CN110412189A - 一种快速检测油脂或生物样品中的维生素d的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法，本发明中，将待测样品使用多维色谱系统进行维生素D样品的在线预处理和分离；其中，所述多维色谱系统包括依次连接的超临界色谱部分及反相液相色谱部分，所述反相液相色谱部分中包括一个或一个以上的反相液相色谱柱；所述超临界色谱部分包括超临界流动相、改性剂和超临界用填料柱。

Description

一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法
技术领域
本发明涉及一种从油脂或生物样品中维生素的分离、检测方法和系统，属于天然物质的分离领域。
背景技术
维生素D2(也被称为麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)是脂溶性维生素，它们在钙代谢中起着非常重要的作用。维生素D也影响其他代谢途径。缺乏维生素D可导致严重的疾病，如佝偻病和骨骼减弱。通常，使用维生素D补充剂用于治疗或预防维生素缺乏症。维生素D也被添加到婴儿配方奶粉，以满足婴儿的营养需求。但值得注意的是，过量摄入维生素D也可能是危险的。因此，在维生素补充剂和婴儿配方食品中合适地使用维生素D在医疗和保健上都起着非常重要的作用。
由于维生素D含量较低，易受基质干扰，因此在检测前，样品溶液制备过程通常包括皂化、萃取等步骤。传统上，维生素D测定的现有程序一般需要使用溶剂从油性或脂肪基质中萃取，然后通过正相液相色谱(NPLC)进行清洁，进而经过反相液相色谱柱(RPLC)进行分离和检测。由于传统的基于溶剂的提取技术首先是耗时，也需要密集的劳动，并且消耗了大量的有机溶剂，因此也进行了许多尝试，以简化的样品制备过程。
为了分析婴儿配方奶粉中的维生素D，开发了两种反相液相色谱的二维柱切换系统用于在线清除提取物。引用文献1公开了一种在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D3和E的方法，其一维和二维分离均基于反相色谱。样品经过皂化、萃取后，直接进样分析，一次进样即可在线完成样品中各维生素的定量分析。但是，使用RPLC清洗从油状物或脂质的基体中提取的样品的过程会使得一些强疏水性的脂溶性杂质保留在RPLC柱中。杂质积累在色谱柱中，不仅会导致检测物保留时间的改变，而且还会导致清洁柱的寿命缩短。
在另一方面，高效液相色谱法/超高效液相色谱-质谱(HPLC/UPLC-MS)使用更加简单的样品制备方法已被开发用于在油性维生素补充剂、婴儿配方奶粉或生物流体中的维生素D分析。但是，通常情况下这样的方法仍然需要离线溶剂萃取过程或正相固相萃取(SPE)处理以对样品进行预处理或成分清理。引用文献2涉及利用UPLC-MS/MS建立了一种快速、灵敏的、能够同时测定婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素A、D2、D3、α-生育酚的分析方法。但对于检测样品，仍然需要经过碱性无机物的处理以及有机溶剂的提取，在前处理的简便性方面还有改进或提高的余地。
此外，为了获得高效率的自动分析系统，仍然需要基于正相液体在线纯化油性或脂肪样品的色谱法。然后，可以使用反相液相色谱分析分离较少的脂肪洗脱液以提供更好的分辨率。然而，由于两种不同类型的流动相的不匹配性，难以构建柱切换系统以同时包括正相和反相液相色谱。
此外，随着超临界流体技术的发展，也尝试了使用超临界萃取或超临界色谱分析法对物质进行提取或分离。在超临界技术中对于维生素D分离和分析中具有与NPLC相类似的保留时间和分离行为。引用文献3公开了用柱色谱从与其它组分如脱氢胆固醇，速甾醇和光甾醇的混合物中分离维生素D3或前维生素D3的方法，所述色谱柱中的流动相为超临界二氧化碳。但是该方法仅涉及合成维生素D产品后的分离或提纯。
可见，在现有技术中，对于从油脂或生物样品等成分复杂的体系中提取维生素D的方法在应用的便捷性、环保型、快速性等方面的改进不能说是充分的。
引用文献1：
“在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D3和E”，张艳海，《色谱》，2015年3月
引用文献2：
“超高效液相色谱/超临界流体色谱-串联质谱联用技术同时测定婴幼儿配方乳粉中多种维生素的研究”，全思思，广东药科大学硕士学位论文，2017年
引用文献3：CN1144782C
发明内容
发明要解决的问题
针对上述现有技术中对于从油脂或生物样品等成分复杂的体系中提取维生素D的方法所面临的前处理过程复杂、溶剂消耗量大、各色谱分析之间切换缺少便利性等问题，本发明采用多维色谱系统，提供了一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法和检测系统，其使用超临界色谱与反相液相色谱联用，能够实现简便、快速的对油脂或生物样品中含有的维生素D进行分离，进而使用检测仪器对分离得到的维生素D进行检测分析。
