KR20080003941A - 면역센서 - Google Patents

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라이프스캔, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 세척 단계가 필요없어 액체 폐기물을 발생시키지 않는 저렴한 정량측정용 1회용 면역센서(20)에 관한 것이다. 또한, 센서(20)의 바람직한 양태에서, 타이밍 단계가 사용자에게 요구되지 않고, 센서(20)는 광범위한 역학 범위에 걸쳐 항원-항체 상호관계에 쉽게 적응시킬 수 있다.
1회용 면역센서, 세척 단계, 액체 폐기물, 타이밍 단계, 리포터 복합체

Description

면역센서{Immunosensor}
본 발명은 면역측정 장치 및 면역측정 방법에 관한 것이다. 당해 장치는 1회용 면역센서를 포함한다.
생물의학적 센서는 각종 분석물의 존재 및/또는 농도를 보고하는 데 사용된다. 분석물이 단백질인 경우, 단백질(항원)과 항체와의 상호작용이 매우 특이하므로 사용되는 검출 성분은 통상적으로 항체이다. 이러한 면역측정법은 통상적으로 두 가지 범주에 속한다. 예를 들면, 간단한 육안 검출에 의해 수득되는 "예스/노우 응답(yes/no answer)" 또는 정량 분석법으로 측정되는 항원의 농도가 있다. 대부분의 정량 분석법은 (방사능 모니터링용) 신틸레이션 계수기(scintillation counter), 분광 광도계, 형광 광도계(참조: 미국 특허공보 제5,156,972호), 표면 플라즈몬 공명 기기(surface plasmon resornance instrument)(참조: 미국 특허공보 제5,965,456호) 등과 같은 고가의 장치를 포함한다. 따라서, 가정 또는 전문분야에서 사용하기에 적합할 정도로 충분히 저렴하고 간편한 정량 분석적 면역측정법을 개발하는 것이 유리할 것이다.
통상적인 면역측정법은 경쟁 검정법과 샌드위치 검정법의 두 가지 범주로 분류된다. 경쟁 검정법에서, 시험 샘플 속의 항원을 항원-프로브(probe) 복합체와 혼합하면, 혼합물은 항체에 결합하기 위해 경쟁한다. 프로브는 효소, 형광발색단 또는 발색단일 수 있다. 다음으로, 샌드위치 검정법에서, 시험 샘플 속의 항원이 항체에 결합한 후, 또 다른 항체-프로브 복합체가 항원에 결합한다. 이들 선행 기술 검정법에서는 1회 이상의 세척 단계가 통상적으로 필요하다. 세척 단계는 검정 절차를 복잡하게 하고 생물유해한 액체 폐기물을 생성시킬 수 있다. 따라서, 세척 단계를 필요로 하지 않는 면역측정법을 수행하는 장치를 개발하는 것이 유리할 것이다. 이러한 장치는 1회용 장치로 고안될 수 있다.
본 발명은 세척 단계가 필요없어 액체 폐기물을 생성시키지 않는 저렴한 정량 분석용 1회용 면역센서를 제공한다. 또한, 바람직한 양태에서, 당해 센서는 사용자의 타이밍 단계(timing step)가 필요없고, 광범위한 역학적 범위로 항원-항체 상호작용에 쉽게 적응시킬 수 있다.
한 가지 양태에서, 내부 표면, 근위 말단부(proximal end) 및 원위 말단부(distal end)를 갖는 반응 챔버; 표적 항원에 결합할 수 있는, 반응 챔버 속에 고정된 부동화 항체; 프로브를 포함하며 샘플과 혼합될 수 있는, 반응 챔버 속에 존재하는 리포터 복합체(reporter complex); 내벽, 내부 표면, 원위 말단부 및 근위 말단부를 갖는 검출 챔버; 반응 챔버의 근위 말단부에 위치하는 샘플 유입구; 및 반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 샘플 통로를 포함하는, pH를 갖는 유체 샘플 속의 표적 항원을 검출하는 데 사용하기 위한 1회용 장치가 제공된다.
당해 양태의 한 가지 측면에서, 반응 챔버 속에 들어 있고 반응 챔버 내부 표면에 대한 단백질의 비특이성 결합을 방지할 수 있는 제제가 포함된다. 당해 제제는 표면활성제 및 블로킹 단백질(예: 소 혈청 알부민)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 리포터 복합체는 부동화 항체에 결합하기 위해 표적 항원과 경쟁할 수 있는 또 다른 항원 또는 표적 항원에 결합할 수 있는 또 다른 항체를 추가로 포함한다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 프로브는 발색단 및 형광발색단으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 프로브는 글루코스 옥시다제 또는 글루코스 디하이드로게나제와 같은 효소를 포함할 수 있다. 효소 기질, 예를 들면, 갈락토스, 아세트산 또는 글루코스와 같은 산화 가능한 기질이 또한 포함될 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 검출 챔버는 매개체를 추가로 포함한다. 매개체는 디클로로페놀인도페놀, 전이금속과 질소-함유 헤테로원자종과의 착체 또는 페리시아나이드를 포함할 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 장치는 샘플의 pH를 조절할 수 있는 완충액, 예를 들면, 인산염 또는 시트르산염을 포함하는 완충액을 추가로 포함한다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 부동화 항체 및/또는 리포터 복합체는 반응 챔버의 내부 표면에 지지된다. 리포터 복합체는 약 1mm 미만으로 부동화 항체로부터 분리될 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 장치는 하나 이상의 항원, 효소 및 항체를 안정화시키는 안정화제를 추가로 포함한다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 효소 기질은 검출 챔버의 내부 표면에 지지된다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 장치는 지지 물질을 추가로 포함한다. 지지 물질은 검출 챔버에 함유될 수 있고 효소 기질, 매개체 및 완충액과 같은 하나 이상의 물질은 지지 물질에 지지되거나 지지 물질 속에 함유될 수 있다. 지지 물질은 또한 반응 챔버 속에 함유될 수 있고, 부동화 항체, 리포터 복합체 및 반응 챔버 내부 표면에 대한 단백질의 비특이성 결합을 방지할 수 있는 제제와 같은 하나 이상의 물질이 지지 물질에 지지되거나 지지 물질 속에 함유될 수 있다. 지지 물질은 폴리올레핀, 폴리에스테르, 나일론, 셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함하는 메쉬 또는 섬유상 충전재; 폴리설폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 나일론, 셀룰로스 아세테이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체성 물질을 포함하는 거대다공성 막과 같은 다공성 물질 또는 소결 분말을 포함할 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 검출 챔버는 두 개 이상의 전극을 포함한다. 전극은 팔라듐, 백금, 금, 이리듐, 탄소, 결합제와 혼합된 탄소, 산화인듐, 산화주석 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 검출 챔버의 벽은 프로브에 의해 방출되거나 흡수된 방사선에 투과성이고, 당해 방사선은 검출 챔버 속의 리포터 복합체의 존재 또는 부재를 보여준다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 반응 챔버가 실질적으로 충전된 상태를 검출할 수 있는 검출기가 포함된다. 검출 챔버의 원위 말단부에 검출 챔버 통기구를 형성시킬 수 있는 천공 수단(piercing mean)이 또한 포함될 수 있다. 반응 챔버의 원위 말단부에 반응 챔버 통기구가 또한 포함될 수 있다.
또 다른 양태에서, 근위 말단부와 원위 말단부를 갖는, 제1 시트의 재료를 통해 연장되는 제1 개구부(이는 반응 챔버의 측벽, 검출 챔버의 측벽 및 반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 제1 샘플 통로를 경계 짓는다(defining))를 형성시키는 단계; 제1 층을 제1 시트의 제1 면에 탑재하고 개구부로 연장시켜 제1 반응 챔버 말단 벽과 제1 검출 챔버 말단 벽을 경계 짓는 단계; 제2 층을 제1 시트의 제2 면에 탑재하고 개구부로 연장시켜, 제1 층과 실질적으로 중첩 정합되도록 제2 반응 챔버 말단 벽과 제2 검출 챔버 말단 벽을 경계 지음으로써, 시트와 층들이 다수의 외부 표면을 갖는 스트립을 형성하도록 하는 단계; 스트립의 외부 표면을 통해 반응 챔버로 연장되는 제2 통로(이는 반응 챔버 통기구를 경계 짓는다)를 반응 챔버의 원위 말단부에 형성시키는 단계; 스트립의 외부 표면을 통해 반응 챔버로 연장되는 제3 통로(이는 샘플 유입구를 경계 짓는다)를 반응 챔버의 근위 말단부에 형성시키는 단계; 항체를 반응 챔버 속에서 부동화시키는 단계; 및 프로브를 포함하는 리포터 복합체를 반응 챔버 속에 위치시키는 단계를 포함하는, pH를 갖는 유체 샘플 속의 표적 항원을 검출하는 데 사용하기 위한 1회용 장치의 제조방법을 제공한다.
