CN115184519A - 维生素d软胶囊中维生素d溶出度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种维生素D软胶囊溶中维生素D溶出度的检测方法，属于化学成分检测技术领域。该检测方法，包括如下步骤：供试品溶液的制备：取维生素D制剂一粒，置于强碱溶出介质中进行溶出，分时取样，过滤膜后作为供试品溶液。液相色谱分析：分别将标准品溶液和供试品溶液注入到在线固相萃取色谱柱中进行在线固相萃取，将萃取后的标准品流出液和供试品流出液分别注入到分析柱中，分别对标准流出液和供试品流出液进行色谱分析，并对供试品中维生素D含量进行测定。本申请提供的检测方法稳定性和耐用性均很好，可以使维生素D溶出度的检测更加准确。
Description
技术领域
本申请涉及一种维生素D软胶囊溶中维生素D溶出度的检测方法，属于化学成分检测技术领域。
背景技术
维生素D为固醇类衍生物，家族成员包括维生素D2和维生素D3，其主要生理功能是调节体内钙、磷代谢，维持血浆钙、磷水平，从而维持骨骼的正常生长与发育。维生素D制剂在临床应用广泛，如佝偻病、骨质疏松等。维生素D的缺乏可能会影响儿童的生长发育，也会使骨质疏松症进展、导致骨折的风险。除此之外，据研究表明维生素D还具有很多骨外的作用，包括对肿瘤、心血管系统、自身免疫性系统、内分泌系统等影响[卢金淼等.世界临床药物.2013,34(9):566-569]。所以适当补充维生素D及其类似物显得尤为重要。
维生素D为脂溶性维生素，难溶于水，一般将其制成油溶型软胶囊，其释放、溶出过程与其他常规口服剂型不同。因此，维生素D软胶囊的溶出度测定尤为重要。现有的测定方法中，由于维生素D的溶出度很低，对仪器的检测灵敏度要求高。
发明内容
本申请的目的在于提供一种维生素D软胶囊溶中维生素D溶出度的检测方法，采用在线固相萃取的方式去除溶出介质中的碱性物质和表面活性剂，改善分析柱使用寿命并降低分析维生素D的基质干扰，实现对溶出介质中的维生素D的准确定量分析。
本申请是通过以下技术方案实现的：
一种维生素D软胶囊中维生素D溶出度的检测方法，包括如下步骤：
1)标准品溶液的制备：分别称取维生素D2、D3标准品适量，用强碱溶出介质配制成具有浓度梯度的混合标准品溶液；
2)供试品溶液的制备：取维生素D制剂一粒，置于强碱溶出介质中进行溶出，分时取样，过滤膜后作为供试品溶液；
3)液相色谱分析：分别将标准品溶液和供试品溶液注入到在线固相萃取色谱柱中进行在线固相萃取，将萃取后的标准品流出液和供试品流出液分别注入到分析柱中，分别对标准流出液和供试品流出液进行色谱分析，并对供试品中维生素D含量进行测定。
在一些可能的实施方式中，强碱溶出介质为10％曲拉通X-100/0.5N氢氧化钠。
在一些可能的实施方式中，强碱溶出介质的配置方法为：氢氧化钠溶解在1/4水中，放冷至室温；曲拉通X-100溶解到3/4水中；两种溶液混合，静置24h以上。
在一些可能的实施方式中，步骤2)中，供试品的溶出采用桨法，可监测不同时间点的维生素D溶出度。
在一些可能的实施方式中，步骤3)中，固相萃取色谱柱为聚合物基质固相萃取色谱柱。
在一些可能的实施方式中，步骤3)中，分析柱为C4～C30色谱柱。
在一些可能的实施方式中，步骤3)中，萃取后的标准品流出液和供试品流出液为：经过固相萃取色谱柱中3～7min的流出液。
在一些可能的实施方式中，液相色谱的分析条件为：
(i)甲醇或乙腈为流动相；
(ii)固相萃取色谱柱为聚合物基质固相萃取色谱柱，色谱柱规格为2.1mm×50mm，10～30μm粒径；
(iii)分析柱采用Tnature C18，4.6mm×150mm，5μm粒径；
(iv)柱温25～45℃；
(v)进样量为100μl；
(vi)固相萃取流速为1.0mL/min；
(vii)分析流速为1.0mL/min。
本申请提供的一种维生素D软胶囊溶中维生素D溶出度的检测方法的有益效果如下：
采用在线固相萃取的方式去除溶出介质和碱性溶剂，改善分析柱寿命并降低分析维生素D的基质干扰，实现对溶出介质中的维生素D的准确定量分析。同时，能够实现对目标化合物的浓缩富集，提高分析灵敏度。目标化合物定量限为4ng/ml，满足实际检测需求。