本发明的方法和分析系统，允许在不同色谱柱之间进行便捷、快速的切换，进而实现了快速、准确地检测维生素D。
用于解决问题的方案
本发明中，使用如下方案解决了上述技术问题：
本发明首先提供了[1]一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：待测样品的制备；
S2：将待测样品使用多维色谱系统进行维生素D的分离；
其中，所述多维色谱系统包括依次连接的超临界色谱部分及反相液相色谱部分，所述反相液相色谱部分中包括一个或一个以上的反相液相色谱柱；
所述超临界色谱部分包括超临界流动相以及改性剂，所述改性剂选自醇类物质、腈类物质或它们的水溶液，优选为甲醇或其水溶液；
S3：检测由S2步骤分离得到的维生素D。
[2]根据[1]所述的方法，所述超临界色谱部分包括一个超临界色谱柱；所述反相液相色谱部分中包括两个反相液相色谱柱。
[3].根据[1]或[2]所述的方法，所述多维色谱系统中的色谱柱通过多通阀组进行连接。
[4].根据[1]-[3]中任一项所述的方法，所述超临界色谱部分中：
固定相选自极性基团改性的硅胶，所述极性基团选自羟基、氨基或氰基，优选地，所述改性的硅胶选自二醇基硅胶；
流动相为超临界二氧化碳。
[5].根据[1]-[4]中任一项所述的方法，所述反相液相色谱部分中：
固定相选自疏水基团改性的硅胶，所述疏水基团选自烷基，优选地，所述改性的硅胶优选自C18-硅胶；
所述流动相为极性有机溶剂或其水溶液。
[6].根据[1]-[5]中任一项所述的方法，所述反相液相色谱部分的反相液相色谱柱相同或不同。
[7].根据[1]-[6]中任一项所述的方法，在S2步骤中，被超临界色谱部分吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到反相液相色谱部分中，并在该反相液相色谱部分中去除从超临界色谱部分中流出的超临界流动相。
[8].根据[1]-[7]任一项所述的方法，S2步骤中，包括如下步骤：
S21：使用超临界色谱柱对待测样品进行成分分离，并将弱极性物质输送到反相液相色谱柱中；
S22：在反相液相色谱柱中，将从超临界色谱柱中流出的超临界流动相去除；
S23：在上述反向液相色谱柱中，进一步通入流动相，将存在于反相液相色谱柱中的物质进行分离，得到分离出的维生素D组分；
任选地，S21步骤中所述将弱极性物质输送到反相液相色谱柱中与S22步骤同步进行。
[9].根据[1]-[8]中任一项所述的方法，S2步骤中，包括如下步骤：
S21’：使用超临界色谱柱对样品进行成分分离，将弱极性物质输送到反相液相色谱部分的第一反相液相色谱柱中；
S22’：在第一反相液相色谱柱中，将从超临界色谱柱中流出的超临界流动相去除；
S23’：在第一反相液相色谱柱中，进一步通入流动相将存在于该色谱柱中的弱极性物质输送到第二反相液相色谱柱中，在所述第二反相液相色谱柱中分离得到维生素D组分；
任选地，S21’步骤中所述将弱极性物质输送到第一反相液相色谱柱中与S22’步骤同步进行。
[10].根据[1]-[9]中任一项所述的方法，在S2步骤前，还包括使用前处理色谱柱分离待测样品中的蛋白成分的步骤；S3步骤中，使用质谱仪器进行检测。
进一步，本发明还提供了：
[11].一种分析系统，其适用于高脂溶性成分的分析和检测，尤其可以用于自动检测油脂或生物样品中的维生素D，所述系统包括：
自动进样装置；
多维色谱系统，其包括超临界色谱柱、一个或多个反相液相色谱柱，其中，在超临界色谱柱中非极性物质被洗脱去除，弱极性物质被超临界色谱柱的固定相吸附后被进一步的输送到所述反相液相色谱柱中；
柱温箱，用于放置所述色谱柱；
液相泵，用于向所述超临界色谱柱输送改性剂、以及向所述一个或多个反相液相色谱柱输送流动相；以及
质谱检测仪器。
[12].根据[11]所述的系统，所述改性剂选自醇类物质、腈类物质或它们的水溶液，优选为甲醇或其水溶液。
[13].根据[11]或[12]所述的系统，所述多维色谱系统中的超临界色谱柱以及一个或多个反相液相色谱柱之间通过多通阀组进行连接或连接的切换。
[14].根据[11]-[13]任一项所述的系统，被所述超临界色谱柱吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到反相液相色谱柱中，并在该反相液相色谱柱中去除从超临界色谱柱中流出的超临界流动相。
[15].根据[11]-[14]任一项所述的系统，所述多维色谱系统包括一个反相液相色谱柱，被所述超临界色谱柱吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到所述反相液相色谱柱中，并在该反相液相色谱柱中去除从超临界色谱柱中流出的超临界流动相，然后，所述弱极性物质在该反相液相色谱柱中进行成分的分离。
