CN1187145A - 利用电打孔给药和传送基因的治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种利用针阵列设备的体内电疗方法,即电打孔给药疗法。该方法利用本发明的设备将电打孔与化疗药物结合治疗肿瘤,使体内的肿瘤退化。

Description

利用电打孔给药和传送基因的治疗方法
本发明所属技术领域
本发明涉及治疗人和其它动物中的疾病，具体地说，涉及一种改进的方法和设备，该方法和设备在患者体内施加受控电场借助电打孔将基因和药物化合物送入患者的活细胞。
本发明的技术背景
在70年代，人们发现电场能够在细胞上打孔且不给细胞带来永久损伤。这项发现使大分子注入细胞质成为可能。人们知道可以通过所谓的电打孔方法将基因和其它分子(如药物化合物)并入活细胞。将基因或其它分子与活细胞在缓冲介质中混合并且施加强电场。细胞膜瞬时变成多孔的，于是基因或分子进入细胞。在那里它们能够改善细胞的基因组。
最近已经有人提出将电打孔作为治疗某些疾病(如癌)的一种途径。例如，在用化疗治疗某些类型的癌症时，必要的是使用足够剂量的药物杀死癌细胞且被杀死的正常细胞的数量又是可以接受的。如果化疗药物能够直接注入癌细胞内部，那么这个目标将能实现。某些最好的抗癌药(如平阳酶素)通常不能穿越某些癌细胞的细胞壁。但是，电打孔使平阳酶素进入细胞成为可能。
电打孔的医疗应用之一是用于治疗癌症。实验室规模的哺乳动物实验已经完成，并且有下述报告：Okino，M.，E.Kensuke，1990，“The effects of a Single High Voltage Electrical Stimulation withan Anticancer Drug on in vivo Growing Malignant Tumors”，Jan.Journal of Surgery.20：197-204、Mir.L.M.，S.Orlowski，J.Belehradek Jr.，以及C.Paoletti，1991，“ElectrochemotherapyPotentiation of Antitumor Effect of Blomycin by Local Electric Pulses“，Eur.J.Cancer，27：68-72。临床试验已经由Mir.L.M.，M.Belehradek，C.Domenge，S.Orlowski，以及B.Poddevin等人完成，并且于1991年发表报告：“Electrochemotherapy，a novel antitumortreatment：first clinical trials”，C.R.Acad.Sci.Paris，313：613-618。
这种治疗是借助直接将抗癌药物注入肿瘤并且将电场施加给一对电极之间的肿瘤完成的。必须合理地精确地调整电场强度，以使肿瘤细胞发生电打孔而且不损伤任何正常细胞(即健康细胞)，至少将损伤正常细胞(即健康细胞)的数量降到最低。对于外部的肿瘤在正常情况下这种治疗容易完成。将电极置于肿瘤的对置的两侧，使电场位于电极之间，然后测量电极之间的距离并且按照公式E＝V/d将适当的电压施加给电极(公式中E是电场强度，单位是V/cm；V是电压，单位是V；d是距离，单位是cm)。在需要处理内部肿瘤时，适当的确定电极位置和测量电极间距离就不容易了。在上述发明应用中，揭示了一种适合体内电打孔的电极系统，其中电极可以插入体腔。在相关的美国专利5,273,525中，用于电打孔注入分子和大分子的注射器是同时起电极作用的注射针。这种结构使电极在皮下的部位起作用。实际需要的是有一个电极装置，该装置具有能够插入肿瘤或接近肿瘤的电极，以致能够在该组织中产生肿瘤细胞电打孔所需的预定的电场。
研究工作业已表明大型核苷酸序列(高达630kb)能够经电打孔导入哺乳动物的细胞，并借此提供一种基因治疗方法。(参阅下述文献：Eanault等人，Gene(Amsterdam)，Vol.144(2)：p305，1994；Nucleic Acids Research，Vol.15(3)：p1311，1987；Knutson等人，Anal.Biochem.，Vol.164：p44，1987；Gibson等人，EMBO J.Vol.6(8)：p2457，1987；Dower等人，GeneticEngineering，Vol.12：p275，1990；Mozo等人，Plant MolecularBiology，Vol.16：p917，1991)
本发明概述
因此，本发明的首要目标是提供一种改进设备，该设备能够方便有效地定位，以便在组织中产生预定的电场。
本发明另一个主要目标是一种改进设备，该设备提供一种方便有效的装置，该装置适合将电极定位到组织中以便将治疗药物注入该组织并将电场施加给该组织。
依据本发明的首要方面适合将电打孔应用于患者身体某个部分的电极设备包括支撑部件；许多针状电极，该组针状电极可调地安装在所述支撑部件上，适合按照选定的的位置和间隔距离插入组织；以及一套装置，该装置包括一台信号发生器，该信号发生器能够对所述距离作出响应，将与所述电极间的距离成正比的电信号施加给电极，以便产生预定强度的电场。