당해 양태의 한 가지 측면에서, 개구부는 제1 시트의 근위 말단부를 통해 연장되어 제3 통로를 형성한다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 제1 시트, 제1 층 및 제2 층은 전기 저항성 재료를 포함하고, 제1 층은 제1 시트의 제1 면과 대향하는 제1 전극을 포함하고, 제2 층은 시트의 제2 면과 대향하는 제2 전극을 포함한다. 전극들 중 적어도 하나는 팔라듐, 백금, 금, 이리듐, 탄소, 결합제와 혼합된 탄소, 산화인듐, 산화주석 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다. 제1 전극은 실질적으로 제1 검출 챔버 말단 벽을 덮고, 제2 전극은 실질적으로 제2 검출 챔버 말단 벽을 덮는다. 전극들 중 적어도 하나는 스퍼터링 피복된 금속 부착물일 수 있다. 제2 전극은 제1 전극으로부터 약 500㎛ 이하, 제1 전극으로부터 약 150㎛ 이하 또는 제1 전극으로부터 약 50㎛ 내지 약 150㎛의 거리에 대향 관계로 탑재될 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 층들은, 예를 들면, 열활성화 접착제, 감압성 접착제, 열경화성 접착제, 화학 경화성 접착제, 열 용융성 접착제 및 열 유동성 접착제와 같은 접착제에 의해 시트에 접착된다. 적어도 시트 또는 층들 중 하나는 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리올레핀 및 이들의 혼합물 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트와 같은 중합체성 재료를 포함할 수 있다. 하나 이상의 층은 적외선, 가시광선 및 자외선을 포함하는 방사선의 파장에 투과성일 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 당해 방법은 효소 기질과 매개체를 제공하는 단계를 추가로 포함하는데, 여기서, 효소 기질과 매개체는 검출 챔버에 들어 있고, 프로브는 효소이고, 매개체는 효소와 전극간의 반응을 매개하여 전기화학적 반응을 일으킬 수 있다.
당해 양태의 또 다른 측면에서, 당해 방법은 샘플의 pH를 조절할 수 있는 완충액을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
제3 양태에서, 근위 말단부와 원위 말단부를 갖는, 전기 저항성 재료의 제1 시트를 통해 연장되는 제1 개구부(이는 제1 개구부 반응 챔버 부분과 제1 개구부 검출 챔버 부분을 갖고; 반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 샘플 통로, 반응 챔버 측벽의 제1 부분 및 검출 챔버 측벽을 경계 짓는다)를 형성시키는 단계, 근위 말단부와 원위 말단부를 갖는, 전기 저항성 재료의 제2 시트를 통해 연장되는 제2 개구부(이는 반응 챔버 측벽의 제2 부분을 경계 짓는다)를 형성시키는 단계, 근위 말단부와 원위 말단부를 갖는, 전기 저항성 재료의 제3 시트를 통해 연장되는 제3 개구부(이는 반응 챔버 측벽의 제3 부분을 경계 짓는다)를 형성시키는 단계, 반응 챔버 측벽의 제2 부분이 반응 챔버 측벽의 제1 부분과 실질적으로 정합되도록 제2 시트의 제1 면을 제1 시트의 제1 면에 탑재하는 단계(여기서, 제2 시트는 제1 개구부 검출 챔버 부분 위로 연장되어 제1 검출 챔버 말단 벽을 경계 짓는다), 반응 챔버 측벽의 제3 부분이 반응 챔버 측벽의 제1 부분과 실질적으로 정합되도록 제3 시트의 제1 면을 제1 시트의 제2 면에 탑재하는 단계(여기서, 제3 시트는 제1 개구부의 검출 챔버 부분 위로 연장되어 제2 검출 챔버 말단 벽을 경계 짓는다); 제1 층을 제2 시트의 제2 면에 탑재하여 제2 개구부로 연장시켜 제1 반응 챔버 말단 벽을 경계 짓는 단계; 제2 층을 제3 시트의 제2 면에 탑재하여 제3 개구부로 연장시켜, 제1 층과 실질적으로 중첩 정합되도록 제2 반응 챔버 말단 벽을 경계 지음으로써, 시트들과 층들이 다수의 외부 표면을 갖는 스트립을 형성시키는 단계; 스트립의 외부를 통해 반응 챔버로 연장되는 제2 통로(이는 반응 챔버 통기구를 경계 짓는다)를 반응 챔버의 원위 말단부에 형성시키는 단계; 스트 립의 외부를 통해 반응 챔버로 연장되는 제3 통로(이는 샘플 유입구를 경계 짓는다)를 반응 챔버의 원위 말단부에 형성시키는 단계; 항체를 반응 챔버 속에서 부동화시키는 단계, 및 프로브를 포함하는 리포터 복합체를 반응 챔버 속에 위치시키는 단계를 포함하는, pH를 갖는 유체 샘플 속의 표적 항원을 검출하는 데 사용하기 위한 1회용 장치의 제조방법이 제공된다.
제4 양태에서, 내부 표면, 근위 말단부 및 원위 말단부를 갖는 반응 챔버, 반응 챔버에 고정된 부동화 항체(이는 표적 항원에 결합할 수 있다), 반응 챔버 속에 존재하는 리포터 복합체(이는 프로브를 포함하고 샘플과 혼합될 수 있으며, 부동화 항체에 결합하기 위해 표적 항원과 경쟁할 수 있는 또 다른 항원을 추가로 포함한다), 내벽, 내부 표면, 원위 말단부 및 근위 말단부를 갖는 검출 챔버, 반응 챔버의 근위 말단부에 있는 샘플 유입구 및 반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 샘플 통로를 포함하는 1회용 장치를 제공하는 단계; 유체 샘플을 샘플 유입구와 접촉시키는 단계; 샘플이 샘플 유입구로부터 반응 챔버로 유동하도록 함으로써 반응 챔버를 유체 샘플로 실질적으로 충전시키는 단계; 실질적으로 모든 리포터 복합체가 샘플 속의 항원의 부재하에 부동화 항체에 결합하는 데 충분한 소정의 시간을 경과시키는 단계; 샘플이 반응 챔버로부터 샘플 통로를 통해 검출 챔버로 유동하도록 함으로써 검출 챔버를 유체 샘플로 실질적으로 충전시키는 단계; 및 검출 챔버 속에서 항원-프로브 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계(항원-프로브 복합체의 존재 또는 부재는 샘플 속의 항원의 존재 또는 부재를 나타낸다)를 포함하여, 유체 샘플 속의 표적 항원의 존재 또는 부재를 측정하는 방법 이 제공된다.
당해 양태의 한 가지 측면에서, 당해 방법은 검출 챔버의 원위 말단부에 검출 챔버 통기구를 형성시키기 위해서 검출 챔버의 벽을 뚫는 단계를 예정된 시간의 경과 직후에 추가로 포함한다.
제5 양태에서, 전기 저항성 재료의 제1 시트를 통해 연장되는 제1 개구부(이는 근위 말단부와 원위 말단부를 갖는 검출 챔버 부분을 갖고 검출 챔버 측벽을 경계 짓는다)를 형성시키는 단계; 제1 층을 제1 시트의 제1 면에 탑재하고 개구부로 연장시켜 제1 검출 챔버 말단 벽을 경계 짓는 단계; 제2 층을 제1 시트의 제2 면에 탑재하고 개구부로 연장시켜, 제1 층과 실질적으로 중첩 정합되도록 제2 검출 챔버 말단 벽을 경계 지음으로써 시트와 층들이 스트립을 형성하는 단계; 근위 말단부와 원위 말단부를 갖는 스트립을 통해 연장되는 제2 개구부(이는 근위 말단부와 원위 말단부를 갖는 반응 챔버 부분을 갖고, 반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 샘플 통로와 반응 챔버 측벽을 경계 짓는다)를 형성시키는 단계; 제3 층의 제1 면을 스트립의 제1 면에 탑재하는 단계(여기서, 제3 층은 제2 개구부의 반응 챔버 부분 위로 연장되어 제1 반응 챔버 말단 벽을 경계 짓는다); 제4 층의 제1 면을 스트립의 제2 면에 탑재하는 단계(여기서, 제4 층은 제2 개구부의 반응 챔버 부분 위로 연장되어 제2 반응 챔버 말단 벽을 제1 반응 챔버 말단 벽과 실질적으로 정합되도록 경계 짓는다); 장치의 표면을 통해 반응 챔버로 연장되는 제3 개구부(이는 반응 챔버 통기구를 경계 짓는다)를 반응 챔버의 원위 말단부에 형성시키는 단계; 장치의 표면을 통해 반응 챔버로 연장되는 제4 개구부(이는 샘플 유 입구를 경계 짓는다)를 반응 챔버의 근위 말단부에 형성시키는 단계; 항체를 반응 챔버 속에서 부동화시키는 단계; 및 프로브를 포함하는 리포터 복합체를 반응 챔버 속에 위치시키는 단계를 포함하여, 다수의 외부 표면을 갖는, pH를 갖는 유체 샘플 속의 표적 항원을 검출하는 데 사용하기 위한 1회용 장치를 제조하는 방법이 제공된다.
당해 양태의 한 가지 측면에서, 제1 시트, 제1 층 및 제2 층은 전기 저항성 재료를 포함하고, 제1 층은 제1 시트의 제1 면과 대향하는 제1 전극을 포함하고, 제2 층은 시트의 제2 면과 대향하는 제2 전극을 포함한다.
본 발명에 따라 세척 단계가 필요없어 액체 폐기물을 발생시키지 않는 저렴한 정량측정용 1회용 면역센서(20)가 제공된다. 또한, 센서(20)의 바람직한 양태에서, 타이밍 단계가 사용자에게 요구되지 않으며, 광범위한 역학 범위에 걸쳐 항원-항체 상호관계에 쉽게 적응시킬 수 있다.