[16].根据[11]-[14]任一项所述的系统，所述多维色谱系统中包括两个反相液相色谱柱，其中，被所述超临界色谱柱吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到第一反相液相色谱柱中，并在该反相液相色谱柱中去除从超临界色谱柱中流出的超临界流动相，
然后，弱极性物质被输送到第二反相液相色谱柱中，进行成分的分离。
[17].根据[11]-[16]任一项所述的系统，所述超临界色谱柱中：
固定相选自极性基团改性的硅胶，所述极性基团选自羟基、氨基或氰基，优选地，所述改性的硅胶选自二醇基硅胶；
流动相为超临界二氧化碳。
[18].根据[11]-[17]任一项所述的系统，所述反相液相色谱柱中：
固定相选自疏水基团改性的硅胶，所述疏水基团选自烃基，优选地，所述改性的硅胶优选自C18-硅胶；
所述流动相为极性有机溶剂或其水溶液。
[19].根据[11]-[18]任一项所述的系统，至少将执行分离弱极性物质的反相液相色谱柱置于柱温箱中。
[20].根据[11]-[19]任一项所述的系统，所述系统还具有前处理色谱柱，用于分离待测样品中的蛋白成分。
发明的效果
通过本发明上述技术方案的实施，能够取得如下的有益效果：
本发明中，对于从油脂或生物样品中维生素D的检测无需对样品进行复杂的前处理手段，因此，无需像通常那样在前处理过程那样使用大量的溶剂对维生素D进行提取；
在本发明所提供的多维色谱系统中，超临界色谱与反相液相色谱之间，可以实现不同类型的色谱柱之间的直接切换，避免了通常情况下不同类型色谱柱之间联用时，流动相不兼容的缺点；
进而，本发明所提供的方法或分析系统，能够快速、准确的实现对油脂或生物样品中维生素D的检测，尤其地，能够以高度自动化的方式运行，极大的提高了分析效率、降低了分析成本。
此外，依据本发明的方法对维生素D成分进行检测时，检测结果具有良好的线性相关系数，并且重现性好以及回收率高。
附图说明
图1：本发明一个实施方案中维生素D检测流程图
图2：SFC过程中改性剂相对于CO2用量对于不同色谱柱保留行为的影响
图3：二醇基柱中不同含量的甲醇对于保留行为的影响
图4：C18柱中不同含量的甲醇对于保留行为的影响
图5和图6：对于标准样品的检测分析结果
图7：油性液滴维生素D3的分析
附图标记说明
11：CO2泵 12：甲醇液相泵 13：自动进样器
14：超临界色谱柱(二醇基) 15：检测器(二极管阵列检测器)
16：压力控制单元(背压控制单元)
21：甲醇液相泵 22：反相液相色谱柱(C18)
23：反相液相色谱柱(C18)
24：质谱检测器
41-46：六通阀组
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方式、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方式、具体例子。需要说明的是，本说明书中，使用“-”表示的数值范围是指包含“-”前后所记载的数值作为下限值和上限值的范围，使用“％”在没有特殊声明的情况下，均指的是体积百分数，即“V％”。
<本发明的第一方面>
在本发明的第一方面中，提供了一种可快速检测油脂样品或生物样品中的维生素D的方法。
对于检测的对象，可以是各种含有维生素D的膳食补充剂或营养剂，或者是婴儿配方奶粉或食品，在本发明的一些实施方案中，这些含有维生素D的物质可以是固体的、也可以是液体或油性稠状物形式存在的。
对于上述这些样品，在一些实施方案中，可以进行或不进行任选的前处理。对于前处理的手段没有特别的限制，只要是不破坏待测样品中维生素D的含量即可。可以使用干燥、研磨等手段，获得细的粉末体，以便使样品易于溶解，或者，例如对于乳粉或米粉等，可以使用皂化、酶解等前处理手段，或者对于有些油性组分可以直接对样品进行简单的有机溶剂萃取，将其中的维生素D等成分萃取到有机溶剂中。
将任选的进行了前处理的样品，使用有机溶剂进行溶解或稀释，制备待测样品溶液。本发明中，对于有机溶剂，可以选自烃类溶剂、酮类溶剂、醚类溶剂等。在优选的实施方案中，可以使用烃类溶剂，例如正己烷等。
对于溶解完毕而得到的待测样品溶液，可以通过自动进样器加入到检测设备中。
另外，在本发明的另外的一些实施方案中，可以在检测样品时，先利用色谱法等方法去除样品中的蛋白成分。例如使用前处理色谱柱预先除去样品中的蛋白成分，然后再对样品中的维生素D成分进行分离和检测，因此，本发明也可以针对含有维生素D的生物样品，例如血液等进行检测。
多维色谱系统
本发明的多维色谱系统，提供对待测样品溶液的预清洗和分离作用。所述多维色谱系统包括超临界色谱部分，以及反相液相色谱部分。
超临界色谱部分
超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography；SFC)以超临界流体做流动相是依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程。