本发明的另一个方面包括一些针，这些针的作用是将治疗药物注入组织并且作为电极产生适合部分组织细胞的电场。
本发明的另一方面是提供一种治疗方法，该方法利用针阵列装置处理细胞，特别是肿瘤细胞。
附图的简要说明
结合附图阅读下面的详细说明将更容易体会本发明的目标、优点和特征。现将附图简要说明如下：
图1是依据本发明的优选实施方案中针组合件的剖面图。
图2是图1所示实施方案的仰视图。
图3是本发明另一个实施方案中组合件的立体图。
图4是图3所示实施方案组装后的立体图。
图5是适合图4电极组合件的选择开关的立体图。
图6a-6b是图5中的开关选择接触位置的图解说明。
图7是本发明第三个实施方案的立体图。
图8是本发明第四个实施方案的立体图。
图9a-9d是俯视图，说明优先选择的电极形式以及使用顺序。
图10a和10b说明异种移植Panc-3的裸鼠体内的肿瘤用平阳酶素进行ECT治疗43天后的体积(图中D表示药物，E表示电打孔)。
图11图解说明在裸鼠体内Panc-3细胞瘤在用平阳酶素进行ECT治疗后的增长。
图12a和12b分别说明异种移植非小细胞肺癌(NSCLC)的裸鼠体内的肿瘤用平阳酶素进行ECT治疗20和34天后的体积(图中D表示药物，E表示电打孔)。
图13说明异种移植非小细胞肺癌(NSCLC)的裸鼠体内的肿瘤用平阳酶素进行ECT治疗34天后的体积。箭头表示在第27天给一只鼠再次进行处理(图中D表示药物，E表示电打孔)。
图14a和14b说明在分别异种移植Panc-3和NSCLC的裸鼠试样中在施加脉冲前用新制癌菌素定量给药的效果。
图14c和14d说明在异种移植Panc-3的裸鼠试样中在施加脉冲后用新制癌菌素定量给药的效果。
本发明的最佳实施例
在本文中术语“分子”包括药剂、基因、抗体或其他的蛋白。电打孔在人体治疗应用由两部分组成，包括：将抗癌药物注入肿瘤，以及将电极置于肿瘤对置的两侧并在电极之间施加电压脉冲通过电打孔将药物导入肿瘤，这种治疗方法被称为电化学疗法(ECT)。本发明设计的主要目的是为了使如Okino和Mir等人报告的ECT疗法能够在非体表肿瘤(如体内肿瘤)中得以实施。但是它也可以用于其他的治疗应用。
参照图1，该图说明了一种针组合件，该组合件是依据本发明的一个优选的实施方案设计的并且用数字10代表它。这个针组合件包括一个细长的管状支撑体12，该支撑体最好是不锈钢的空心轴。中心针座14安装在轴12的下端并且有一个中心孔16，中心针18在该孔中并可顺着该孔滑动。轴12包括针的出口槽20，通过该槽针状电极18从槽内延伸到槽外，在槽外它借助接线端子22紧固在管12的外面。
电极18的上端可以紧固到螺钉24上，以便与电路连接。管座12的下端包括螺纹26，安装了许多颗针的针环28和制动环30被安装在该螺纹上，制动环的作用是制止针环28移动位置，即将针环28锁定在某个位置。
许多针32安装在沿着针环28的外表面等间隔排列的槽34中。这样提供了一个等间隔排列的针的环形阵列，在所示的实施方案中为8个。借助带形接线端子36这些针保持在适当的位置上，带形接线端子36的两端借助螺钉螺母38紧固在一起，该带形接线端子还起着这些针的电连接作用。带形接线端子36直接将这些针固定并保持在适当的位置上。
这个电极组合件是为了在将这些针插入组织时将电能施加给活组织而设计的。中心针18作为一个电极，正极或负极，其他的针即环形排列的针32作相反的电极。当接线端子安装好并紧固时，所有这些针都保持在固定的位置上。这些针当中有一颗或多颗针可以是筒形或管形的，以便将基因、药物、或其它物质的分子注入该组织。
在操作时，应当调整中心针，使它刺入组织达到符合需要的深度。为了做到这一点，松开中心针的接线端子22，让中心针18向内或向外滑动，象在图1中所见到的那样，以使它从中心针导座14中伸出，达到符合需要的刺入距离。然后在该位置将该针夹紧。然后调整环形分布的针32，使它刺入组织达到符合需要的深度。这可以借助松开带形接线端子36并使这些针滑到符合需要的位置。可以借助移动针环28使它向轴12的末端移动或远离该末端上下移动完成辅助调整。治疗物质可以通过这些针当中的一颗或多颗针注入该组织，或者借助单独的设备注入该组织。
在所有的针都调整到适当的刺入深度之后，握紧轴12把针插入组织达到符合需要的深度。然后，将适当的脉冲发生器与电极组合件连接起来并且将适当的电压施加给电极。在施加电压之前，将适量的治疗物质，如基因或用于处理该组织的适当的化学物质或药物的分子注入组织。
这种电极组合件的改进方案可以包括一个在中心电极位置上的实心的非刺入电极(未示出)。非剌入的中心电极可以是任何适当形状的导体，例如钮扣形或平板形，它安装在轴12的末端并且与组织表面接触。应当调整环形排列的针，使它们在中心电极被支撑在组织表面上时刺入组织并达到符合需要的深度。电能从刺入的针经过组织流向表面上的中心电极。为了治疗接近表面的肿瘤可以采用这些安排，在这种场合电极的环形阵列是为包围肿瘤而设计的。中心电极的定位使得电能通过组织流向中心电极。