다음 설명 및 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 상세하게 설명한다. 당해 기술분야의 숙련가는 이의 범위에 포함되는 본 발명의 다수의 변화 및 변형이 있음을 인지할 것이다. 따라서, 바람직한 양태의 설명은 본 발명의 범위를 한정하려는 것으로 간주되어서는 안된다.
1단계의 비세척 면역센서가 기재된다. 당해 센서는 두 개의 인접하는 챔버, 즉 반응 챔버와 검출 챔버를 사용하는 1회용 장치이다. 반응 챔버에서는 항원-항체 반응이 일어나고 검출 챔버에서는 이들 반응의 결과가 검출되고 샘플 속의 항원의 존재 또는 부재가 추정된다.
모든 적합한 검출방법이 사용될 수 있다. 적합한 검출방법은, 예를 들면, 색의 전개가 관찰되는 육안 검출법 또는 반사광 또는 투과광이 흡광도의 변화를 측정하는 데 사용되는 분광학적 검출법을 포함한다. 바람직한 양태에서, 검출방법은 항원/항체 반응 생성물에 의해 간접적으로 발생된 전류 또는 전위를 측정하는 전기화학적 방법이다.
유체 샘플의 전기화학적 측정법 및 전기화학적 측정 장치는 본원에 참고로 인용된, 2000년 7월 14일자로 출원된 계류중인 미국 특허원 제09/615,691호(발명의 명칭: Antioxidant sensor), 2000년 7월 14일자로 출원된 계류중인 미국 특허원 제09/616,512호(발명의 명칭: Hemoglobin sensor) 및 2000년 7월 14일자로 출원된 계류중인 미국 특허 제09/616,556호(발명의 명칭: Electrochemical method for measuring chemical reaction rates)에 추가로 논의되어 있다.
각종 시험 단계들의 타이밍, 즉 반응 단계 및 검출 단계는 수동으로 행해질 수 있다. 또한, 타이밍은 반응 챔버가 충전될 때 발생된 개시 신호에 반응하여 자동적으로 행해질 수 있다.
전기화학적 검출에 사용하기에 적합한 센서의 양태는 도 1과 도 2에 예시되어 있다. 도 1은 센서 스트립의 상부도이고, 도 2는 반응 챔버와 검출 챔버를 상 세하게 보여주는 단면도이다.
센서
바람직한 양태의 면역센서는 전기화학적 글루코스 검출장치를 제조하는 데 사용되는 익히 공지된 박층 장치 제조 기술(참조: 본원에 참고로 인용된 미국 특허공보 제5,942,102호)을 사용하여 제조할 수 있다. 약간 변형된 당해 기술은 비전기화학적 검출방법을 이용하는 면역센서를 제조하는 데도 사용된다.
도 1 및 도 2에 도시된 면역 센서의 바람직한 양태에서, 검출 챔버(28)는 전기화학적 셀(28)을 포함한다. 먼저, 반응 챔버(22)와 검출 챔버(28)는 전기 저항성 재료의 시트(36)를 통해 연장되는 개구부를 형성시킴으로써 제조된다. 당해 개구부는 반응 챔버(22)와 검출 챔버(28) 사이의 샘플 통로(38) 뿐만 아니라 반응 챔버(22)와 검출 챔버(28) 둘 다의 측벽을 경계 짓는 형태이다. 개구부를 반응 챔버(22)의 근위 말단부(24)으로부터 시트의 에지(37)까지 연장시킴으로써 샘플 유입구(24)가 또한 형성된다. 한 가지 양태에서, 시트(36)의 두께는 반응 챔버(22)와 검출 챔버(28)의 전체 높이를 한정하며 이들은 동일하다. 또 다른 양태에서, 반응 챔버(22)의 높이는 검출 챔버(28)의 높이보다 높다. 검출 챔버(28)보다 높이가 높은 반응 챔버(22)는 다수의 시트들(32, 34 및 36)을 함께 적층시킴으로써 제조된다. 층의 중간 시트(36)는 위에서 기재한 바와 같이 반응 챔버(22)와 검출 챔버(28) 둘 다의 측벽(74) 및 측벽(76)을 경계 짓는 개구부를 갖는다. 당해 중간 층(36)을 두 개 이상의 추가 층(32)과 추가 층(34) 사이에 삽입시키는데, 추가 층(32)과 추가 층(34)은 반응 챔버(22)의 측벽(74)만을 경계 짓는 개구부를 가짐으로써 추가 층(32)과 추가 층(34)은 검출 챔버(28)의 말단 벽(60)과 말단 벽(62)을 경계 짓는다. 당해 양태에서, 검출 챔버의 말단 벽(60)과 말단 벽(62)은 다음에 기재되는 바와 같이 제조될 수 있는 전극(52)과 전극(54)를 포함한다.
반응 챔버(22)와 검출 챔버(28)의 측벽(74) 및 측벽(76)을 형성시킨 후, 제1 박막 전극 층(52)을 전기 저항성 재료의 시트(36)의 한 면(70)에 탑재하고 검출 챔버(28)를 형성하는 개구부로 연장시켜 말단 벽(60)을 형성시킨다. 층(52)은, 예를 들면, 접착제를 통해 시트(36)에 접착될 수 있다. 적합한 접착제는, 예를 들면, 열활성화 접착제, 감압성 접착제, 열경화성 접착제, 화학적 경화성 접착제, 열 용융성 접착제, 열 유동성 접착제 등을 포함한다. 전극 층(52)은 전기 저항성 재료(32)를 적합한 금속, 예를 들면, 백금, 팔라듐, 탄소, 산화인듐, 산화주석, 혼합된 인듐/주석 산화물, 금, 은, 이리듐, 이들의 혼합물 등을 피복(예: 스퍼터링 피복)시켜 제조된다. 전극(52)과 전극(54)으로서 사용하기에 적합한 재료는 센서(20) 속에 존재하는 시약과 혼화성이다. 즉, 이들은 시약과 화학적으로 반응하지 않는다.
또 다른 박막 전극 층(54)을 전기 저항성 재료(36)의 반대면(72)에 탑재하고, 또한 검출 챔버(28)를 형성하는 개구부로 연장시켜 제2 말단 벽(62)을 형성시킨다. 바람직한 양태에서, 전극 층(52)과 전극 층(54)은 약 500㎛ 이하, 보다 바람직하게는 150㎛ 이하, 가장 바람직하게는 50 내지 150㎛의 거리로 대향하는 관계로 탑재되어 있다. 샘플 유입구(24)가 아직 형성되지 않았다면, 예를 들면, 반응 챔버(22)의 근위 말단부(23)을 교차하는 장치(20)의 에지(37)에 노치(notch)를 형성시킴으로써 샘플 유입구(24)를 제공한다.
전극 층(52)과 전극 층(54)에는 센서(20)가 측정 회로에 위치하도록 하는 연결 수단이 제공된다. 셀(28) 속의 전극(52) 또는 전극(54) 중 적어도 하나는 검출 전극, 즉 산화방지제의 경우에는 환원된 산화환원반응 제제의 양에 민감하거나 산화제의 경우에는 산화된 산화환원반응 제제의 양에 민감한 전극이다. 검출 전극(52) 또는 검출 전극(54)의 전위가 당해 분석물의 농도의 지표인 전위차 센서(20)의 경우, 참조 전위를 제공하는 작용을 하는, 참조 전극으로서 작용하는 제2 전극(54) 또는 전극(52)이 존재한다. 검출 전극 전류가 샘플 속의 분석물의 농도의 지표인 전류측정 센서(20)의 경우, 전기 회로를 완성하는 카운터 전극으로서 작용하는 하나 이상의 다른 전극(54) 또는 전극(52)이 존재한다. 당해 제2 전극(54) 또는 전극(52)는 또한 참조 전극으로서 작용할 수 있다. 또한, 별개의 전극(도시하지 않음)이 참조 전극 작용을 수행할 수 있다.
면역센서(20)가 전기화학적 셀(28)로서 작동되는 경우, 반응 챔버(22) 및/또는 검출 챔버(28)를 경계 짓는 개구부를 함유하는 시트(32), 시트(34) 및 시트(36)는 전기 저항성 재료를 포함해야 한다. 적합한 전기 저항성 재료는, 예를 들면, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리올레핀, 이들의 혼합물 등을 포함한다. 바람직한 폴리에스테르는 폴리에틸렌 테레프탈레이트이다. 면역센서(20)가 전기화학적 검출방법 이외의 검출 방법을 사용하여 작동되는 경우, 재료는 전기 저항성일 필요는 없다. 그러나, 위에서 기재한 중합체성 재료들이 가공 용이성, 저 가 및 시약 및 샘플에 대한 반응성의 부족으로 인해 바람직한 양태의 면역센서를 구성하는 데 사용하기에 바람직하다. 특정 주파수의 광의 흡수, 투과 및 방출을 포함하는 검출방법의 경우, 말단 벽(60) 및/또는 벽(62) 및 층(32) 및 층(46) 및/또는 검출 챔버(28)의 말단 벽 위의 층(34) 및 층(42)는 광 주파수에 투과성이어야 한다.