进一步地，选用的固相萃取色谱柱填料为聚合物基质，在强碱条件下结构很稳定(发明人研究发现，如果固相萃取柱为C18，则需要在中性条件下进行萃取，不然易发生破坏)，对溶出介质中的碱液和曲拉通X-100几乎无保留，对目标化合物保留较好。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例提供的维生素D软胶囊溶中维生素D溶出度的检测方法的检测流程图；
图2是本申请实施例提供的配有六通阀的二维双泵系统在SPE富集净化和SPE洗脱的溶液流路示意图；
图3是本申请实施例1中在线固相萃取-液相色谱法测定维生素D2软胶囊溶出度含量维生素D2的色谱图；
图4是本申请对比例1中液相色谱法直接测定维生素D2软胶囊溶出度含量维生素D2的色谱图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在本申请实施例的描述中，需要说明的是，指示方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该申请产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，或者是本领域技术人员惯常理解的方位或位置关系，或者是该申请产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
在本申请实施例的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接连接，也可以通过中间媒介间接连接。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
维生素D为脂溶性维生素，难溶于水，一般将其制成油溶型软胶囊，其释放、溶出过程与其他常规口服剂型不同。维生素D软胶囊需要在强碱性条件下溶出，其中溶出介质为10％曲拉通X-100/0.5N氢氧化钠的强碱溶剂。
由于样品溶出介质pH约为13，分析色谱柱长期在这样的条件下进样，硅胶很容易溶解，导致柱头塌陷；同时，由于曲拉通X-100具有紫外吸收信号，溶出介质中大量的曲拉通X-100又会对痕量维生素D的定量检测产生干扰。几方面综合起来，最终会出现检测干扰大、保留时间不重复等问题。
因此，现有技术中，使用盐酸中和溶出介质的方法消除碱液对色谱柱塌陷的问题，发明人研究发现，其依然存在以下问题：1)样品溶出液需要调和pH，增加了操作步骤，引入更多实验误差；2)中和过程中可能有固体析出现象而导致目标物损失；3)溶出介质中大量的曲拉通X-100(具有明显的紫外信号)进入到色谱柱，影响基线进而干扰目标峰出峰及灵敏度低的问题，并且曲拉通X-100是一类表面活性剂，长期大量进入色谱柱，影响色谱柱寿命，导致方法耐受性差。
同时，发明人还发现，以0.01mg规格维生素D2软胶囊为例，采用500mL溶出介质，其全部溶出后的浓度仅为20ng/mL，按照溶出初期溶出10％～20％估计，维生素D2的浓度仅为2～4ng/mL，对灵敏度要求极高，只能通过增大进样量来提高检测的灵敏度，进一步增加了检测难度。
基于以上分析，本申请提出了采用在线固相萃取的原理用于维生素D软胶囊中维生素D2、维生素D3含量的测定。通过选用聚合物基质固定相作为固相萃取色谱柱，基于碱性物质以及溶出介质极性较大，在固相萃取色谱柱几乎不保留的特点，采用在线固相萃取的方式可以实现去除溶出介质中的碱性物质和表面活性剂。以C4-C30为键合相的色谱柱为分析柱对维生素D进行分离分析，从而最终实现对溶出介质中的维生素D的溶出含量测定。
下列实施例和对比例中均采用了紫外检测器进行维生素检测，当然也可以采用二极管阵列检测器的检测。图1为本申请实施例提供的维生素D软胶囊溶中维生素D溶出度的检测方法的检测流程图。请参阅图1，该检测方法包括如下步骤：
S110强碱溶出介质的制备：氢氧化钠溶解在1/4水中，放冷至室温；曲拉通X-100溶解到3/4水(40℃)中；两种溶液混合，静置24h以上，溶出杯中无泡沫。该强碱溶出介质为10％曲拉通X-100/0.5N氢氧化钠。
S120标准品溶液的制备：分别称取维生素D2、D3标准品适量，用强碱溶出介质配制成具有浓度梯度的混合标准品溶液。
维生素D2标准储备液(1μg/mL)：精确称取10mg维生素D2标准品，用溶出介质溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，摇匀，再取1mL于100mL棕色容量瓶中，摇匀，备用。避光储存于冰箱中，24h内基本稳定。临用前将溶液回温至室温。