超临界流体色谱兼有气相色谱和液相色谱的特点。它既可分析气相色谱不适应的高沸点、低挥发性样品，又比高效液相色谱有更快的分析速度和更优的条件。本发明中，使用超临界色谱柱对样品溶液进行预清洗，即将待测样品中溶液中的非极性油脂成分去除。
本发明中超临界色谱柱可以是填充柱也可以是毛细管柱，在一些实施方案中，优选填充柱超临界流体色谱(PCSFC)。
超临界色谱柱中的固定相选自极性基团改性的硅胶，对于极性基团，可以选自羟基、氨基或氰基。在一些优选的实施方案中，考虑到在使用超临界色谱柱对样品溶液进行预清洗时，需要预留出合适的维生素D的保留时间，因此，优选以羟基作为改性基团，更具体而言，本发明中在超临界色谱柱中的固定相优选可以使用二醇基硅胶。其使用含有1,2-二羟基丙基官能团的有机硅烷键合而成，另外，该固定相是可以多孔球形硅胶。
由于本发明中超临界色谱柱中的流动相可以选择超临界流体，所述超临界流体为在临界温度和临界压力以上的条件下物质的一种状态，该状态介于气体和液体之间。适用的超临界流体可以为超临界二氧化碳或超临界乙烷等。在本发明的一些实施方案中，超临界流动相选自超临界二氧化碳。操作温度和压力主要决定于所选用的超临界流动相。本发明中，当以超临界二氧化碳作为超临界流动相时，操作温度为31℃以上，优选为35℃以上，操作压力为7.3MPa以上，优选为7.5MPa以上。从超临界流体对维生素D的溶解性、保留时间以及可操作性方面考虑，操作温度优选为40-60℃，操作压力优选为7.5-15MPa。
本发明中，采用改性剂作为调节超临界二氧化碳流体极性的物质。所述改性剂可以选自醇类物质或腈类物质。对于醇类物质，可以使用甲醇、异丙醇等各种脂肪醇；对于腈类物质，可以使用乙腈等作为改性剂。对于改性剂的用量(相对流量)，通常情况下可以为流动相的1％-5％。从控制维生素D的保留时间方面考虑，本发明优选改性剂的用量为1.5％-4％，更优选为2％-3％，最优选为2％-2.5％。另外从控制保留时间的角度，改性剂的纯度在80％以上，优选在90％以上，更优选为100％。
本发明的流动相和改性剂可以通过液相泵供给到色谱柱中。在一些实施方案中，本发明的超临界色谱柱可以置于柱温箱中。另外，超临界色谱部分中，还可以设置检测器以及压力控制单元(例如背压控制单元BPR)以及独立的CO2供给泵。在一些实施方案中，压力控制单元设置于该超临界色谱部分的末端，用于卸除流动相和废液；对于检测器没有特别限制，其设置于压力控制单元之前，其可以检测从色谱柱溶出的各种成分，尤其地，其可以检测维生素D的流出，从而确定该样品溶液中维生素D的保留时间。优选地，检测器可以为二极管阵列检测器。
对于本发明中所使用的超临界色谱仪，可以通过市售获得，例如可以是岛津公司的“Nexera UC”超临界色谱系统。
样品溶液经过自动进样装置加入到超临界色谱部分后，启动超临界色谱仪，样品中的弱极性物质，如维生素D保留在色谱柱上，而非极性的油脂则快速地从色谱柱上被洗脱下来。
在此步骤中，使用超临界色谱完成了对含有维生素D成分样品的快速预清洗，能够简单、方便的去除非极性的油脂成分。
切换装置
在超临界色谱的处理中，去除了非极性的油性成分之后，在维生素D的保留时间到达以前，将系统切换至反相液相色谱部分。
在本发明的一些实施方案中，可以使用多通阀组进行上述切换。对于多通阀组没有特别的限定，可以使用液相色谱中常规的各种进样用多通阀组。优选地，本发明中使用六通阀组或十通阀组，更优选的可以使用六通阀组。通过对多通阀组的不同切换操作，可以实现不同流通或连接路径，尤其适合在多种设备之间的连接和控制。
所谓的切换装置进行的切换，指的是将超临界色谱柱的出液口与检测器以及压力控制单元断开，同时将超临界色谱柱的出液口通过多通阀组与反相液相色谱的入液口相接通。并且，通过该多通阀组同时将反相液相色谱的末端至少与上述的压力控制单元连接。
在本发明中，在执行上述切换时或切换前，停止对超临界色谱柱供给流动相。在此过程中，不停止改性剂的供给，当完成切换之后，可以加大改性剂的供给速度，例如可以将改性剂的提高到0.5-1mL/min。此时，可以仅仅通过改性剂的流动将吸附于超临界色谱柱中的包含维生素D的弱极性物质洗脱出，从而与残留于系统中的超临界二氧化碳一起，通过多通阀组而进入反相液相色谱部分中。
通过上述的切换完成了步骤S21，即，使用超临界色谱对待测样品进行成分分离，将包含维生素D的弱极性物质输送到反相液相色谱部分；或通过上述的切换完成了步骤S21’，即，使用超临界色谱对样品进行成分分离，将包含维生素D的弱极性物质输送到反相液相色谱部分的第一反相液相色谱柱中。
反相液相色谱部分
本发明中，在反相液相色谱部分中，包括一个或一个以上的反相液相色谱柱。在一些实施方案中，这些反相液相色谱柱在使用时置于柱温箱中。