셀(28)에서 사용하기 위한 시약, 예를 들면, 부동화 항체, 프로브 결합된 항원, 완충액, 매개체 등은 매트릭스 속에서 반응 챔버(22)의 벽(40), 벽(48) 및/또는 벽(74)에 또는 검출 챔버(28)의 벽(60), 벽(62) 및/또는 벽(76)에 또는 챔버 속에 들어 있는 독립 지지체에 지지될 수 있거나 자가 지지(self supporting)될 수 있다. 시약이 챔버 벽 또는 전극(52) 및 전극(54)에 지지되어야 하는 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 인쇄 기술, 예를 들면, 잉크 제트 인쇄법, 스크린 인쇄법, 석판인쇄법 등을 사용하여 화학약품을 도포할 수 있다. 바람직한 양태에서, 시약을 함유하는 용액을 챔버 내의 표면에 도포하여 건조시킨다.
항체(44), 프로브 결합된 항원(50) 또는 기타 화학약품을 반응 챔버(22) 또는 검출 챔버(28)의 표면(40), 표면(48), 표면(60), 표면(62), 표면(74) 및/또는 표면(76) 위에서 부동화시키거나 건조시키는 것보다 이들을 챔버 속에 위치하는 하나 이상의 독립 지지체에 지지시키거나 이들을 독립 지지체에 함유시키는 것이 유리할 수 있다. 적합한 독립 지지체는 메쉬 재료, 부직포 시트 재료, 섬유상 충전재, 거대다공성 막 또는 소결 분말을 포함하며 이들로 제한되는 것은 아니다. 독립 지지체의 이점으로는 표면적 증가가 있으며, 필요한 경우, 이에 의해 많은 항체 및 프로브 결합된 항원이 반응 챔버 속에 포함된다. 이러한 양태에서, 항체는 다공성 재료 일부분에 부동화되고 제1 반응 챔버 속에 위치하며, 프로브 결합된 항원은 또 다른 부분의 다공성 재료 위에서 건조되어 반응 챔버 속에 위치된다. 또한, 항체 또는 프로브 결합된 항원은 다공성 재료에 혼입되고 다른 성분은 위에서 기재한 반응 챔버 벽에 지지된다. 또 다른 양태에서, 반응 챔버의 벽 자체는 다공성이며 항체 및/또는 프로브 결합된 항원이 이들 속에 혼입된다. 이러한 양태에서, 액체가 다공성 벽으로 통과할 수 있지만 한정된 영역으로 누출되지 않는다. 이는 거대다공성 막을 사용하여 반응 챔버 벽을 형성시키고 막을 반응 챔버 주위에서 압축시켜 샘플의 목적하는 영역으로의 누출을 방지함으로써 달성된다.
메쉬 재료, 부직포 시트 재료 및 섬유상 충전재와 같은 적합한 독립 지지체는 폴리올레핀, 폴리에스테르, 나일론, 셀룰로스, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 이들의 혼합물 등을 포함한다. 적합한 거대다공성 막은 폴리설폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 나일론, 셀룰로스 아세테이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 이들의 혼합물 등을 포함하는 중합체성 재료로부터 제조될 수 있다.
단백질 또는 항체는 매트릭스, 예를 들면, 폴리비닐 아세테이트에 함유시킬 수 있다. 샘플 속에서의 매트릭스의 용해도 특성을 변화시킴으로써 단백질 또는 항체의 샘플로의 조절된 방출이 달성될 수 있다.
모든 경우에 센서 속에서 사용되는 재료들은 물질 제조에 따른 형태이고 셀 자체는 1회 실험에 사용된 후 폐기될 수 있도록 고안된다.
위에서 기재한 바와 같이 제조된 면역센서의 바람직한 양태를 도 1 및 도 2 에 도시한다. 이러한 바람직한 양태에서, 층(32) 및 층(34)은 전기 전도성 재료로 피복된 기판(52) 및 기판(54)이다. 표면(60) 또는 표면(62) 위의 전기 전도성 재료(52) 또는 전기 전도성 재료(54)는 검출 챔버(28)에 대향하고 표면(33) 또는 표면(35) 위에 피복된 접착층(도시하지 않음)은 각각 층(42) 또는 층(46)에 대향한다.
항원의 존재 또는 부재를 측정하기 위한 센서 사용
바람직한 양태에서, 센서(20)는 도 1의 센서(20)의 상부도 및 도 2의 라인 A-A'를 통한 센서의 단면도에 도시된 바와 같이 효소, 예를 들면, 글루코스 옥시다제 또는 글루코스 디하이드로게나제를 프로브로서 사용하는 전기화학적 셀(28)이다. 분석물의 존재 또는 부재는 다음과 같은 양태로 추정한다.
사용자는 먼저 샘플을 샘플 유입구(24)를 통해 센서(20)의 반응 챔버(22)에 도입시킨다. 샘플은 모세관 작용 또는 침투 작용의 영향하에 반응 챔버(22)로 도입된다. 충전시키는 동안, 반응 챔버 통기구(26)를 대기에 개방하여 샘플에 의해 대체된 공기가 방출되도록 한다. 샘플이 반응 챔버 통기구(26)까지 충전될 때(이 때 충전을 중단한다)까지 샘플을 반응 챔버(22)로 도입시킨다. 반응 챔버(22)의 체적은 검출 챔버(28)와 적어도 동일하고, 바람직하게는 검출 챔버(28)보다 크도록 선택한다.
도 1에서 빗금친 원은 층(32), 층(34) 및 층(36)을 뚫지만 층(42) 및 층(46)은 뚫지 않은 개구부(30)를 나타내며 층(34)에서의 개구부는 검출 챔버(28)로 개방 된다. 층(42) 및 층(46)은 초기에 뚫리지 않기 때문에 검출 챔버(28)의 대기로의 유일한 개방로는 반응 챔버(22)로 개방된 샘플 통로(38)이다. 따라서, 반응 챔버(22)를 샘플로 충전시킬 때, 이는 검출 챔버(28)에 대하여 샘플 통로(38)를 차단한다. 이는 검출 챔버(28) 속의 공기를 포착하여 검출 챔버가 샘플로 충전되는 것을 실질적으로 방지한다. 샘플이 검출 챔버(28)로의 개구부과 먼저 접촉하고 개구부(38)의 먼 쪽과 접촉하는 시간 동안에 소량의 샘플이 검출 챔버(28)에 도입된다. 그러나, 일단 샘플이 검출 챔버(28)로의 개구부(38)를 완전히 교차하여 습윤시키면 검출 챔버(28)의 충전은 일어나지 않는다.
반응 챔버(22)의 기저를 형성하는 기판(42)의 내부 표면(40)은 검출될 항원에 대한 항체(44)로 피복된다. 항체(44)는 이들이 시험 동안에 기판(42)으로부터 제거되지 않도록 기판(42)의 표면(40)에 흡착되거나 다르게는 부동화된다. 임의로, 항체(44)를 기판(42)의 내부 표면에 도포한 후, 당해 표면에 대한 단백질의 특이적 결합을 방지하기 위해 고안된 제제를 도포할 수 있다(도시하지 않음). 당해 기술분야에 공지되어 있는 이러한 제제의 예는 소 혈청 알부민(BSA)이다. 비이온성 표면활성제, 예를 들면, 트리톤(Triton) X100™[제조원: 미국 펜실베니아주 필라델피아에 소재하는 롬 앤드 하스(Rohm & Haas)] 또는 트윈(Tween™)[제조원: 미국 델라웨어주 윌밍톤에 소재하는 아이씨아이 아메리카즈(ICI Americas)]를 또한 당해 제제로서 사용할 수 있다. 선택된 비이온성 표면활성제는 단백질을 변성시키지 않는다. 기판(42)의 내부 표면(40) 위의 피막(44)은 시험에 사용될 준비가 되어 있는 경우 건조 상태이다.
또 다른 기판(46)은 반응 챔버(22)의 상부 표면(48)을 경계 짓는다. 기판(46)의 내부 표면(48) 위에 검출될 항원(50)에 결합된 효소를 피복시킨다. 적합한 효소의 예로는 글루코스 옥시다제 및 글루코스 디하이드로게나제가 있으며 이들로 제한되는 것은 아니다. 효소 결합된 항원(50)을 당해 표면(48)이 샘플에 의해 습윤되는 경우에 샘플로 방출될 수 있는 방식으로 기판(46)의 내부 표면(48) 위에서 건조시킨다. 따라서, 기판(46)의 내부 표면(48)과 효소 결합된 항원(50) 위에 피복하는 방법은 효소 결합된 항원(50)과 기판(46)의 내부 표면(48) 사이에 단지 약한 결합이 존재하도록 선택된다. 표면(48)으로부터 효소 결합된 항원(50)의 용해 속도는 샘플이 반응 챔버(22)를 충전시키는 데 걸리는 시간 동안 약간의 용해가 일어나도록 선택된다. 이런 식으로, 효소 결합된 항원(50)은 충전시킨 후 반응 챔버(22)의 영역 전체에 걸쳐 균일하게 분포된다.
효소 결합된 항원(50)과 항체(44)의 상대적인 양은 항체(44)가 효소 결합된 항원(50)을 약간 초과하도록 선택된다. 본 명세서에서, 약간의 초과는 초과량이 샘플 속에서 검출될 항원 분자의 수에 비해 적은 양인 것으로 정의된다.