这种电极组合件的其它优点包括所有的针18和32都能够独立地调整，以达到符合需要的刺入深度。针环28也可以调整，使它离开轴12的末端定位，以致能够直接观察中心针和环形排列的针的插入。此外，为了包围待处理的组织区域，针环28可以具有任何尺寸和结构。
参照图3和图4，该图说明了针状电极环形阵列组合件的替代实施方案，并且通常用数字40代表。这种针组合件包括针42至52的环形阵列，这些针等间隔地安装在毂盘54中，该毂盘安装在细长的圆柱形轴56上。毂盘54最好有适当选定的直径，以便提供围绕着肿瘤或其它待处理的组织定位所需要的阵列直径。这些针当中可以有一颗或多颗针是空心针以便能够注入治疗物质的分子，后面将更全面地叙述。
电接线插座组合件包括座体58，座体有中心孔60，轴56将安装在该中心孔内，以及环形针座阵列62至72，针42至52的一端容纳在针座中。针座62至72将实现针42至52与接线端子74至84的电连接，接线端子又与电流分配器连接，下面继续介绍。
电接线器插座组合件58装配到轴56上，于是针的一端插入针座62至72，与接线端子74至84完成电连接。将安装好针阵列毂盘54和插座58的轴56安装到适合握持的手柄86上。手柄86呈长圆柱形状，适合用手握持操作。手柄86上有一个朝前的插座，该插座有朝前延伸的管状轴88，管状轴上有孔90，当轴88插入接线器部件58内的孔(未示出)时，轴56插入孔90。轴56插入孔90并且轴56上有环形槽92，借助轴颈锁定器将该槽锁定，该轴颈锁定器包括在横置孔96中偏向一侧的横置销94，并且有容纳轴颈92并将它锁定在手柄中的孔98。弹簧102安装在孔96中使横置销94偏置到锁定位置。按压横置销94的一端100，可以松开轴56，将它取出。
当手柄如图4所示装配时，可以用手握紧手柄把针插入选定的组织区。优先选择调整针42至52的距离，使这些针定位在待治疗的组织周围。如上所述，这些针42至52当中可以有一颗或多颗针是空心针，用于注入需要的治疗药物。然后，将电极接线端子74至84按优先选择的配置接到旋转开关组合件上，如图5所示，利用该旋转开关选择需要激活即需要施加电压的对置的电极对。
开关组合件通常用数字104表示，该组合件包括固定的圆柱形壳体106，在壳体中安装着转轮108，转轮上有隔开的接触片110和112，这一对接触片通过一对接线器114和116与脉冲功率发生器115相连。旋转转轮改变接触片110和112在壳体106中的位置，使它们与环形排列的与接线端子74至84连通的触点118、120、122、124、126、和128接触。
参照图6a至图6c，转轮108上有内部的接触片110和112，每个接触片可以在触点118至128中桥接两个触点，这些触点又通过接线端子74至84与脉冲源连通。内部的接触片110和112随着转轮108旋转，选择接触位置，确定与内部触点118至128当中哪些触点对连通，借此确定激活哪对对置的针状电极。这样使操作者能够依据最佳治疗方案围绕着选定的组织选择电极位置和电场方向。转轮108使操作者能够选择如何产生电场，是从各个方向包围组织还是穿越组织。
参照图7，它说明本发明另一个实施方案，在这个方案中产生电场的电极阵列平行设置并且相对位置可以调整。电极组合件以数字130表示，该组合件包括一对针状电极阵列132和134，这对阵列包括安装在绝缘的支撑零件140上的导电的针状电极136和138。针阵列132保持在固定夹具142中，允许以支撑为基准调整针136的深度。
针138安装在活动夹具146中，借助紧固螺钉148可以调整该夹具的位置。在针136和138中，每根针上都有限制刺入深度的制动环144。在设置间距的紧固螺钉148将夹具146按照选定的位置固定在支撑140上。间距传感器150感受针阵列132和134之间的距离并产生一个信号，通过电缆152将该信号传送给脉冲发生器。脉冲发生器借助电缆154和156与针状电极相连。
参照图8，它说明针座的详细结构，该针座通过各种排列方式建立不同形态的针阵列，即拉开距离的一对针，或平行的针阵列。这个实施方案包括一个底座158，该底座上有许多毗邻的平行槽160，针162和164可以按照选定的相对位置固定在该平行槽中。如图所示，这个针座可以用于安装一对极性相反的针状电极162和164。可以选择这些针的相对位置，使它们定位于选定组织的两侧。借助夹板159将针锁定在槽中。此外，该针座可以与附加针座结合使用，以便在选定组织的对置的侧面提供多重阵列。图示的针可以经接线端子166和168与适当的脉冲发生器连接。
参照图9a至图9d，这些图对本发明做了补充说明。正象清楚的图解说明那样，组合电极可以采取多个单针170和172形式，使用时首先将针插入选定的组织区，或插在选定组织区的侧面，例如插在图示的肿瘤194的两侧。然后，将针与注射管或其他的分子源连接起来，将选定的分子溶液注入组织区。这些针可以是不导电的，将一对电极176和178通过相应的针孔腔送入该组织，如图9b所示，然后将针拔出，如图9c所示。每个电极176或178备有一段绝缘导线180或182以及一个电极引出头184或186。
然后，可以用小型接线夹192和194将来自适当的功率发生器的一对导线188和190与电极引出头连接起来，在电极之间施加电压，如图9d所示。这样在组织中产生电场，并用电场在选定的组织如肿瘤等中的细胞上开孔。这种电打孔可以使选定的分子进入组织细胞，可以象希望的那样更有效地杀死该细胞或改变该细胞。这种形式的针还可以在上述的任何组合件或全部组合件中使用。