维生素D3标准储备液(1μg/mL)：精确称取10mg维生素D2标准品，用溶出介质溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，摇匀，再取1mL于100mL棕色容量瓶中，摇匀，备用。避光储存于冰箱中，24h内基本稳定。临用前将溶液回温至室温。
在进行测试时，根据需要用溶出介质将标准储备液稀释至一定浓度后使用。
S130供试品溶液的制备：取维生素D制剂一粒，置于强碱溶出介质中进行溶出，分时取样，过滤膜后作为供试品溶液。
将维生素D2软胶囊：取一粒[规格，0.01mg]溶于0.5mol·L-1氢氧化钠-10％曲拉通X-100介质500mL中，转速100r/min，温度37℃，检测不同时间溶出浓度，过滤膜后作为供试品溶液。
将维生素D3软胶囊：取一粒[规格，0.01mg]溶于0.5mol·L-1氢氧化钠-10％曲拉通X-100介质500mL中，转速100r/min，温度37℃，检测不同时间溶出浓度，过滤膜后作为供试品溶液。
S140液相色谱分析：分别将标准品溶液和供试品溶液注入到在线固相萃取色谱柱中进行在线固相萃取，将萃取后的标准品流出液和供试品流出液分别注入到分析柱中，分别对标准流出液和供试品流出液进行色谱分析，并对供试品中维生素D含量进行测定。
图2为本申请实施例提供的配有六通阀的二维双泵系统在SPE富集净化和SPE洗脱的溶液流路示意图。请参阅图2，该配有六通阀二维双泵系统的高效液相色谱仪，包括固相萃取进样泵(一维泵)、自动进样器、柱温箱内六通阀、废液收集装置、固相萃取柱(在线SPE柱)、分析泵(二维泵)、分析柱、可变波长检测器、控制系统。固相萃取进样泵(一维泵)与自动进样器连接，用于实现样品分析溶液的吸取和进样；自动进样器另一端与柱温箱内阀口1连接；固相萃取柱两端分别与柱温箱内阀口3和阀口6连接，用于实现样品分析溶液的净化及富集的分析物的洗脱进样；废液收集装置与柱温箱内阀口2连接，用于收集洗脱液；分析泵(二维泵)与六通阀口5的连接，用于运输流动相平衡一维分析柱和洗脱富集在固相萃取柱的目标物；分析柱一端与柱温箱内阀口4连接，另一端与检测器连接，用于分析部分目标物。
液相色谱分析条件为：分别将标准品溶液和供试品溶液注入固相萃取柱，在线固相萃取柱采用聚合物基质的固相萃取色谱柱，规格为2.1×50mm，10～30μm粒径，固相萃取流动相为乙腈；分析柱采用Tnature C18，规格为4.6mm×150mm，5μm粒径，分析柱流动相为80％乙腈水；运行时间为15min；流动相流速为1mL/min，进样体积为100μL；六通阀的流路设置为：0～3min，流出液排至废液；3～7min，流出液流入分析柱；7～15min，目标化合物经二维泵从分析柱中洗脱被紫外检测器检测，一维泵平衡固相萃取柱。
本申请采用特殊填料、规格的净化柱(采用聚合物基质的固相萃取色谱柱)以实现强碱性溶液直接定容后上机分析，不需要调节pH，扩大了方法的适用范围，提高样品的分析率。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例一：在线固相萃取-液相色谱法测定维生素D2软胶囊溶出度含量。
1.样品的制备：
将维生素D2软胶囊[规格，0.01mg]溶于0.5mol·L-1氢氧化钠-10％曲拉通X-100介质500mL中，转速100r/min，温度37℃，完全溶解后，过滤膜后为样品溶液，上机检测；
采用高效液相色谱分别对标准系列工作溶液和处理后的待测试样进行检测，其液相色谱检测装置的通路结构如图2所示，标准溶液和供试品溶液分别由进样器注入固相萃取色谱柱中，然后通过六通阀的切换：0～3min，流出液排至废液；3～7min，流出液流入分析柱；7～15min，目标化合物经分析泵从分析柱中洗脱被紫外检测器检测，固相萃取进样泵平衡固相萃取柱，色谱检测结果如图3所示；
具体的液相色谱的分离测试条件如下表所示：
本实施例所得的标准品线性方程(浓度为横坐标，峰面积为纵坐标)及线性范围如下表所示：
| 标准品 | 浓度范围 | 线性方程 | 相关系数R<sup>2</sup> |
| 维生素D2 | 2-50ng/mL | Y＝306.01x+36.6 | 0.9997 |
维生素D2的标准曲线的相关系数R2≥0.99，表明线性良好，可作为标准曲线。
按照实施例1的方法测定供试样品中维生素D2含量(记作实际检测值)，以0.5mol/L NaOH-10％曲拉通溶液为溶出介质，采用桨法(沉降篮)，100r/min，取已测定维生素D2软胶囊90min时溶出样品9份，分成3组，每组分别精密加入相当于样品中所含维生素D2量的80％、100％、120％对照品，取上述过滤溶液进行检测，并按照下列公式计算回收率：