따라서, 샘플을 반응 챔버(22)에 충전시키는 경우, 효소 결합된 항원(50)을 도입시키고 샘플과 혼합한다. 효소 결합된 항원(50)이 항체(44)와 접촉하도록 하기 위해서 충분한 시간이 허용된다. 과량의 항체(44)가 존재하기 때문에 항원이 샘플 속에 존재하지 않는 경우, 거의 모든 효소 결합된 항원(50)이 항체(44)에 결합하여 효과적으로 부동화된다. 항원이 샘플 속에 존재하는 경우, 효소 결합된 항원(50)보다 작고 이미 샘플 용적 전체에 걸쳐 존재하는 항원은 효소 결합된 항 원(50)이 항체(44)와 접촉하기 전에 항체(44)와 접촉하여 항체(44)에 결합한다. 따라서, 항체(44)는 차단되고 효소 결합된 항원(50)에 결합되는 것이 방지된다. 따라서, 항원이 초기에 샘플 속에 존재하는 경우, 반응 단계 말기에 효소 결합된 항원(50)은 샘플 속에 이동성을 나타내며 잔류한다. 항원이 초기에 샘플 속에 존재하지 않는 경우, 효소 결합된 항원(50)은 반응 단계 말기에 기판(46)의 내부 표면(48)에 부동화된다.
반응 단계의 말기는 샘플이 반응 챔버(22)에 도입된 후 예정된 시간이다. 예정된 시간은 항원이 샘플 속에 초기에 존재하지 않는 경우에 거의 모든 효소 결합된 항원(50)이 시험 조건하에 항체(44)에 결합하기에 충분한 시간이 되도록 설정된다.
샘플이 반응 챔버(22)에 도입되는 시간은, 예를 들면, 센서(20)에 연결된 계기 위의 버튼을 누름으로써 사용자에 의해 지시될 수 있다. 이러한 작업은 타이밍 장치를 개시시키는 데 사용된다. 육안 검출의 경우, 계기 장치는 필요없다. 이러한 양태에서, 사용자는 수동으로 반응 기간을 정한다.
전기화학적 검출이 항체/항원 반응의 결과를 검출하는 데 사용되는 경우, 샘플이 반응 챔버(22)에 도입되는 것의 지시는 자동화될 수 있다. 위에서 기재한 바와 같이, 샘플이 반응 챔버(22)에 충전되는 경우, 반응 챔버(22)로의 개구부(38)에서 검출챔버(28)의 적은 부분이 샘플로 습윤된다. 전기화학적 검출이 사용되는 경우, 적어도 두 개의 전극(52) 및 전극(54)이 검출 챔버(28) 속에 존재한다. 이들 전극(52)과 전극(54)이 검출 챔버(28) 속에 각각의 전극(52) 및 전극(54)의 적어도 일부분이 반응 챔버(22)의 충전 동안에 샘플과 접촉되도록 위치하는 경우, 샘플의 존재는 전극(52) 및 전극(54)을 연결하고 타이밍 장치를 개시시키는 데 사용될 수 있는 전기 신호를 생성시킨다.
타이밍 장치가 개시되고 예정된 시간 후, 시험의 항체/항원 반응 단계는 사용자에 의해 또는 자동적으로 종료되어야 한다. 시험의 항체/항원 반응 단계가 종료되면, 대기로의 통기구(56)가 개방된다. 예를 들면, 계기 중의 솔레노이드 활성화된 니들이 층(42) 또는 층(46) 또는 층(42)과 층(46) 둘 다를 뚫는 데 사용될 수 있고, 이에 의해 검출 챔버(28)의 원위 말단부(58)을 대기로 개방한다. 뚫는 작업은 계기에 의해 위의 예에서와 같이 자동적으로 수행되거나 계기가 사용될 수 없는 육안 검출의 경우에 사용자에 의해 수동으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 사용자는 층(42)과 층(46)을 통해 니들을 삽입하여 통기구(56)를 형성시킨다.
대기로의 통기구(56)의 개방은 검출 챔버(28)에 포착된 공기가 방출되도록 하여 검출 챔버(28)가 반응 챔버(22)로부터의 반응된 샘플로 충전되도록 한다. 반응된 샘플은 반응 챔버(22)에 존재하는 모세관 힘에 비해 증가된 검출 챔버(28)의 모세관 힘으로 인해 검출 챔버(28)로 도입된다. 바람직한 양태에서, 증가된 모세관 힘은 검출 챔버(28)의 표면(60) 및 표면(62)을 적합하게 피복함으로써 또는 보다 바람직하게는, 검출 챔버(28)에 대한 모세관 거리를 반응 챔버(22)에 대한 모세관 거리보다 작도록 선택함으로써 제공된다. 이러한 양태에서, 모세관 거리는 챔버의 가장 작은 치수인 것으로 정의된다.
효소 기질과, 효소 결합된 항원(50)의 효소 부분과 반응하여 검출 가능한 신 호를 생성시킬 수 있는 매개체를 포함하는 건조된 시약(64)을 임의로 검출 챔버(28)에 위치시킨다. 효소 기질 및 매개체는, 존재하는 경우, 효소 기질(64)과 특정 효소의 반응 속도가 존재하는 효소의 양에 의해 측정되도록 충분한 양이어야 한다. 예를 들면, 효소가 글루코스 옥시다제 또는 글루코스 디하이드로게나제인 경우, 적합한 효소 매개체(64) 및 글루코스(샘플 속에 이미 존재하지 않는 경우)가 검출 챔버(28) 속에 위치한다. 완충액이 또한 검출 챔버(28) 속의 샘플의 pH의 조절을 보조하기 위해서 포함될 수 있다. 전기화학적 검출 시스템이 사용되는 양태에서, 페리시아나이드가 적합한 매개체이다. 기타 적합한 매개체로는 전이금속과 질소-함유 헤테로원자종 간의 착체 및 디클로로페놀인도페놀이 있다. 글루코스, 매개체 및 완충 시약(64)은 효소와 효소 기질(64)과의 반응 속도가 존재하는 효소의 농도에 의해 제한되도록 충분한 양으로 존재한다.
검출 챔버(28)가 충전되는 경우, 시약(64)은 샘플에 용해된다. 시약(64)의 효소 성분은 글루코스 및 매개체와 반응하여 환원된 매개체를 생성시킨다. 이러한 환원된 매개체는 검출 챔버(28) 속에서 양극으로서 작용하는 전극(52) 또는 전극(54)에서 전기화학적으로 산화되어 전류를 생성시킨다. 한 가지 양태에서, 시간의 따른 이러한 전류의 변화 속도를 반응된 샘플 속에 존재하는 효소의 존재 및 양의 표지로서 사용한다. 전류의 변화 속도가 예정된 한계치보다 작은 경우, 이는 상당량의 효소 결합된 항원(50)이 반응된 샘플 속에 존재하지 않는 것을 나타내며 초기 샘플 속에 존재하는 항원의 부족을 나타낸다. 전류의 변화 속도가 한계치보다 큰 경우, 이는 효소 결합된 항원(50)이 반응된 샘플 속에 존재하며, 따라서 항 원이 또한 샘플 속에 초기에 존재함을 나타낸다. 한 가지 양태에서, 전류의 변화 속도는 샘플 속에 초기에 존재하는 항원의 상대량을 측정하는 데 사용된다.
전기화학적 검출 시스템의 바람직한 양태에서, 검출 챔버(28) 속의 전극(52) 및 전극(54)은, 예를 들면, 국제공개공보 제WO 97/18464호에 기재되어 있는 스퍼터링법으로 기판(32) 및 기판(34)의 내부 표면(60) 및 내부 표면(62) 위에 피복된 전기 전도성 층으로서 형성된다. 이들 전기 전도성 층(52) 및 전기 전도성 층(54)은 존재하는 시약과 화학적으로 반응하지 않고 선택된 전위에서 전극(52) 및 전극(54)으로서 유용한 재료로 이루어진다. 적합한 재료의 예에는 팔라듐, 백금, 금, 이리듐, 탄소, 결합제와 혼합된 탄소, 산화인듐, 산화주석, 및 인듐 및 주석의 혼합된 산화물이 있으며 이들로 제한되는 것은 아니다.
이러한 양태에서, 불활성 전기 절연성 층(36)이 전극 함유 기판(32) 및 기판(34)을 분리한다. 바람직하게는, 전기 절연성 층(36)은 층(32)과 층(34)을 예정된 분리 거리로 유지시키는 작용을 한다. 이러한 분리가, 예를 들면, 500㎛ 미만, 보다 바람직하게는 50 내지 150㎛로 충분히 작은 경우, 전극(52)과 전극(54) 사이의 전류 유동은 사용된 검출 시간에 대해 적합하게 짧은 시간 후에 환원된 매개체의 농도에 정비례한다. 이러한 양태에서, 전류 발생 속도는 효소 반응 속도와 직접 관련되고, 따라서 존재하는 효소의 양과 직접 관련된다.