本发明的反相液相色谱柱中的固定相可以为疏水性基团改性的硅胶，所述疏水性基团可以为各种烃基，例如C8基、C18基或苯基等。在本发明的一些实施方案中，使用C18改性的硅胶作为固定相。作为流动相，可以使用极性有机溶剂或其水溶液，例如醇类物质或腈类物质。对于醇类物质，可以使用甲醇、异丙醇等各种脂肪醇；对于腈类物质，可以使用乙腈等，在一些实施方式，流动相可以以水溶液的形式使用，例如，使用甲醇的水溶液。在以水溶液使用的情况下，从缩短保留时间的角度考虑，流动相中极性有机溶剂的含量应当为60％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上。在本发明一些优选的实施方案中，反相液相色谱中的流动相为90％以上的甲醇或100％的甲醇。
在本发明的一些实施方案中，反相液相色谱部分可以仅包括一个色谱柱。如上所述，当进行切换后，超临界色谱与该反相液相色谱相串联，此时，反相液相色谱末端也切换或连接到上述所提及的压力控制单元连接，这种切换或连接的形成也可以通过上述多通阀组来实现。
如前文所述，在进行色谱柱的切换后，吸附于超临界色谱柱中的弱极性的组分继续被改性剂所冲洗，在一些优选的实施方案中，从提高洗脱效率的角度考虑，此时可以提高改性剂的流速，能够较快速的将这些低极性组分从超临界色谱柱中洗脱出。进而这些组分以及残留于体系中的超临界流动相一起进入了反相液相色谱柱中。此时，由于反相液相色谱柱末端与压力控制单元已经连接，因此，可以通过压力控制单元的操作将体系中的超临界流动相排除体系之外。这样的过程中，不会影响其他流动相或组分的状态。此时完成了步骤S22，即在反相液相色谱中，将从超临界色谱中流出的流动相去除。
卸除超临界流动相的同时或之后，采用液相色谱的液相泵向反相液相色谱柱中通入流动相。在本发明的一些实施方案中，反相液相色谱的流动相可以与前述的超临界色谱中的改性剂相同或不同，在优选方案中，二者是相同的，例如均为纯度80％以上或90％以上的甲醇水溶液，或者是100％的甲醇。本发明中，由于源自在超临界色谱中的超临界流动相被去除，而在反相液相色谱中仅保留了待分离的弱极性组分以及具有极性的改性剂，此时可以直接在反相液相色谱柱中通入极性的流动相，从而解决了不同类型的色谱柱切换时，流动相不匹配的问题。
当反相液相色谱柱体系中再次通入极性流动相之后，可以进行对弱极性物质的分离。此时完成了步骤S23，即，在上述反相液相色谱中，进一步通入流动相，将存在于反相液相色谱中的物质进行分离，得到分离出的维生素D组分。这里的维生素D组分中，包含了维生素D2和维生素D3组分。
另外，在执行上述步骤S23时，尤其是当前述使用压力控制单元将源自于超临界色谱中的超临界流动相去除完毕之后，将反相液相色谱与该压力控制单元断开，通过上述的多通阀组的切换将反相液相色谱与质谱仪进行连接。此时，可以将前述分离得到维生素D组分使用质谱进行检测和分析。
在本发明的另外一些实施方案中，在反相液相色谱部分可以包括一个以上的色谱柱。在典型的实施方案中，反相液相色谱部分可以包含两个串联的色谱柱。
步骤S21’，与上文S21步骤相同，在使用超临界色谱对待测样品进行成分分离，将非极性的油性物质去除后，停止超临界流动相的供给，并继续通入改性剂，可以通过加大通入改性剂流速的方式，借助多通阀组进行色谱柱的切换，将吸附于超临界色谱柱中的包含维生素D的弱极性成分输送到第一反相液相色谱柱中。
在步骤S22’中，起初，将第一反相液相色谱柱末端与压力控制单元相连接，并卸除输送到该色谱柱中的超临界流动相。
进而，通过多通阀组进行切换，将第一反相液相色谱柱与压力控制单元断开，并与第二反相液相色谱柱连接。
在步骤S23’中，卸除超临界流动相的同时或之后，启动液相泵，向第一反相液相色谱柱中输送极性流动相，并在第一、第二反相液相色谱柱连接后，将吸附于第一反相液相色谱柱中的弱极性组分进一步冲洗到第二反相液相色谱柱中，并在第二反相液相色谱柱中对维生素D组分进行分离。
对于在第二反相液相色谱中分离得到维生素D，可以使用与该色谱柱相串联的质谱分析仪进行分析和检测。
对于以上的第一和第二反相液相色谱柱，二者可以是相同的，也可以是不同的。在本发明优选的实施方案中，二者是不同的，例如第二反相液相色谱柱的长度大于第一反相液相色谱柱。这样的设计使得在第一反相液相色谱柱中弱极性物质更容易被冲洗，又在第二反相液相色谱柱中提高了分离的精确度。因此，第一反相液相色谱柱可以视为第二反相液相色谱柱的前处理柱，主要作用包括富集包含维生素D的弱极性物质，并去除超临界流动相。
以下，将根据附图1对本发明优选的实施方案进行说明：
使用本发明的方案对婴儿维生素D补充剂样品进行分析。取适量该油状样品，并将样品在正己烷中溶解。
将样品放入自动进样器13中，启动超临界色谱仪，分别通过泵11和液相泵12分别将超临界二氧化碳以及改性剂输送到色谱柱中14中。此时，色谱柱14通过六通阀41和46依次地与二极管阵列检测器15以及压力控制单元16相连接形成通路A。随着超临界流动相的流动，在色谱柱14中，非极性的油性成分被清洗出，而包含维生素D的弱极性组分吸附于色谱柱14的固定相上，从而完成对含有维生素D的弱极性组分的预清洗。
