CN1441902A - 用于测定化学反应速度的电化学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对能产生一种电活性反应产物的化学反应进程的测定,然后在电极上通过电流测定或库仑测定检测所述反应产物。该方法可用于需要跟踪一种化学反应进程的场合,特别是用于传感器用途,其中,可以利用一种分析物的反应进程测定该分析物的浓度。在这种用途中的传感器,可以包括安装在一种电绝缘基质(1)上的一个工作电极(2)和一个反电极(3),并且还可以包括在它上面安装有一层化学反应剂(4)的第二种基质(5)。
Description
发明领域
本发明涉及对一种能产生电活性反应产物的化学反应进程的测定,然后在电极上通过电流测定或库仑测定检测所述反应产物。该方法可用于需要跟踪一种化学反应进程的用途,特别是用于传感器用途,其中,可以利用一种分析物的反应进程测定该分析物的浓度。
发明背景
相关技术的说明
在电流测定电化学中,可以将电极上的电流用作在工作电极上发生电化学反应的电活性物质浓度的指标。在库仑测定中,随着时间的发展所述电极上的电流会整合成通过的电荷的总量,由此产生在工作电极上起反应的电活性材料量的指标。所述电极上的电流(或任何时间通过的电荷)取决于所述电活性物质向所述工作电极转移的速度。当在所述电极附近存在较大浓度的电活性物质,并且对所述电极施加足以在电极/溶液界面上使所述电活性物质发生电化学反应的电位时,最初会产生一个较大的电流,该电流会随着时间推移而减弱。对于绝缘的电极来说,施加在所述电极上的电位足以使所述电活性物质在达到所述电极之后马上有效发生反应,并且,电活性物质向所述电极的转移是通过扩散控制的。所述电流遵循在本领域中被称为Cottrel公式的曲线。根据该公式,所述电流与时间的平方根成反比例地改变。由此产生一种随着时间推移而衰减的电流,因为在所述电极上发生反应的电活性物质在电极附近被消耗,并且随着时间发展,电活性物质必须从越来越远的地方转移到所述电极。
如果除了在所述电极上发生的所述电活性物质的电化学反应之外,所述电活性物质正在通过一种化学反应在所述工作电极附近产生的话,所述电极上电流的形式就会变得复杂。所述电极反应倾向于降低靠近工作电极的电活性物质的浓度,而所述化学反应倾向于提高所述电活性物质在该部位的浓度。因此,这两种过程的时间依赖型行为搅和在一起之后,要通过所述电极上的电流(或通过的电荷)测定所述化学反应动力学是困难的。
由于这种原因,在已经公开的文献中,化学反应的速度通常是不能通过电化学方法测定的,除非在特定场合使用特殊设备。所述设备的一个例子是本领域已知的旋转环/片电极。这种装置仅适用于较快的反应动力学,并且需要以已知的受控制的速度旋转,具有业已充分鉴定的液体流体动力学。
发明概述
本发明所提供的方法,可以使用一种简单的电化学方法和装置获取化学反应速度信息。
在第一方面,提供了一种用于测定一种液体样品的成分与一种试剂之间的能产生一种电活性物质的化学反应速度的方法,该方法包括提供一个电化学电池,该电池具有一个工作电极、一个反电极、以及至少一个壁;大体上将所述试剂固定在所述电化学电池上的距离所述工作电极很小距离的部位,其中,所述距离使得所述电活性物质从所述部位向工作电极的转移是通过扩散控制的;将所述液体样品放入所述电化学电池中,使得所述液体样品与所述试剂、工作电极和反电极接触;让所述成分与所述试剂起反应,以便产生所述电活性物质;在所述工作电极和所述反电极之间施加一个电位,其中,所述电位足以使所述电活性物质在所述工作电极上发生电化学反应;测定通过所述工作电极上的电化学反应所产生的电流,以便获得所述化学反应速度的指数。
在该实施方案的一个方面,所述工作电极和反电极的间隔足够大,以便在测定电流时在所述反电极上发生的电化学反应的产物不会达到所述工作电极。所述工作电极和所述反电极的间隔距离可以大于大约500微米;大约500微米-大约5毫米;或大约1毫米-大约2毫米。所述工作电极和反电极可以位于相同平面上。
在本实施方案的另一方面,所述部位与所述工作电极的间隔距离最少为大约10微米-大约5毫米;大约50微米-大约500微米;或大约100微米-大约200微米。
在本实施方案的另一方面,所述反电极能够起着组合的反电极/参考电极的作用。所述电化学电池还可以包括一个参考电极。
在本实施方案的另一方面,所述工作电极起着阳极的作用,并且可以包括铂、钯、碳、与一种或多种惰性粘接剂组合的碳、铱、氧化铟、氧化锡、与氧化锡组合的铟、及其混合物。