上述的各种针状电极组合件使电极能够定位在体内的肿瘤或其它组织中，或者定位在体内的肿瘤或其它组织附近。虽然本发明应用的核心是电化学疗法，但是，本发明的各种实施方案可以用于其它治疗，如某些身体器官的基因治疗。
待产生的电场性质由组织的性质、选定组织的大小和位置确定。符合需要的电场是幅度正确并且尽可能均匀的电场。电场强度过大将导致细胞溶解，电场强度过低将导致降低效力。电极可以有许多种安装和操作方式，包括但不限于在原始应用中采用的那些方式。可以按照常规用手术钳在体内操作电极。
由脉冲发生器提供的电信号波形可以是指数衰减型脉冲、方波脉冲、单极性振荡脉冲串、或双极性振荡脉冲串。电场强度可以是0.2kV/cm至20kV/cm。脉冲持续时间可以是10μsec.至100msec.。脉冲个数可以从1个至100个。当然，波形、电场强度和脉冲持续时间都还要取决于细胞的类型和需要通过电打孔进入细胞的分子类型。
包括给已知的细胞电打孔需要的电场强度在内的各种参数可以从许多相关的研究报告中获得，也可以从Genetronics有限公司(San Diego，Califonia，本申请的受让人)保存的数据库中获得。体内细胞电打孔，如电化学疗法(ECT)需要的电场在幅度上与该细胞在体外的需要的电场相似。这个幅度在100V/cm至每厘米若干千伏范围内。这已经通过发明人自己的实验以及其他人在科学出版物中报告的实验得到证实。在电化学疗法领域中首次给活体施加脉冲电场治疗肿瘤是1987年由Okino在日本报告的。
多年来，用于完成文中所述程序的脉冲发生器可以按照牌号在市场上购买。一种适用的信号发生器是ECM600型细胞电控器(ELECTRO CELL MANIPULATOR)，可以从Genetronics有限公司(San Diego，Califonia，U.S.A.)购买。ECM600型信号发生器通过电容完全放电产生脉冲，结果是指数衰减型波形。这种信号发生器产生的电信号可以用短暂的跃升时间和指数型衰减表示其特征。在该信号发生器中，电打孔脉冲持续时间可以通过在10个时间寄存器中选择一个来设定，用R1至R10标明该组时间寄存器。可以采用两种模式操作它们，高压模式(采用50微法的电容器)和低压模式(采用25微法至3,175微法的电容器)。
ECM600型信号发生器有一个控制按钮，该控制按钮允许调整给电容器充电的电压幅度，在低压模式中该电压在50V至500V之间，在高压模式中该电压在0.05kV至2.5kV之间。电信号的幅度显示在ECM600型信号发生器的显示器上。这台装置进一步包括许多在低压模式中控制脉冲持续时间的按钮开关，借助将输出和由7个供选择的附加电容器与一些电阻同时并联来控制脉冲持续时间。
ECM600型信号发生器还包括一次性自动充放电的脉冲控制按钮。按下这个按钮启动一个自动循环，该循环包括给内部电容器充电至设定电压，然后将脉冲提供给外部的电极，每个循环所需时间不足5sec.。可以连续地按压手动按钮，重复施加预定的电场。
本发明的治疗方法优先选择利用方波脉冲电打孔系统。例如，可以使用从Genetronics有限公司购买的T820型方波电打孔器(ElectroSquarePorator(T820))。
方波电打孔系统提供受控的电脉冲，该脉冲迅速地跃升到设定电压，在该电压停留至设定的时间长度(脉宽)，然后迅速跌落至零。就给植物原生质体和哺乳动物细胞系列电打孔而论，这种类型系统的转化效率优于指数衰减型系统。
T820型方波电打孔器是市场上第一个市售的能够产生高达3000V电压的方波电打孔系统。其脉宽可以在5μsec.至99msec.之间调整。方波电打孔脉冲对细胞的影响比较温和，使细胞有较高的存活能力。
T820型方波电打孔器可以在高压模式(100至3000V)和低压模式(50至500V)两种模式下发挥作用。对于低压模式脉宽大约是0.3至99msec，对于高压模式脉宽大约是5至99μsec.。T820具有提供多次脉冲的能力，脉冲次数大约在1次至99次之间。
Mir和另一些人已经将方波脉冲用于电化学疗法，这种方法允许将治疗药物注入恶性肿瘤。曾经给实验鼠注射低剂量的平阳酶素。然后，给恶性肿瘤电打孔，结果导致肿瘤减小或完全消失(参阅Mir，L.M.，Eur.J.Cancer，Vol.27(1)，p68，1991)。
Saunder已经在植物的原生质体的电打孔方面对方波脉冲和指数衰减型脉冲做了比较。与指数衰减型脉冲相比，方波电打孔产生更高的转化效率。他还报告说，采用方波脉冲在优化电打孔参数时更容易，因为在更大的电压范围内能够产生充分的转化效率(参阅Saunder的“Guide to Electroporation and Electrofusion”，pp227-247，1991)。
本发明的治疗方法包括电疗(也叫做电打孔施药疗法)，它利用本发明的装置将大分子提供给细胞或组织。如前所述，文中所用术语“大分子”或“分子”指的是药物(例如化疗制剂)、核酸(例如聚核苷酸)、包括抗体的肽和多肽。聚核苷酸包括DNA、cDNA和RNA序列。