在维生素D的保留时间到达前，使用六通阀对系统进行切换，同时停止超临界流体的供给，但不停止改性剂的供给，并提高该改性剂的流速。同时，六通阀中41与46之间断开，并且41与42之间接通，45与46之间接通，形成通路B，该通路中依次包含色谱柱14、色谱柱22、二极管阵列检测器15以及压力控制单元16。在该通路中，流速增大的改性剂将弱极性组分从色谱柱14输送到色谱柱22中。进一步，通过压力控制单元16将残留在体系中的超临界二氧化碳排出。
将二氧化碳排除完毕后，断开六通阀的41和42、断开45和46，同时接通42和43，接通44与45，并通过液相泵21向色谱柱22中供给极性流动相。这样形成了通路C，其含有两个串联的反相液相色谱柱22和23。弱极性的组分通过管路从色谱柱22中被冲洗到色谱柱23中，并在色谱柱23中完成对维生素D组分的分离。
进而，在通路C的末端，色谱柱23可以直接与质谱检测器24相连接。从而实现对维生素D各组分的分析和检测。
<本发明的第二方面>
本发明的第二方面中，提供了用于高脂溶性成分，尤其是用于自动检测油脂或生物样品中的维生素D的系统，该系统用于执行本发明第一方面所述的检测方法。
所述系统包括：
自动进样装置；
多维色谱系统，其包括超临界色谱柱、一个或多个反相液相色谱柱，其中，所述色谱色谱柱通过多通阀组进行连接，并且，在超临界色谱柱中非极性物质被洗脱去除，弱极性物质被超临界色谱柱的固定相吸附后被进一步的输送到所述反相液相色谱柱中；
柱温箱，用于放置所述色谱柱；
液相泵，用于向所述超临界色谱柱输送改性剂、以及向所述一个或多个反相液相色谱柱输送流动相；以及
质谱检测仪器。
用于超临界液相色谱的所述改性剂与上文所述相同，可以选自醇类物质、腈类物质或它们的水溶液，优选为甲醇或其水溶液，对于其水溶液，在本发明的一些优选的方案中，可以使用80％以上或90％以上的甲醇的水溶液。
所述多维色谱系统中的超临界色谱柱以及一个或多个反相液相色谱柱之间通过多通阀组进行连接或切换，如前文所述，本发明中的多通阀组优选为六通阀组或十通阀组。
进一步，被所述超临界色谱柱吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到反相液相色谱柱中，并在该反相液相色谱柱中去除从超临界色谱柱中流出的超临界流动相。
当所述多维色谱系统包括一个反相液相色谱柱时，被所述超临界色谱柱吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到所述反相液相色谱柱中，并在该反相液相色谱柱中去除从超临界色谱柱中流出的超临界流动相，进而，所述弱极性物质在该反相液相色谱柱中进行成分的分离。
当所述多维色谱系统中包括两个反相液相色谱柱时，其中，被所述超临界色谱柱吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到第一反相液相色谱柱中，并在该反相液相色谱柱中去除从超临界色谱柱中流出的超临界流动相，
进而，弱极性物质被输送到第二反相液相色谱柱中，进行成分的分离。
所述超临界色谱柱、反相液相色谱柱的固定相和使用的流动相分别与上文公开的范围是相同的。
另外，至少将执行分离弱极性物质的反相液相色谱柱置于柱温箱中。
此外，在本发明的一些实施方案中，所述系统还具有前处理色谱柱，用于分离待测样品中的蛋白成分，例如可以将该前处理色谱柱置于所述超临界色谱柱之前。
实施例
以下说明本发明的实施例，但本发明不限定于下述的实施例。
<化学品和试剂>
分析标准化合物，维生素D2和维生素D3购自Dr.Ehrenstorfer的实验室。维他命补充剂(Baby Ddrops，批号：187759，液体Vitamin D3，每滴400IU,从Ddrops Company购买)。甲醇(LC-MS级)和正己烷(HPLC级)(Thermo Fisher Scientific公司的SFC级)。二氧化碳(CO2，纯度≥99.99％，中国北京)。
<仪器>
实验使用Shimadzu Nexera UC系统与Shimadzu LC-MS 8050(日本京都)偶联进行。UC系统由CBM-20A控制器，在线DGU-20A脱气机，LC-30AD SFCO2泵，LC-30AD改性剂泵，SIL-30AC自动进样器(带5μL样品环)，CTO-20AC柱温箱，SPD M20A二极管阵列检测器(带高压电池)和一个SFC-30A背压调节器(BPR)组成。另外，柱温箱中安装了一个高压开关六通阀，用于进行色谱柱切换。数据收集和系统控制使用Shimadzu Labsolution Ver5.8.5。
SFC柱(4.6毫米×250毫米；5微米)的SFC模式检查用于预分离，包括三种材料UC-XSilica，UC-X NH2，和UC-X Diol(二醇基)。短C18色谱柱(VP-ODS，4.6毫米×50毫米；5微米)。长C18色谱柱(4.6毫米×250毫米；5微米)来分离维生素D。两个参考柱，包括二醇基柱和C18柱(4.0毫米×10毫米；5微米)来检查在流动相中使用不同比例的甲醇时维生素D的保留时间。所有的色谱柱均购自Shimadzu-GL Sciences(上海)实验室用品有限公司。