回收率(％)＝(实际检测值-本底含量)×100％/理论添加量
本实施例所得的回收率如下表所示：
从上表可以看出，本申请实施例提供的检测方法中，维生素D2的平均回收率较高，可以说明，采用聚合物基质的固相萃取色谱柱能够较好地对维生素D2进行萃取，以便后续的检测分析。
从图3可以看出，本实施例提供的检测方法中具有明显的维生素D2特征峰，且该峰与其他峰的位置较远，不易出现检测干扰。
对比例一：液相色谱法测定维生素D2软胶囊溶出度含量。
将维生素D2软胶囊[规格，0.01mg]溶于0.5mol·L-1氢氧化钠-10％曲拉通X-100介质500mL中，转速100r/min，温度37℃，完全溶解后，过滤膜后为样品溶液，上机检测；
采用高效液相色谱分别对标准系列工作溶液和处理后的待测试样进行检测，具体的液相色谱的分离测试条件如下表所示：
| 分析条件 | |
| 流速 | 1.5mL/min |
| 流动相A | 乙腈 |
| 流动相B | 甲醇 |
| 流动相C | 水 |
| 进样量 | 100μL |
| 色谱柱 | XTerra MS C18,4.6×150mm,3.5μm |
| 柱温 | 40℃ |
| 洗脱程序 | A:B:C＝5:90:5 |
| 检测波长 | 265nm |
液相色谱图如图4，从图4可以看出，供试品中的维生素D2特征峰与曲拉通特征峰距离较近，出现了明显的检测干扰，导致检测结果不准确。
以上仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种维生素D软胶囊中维生素D溶出度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)标准品溶液的制备：分别称取维生素D2、D3标准品适量，用强碱溶出介质配制成具有浓度梯度的混合标准品溶液；
2)供试品溶液的制备：取维生素D制剂一粒，置于强碱溶出介质中进行溶出，分时取样，过滤膜后作为供试品溶液；
3)液相色谱分析：分别将所述标准品溶液和所述供试品溶液注入到在线固相萃取色谱柱中进行在线固相萃取，将萃取后的所述标准品流出液和所述供试品流出液分别注入到分析柱中，分别对所述标准流出液和所述供试品流出液进行色谱分析，并对所述供试品中维生素D含量进行测定。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述强碱溶出介质为10％曲拉通X-100/0.5N氢氧化钠。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述强碱溶出介质的配置方法为：氢氧化钠溶解在1/4水中，放冷至室温；曲拉通X-100溶解到3/4水中；两种溶液混合，静置24h以上。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述供试品的溶出采用桨法，可监测不同时间点的维生素D溶出度。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述固相萃取色谱柱为聚合物基质固相萃取色谱柱。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述分析柱为C4～C30色谱柱。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，萃取后的所述标准品流出液和所述供试品流出液为：
经过所述固相萃取色谱柱中3～7min的流出液。
8.根据权利要求1～7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的分析条件为：
(i)甲醇或乙腈为流动相；
(ii)所述固相萃取色谱柱为聚合物基质固相萃取色谱柱，色谱柱规格为2.1mm×50mm，10～30μm粒径；
(iii)所述分析柱采用Tnature C18，4.6mm×150mm，5μm粒径；
(iv)柱温25～45℃；
(v)进样量为100μl；
(vi)固相萃取流速为1.0mL/min；
(vii)分析流速为1.0mL/min。
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