在本发明中试图使用的药物通常是具有抗癌或溶解细胞作用的化疗药物。这类药物或制剂包括平阳酶素、新制癌菌素、苏拉明、和二氨二氯络铂。其他的化疗制剂是本领域技术人员已知的抗癌药物(实例见“The Merck Index”)。制剂的化学组成将确定与施加电脉冲相关的适当的给药时间。例如：在不受具体的理论约束的同时，据信，为了避免在电场内携带较多电荷的药物的静电相互作用，如果采用电打孔后给药，等电(离)点(isoeletric point)低的药物(例如，新制癌菌素，IEP＝3.78)可能更有效。此外，象平阳酶素这样的药物，它们有非常负的logP值(P是辛醇与水之间的分配系数)，非常大的尺寸(MW＝1400)，而且它们是亲水的，借此与脂质薄膜紧密结合，所以，它们扩散进入肿瘤细胞非常缓慢，通常在施加电脉冲之前或基本上与施加电脉冲同时给药。电打孔借助在细胞膜上打孔促进平阳酶素或其它类似的药物进入肿瘤细胞。
借助本发明的方法将分子导入细胞调整基因表达是符合需要的。术语“调整”是一种设想，即在基因表达过分表达时，压缩基因表达；在基因表达欠表达时，扩展基因表达。在细胞增生机能失调与基因表达相关的场合，可以采用在转译级干扰基因表达的核酸序列。例如，这种途径利用反义核酸(antisense nucleic acid)、核酶、或三倍体(triplex)制剂阻断特异的mRNA的转录或转译，或者借助反义核酸或三倍体制剂遮蔽mRNA，或者借助核酶剪切mRNA。
反义核酸是DNA或RNA分子，它至少与部分的特异性mRNA是互补的(见Weintraub，Scientific American，Vol.262，p40，1990)。在细胞中，反义核酸与相应的mRNA杂交，形成双链分子(double-stranded molecule)。因为细胞不转译双链的mRNA，所以，反义核酸干扰mRNA的转译。优先选择大约15个核苷酸的反义寡聚物，因为它们容易合成而且在导入目标细胞时出现的问题可能比大分子要少。使用反义方法抑制体外基因的转译在技术上是已知的(Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，Vol.172，p289，1988)。
作为三倍体策略，运用寡聚核苷酸阻止转录是已知的，因为寡聚物缠绕双螺旋的DNA，形成三股螺旋体。所以，为了识别在选定基因上的特征位(a unique site)可以设计这些三倍体化合物(Maher等人，Antisense Res.and Dev.，Vol.1(3)，p227，1991；Helene，C.，Anticaner Drug Design，Vol.6(6)，p569，1991)。
核酶是一类RNA分子，它们拥有剪切单股的RNA的能力，与DNA限制性核酸内切酶的方式类似。通过修饰给RNA编码的核苷酸序列，就可以设计能识别RNA分子中特异的核苷酸序列并剪切它的分子(Cech，J.Amer.Med.Assn.，Vol.260，p3030，1988)。这种途径的优点是，因为它们的序列特异性，所以只有具有特异序列的mRNA失去活性。
有两种基本型的核酶，四膜虫属型(Hasselhoff，Nature，Vol.334，p585，1988)和“双髻鲨”型。四膜虫属型核酶识别长度是四个碱基的序列，而双髻鲨型核酶识别长度是11至18个碱基的序列。识别的序列越长，在目标mRNA中排他地发生该序列的或然率就越大。因此，在两种类型的核酶中，优先选择用双髻鲨型核酶去除特异的mRNA的活性，并且为了较短的识别序列，优先选择18个碱基的识别序列。
本发明还提供基因疗法，用于治疗由于特异的基因或由于缺乏基因引起的细胞增生机能失调或免疫机能失调。这种疗法将借助将特异性有义或反义的多核苷酸导入机能失调的细胞达到它的治疗效果。利用重组诸如嵌合病毒(a chimeric virus)类的表达载体能够实现多核苷酸的供给，或者象实例中“裸露的”DNA那样提供多核苷酸。
诸如文中所述的可用于基因疗法的各种病毒的载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘、或优先选择的RNA病毒(如逆病毒(retrovirus))。逆病毒的载体最好是鼠型或鸟型逆病毒的衍生物。能够插入单一异体基因(a single foreign gene)逆病毒的载体包括但不限于：Moloney鼠型白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠型肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠型乳房肿瘤病毒(MuMTV)、以及劳氏肉瘤病毒(RSV)。当对象是人时，可以利用诸如长臂猿白血病病毒(GaLV)那样的载体。许多补充的逆病毒载体能够合并多种基因。所有这些载体都能转移或合并有可选择标记的基因，以致能够识别和产生转导的细胞。