<标准溶液的制备和样品溶液>
维生素D标准品的储备溶液在正己烷中制备，如下：D3 1mg/mL；D2 1mg/mL。所有的储备溶液都储存在-30℃。工作标准品用正己烷稀释维生素D标准储备液到10-200μg/L。
用正己烷稀释一滴Baby Ddrops(每滴大约10μg)，并且维生素D3的最终浓约为100μg/L。将维生素AD滴剂从一个软胶囊容器中挤出并用正己烷稀释，维生素D3的最终浓度约为125μg/L。
<SFC-LC/MS列切换系统>
如图1所示，SFC和LC/MS配有一个高压六通阀，它将位置在0和1之间改变。在一次分析中，阀门改变了两次，并且有三个步骤如下。
使用SFC的预清洗的步骤
在该步骤中，将含有维生素D的样品注入系统中，并且通入超临界二氧化碳流体和甲醇的混合物，使维生素D样品通过正相色谱柱，维生素D和杂质分别被保留在色谱柱上以及被分离。BPR提供15MPa的背压。在另一方面中，分别用于预处理和反相分离两个C18柱，用甲醇为1ml/min的流速冲洗。
预处理反相色谱柱上处理超临界二氧化碳的步骤
在维生素D从SFC柱洗脱之前，将阀门从位置0切换到1，并停止CO2泵的工作。流动相仅剩下0.5mL/min的流速的甲醇，BPR背压保持在15MPa。将维生素D和剩余的超临界CO2从SFC柱冲入预处理C18柱(长50mm)。维生素D被保留在该预处理C18柱中，超临界CO2流体从柱中洗脱被排出。另一方面，反相分离C18柱(长250mm)仍然以1mL/min的流速用甲醇冲洗。
使用反相分离C18柱进行分离的步骤
在维生素D从预处理C18柱洗脱之前，将阀从位置1切换回到0，并且通过甲醇以1mL/min的流速将维生素D从预处理C18柱冲洗到反相分离C18柱中。维生素D在所述反相分离C18柱中分离，然后通过MS/MS检测。数据采集在正离子电喷雾电离(ESI)模式下进行，条件如下：
毛细管电压：4千伏；接口温度：300C；DL温度：250℃；加热块的温度：400℃；喷雾气体流量：3L/分钟；加热气流量：10L/min；干燥气流量：10L/min。在该过程中使用多重反应监测(MRM)手段(维生素D2m/z 397.30>69.10，397.30>271.20；维生素D3m/z 385.30>259.20，385.30>367.30)。另一方面，SFC柱被超临界流体冲洗，其与步骤1相同，为下一次分析做准备。
<结果与讨论>
对于SFC-LC/MS柱切换条件的优化
为了确定色谱柱的类型和流动相组成对维生素D保留时间的影响，研究了维生素D在具有不同官能团的SFC柱上的保留行为以及流动相组成对保留时间的影响。
SFC的优化
三个具有不同极性官能团的超临界流体色谱柱(NH2，Diol和Silica)用于研究维生素D的保留行为。
如图2所示，维生素D的保留时间随着每个柱上改性剂甲醇的比例的下降而增加。在任意甲醇比例的条件下，保留时间维生素D2和D3几乎相同。与NH2和Silica柱相比，维生素D在二醇基柱上的保留时间最长。较长的保留时间意味着可以在SFC柱中有更多的时间将非极性油脂成分清洗去除而不导致维生素D成分的溶出或洗脱。最后，选择了二醇柱并将改性剂甲醇流量的设定为2％(相对于超临界CO2流量)用于含维生素D的油状物或脂质样品的清洗。
CO2供给停止后二醇基柱C18柱中流动相组成的影响
在CO2停止供给后，为了确定二醇基柱和C18柱中流动相组成的影响，研究了流动相中甲醇与水的比例对二醇基柱和C18柱保留行为的影响。保护柱(10mm长)用于缩短分析时间。
可以看出，在CO2停止供给后，在超临界色谱柱在中，增加流动相中甲醇的百分比会降低维生素D3在二醇基柱上的保留时间(图3)。
因此，整体来看，在SFC过程中，保持改性剂流量相对于超临界CO2流量较低的比例，并使用高含量的甲醇(90％和100％的甲醇)作为改性剂时，能够在SFC清洗过程中获得更长的维生素D的保留时间，同时在停止超临界二氧化碳供给后，又能够较快的将维生素D组分从SFC柱洗脱从而进行预处理C18柱。
进一步，对于不同含量的甲醇C18柱的保留行为也进行了研究。尽管流动相中，降低甲醇的含量增加了维生素D3的保留时间(图4)，但在C18柱中仍然可以使用高含量甲醇溶液(90％和100％的甲醇)作为流动相，即，使得SFC的改性剂与C18色谱柱中的流动相组成相同，这是由于高含量的甲醇不仅能够从二醇基柱快速洗脱维生素D3，也能够保证维生素D3在C18柱上具有足够的保留时间。
因此，从以上分析可以看出，在SFC柱中的改性剂以及在C18柱使用的流动相均可以是高含量的甲醇。
在确定了上述SFC柱中的改性剂以及C18柱中的流动相后，将从SFC柱切换到预处理C18柱的切换时间为8.5分钟，将从预处理C18柱到反相分离C18柱的切换时间设定为17.5分钟。