在本实施方案的另一方面,所述工作电极起着阴极的作用,并且可以包括铂、钯、碳、与一种或多种惰性粘接剂组合的碳、铱、氧化铟、氧化锡、与氧化锡组合的铟、钢、不锈钢、铜、镍、银、铬、及其混合物。
在本实施方案的另一方面,所述反电极包括铂、钯、碳、与惰性粘接剂组合的碳、铱、氧化铟、氧化锡、与氧化锡组合的铟、钢、不锈钢、铜、镍、铬、银及其混合物。所述反电极还可以包括用基本上不溶性的银盐包衣的银,如氯化银、溴化银、碘化银、氰亚铁酸银、氰铁酸银。
在本实施方案的另一方面,所述部位位于所述反电极上或位于其壁上。所述部位和工作电极可位于相同平面上,或位于朝向并且大体上平行于工作电极的平面上。
在本实施方案的另一方面,所述试剂包含在与所述电化学电池表面结合的聚合物基质中;所述基质是通过化学方式连接在所述电化学电池表面上的;通过物理方式连接在所述电化学电池表面上的;或者干燥在所述电化学电池表面上,并且在所述液体样品中具有足够低的迁移率,以便在测定电流时所述试剂不会明显迁移。
在本实施方案的另一方面,所述方法还包括一种氧化还原介体。该氧化还原介体可以包括二茂亚铁(ferrocinium)、锇与二吡啶、二苯酮和氰铁酸盐的复合物。
在本实施方案的另一方面,所述样品可以包括全血。所述成分可以包括葡萄糖。所述试剂可以包括酶,如PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶和醇脱氢酶。
在本实施方案的另一方面,所述电位优选为+50至+500mV,更优选大约+300mV。
在第二种实施方案中,提供了一种用于测定全血中葡萄糖和PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶之间的化学反应速度的方法,包括提供一种电化学电池,该电池具有一个工作电极、一个反电极、至少一个壁、容纳在所述电化学电池中的包括氰铁酸盐在内的一种氧化还原介体,以及包括PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶在内的试剂,所述试剂被基本上固定在所述电化学电池上的距离所述工作电极最小距离的部位上;将所述全血样品放入所述电化学电池中,以便该样品接触所述试剂,所述氧化还原介体,所述工作电极,和所述反电极;让所述葡萄糖与PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶起反应,以便产生还原的PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶,还原的PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶又会与所述氰铁酸盐氧化还原介体起反应,以便形成氰亚铁酸盐;在所述工作电极和反电极之间施加一个电位,其中,所述电位足以使所述氰亚铁酸盐在工作电极上发生电化学反应;并且测定通过所述工作电极上氰亚铁酸盐的电化学反应所产生的电流,其中,所述测定结果是葡萄糖和PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶之间的化学反应速度的指标。
附图说明
图1表示一种电化学电池,其中,所述试剂位于该电池朝向工作电极的壁上。
图2表示一种电化学电池,其中,所述试剂位于反电极上。
图3表示用于包括葡萄糖、PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶和氰铁酸钾氧化还原介体在内的反应系统的三种全血样品的电流随时间的变化。以上三种血液样品含有分别为20%、42%和65%的血细胞比容水平,其中,血细胞比容是红血细胞在样品中的体积百分比。
优选实施方案
以下说明和例子详细说明了本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解的是,在本发明的范围内包括本发明的多种改变和改进。因此,对优选实施方案的说明不应当被视为对本发明范围的限定。
根据本发明,可以用一种电化学电池获得有关能产生至少一种电活性产物的化学反应产物速度的信息,这一目的是通过确保所述化学反应位于远离使所述电活性产物与所述发生电化学反应的电极的部位而实现的。
用于获得流体样品的电化学测定结果的方法和装置进一步披露于以下文献中:申请日为2000年7月14日的待批美国专利申请号09/615691,题为“抗氧化剂传感器”,申请日为2000年7月14日的待批美国专利申请号09/616512,题为“血红蛋白传感器”,申请日为2000年7月14日的待批美国专利申请号09/616433,题为“免疫传感器”,以上每一份专利申请以其全文形式收作本文参考。