治疗用的肽或多肽也可以被包括在本发明的治疗方法之内。例如，可以提供免疫调节剂和生物学反应修饰剂，以被细胞摄入。术语“生物学反应修饰剂”指的是涉及改善免疫反应的物质。免疫反应修饰剂的实例包括淋巴细胞因子之类的化合物。淋巴因子包括肿瘤坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素2和白细胞介素3、淋巴细胞毒素、巨噬细胞活化因子、迁移抑制因子、群落刺激因子、以及α干扰素、β干扰素、γ干扰素和它们的子型。
还包括多核苷酸，它为新陈代谢酶和蛋白质编码，包括给抗血管形成化合物，如因子VIII和因子IX编码。
本发明的大分子还包括抗体分子。文中所用术语“抗体”意思是完整的分子以及它们的碎片，如Fab和F(ab’)2。
按照本发明，提供多核苷酸或多肽的给药可以是多种方式的，例如，胃肠外注射、快速输液、鼻咽吸收、皮肤吸收、或口服。例如，在治疗肿瘤时，电化学疗法制剂或其它制剂可以局部给药、有计划地注射或直接注入肿瘤。举例说，在直接将药物供给肿瘤时，按“扇面”方式注射药物是有利的。术语“扇面”指的是为了使药物更好地散布到肿瘤的各个部分，注射时，改变针的方向，或者按多个方向多次注射，就象打开的折扇一样多方向给药，而不是集中在一处。与在这项技术中通常使用的药物体积相比，为了使药物适当地散布到肿瘤的各个部分，在向肿瘤给药(如注射)时，增加药物溶液的体积是符合需要的。例如在文中的实施例中，熟悉这项技术的人通常注射50μl药物溶液，但是，将药物溶液体积增加到150μl结果得到更大改进。优先选择非常缓慢地在肿瘤的周围注射药物，而不是在潮间压力非常高的肿瘤中心注射药物。
优先选择给药与电打孔处理基本同时进行。术语“基本同时进行”意思是提供分子和电打孔处理的时间适当地接近。提供分子(即治疗药物)的时间间隔是任意的，这取决于诸如肿瘤的性质、患者的状况、分子的大小、化学特性以及半衰期。
胃肠外给药的制剂包括无菌水、水性溶液和非水性的溶液、悬浮液和乳浊液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙烯醇、植物油(如橄榄油)、以及可注射的有机酯(如乙基油酸酯)。咬合整饰的载体可以用于增加皮肤的渗透性和提高抗原的吸收。适合口服给药的液体制剂形式通常可以包括包含液体制剂形式的微脂粒溶液。适当的微脂粒悬浮形式包括包含通用稀释剂(如纯水)的乳浊液、悬浮液、溶液、糖浆、以及酏剂。除稀释剂之外，这些组合物还包括辅剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂。进而可以采用血管收缩药剂，以使治疗药物在施加脉冲前保持在指定位置。
任何细胞都可以用本发明的方法处理。文中提出的实施例说明本发明方法在处理肿瘤细胞，如胰和肺中的癌细胞中的运用。其它细胞增生机能失调也可以借助本发明的电打孔方法处理。术语“细胞增生机能失调”指的是恶性的以及良性的细胞群体，该群体往往在形态上和遗传基因上不同于周围组织。恶性细胞(即肿瘤或癌)的发展是多个步骤的结果。本发明的方法在处理恶性肿瘤或各种器官系统的机能失调当中是有用的，例如，在处理胰和肺中的细胞时特别有用，也还包括心脏、肾、肌肉、乳腺、结肠、前列腺、胸腺、睾丸以及卵巢中的细胞。优先选择的对象是人的细胞。
下面的实施例旨在说明但不是限制本发明。这些实施例是可能使用的范围中典型的实例，对于熟悉这项技术的人可以采用其它已知的替代方法。本发明的最佳实施例
下述实施例说明电化学疗法(ECT)的运用，将分化不充分的人体胰腺肿瘤(Panc-3)皮下异种移植到裸鼠的左肋部，并用ECT处理。单一处理程序涉及将平阳酶素(在0.15ml盐水中0.5个单位)按前述用“扇形”方式注射到肿瘤内部，接下来，在10分钟之后，利用本发明的沿着1cm直径的圆周排列的针阵列电极施加6个方波电脉冲。为了适应大小各异的肿瘤，还可以使用各种直径的针阵列(例如，0.5cm、0.75cm、和1.5cm)。各种高度的止动器可以插在阵列的中心，以使针刺入肿瘤的深度可以变化。内藏的机构允许切换电极，以使脉冲电场最大限度地覆盖肿瘤。电参数是：1300V/cm和6×99μsec的脉冲，间隔1sec.。
结果表明在处理现场几乎所有实验鼠都有严重坏死和水肿。在处理之后，处理组(D+E+；D代表药物，E代表电场)的实验鼠肿瘤体积都大幅度减小，而对照组(D+E-)的实验鼠肿瘤体积都显著增加。我们观察到在ETC处理28天后90％的实验鼠肿瘤几乎完全退化，10％的实验鼠没有反应。在最初处理77天后，观察到处理组中60％的实验鼠已经完全退化，没有可触摸的肿瘤。但是，在处理35天后，有20％的实验鼠肿瘤再次增长，但增长速度比对照组要小得多。这个观察结果与针的深度小于肿瘤的尺寸Z造成的原始大肿瘤的处理不完全有关。肿瘤样品的组织学分析表示在D+E+组中坏死的肿瘤细胞的空胞与D+E-组中有生命力的细胞和坏死细胞混合物的对比。利用异种移植非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤的裸鼠进行的初步研究也已表明采用平阳酶素和ECT处理取得了非常令人鼓舞的结果。
实施例1