<对维生素D2和D3标准样品的分析>
包含维生素D2和D3的一系列标准溶液被注入到柱切换系统中。如图5所示，维生素D2和D3从所有三个柱中洗脱出来，并分别在24.9分钟和25.5分钟通过MS/MS检测。维生素D2和D3的两个尖峰是尖锐的，对称的，并且完全分开。在20.0分钟时也检测到溶剂峰。
进一步，五个浓度(20，50，100，150和200μg/L)用来构建校准曲线(图6)，可以看出，能够获得具有良好线型的曲线，在20-200μg/L的检测范围内，线性相关系数大于或等于0.998(表1)。维生素D2和D3标准样品的检测极限分别为20μg/L和16μg/L。
表1.柱切换体系中维生素D检测的线性程度
<油性液滴维生素D3的分析>
如图7所示，使用本发明的检测系统对婴儿维生素D补充剂Baby Ddrops进行直接分析。使用正己烷对油状样品进行稀释后，直接注入检测系统，得到了良好的重现性(n＝6，RSD＝1.47％，其中n为测试次数，RSD为标准偏差)。并同时获得了100％附近的回收率。
产业上的可利用性
本发明的检测方法和装置可以在工业生产上用作维生素D成分分析。

Claims (10)

1.一种快速检测油脂或生物样品中的维生素D的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：待测样品的制备；
S2：将待测样品使用多维色谱系统进行维生素D的分离；
其中，所述多维色谱系统包括依次连接的超临界色谱部分及反相液相色谱部分，所述反相液相色谱部分中包括一个或一个以上的反相液相色谱柱；
所述超临界色谱部分包括超临界流动相以及改性剂，所述改性剂选自醇类物质、腈类物质或它们的水溶液，优选为甲醇或其水溶液；
S3：检测由S2步骤分离得到的维生素D。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超临界色谱部分包括一个超临界色谱柱；所述反相液相色谱部分中包括两个反相液相色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多维色谱系统中的色谱柱通过多通阀组进行连接。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述超临界色谱部分中：
固定相选自极性基团改性的硅胶，所述极性基团选自羟基、氨基或氰基，优选地，所述改性的硅胶选自二醇基硅胶；
流动相为超临界二氧化碳。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述反相液相色谱部分中：
固定相选自疏水基团改性的硅胶，所述疏水基团选自烃基，优选地，所述改性的硅胶优选自C18-硅胶；
所述流动相为极性有机溶剂或其水溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述反相液相色谱部分的反相液相色谱柱相同或不同。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，在S2步骤中，被超临界色谱部分吸附的弱极性物质仅在所述改性剂的作用下被输送到反相液相色谱部分中，并在该反相液相色谱部分中去除从超临界色谱部分中流出的超临界流动相。
8.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，S2步骤中，包括如下步骤：
S21：使用超临界色谱柱对待测样品进行成分分离，并将弱极性物质输送到反相液相色谱柱中；
S22：在反相液相色谱柱中，将从超临界色谱柱中流出的超临界流动相去除；
S23：在上述反向液相色谱柱中，进一步通入流动相，将存在于反相液相色谱柱中的物质进行分离，得到分离出的维生素D组分；
任选地，S21步骤中所述将弱极性物质输送到反相液相色谱柱中与S22步骤同步进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，S2步骤中，包括如下步骤：
S21’：使用超临界色谱柱对样品进行成分分离，将弱极性物质输送到反相液相色谱部分的第一反相液相色谱柱中；
S22’：在第一反相液相色谱柱中，将从超临界色谱柱中流出的超临界流动相去除；
S23’：在第一反相液相色谱柱中，进一步通入流动相将存在于该色谱柱中的弱极性物质输送到第二反相液相色谱柱中，在所述第二反相液相色谱柱中分离得到维生素D组分；
任选地，S21’步骤中所述将弱极性物质输送到第一反相液相色谱柱中与S22’步骤同步进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，在S2步骤前，还包括使用前处理色谱柱分离待测样品中的蛋白成分的步骤；S3步骤中，使用质谱仪器进行检测。
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