도 1에서, 연결 말단(66)이 도시되어 있다. 검출 챔버(28) 속의 전극(54)과 전극(56)은 연결 말단(66)을 통해 계기(도시하지 않음)와 전기 연결된 상태로 위치할 수 있다. 연결 수단(도시하지 않음)은 컨덕팅 트랙(conducting track)(도시하 지 않음)을 통해 검출 챔버(28) 속의 전극(54) 및 전극(56)과 전기적으로 연결되어 있다. 도 1에 예시된 바람직한 양태에서, 이들 컨덕팅 트랙은 내부 표면(32)과 내부 표면(34) 위에 피복된 컨덕터(52)와 컨덕터(54)의 필름의 연장으로 이루어진다. 연결 영역(66)에 연결되어 있는 계기는 검출 챔버(28) 속의 전극(52)과 전극(54) 사이에 전위를 적용할 수 있고 생성된 전기 신호를 분석할 수 있으며 반응을 표시하고 임의로 메모리에 반응을 저장할 수 있다.
전기화학적 검출법을 사용하는 다른 양태에서, 검출 챔버의 내부면의 한 쪽 또는 두 쪽 모두에 전기 전도성 재료의 스트립을 사용하는데, 단 적어도 두 개의 전극, 즉 검출 전극과 카운터/참조 전극이 존재한다. 임의로, 별도의 참조 전극으로서 작용하는 제3 전극이 포함된다.
육안 검출 또는 반사율 분광분석법(reflectance spectroscopy)이 사용되는 검출 방법인 양태의 경우, 적어도 층(32)과 층(46) 또는 층(34)과 층(42)은 관찰될 방사선 파장에 투과성이다. 육안 검출의 경우, 검출 챔버(28)에서 단순한 색 변화가 관찰된다. 반사율 분광분석법의 경우, 검출 방사선은 층(32)과 층(46) 또는 층(34)과 층(42)을 통해 반사되고, 검출 챔버(28) 속의 용액으로부터 반사된 방사선이 분석된다. 투과 분광분석법이 검출 방법으로서 사용되는 경우, 적어도 층(32), 층(46), 층(34) 및 층(42)이 선택된 파장에서 방사선에 투과성이다. 방사선은 검출 챔버(28) 속의 샘플을 통해 반사되고 빔의 감쇠가 측정된다.
센서를 구성하는 방법의 바람직한 양태에서, 층(36)은 상부 표면(70)과 하부 표면(72)에 피복된 접착층(도시하지 않음)을 갖는 기판을 포함한다. 층(36)의 기 판에 적합한 재료의 예로는 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리올레핀, 및 바라직하게는 폴리에틸렌 테레프탈레이트가 있다. 적합한 접착제의 예는 감압성 접착제, 열 및 화학적 경화성 접착제 및 열용융성 및 열 유동성 접착제이다.
멜리텐(melitten)의 프로브로서의 용도
통상적인 ELISA로 항원을 효소에 결합시킨다. 그러나, 꿀벌의 독액에서 발견된 폴리펩타이드인 멜리틴에 항원을 결합시킬 수도 있다. 이러한 양태에서, 항원-멜리틴 복합체를 포함하는 프로브 결합된 항원을 위에서 기재한 바와 같이 반응 챔버의 벽 위에서 건조시킬 수 있다. 검출 챔버는 리포좀 또는 지질 소포 속에 페로시안염을 포함하는 매개체를 함유할 수 있다. 항원-멜리틴 복합체가 리포좀에 도달하면, 이들은 터져서 페로시안염을 방출한다. 이는 신호의 빠른 증폭을 유도한다. 즉, 소량의 자유로운 항원이 항체의 결합부위에 대해서 항원-멜리틴 복합체와 경쟁하여 페로시안염의 농도가 증가된다.
전기화학적 검정에서의 양고추냉이 퍼옥시다제와 알칼리성 포스파타제의 사용
통상적인 ELISA는 비색 검정(colorimetric assay)에 효소로서 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 또는 알칼리성 포스파타제(AP)를 사용한다. 그러나, 이들 효소 둘 모두가 전기화학적 검정에 사용되도록 하는 기질을 개발한다. 이러한 양태에서, AP는 p-아미노페닐 포스페이트와 함께 사용될 수 있고 HRP는 테트라티아풀발렌과 함께 사용될 수 있다.
당해 면역센서를 사용하여 전기화학적 측정치 수득
특정 양태에서, 하나 이상의 전기활성 생성물을 수득하는 화학 반응 속도에 대한 정보는 화학 반응이 전기활성 생성물과 전기화학적으로 반응하는 데 사용되는 전극으로부터 먼 부위에 편재됨을 보장함으로써 당해 센서를 사용하여 수득될 수 있다.
화학 반응 부위는 화학 반응 부위로부터 전극으로의 전기활성 종의 물질 이동이 특정 시간에 전극에서의 전류 유동을 효과적으로 조절하도록 전극으로부터 충분히 떨어져 있다. 이러한 배열은 화학 반응 부위와 전극 사이의 실질적으로 선형 전기활성 종 농도 기울기를 보장한다. 전기활성 종의 농도는 전극에서 발생하는 전기화학적 반응에 의해 전극에서는 효과적으로 0으로 유지된다. 따라서, 농도 기울기의 크기의 시간 진행은 액체 매질 속의 전기활성 반응 생성물의 확산 계수 및 화학 반응 부위에서의 전기활성 종의 농도의 시간 진행에 의해서만 실질적으로 결정된다. 전극에서의 전류 유동이 전극에서의 전기활성 종의 농도 기울기에 비례하기 때문에 이러한 전류의 시간 진행은 원거리 부위에서 발생하는 화학 반응의 시간 진행을 반영한다. 이는 전극에서 측정된 전류(또는 전류가 집적되는 경우, 통과된 전하)가 발생한 화학 반응의 정도 및 속도의 편리한 척도로서 사용되도록 한다.
화학 반응이 작동 전극으로부터 멀리 떨어져 있음을 보장하는 적합한 방법의 예는 전극으로부터 원거리 고형 표면에 하나 이상의 반응 성분들을 부동화시키는 것이다. 반응 성분(들)은 고형 표면 위에서 건조시키거나 다른 방법으로 고형 표면에 부착시킨 중합체성 매트릭스에 이들을 혼입시킴으로써 부동화할 수 있다. 반응 성분(들)은 또한 화학적 결합 또는 물리적 결합에 의해 고형 표면에 직접 결합될 수 있다. 또한, 하나 이상의 반응 성분들은 특별한 부동화 수단 없이 고형 표면 위에서 간단히 건조시킬 수 있다. 이러한 상황에서, 하나 이상의 반응 성분들은 필요한 측정을 수행하기 위해서 전기화학적 전류가 유용하게 모니터링될 수 있는 시간 동안 건조되는 위치로부터 상당히 이동하지 않도록, 전기화학적 셀을 충전시키고 있는 액체 매트릭스 속에서의 이동성이 충분히 낮다. 본 명세서에서, 상당한 이동은 화학 반응에 필요한 가장 느리게 이동하는 성분이 작동 전극에 충분히 가까이 접근하여 코트렐형 소모 역학(Cottrell type depletion kinetics)이 전극에서의 전류 유동의 시간 진행을 수행하기 시작함을 의미한다.
바람직한 양태에서, 화학 반응 부위와 작동 전극 사이의 분리 거리의 범위는 바람직하게는 약 1cm 이하, 바람직하게는 5mm 이하, 보다 바람직하게는 5㎛, 10㎛, 50㎛, 100㎛, 200㎛, 500㎛ 내지 5mm, 보다 바람직하게는 5㎛, 10㎛, 50㎛, 100㎛, 200㎛ 내지 500㎛, 가장 바람직하게는 5㎛, 10㎛, 50㎛, 100㎛ 내지 200㎛이다.
작동 전극 뿐만 아니라, 액체 샘플과 접촉하는 적어도 카운터 전극을 제공하여 전기화학적 회로를 완성한다. 임의로, 카운터 전극은 결합된 카운터/참조 전극으로서 작용할 수 있거나 별개의 참조 전극이 제공될 수 있다. 바람직한 양태에서, 작동 전극 및 카운터 전극은 바람직하게는 약 300㎛ 이상, 바람직하게는 약 500㎛ 이상, 보다 바람직하게는 약 500㎛ 내지 10mm, 보다 바람직하게는 약 500㎛ 내지 1mm, 2mm, 5mm, 가장 바람직하게는 1mm 내지 2mm, 5mm, 10mm의 거리로 떨어져 있다.
작동 전극은 전극의 전류 반응을 방해하는 정도로 사용하는 동안에 접촉하게 되는 특정 성분과 화학적으로 반응하지 않는 재료로 구성된다. 작동 전극이 양극으로서 사용되는 경우, 적합한 재료의 예는 백금, 팔라듐, 탄소, 불활성 결합제와 배합된 탄소, 이리듐, 산화인듐, 산화주석, 인듐과 주석 산화물의 혼합물이다. 작동 전극이 음극으로서 사용되는 경우, 위에서 열거한 재료 이외에 기타 적합한 재료는 강철, 스테인레스 강, 구리, 니켈, 은 및 크롬이다.
카운터 전극용으로 적합한 재료의 예는 백금, 팔라듐, 탄소, 불활성 결합제와 배합된 탄소, 이리듐, 산화인듐, 산화주석, 인듐과 주석 산화물의 혼합물, 강철, 스테인레스 강, 구리, 니켈, 크롬, 은 및 실질적으로 불용성 은 염, 예를 들면, 염화은, 브롬화은, 요오드화은, 페로시안화은, 페리시안화은으로 피복된 은이다.