肿瘤细胞系列Panc-3，一种分化不完全的胰腺癌细胞系，由抗癌有限公司(AntiCancer Inc.，San.Diego)提供。为了进行ECT实验，取自保留肿瘤细胞系的鼠的组织解冻后切成非常小的片，每片大约1mm，然后用外科手术将8至10片异种移植到在裸鼠左肋制作的皮下气囊中，再外科缝合6.0针。在肿瘤平均尺寸达到大约5mm之后，有可触摸肿瘤的实验鼠随机的分成两组，10只作对照组(D+E-；D代表药物，E代表电场)，10只作ECT处理组(D+E+)，即在注射平阳酶素之后用BTX T820型方波发生器施加脉冲。测量肿瘤的尺寸，并用下式计算肿瘤体积：
                (II/6)×a×b×c
其中a，b，c分别是肿瘤的长度、宽度和厚度。0.5个单位的平阳酶素溶解在0.15ml的0.9％氯化钠水溶液中，然后用扇面方式注射到对照组(D+E-)和处理组(D+E+)中每只实验鼠的肿瘤中。在注射药物10分钟后，(D+E+)组的每只实验鼠都用配备本发明介绍的针阵列电极的T820型方波电打孔器进行电脉冲处理。使用的电参数如下：电场强度1300V/cm；6个脉冲，每个脉冲99μsec.，间隔1sec。
每天监视实验鼠的死亡率并且记录病情的任何变化。有规律地定时测量肿瘤尺寸，监视肿瘤的生长情况，退化和(或)增大。另外一组异种移植非小细胞肺癌系列的裸鼠也用相同于Panc-3肿瘤的方法进行处理。
图10a和图10b表示对于Panc-3肿瘤在使用平阳酶素并作ECT处理后的43天周期内确定的肿瘤体积的分析结果。在经过处理和没有经过处理的实验鼠之间肿瘤体积有显著的差别。在处理24天后基本上没有可探测的肿瘤。图10的结果还总结于表1。肿瘤实际退化的图示说明示于图11。
表1  裸鼠体内Panc-3肿瘤的电化学疗法治疗处理后的    肿瘤体积    肿瘤体积    肿瘤体积    肿瘤体积天数      (mm3)C1    (mm3)C2   (mm3)T1     (mm3)T20         138.746     148.94      123.11      178.371         206.979     179.82      210.95      252.728         394.786     451.787     104.55      211.1115        557.349     798.919     113.21      226.96618        939.582     881.752     161.73      246.9124        1391.057    1406.98     41.56       47.222828        1628.631    1474.21     0           035        2619.765    2330.31     0           038        2908.912    2333.967    0           043        3708.571    5381.759    0           0
细胞系：人体的分化不充分的胰腺肿瘤(Panc-3)
鼠型：裸鼠；        移植：皮下异种移植
对照组：C1和C2；    处理组：T1和T2
利用抗癌公司提供的非小细胞肺癌细胞系177(NSCLC，177(AntiCancer，San Diego，CA))作了Panc-3实验的重复实验。实验结果示于图12a和图12b，并且与用平阳酶素和Panc-3的实验结果相似。在一个实验中，在第27天对一个复发的肿瘤重新作了处理(图13)，并且在7天后肿瘤的迹象消失。
按照前面强调的程序，用新制癌菌素(NCS)模拟上述的Panc-3和NSCLC实验。如图14a和14b所示，与研究平阳酶素时所用的给药方式类似，在施加脉冲前用NCS给药，结果表明在减小肿瘤尺寸方面全然没有效果。我们认为这是由于NCS的等电(离)点低，静电相互作用阻碍了药物进入肿瘤细胞。所以，采用先加脉冲并且在施加脉冲后注射NCS的办法作了重复实验。
图14c表示经过处理的7只实验鼠(代号ID1-7)的肿瘤初始体积(I)和第13天肿瘤最终体积的比较。我们观察到其中有几只实验鼠(ID1，2，4，和7)的肿瘤体积有所增加，但这种增加似乎是水肿的结果。但是，如图14d所示，在研究另一组5只实验鼠时，在第23天所有的实验鼠的肿瘤体积都明显地减小。
比较图14a，14b和图14c，14d表明在施加脉冲后注射NCS比在施加脉冲前注射NCS更有效。结论
这些实施例说明利用平阳酶素或NCS和针阵列电极借助电化学疗法能够有效地处理异种移植到裸鼠身上的分化不充分的胰腺癌(Panc-3)和非小细胞肺癌(NSCLC)。其它类似的化疗制剂利用本发明的方法可能也是有效的。
结果表明经过一次处理77天后处理组中有60％达到完全退化，没有可触摸的肿瘤。观察到部分退化的(肿瘤体积减少80％)占30％，而只有10％没有反应(表2)。
             表2用平阳酶素和电化学疗法治疗Panc-3
    处理后的天数     28     35     57     77
    CR(100％)     6     6     6     6