所述化学反应的部位距离所述电极足够远,以便所述电活性物质从所述化学反应部位向所述电极的质量转移,在任何时间都能有效控制所述电极上的电流。这种设计能确保在所述化学反应部位和电极之间存在基本上为线性的电活性物质的浓度梯度。通过发生在所述电极上的电化学反应将所述电极上的电活性物质的浓度有效保持为0。因此,该浓度梯度大小随时间的变化,基本上仅仅是由所述化学反应部位的所述电活性物质浓度随着时间推移的变化和所述电活性反应产物在液体介体中的扩散系数决定的。由于所述电极上的电流与所述电极上电活性物质的浓度梯度成正比,该电极随着时间推移的变化能体现发生在所述远处部位的化学反应随着时间推移的变化。这样就可以将在所述电极上测定的电流(或通过的电荷,如果所述电流是整合的话)可以被用作所发生的化学反应速度和程度的方便的指标。
用于确保所述化学反应远离所述工作电极的合适方法的一个例子是将一种或多种反应成分固定在远离所述电极的固体表面上。所述反应成分的固定可以采用将这些成分掺入聚合物基质中并且干燥,或以其他方式连接在所述固定表面上。所述反应成分还可以通过化学或物理结合直接连接所述固体表面上。另外,可以将一种或多种反应成分简单地干燥在所述固体表面上,不采用特殊的固定措施。在这种情况下,一种或多种反应成分在填充所述电化学电池的液体基质中的迁移率足够低,以便利用在能够有效监测电化学电流以便完成必要的测定的时间内,它不会从它所干燥的位置上发生明显的迁移。在这里,明显的迁移表示所述化学反应所需要的移动最缓慢的成分足够接近所述工作电极,以便Cottrell型消耗动力学开始在所述电极上实施电流的时间进程。
在优选实施方案中,所述化学反应部位和工作电极之间的间隔距离以小于大约1厘米为宜,优选小于5毫米,更优选为5、10、50、100、200、500微米-5毫米,更优选为5、10、50、100、200-500微米,最优选为5、10、50、100-200微米。
除了所述工作电极之外,提供至少一个与所述液体样品接触的反电极,以便完成所述电化学电路。所述反电极可以选择性地起着组合的反电极/参考电极的作用,或者提供一个独立的参考电极。在一种优选实施方案中,所述工作电极和反电极之间的间隔距离以大于大约300微米为宜,优选大于大约500微米,更优选大约500微米-10毫米,更优选大约500微米-1、2、5毫米,最优选1-2、5、10毫米。
所述工作电极优选是用这样的材料制成的:在使用期间它不会与所接触到的任何成分发生能干扰该电极电流反应程度的化学反应。如果所述工作电极被用作阳极的话,合适材料的例子是铂、钯、碳、与惰性粘接剂结合的碳、铱、氧化铟、氧化锡、氧化铟和氧化锡的混合物。如果所述工作电极被用作阴极的话,除了上面所列举的材料之外,其他合适材料有钢、不锈钢、铜、镍、银和铬。
适合用作反电极的材料的例子有铂、钯、碳、与惰性粘接剂结合的碳、铱、氧化铟、氧化锡、氧化铟和氧化锡的混合物、钢、不锈钢、铜、镍、铬、银和用基本上为不溶性的银盐包衣的银,如氯化银、溴化银、碘化银、氰亚铁酸银、氰铁酸银。
化学反应的部位可以位于远离所述工作电极的所述反电极上的裸露的壁上。所述化学反应的部位可以在与工作电极相同的平面上,或者更优选位于朝向并且基本上平行于所述工作电极的平面上。
图1表示适用于一种实施方案的装置。在图1中,电极2和反电极3安装在一种电绝缘基质1上。在第二种基质5上安装有一层化学反应剂4,其中,至少一种化学反应剂基本上被固定在基质5上。在使用时,在壁1和5之间的空间中填充含有能够与试剂4起反应以便产生至少一种电活性物质的物质的液体。所述化学反应产物向工作电极2扩散,在这里,所述电活性物质发生电化学反应,以便产生电流。然后可以将在特定时间的电流或通过的电荷的大小或电流或通过的电荷随时间的变化用于获得发生在所述反应剂层上的化学反应的速度或程度的指标。
图2表示另一种实施方案。图2中部件的编号相应于图1中的部件。在图2中,将反应剂4安装在反电极3上,反电极3安装在电阻基质5上。在该实施方案中,制造反电极3的材料是惰性的,不会与安装在电极3上的反应剂4的任何成分发生反应。
适用于一种优选实施方案的化合物和反应的例子是使用酶PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(GDHpqq)和氧化还原介体测定全血中的葡萄糖。在该反应中,血液中的葡萄糖与GDHpqq起反应,产生葡萄糖酸。在该过程中,所述酶中的PQQ被还原。然后诸如氰铁酸钾的介体氧化所述酶中的PQQ,并形成氰亚铁酸盐。然后所述氧化形式的酶能够与其他葡萄糖起反应。该反应的净结果是使发生反应的每一个葡萄糖分子产生两个成氰亚铁酸盐分子。氰亚铁酸盐是一种电活性物质,因此能够在电极上被氧化,产生电流。适合该反应的其他酶是葡萄糖氧化酶(GOD)或NAD依赖型葡萄糖脱氢酶。对其他反应来说,可以使用乳酸脱氢酶和醇脱氢酶。其他合适的氧化还原介体包括二茂亚铁锇与二吡啶和二苯酮的复合物。