화학 반응 부위는 작동 전극으로부터 떨어진 카운터 전극 또는 노출된 벽에 편재될 수 있다. 화학 반응 부위는 작동 전극과 동일한 평면 위에 존재할 수 있거나, 보다 바람직하게는 작동 전극과 실질적으로 평행하고 대향하는 평면에 존재할 수 있다.
특정 양태에 사용하기에 적합한 센서는 작동 전극과 카운터 전극을 포함하고, 이들은 전기 절연성 기판 위에 위치한다. 또 다른 기판 위에는 화학 반응물로 이루어진 층이 위치하는데, 여기서 적어도 하나의 반응물은 실질적으로 기판 위에 부동화된다. 사용시, 센서의 벽들 간의 공간은 시약과 반응하여 하나 이상의 전기활성 종을 생성시킬 수 있는 물질을 함유하는 액체로 충전된다. 화학 반응 생성물들은 작동 전극을 향해 확산되고, 여기서 전기활성 종(들)은 전기화학적으로 반응하여 전류를 생성시킨다. 특정 시간에 통과된 전류 또는 전하의 크기, 또는 통과된 전류 또는 전하의 시간 진행을 사용하여 반응물 층에서 발생한 화학 반응 속도 또는 정도의 측정치를 수득할 수 있다.
센서의 또 다른 양태에서, 반응물은 전기 저항성 기판 위에 위치하고 있는 카운터 전극 위에 위치한다. 이러한 양태에서, 카운터 전극의 구성 재료는 전극에 위치하는 반응물의 성분들과의 반응에 불활성이다.
위에서 기재한 전기화학적 측정치를 수득하는 방법은 전기화학적 면역측정 시스템을 포함하는 적합한 전기화학적 시스템에 적용될 수 있다. 통상적으로 적용되는 방법의 예는 비면역측정 전기화학적 시스템이기는 하지만 PQQ(pyrroloquinoline quinone) 의존성 글루코스 디하이드로게나제(GDHpqq)와 산화환원 매개체를 사용하여 전혈 속의 글루코스를 측정하는 것이다. 당해 반응에서, 혈액 속의 글루코스는 GDHpqq와 반응하여 글루콘산을 형성시킨다. 당해 방법에서, 효소 속의 PQQ는 환원된다. 페리시안화칼륨과 같은 매개체는 효소 속의 PQQ를 산화시켜 페로시안염을 형성시킨다. 산화된 형태의 효소는 추가의 글루코스와 반응할 수 있다. 이러한 반응에 대한 순수 효과는 반응된 각각의 글루코스 분자에 대해 두 개의 페로시안염 분자를 생성시키는 것이다. 페로시안염은 전기활성 종이고, 따라서 전극에서 산화되어 전류를 생성시킬 수 있다. 당해 반응용으로 적합한 기타 효소는 글루코스 옥시다제(GOD) 또는 NAD 의존성 글루코스 디하이드로게나제이다. 다른 반응용으로 락테이트 디하이드로게나제 및 알콜 디하이드로게나제가 사용될 수 있다. 다른 적합한 산화환원 매개체는 페로시늄, 비피리딘과의 오스뮴 착체 및 벤조페논을 포함한다.
전혈 속의 글루코스와 효소와의 반응은 느릴 수 있는데, 완료되는 데 수 분이 걸린다. 또한, 혈액 샘플의 해마토크릿(haematocrit)이 높을수록 반응은 느리다. 혈액의 해마토크릿은 전혈 샘플 속의 적혈구의 체적 분율이다. 예를 들면, 50mg/ml GDHpqq, 0.9M 페리시안화칼륨 및 50mM pH 6.5의 완충액을 함유하는 용액을 카운터 전극 위에 위치시키고 물을 제거하여 건조된 반응물 층을 생성시킨다. 당해 층에서, GDHpqq는 카운터 전극 위에 효과적으로 부동화시키기에 충분히 큰 반면, 페리시아나이드는 전기화학적 셀 속에서 액체 전체에 걸쳐 보다 균질하게 혼합될 수 있다. 혈액 샘플을 셀에 도입시키고 전위 +300mV를 작동 전극과 카운터 전극에 즉시 가한다. 전위 +300mV가 페로시안염을 산화시키는 데 가장 바람직하지만, 전위는 바람직하게는 +40mV 내지 +600mV, 바람직하게는 +50mV 내지 +500mV, 보다 바람직하게는 +200mV 내지 +400mV이다. 셀에서, 작동 전극은 폴리에스테르 기판 위에 스퍼터링된 금으로 이루어진 층으로 구성되고 카운터 전극은 폴리에스테르 기판 위에 스퍼터링된 팔라듐으로 이루어진 층으로 구성된다.
전류 자취는 상이한 해마토크릿의 혈액 샘플에 대해 기록하는데, 낮은 해마토크릿 혈액, 즉 혈액 속의 해마토크릿 20%, 42% 및 65%에서 빠른 반응 속도를 나타낸다. 각각의 혈액 샘플 속의 글루코스 농도는 대략적으로 동일하다. 즉 65% 해마토크릿 샘플에 대해서는 5.4mM이고 42% 해마토크릿 샘플에 대해서는 5.5mM이고 20% 해마토크릿 샘플에 대해서는 6.0mM이다.
측정된 전류는 대략적으로 다음 수학식으로 제공된다.
i = -FADC/L
위의 수학식에서,
i는 전류이고,
F는 패러데이 상수(96486.7C/mole)이고,
A는 전극 면적이고,
D는 샘플 속의 페로시안염의 확산 계수이고,
C는 반응 부위에서의 페로시안염의 농도이고,
L은 반응 부위와 전극 사이의 거리이다.
따라서, 시간에 따른 C의 변화 속도에 의해 제공되는 반응 속도는 수학식 dC/dt = -(L/FAD)di/dt와 같다.
위에서 논의한 반응에 있어서, 20%, 42% 및 65%의 해마토크릿 샘플에 대해 6 내지 8초 동안 평균 di/dt는 각각 3.82, 2.14 및 1.32microamp/sec이다. 이들 샘플들에 대한 페로시안염의 확산계수는 20%, 42% 및 65% 해마토크릿 샘플 각각에 대해 2.0 ×10-6, 1.7 ×10-6 및 1.4 ×10-6㎠/sec이다. 전극 면적은 0.1238㎠이고 L은 125㎛이다. 이들 값은 20%, 42% 및 65% 해마토크릿 샘플 각각에 대해 2.0, 1.3 및 0.99mM/sec의 반응 속도를 수득한다.
위에서 기재한 바와 같은 혈액 속의 글루코스의 반응을 측정하는 방법은 적 합하게 변형시켜 당해 기술분야의 숙련가들에 의해 인정되는 면역측정 시스템, 예를 들면, 항원 측정법을 포함하는 기타 전기화학 시스템에 적용시킬 수 있다.
위의 설명은 본 발명의 몇가지 방법 및 재료를 기재하고 있다. 본 발명은 제조방법 및 장치에 있어서의 변경 뿐만 아니라 방법 및 재료에 있어서의 변형도 가능하다. 이러한 변형은 본 명세서에서 기재한 본 발명의 기술내용 또는 실시를 고려함으로써 당해 기술분야의 숙련가들에게는 명백해질 것이다. 결과적으로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 양태에 한정되는 것이 아니라 첨부된 청구의 범위에서 실시되는 본 발명의 진정한 범위 및 요지에서 나타나는 모든 변형 및 변경을 포함하고자 한다.
도 1은 전기화학적 셀을 포함하는 면역센서의 상부도(크기는 아님)를 도시한 것이다.
도 2는 도 1의 면역센서의 양태의 라인 A-A'를 따라 절단된 단면도(크기는 아님)를 도시한 것이다.

Claims (11)

  1. (a) 내부 표면(40, 48), 근위 말단부(24) 및 원위 말단부, (b) 표적 항원에 결합할 수 있는, 반응 챔버 속에 고정된 부동화 항체(44) 및 (c) 프로브를 포함하며 샘플과 혼합될 수 있는, 반응 챔버 속에 존재하는 리포터 복합체(50)를 갖는 반응 챔버 (22);
    내벽(60,62), 내부 표면, 원위 말단부(58) 및 근위 말단부를 갖는 검출 챔버(28);
    반응 챔버의 근위 말단부에 위치하는 샘플 유입구(24); 및
    반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 샘플 통로(38)를 포함하고;
    검출 챔버는 전기화학 반응을 검출하기 위한 전극(52,54)을 포함하며;
    반응 챔버가 실질적으로 충전된 상태를 추가로 검출할 수 있고;
    유체 샘플 중 표적 항원의 존재를 검출 챔버(28)에서의 전기화학 반응의 변화로 측정할 수 있는, pH를 갖는 유체 샘플 속의 표적 항원을 검출하는데 사용하기 위한 1회용 장치.