    PR(80％)     3
    NR(％)     1     1     1     1
    致死     2*
    肿瘤再次生长     2
    重新处理     2
    组织学     1
经过处理的实验鼠数：10
CR：完全退化；PR：部分退化；NR：没有反应
*1只实验鼠在重新处理后死亡；1只实验鼠生存64天后死亡
组织学研究清楚地表明对于经受ECT处理的一组肿瘤区出现严重的坏死，反之在对照组中没有出现坏死。业已发现，与施加脉冲前按常规方法注射药物相比，为了使药物最大限度地均匀分布在整个肿瘤中，以扇面方式将体积更大的平阳酶素注射到肿瘤内部是非常有效的方法。
尽管已经结合优选的实施方案介绍了本发明，但是应当理解，不脱离本发明的精髓可以作出各种修改方案。因此，本发明只受权利要求书的限制。

Claims (24)

1.一种给选定的活体组织的一部分施加电场的电极设备，该设备包括：
支撑装置，
电极阵列，该阵列安装在所述支撑装置上，并彼此保留间隔，其中至少所述电极之一具有适合刺入组织给体内组织细胞电打孔的针形结构；以及
电脉冲发生器，该发生器适合将与所述电极间的距离成正比的大振幅电信号施加给电极，以便完成所述电极之间细胞的电打孔。
2.根据权利要求1所述的设备，其中所述针形电极具有适合将分子注入所述组织的空心针。
3.根据权利要求2所述的设备，其中所述电极阵列包括第一极性中心电极和围绕着所述中心电极的许多第二极性电极。
4.根据权利要求3所述的设备，其中所述支撑装置包括空心中心轴，所述中心电极可调地安装在所述轴内，为了选择刺入组织的深度该电极能够调整从所述轴中伸出的长度。
5.根据权利要求4所述的设备，其中所述支撑装置包括轴环，该环安装在所述轴上，并且所述电极是固定在所述环上的环形排列的许多针。
6.根据权利要求5所述的设备，其中所述设备包括一个旋钮开关，该开关能够选择切换位置，交替地将对置的各对电极连接到所述脉冲发生器上。
7.根据权利要求1所述的设备，其中所述支撑装置包括轴环，该环安装在所述轴上，并且所述电极是固定在所述环上环形排列的针。
8.根据权利要求1所述的设备，其中所述电极阵列包括针状电极环形阵列和开关组合件，该组合件有选择地改变所述电极中对置电极的极性。
9.根据权利要求7所述的设备，其中至少有一个所述针状电极具有空心针，适合将分子注入所述组织。
10.根据权利要求1所述的设备，其中所述电极阵列包括针状电极的直线阵列，并且为了调整刺入深度所述电极相对所述支撑设备是可调的。
11.根据权利要求1所述的设备，其中所述电极阵列包括一对隔开的直线针状电极阵列，并且在所述支撑设备上能够调整彼此的相对位置，该设备还包括感受所述阵列之间距离的装置。
12.根据权利要求1所述的设备，其中所述支撑装置包括一对适合插入选定组织的管形针，并且所述电极能够通过所述管形针插入所述组织的导体。
13.根据权利要求12所述的设备，其中所述针可以从所述电极上拆卸下来。
14.根据权利要求7所述的设备，其中电场发生器产生施加给组织的电场，该电场的电场强度在0.2V/cm至20kV/cm，脉冲数在1至100之间。
15.一种使用电打孔将分子导入细胞的方法，该方法包括：
提供电极阵列，至少有一个所述电极具有适合刺入组织的针形结构；
将所述针状电极插入选定的组织，将分子导入该组织；
确定所述电极阵列中与所述组织导通的第二电极的位置，使所述组织位于第一和第二电极之间；
提供电脉冲发生器；
将所述电脉冲发生器与所述电极连接；以及
操作所述电脉冲发生器，将与电极间距离成正比的高幅度电脉冲施加给电极，给组织细胞电打孔。
16.根据权利要求15所述的使用方法，其中所述提供所述电极阵列的步骤包括提供包括一对管状针的第一和第二针状电极，该管状针适合插入选定组织，并且所述电极是可分开的导体，能够通过所述针插入所述组织。
17.根据权利要求16所述的使用方法，其中所述针可以从电极上拆卸下来。
18.根据权利要求15所述的使用方法，其中所述提供所述电极阵列的步骤包括提供第一极性的中心电极和提供许多环绕在所述中心电极周围的第二极性的电极。
19.根据权利要求18所述的使用方法，其中包括提供开关组合件的步骤，该组合件包括一个旋钮开关，该开关能够选择切换位置，将对置的各对电极交替地连接到所述脉冲发生器上。
20.根据权利要求15所述的使用方法，其中分子从包括化疗药物、多核苷酸以及多肽的一组物质中选择。
21.根据权利要求20所述的使用方法，其中化疗药物是平阳酶素。
22.根据权利要求15所述的使用方法，其中组织从包括胰脏、肺、心脏、肾、肌肉、乳腺、结肠、前列腺、胸腺、睾丸以及卵巢的一组组织中选择。
23.根据权利要求15所述的使用方法，其中所述提供所述电极阵列的步骤包括提供多针电极阵列，该电极阵列包括许多插入选定组织的对置电极对，并且所述将脉冲施加给所述电极的步骤包括有选择地将脉冲施加给诸对置电极对。
24.根据权利要求23所述的使用方法，其中所述将脉冲施加给所述电极阵列的步骤包括将所述脉冲依次施加给所述阵列中的各对电极。
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