全血中葡萄糖与所述酶的反应可能是缓慢的,需要几分钟时间才能完成。另外,所述样品的血细胞比容越高,反应就越慢。血液的血细胞比容是红细胞在全血样品中所占的体积比例。在该例子中,构建了如图2所示的电化学电池。将含有50毫克/毫升GDHpqq、0.9M氰铁酸钾和50mM缓冲剂,pH6.5的溶液沉积在所述反电极上,并且除去水分,留下的干燥的反应剂层。在该层中,GDHpqq的量大到足以有效固定在反电极上,而所述氰铁酸盐能够更均匀地混合在所述电化学电池的液体中。将所述血液样品导入所述电池,并且马上在工作电极和反电极之间施加+300mV的电位。尽管对于氧化氰亚铁酸盐来说+300mV的电位是最优选的,但所述电位以在+40至+600mV为宜,优选+50至+500mV,优选+100至+400mV。在所述电池上,工作电极由溅射在一种聚酯基质上的一层金组成,而反电极由溅射在一种聚酯基质上的一层钯组成。
记录具有不同血细胞比容的血液样品的电流量,发现在较低血细胞比容的血液中的反应速度较快,如图3所示。在每一条线末端的数字是所使用的血液样品的血细胞比容百分比,即分别为20%、42%和65%。每一种血液样品中的葡萄糖含量大体上相同,即65%血细胞比容样品的葡萄糖含量为5.4mM,42%血细胞比容样品的葡萄糖含量为5.5mM,而20%血细胞比容样品的葡萄糖含量为6.0mM。
图3所示的电流大体上可以用以下公式表示:
i=-FADC/L
其中,i是电流,F是法拉第常数(96486.7C/mol),A是电极面积,D是所述氰亚铁酸盐在样品中的扩散系数,C是氰亚铁酸盐在反应部位的浓度,而L是反应部位和电极之间的距离。因此,通过C随时间改变的速度表示的反应速度可以用以下公式表示:
dC/dt=-(L/FAD)di/dt
对于图3所示的反应来说,在6-8秒之间,20%、42%和65%血细胞容样品的平均di/dt分别为3.82、2.14和1.32毫安/秒。对于20%、42%和65%血细胞比容的样品来说,氰亚铁酸盐的扩散系数分别为2.0×10-6、1.7×10-6和1.4×10-6平方厘米/秒。电极面积为0.1238平方厘米,而L为125微米。对于20%、42%和65%血细胞比容的样品来说,以上值所得到的反应速度分别为2.0、1.3和0.99mM/秒。
上述方法可用于任何合适的电化学系统,例如,可以用所述方法测定流体样品中的氧化剂或抗氧化剂。所述方法可应用于以常见浓度存在于液体样品中的任何氧化剂或抗氧化剂。例如,可以分析的抗氧化剂包括二氧化硫或抗坏血酸。例如,可以分析的氧化剂包括氯、溴、碘、过氧化物、次氯酸盐和臭氧。如果能够制备含水形式的话,还可以根据水不溶性氧化剂或抗氧化剂,例如,通过使用洗涤剂制备水不溶性氧化还原反应分析物的乳液。所述方法还可用于抗体/抗原反应或用于血红蛋白分析。
以上说明披露了本发明的若干种方法和材料。可以对本发明的所述方法和材料进行改进,并且改变生产方法和设备。本领域技术人员在阅读本说明书或本文所披露的本发明的实践之后能够理解所述改进。因此,并非要将本发明局限于本文所披露的具体实施方案,而是要包括根据体现在所附权利要求书中的本发明的实际范围和构思作出的所有改进和改变。
Claims (31)
1.一种用于测定一种液体样品的成分与一种试剂之间的能产生一种电活性物质的化学反应速度的方法,该方法包括:
提供一个电化学电池,该电池具有一个工作电极、一个反电极、以及至少一个壁;
大体上将所述试剂固定在所述电化学电池上的距离所述工作电极很小距离的部位,其中,所述距离使得所述电活性物质从所述部位向工作电极的转移是通过扩散控制的;
将所述液体样品放入所述电化学电池中,使得所述液体样品与所述试剂、工作电极和反电极接触;
让所述成分与所述试剂起反应,以便产生所述电活性物质;
在所述工作电极和所述反电极之间施加一个电位,其中,所述电位足以使所述电活性物质在所述工作电极上发生电化学反应;和
测定通过所述工作电极上的电化学反应所产生的电流,以便获得所述化学反应速度的指数。
2.如权利要求1的方法,其中,所述工作电极和反电极的间隔足够大,以便在测定电流时在所述反电极上发生的电化学反应的产物不会达到所述工作电极。