  2. 근위 말단부(23)와 원위 말단부를 갖는 제1 시트(36)의 재료를 통과하여 연장되는 것으로서, 반응 챔버의 측벽(74), 검출 챔버의 측벽(76), 및 반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 제1 샘플 통로(38)를 경계 짓는 제 1 개구부를 형성하는 단계,
    제1 층(32)을 제1 시트의 제1 면에 탑재하고 제1 개구부로 연장시켜 제1 반응 챔버 말단 벽과 제1 검출 챔버 말단 벽(60)을 경계 짓는 단계,
    제2 층(34)을 제1 시트의 제2 면에 탑재하고 제1 개구부로 연장시켜, 제1 층과 실질적으로 중첩 정합되도록 제2 반응 챔버 말단 벽과 제2 검출 챔버 말단 벽(62)을 경계 지음으로써, 시트와 층들이 다수의 외부 표면을 갖는 스트립을 형성하는 단계,
    스트립의 외부 표면을 통과하여 반응 챔버로 연장되는 것으로서, 반응 챔버 통기구(26)를 경계 짓는 제2 통로를 반응 챔버의 원위 말단부에 형성하는 단계,
    스트립의 외부 표면을 통과하여 반응 챔버로 연장되는 것으로서, 샘플 유입구(24)를 경계 짓는 제3 통로를 반응 챔버의 근위 말단부에 형성하는 단계,
    항체(44)를 반응 챔버 속에서 부동화시키는 단계 및
    프로브를 포함하는 리포터 복합체(50)를 반응 챔버 속에 위치시키는 단계를 포함하는, pH를 갖는 유체 샘플 속의 표적 항원을 검출하는 데 사용하기 위한 1회용 장치의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1 시트(36), 제1 층(32) 및 제2 층(34)이 전기 저항성 재료를 포함하고, 제1 층이 제1 전극(52)을 포함하며 이때 제1 전극은 제1 시트의 제1면을 마주 대하고, 제2 층이 제2 전극(54)을 포함하며 이때 제2 전극은 제1 시트의 제2면을 마주 대함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제2 전극이 제1 전극으로부터 500㎛ 이하의 거리에 대향 관계로 탑재되어 있음을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 제2 전극이 제1 전극으로부터 150㎛ 이하의 거리에 대향 관계로 탑재되어 있음을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 제2 전극이 제1 전극으로부터 50㎛ 내지 150㎛의 거리에 대향 관계로 탑재되어 있음을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 하나 이상의 층(32, 34, 42, 46)이 적외선, 가시광선 및 자외선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방사선의 파장에 투과성임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제2항에 있어서, 효소 기질과 매개체(64)를 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 이때 효소 기질과 매개체는 검출 챔버에 포함되고, 프로브는 효소이며, 상기 매개체는 전기화학적 반응의 발생을 나타내도록 효소와 전극 사이의 반응을 매개할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  9. 근위 말단부(23)와 원위 말단부를 갖는 전기 저항성 재료의 제1 시트(36)를 통해 연장되는 제1 개구부를 형성하고, 이때 제1 개구부는 제1 개구부 반응 챔버 부분과 제1 개구부 검출 챔버 부분을 갖고, 반응 챔버 측벽(74), 검출 챔버 측벽(76) 및 반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 샘플 통로(38)의 제1 부분을 경계 짓는 단계,
    근위 말단부와 원위 말단부를 갖는 전기 저항성 재료의 제2 시트(32)를 통해 연장되는 제2 개구부를 형성하고, 이때 제2 개구부는 반응 챔버 측벽(40)의 제2 부분을 경계 짓는 단계,
    근위 말단부와 원위 말단부를 갖는 전기 저항성 재료의 제3 시트(34)를 통해 연장되는 제3 개구부를 형성하고, 이때 제3 개구부는 반응 챔버 측벽(48)의 제3 부분을 경계 짓는 단계,
    제2 시트(32)의 제1 면을 제1 시트(36)의 제1 면(70)에 탑재하고, 이때 제2 시트는 제1 개구부 검출 챔버 부분 위로 연장되어 제1 검출 챔버 말단 벽(60)을 경계 짓고, 반응 챔버 측벽의 제2 부분은 반응 챔버 측벽의 제1 부분과 실질적으로 정합되는 단계,
    제3 시트(34)의 제1 면을 제1 시트(36)의 제2 면(72)에 탑재하고, 이때 제3 시트는 제1 개구부의 검출 챔버 부분 위로 연장되어 제2 검출 챔버 말단 벽(62)을 경계 짓고, 반응 챔버 측벽의 제3 부분이 반응 챔버 측벽의 제1 부분과 실질적으로 정합되는 단계,
    제1 층(46)을 제2 시트의 제2 면(33)에 탑재하고 제2 개구부 위로 연장시켜 제1 반응 챔버 말단 벽을 경계 짓는 단계,
    제2 층(42)을 제3 시트의 제2 면(35)에 탑재하고 제3 개구부 위로 연장시켜 제1 층과 실질적으로 중첩 정합되도록 제2 반응 챔버 말단 벽을 경계 지음으로써 시트들과 층들이 다수의 외부 표면을 갖는 스트립을 형성하는 단계,
    스트립의 외부를 통해 반응 챔버로 연장되는 제2 통로를 반응 챔버의 원위 말단부에 형성하고, 이때 제2 통로는 반응 챔버 통기구(26)를 경계 짓는 단계,
    스트립의 외부를 통해 반응 챔버로 연장되는 제3 통로를 반응 챔버의 근위 말단부에 형성하고, 이때 제3 통로는 샘플 유입구(24)를 경계 짓는 단계,
    항체(44)를 반응 챔버 속에 부동화시키는 단계 및
    프로브를 포함하는 리포터 복합체(50)를 반응 챔버 속에 위치시키는 단계를 포함하는, pH를 갖는 유체 샘플 속의 표적 항원을 검출하는 데 사용하기 위한 1회용 장치의 제조방법.
  10. 리포터 복합체(50)가 부동화 항체에 결합하기 위해 표적 항원과 경쟁할 수 있는 제2 항원을 추가로 포함하는 제1항의 장치를 제공하는 단계,
    유체 샘플을 샘플 유입구(24)와 접촉시키는 단계,
    샘플이 샘플 유입구로부터 반응 챔버로 유동하게 함으로써 반응 챔버(22)를 유체 샘플로 실질적으로 충전시키는 단계,
    실질적으로 모든 리포터 복합체가 샘플 중의 항원의 부재하에 부동화 항체(44)에 결합하는 데 충분한 소정의 시간을 경과시키는 단계,
    샘플이 반응 챔버로부터 샘플 통로(38)를 통해 검출 챔버(28)로 유동하게 함 으로써 검출 챔버를 유체 샘플로 실질적으로 충전시키는 단계 및
    검출 챔버 속에서 항원-프로브 복합체의 존재 또는 부재를 검출하고, 이때 항원-프로브 복합체의 존재 또는 부재는 샘플 중의 항원의 존재 또는 부재를 나타내는 단계를 포함하는, 유체 샘플 중의 표적 항원의 전기화학적 검출을 수행하는 방법.
  11. 전기 저항성 재료의 제1 시트(36)를 통해 연장되는 제1 개구부를 형성하고, 이때 제1 개구부는 검출 챔버 부분을 갖고 검출 챔버 측벽(76)을 경계 지으며, 검출 챔버는 근위 말단부와 원위 말단부(58)를 갖는 단계,
    제1 층(32)을 제1 시트(36)의 제1 면(70)에 탑재하고 개구부로 연장시켜 제1 검출 챔버 말단 벽(60)을 경계 짓는 단계,
    제2 층(34)을 제1 시트(36)의 제2 면(72)에 탑재하고 개구부로 연장시켜 제1 층과 실질적으로 중첩 정합되도록 제2 검출 챔버 말단 벽(62)을 경계 지음으로써 시트와 층들이 스트립을 형성하도록 하는 단계,
    근위 말단부와 원위 말단부를 갖는 스트립을 통해 연장되는 제2 개구부를 형성하고, 이때 제2 개구부는 근위 말단부(23)와 원위 말단부를 갖는 반응 챔버 부분을 갖고 반응 챔버 측벽(74) 및 반응 챔버의 원위 말단부와 검출 챔버의 근위 말단부 사이의 샘플 통로(38)를 경계 짓는 단계,
    제3 층(46)의 제1 면을 스트립(33)의 제1 면에 탑재하고, 이때 제3 층은 제2 개구부의 반응 챔버 부분 위로 연장되어 제1 반응 챔버 말단 벽을 경계 짓는 단계,
    제4 층(42)의 제1면을 스트립(35)의 제2 면에 탑재하고, 이때 제4 층은 제2 개구부의 반응 챔버 부분 위로 연장되어 제1 반응 챔버 말단 벽과 실질적으로 정합되도록 제2 반응 챔버 말단 벽을 경계 짓는 단계,
    장치의 표면을 통해 반응 챔버로 연장되는 제3 개구부를 반응 챔버의 원위 말단부에 형성하고, 이때 제3 개구부는 반응 챔버 통기구(26)를 경계 짓는 단계,
    장치의 표면을 통해 반응 챔버(22)로 연장되는 제4 개구부를 반응 챔버의 근위 말단부(23)에 형성하고, 이때 제4 개구부는 샘플 유입구(24)를 경계 짓는 단계,
    항체(44)를 반응 챔버(22) 속에 부동화시키는 단계 및
    프로브를 포함하는 리포터 복합체(50)를 반응 챔버 속에 위치시키는 단계를 포함하는, 다수의 외부 표면을 갖는, pH를 갖는 유체 샘플 속의 표적 항원을 검출하는 데 사용하기 위한 1회용 장치의 제조방법.
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