑制蛋白与反应室内表面的非特异性结合。
17.如权利要求16的装置,其中,所述试剂选自表面活性剂和封闭蛋白。
18.如权利要求16的装置,其中,所述试剂是牛血清白蛋白。
19.如权利要求1的装置,其中所述报道分子与所述固定化抗体间隔小于1毫米。
20.如权利要求1的装置,其中所述装置还包括支持材料。
21.如权利要求20的装置,其中所述支持材料位于检测室内,并且其中选自酶底物、介体、缓冲剂及其组合的第一种物质支持在支持材料上或者包含在支持材料内。
22.如权利要求20的装置,其中所述支持材料位于反应室内,并且其中选自固定化抗体、报道分子、和能够抑制蛋白与反应室内表面非特异性结合的制剂的第二种物质支持在支持材料上或者包含在支持材料内。
23.如权利要求20的装置,其中所述支持材料包括纱布材料。
24.如权利要求20的装置,其中所述支持材料包括纤维填充材料。
25.如权利要求20的装置,其中所述支持材料包括多孔材料。
26.如权利要求25的装置,其中所述多孔材料包括烧结的粉末。
27.如权利要求25的装置,其中所述多孔材料包括大孔膜。
28.如权利要求1的装置,还包括一个能够检测反应室基本上被充满的状态的检测仪。
29.如权利要求1的装置,还包括一个能够在检测室远端形成一个检测室通气孔的穿孔装置。
30.如权利要求1的装置,还包括位于反应室远端的反应室通气孔。
31.一种用于电化学检测流体样品中的靶抗原的方法,该方法包括:
提供反应室和检测室,所述反应室和检测室具有近端和远端;
让样品进入反应室,所述反应室包括一个内表面;一种能够结合靶抗原的抗体;和能够与样品混合并且与靶抗原竞争结合固定化抗体的报道分子;
使靶抗原与报道分子竞争结合固定化抗体;
使未结合的报道分子经过反应室远端和检测室近端之间的样品通道从反应室移动到检测室;以及
通过电极测量检测室中的电化学反应以确定靶分析物是否存在于样品中,
其中,所述靶分析物的存在减少了与固定化抗体结合的报道分子的量并且允许报道分子参与检测室中的电化学反应。
32.权利要求31的方法,其中,所述报道分子包括能够与靶抗原竞争结合固定化抗体的酶探针和抗原。
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