3.如权利要求2的方法,其中,所述工作电极和所述反电极的间隔距离大于大约500微米。
4.如权利要求2的方法,其中,所述工作电极和所述反电极的间隔距离为大约500微米-大约5毫米。
5.如权利要求2的方法,其中,所述工作电极和所述反电极的间隔距离为大约1毫米-大约2毫米。
6.如权利要求2的方法,其中,所述工作电极和反电极可以位于相同平面上。
7.如权利要求1的方法,其中,所述部位与所述工作电极的间隔距离最少为大约10微米-大约5毫米。
8.如权利要求7的方法,其中,所述部位与所述工作电极的间隔距离最少为大约50微米-大约500微米。
9.如权利要求7的方法,其中,所述部位与所述工作电极的间隔距离最少为大约100微米-大约200微米。
10.如权利要求1的方法,其中,所述反电极能够起着组合的反电极/参考电极的作用。
11.如权利要求1的方法,其中,所述电化学电池还包括一个参考电极。
12.如权利要求1的方法,其中,所述工作电极起着阳极的作用。
13.如权利要求12的方法,其中,所述工作电极包括选自铂、钯、碳、与一种或多种惰性粘接剂组合的碳、铱、氧化铟、氧化锡、与氧化锡组合的铟、及其混合物的材料。
14.如权利要求1的方法,其中,所述工作电极起着阴极的作用。
15.如权利要求1的方法,其中,所述反电极包括用基本上不溶性的银盐包衣的银。
16.如权利要求15的方法,其中,所述银盐选自氯化银、溴化银、碘化银、氰亚铁酸银和氰铁酸银。
17.如权利要求1的方法,其中,所述部位位于所述反电极上。
18.如权利要求1的方法,其中,所述部位位于壁上。
19.如权利要求1的方法,其中,所述部位和工作电极位于相同平面上。
20.如权利要求1的方法,其中,所述部位位于朝向并且大体上平行于工作电极的平面上。
21.如权利要求1的方法,其中,所述试剂包含在与所述电化学电池表面结合的聚合物基质中。
22.如权利要求1的方法,其中,所述试剂是通过化学方式或物理方式连接在所述电化学电池表面上的。
23.如权利要求1的方法,其中,所述试剂是干燥在所述电化学电池表面上,并且在所述液体样品中具有足够低的迁移率,以便在测定电流时所述试剂不会明显迁移。
24.如权利要求1的方法,还包括一种氧化还原介体。
25.如权利要求1的方法,其中,所述氧化还原介体选自二茂亚铁锇与二吡啶、二苯酮和氰铁酸盐的复合物。
26.如权利要求1的方法,其中,所述样品包括全血。
27.如权利要求1的方法,其中,所述成分包括葡萄糖。
28.如权利要求1的方法,其中,所述试剂包括选自PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脱氢酶和醇脱氢酶的酶。
29.如权利要求1的方法,其中,所述电位为大约+50至+500mV。
30.如权利要求1的方法,其中,所述电位为大约+300mV。
31.一种用于测定全血中葡萄糖和PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶之间的化学反应速度的方法,包括:
提供一种电化学电池,该电池具有一个工作电极、一个反电极、至少一个壁、容纳在所述电化学电池中的包括氰铁酸盐的一种氧化还原介体,以及包括PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶的试剂,所述试剂被基本上固定在所述电化学电池上距离所述工作电极最小距离的部位上;
将所述全血样品放入所述电化学电池中,以便该样品接触所述试剂,所述氧化还原介体,所述工作电极,和所述反电极;
让所述葡萄糖与PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶起反应,以便产生还原的PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶,还原的PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶又会与所述氰铁酸盐氧化还原介体起反应,以便形成氰亚铁酸盐;
在所述工作电极和反电极之间施加一个电位,其中,所述电位足以使所述氰亚铁酸盐在工作电极上发生电化学反应;和
测定通过所述工作电极上氰亚铁酸盐的电化学反应所产生的电流,其中,所述测定结果是葡萄糖和PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶之间的化学反应速度的指标。
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