CN108663461A - 一种测定奶粉中维生素d的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定奶粉中维生素D的方法，包括以下步骤：1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；2)采用配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素D，若二维液相色谱显示样品疑似含有维生素D时，则比较样品与维生素D标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素D；3)若确认样品中含有维生素D，则通过公式计算样品中维生素D的含量；本发明同现有技术相比，简化了操作步骤，大大缩短了前处理的时间，节省了人力和成本，实现了自动在线净化检测，提高了灵敏度，保证了测试结果的准确性和再现性。

Description

一种测定奶粉中维生素D的方法

[技术领域]

本发明属于分析化学技术领域，具体地说是一种测定奶粉中维生素D的方法。

[背景技术]

维生素D是人体必需的营养素，在自然状态下，日光照射或植物性食物是维生素D的重要来源。维生素D是类固醇衍生物，其家族最重要的成员是维生素D2和D3，可调节人体钙磷代谢，促进骨骼的健康。如人体内缺乏维生素D可导致小儿佝偻、骨骼软化等病症，而含量过高则会造成钙质增加，长期服用易引起结实等症状。由于生活方式的限制，由体内自身合成的维生素D难以满足身体的需求，必需通过食物链供给补充。维生素D常用来强化食品或保健品，特别是婴幼儿食品，维生素D含量常用来作为评价食品营养价值的重要指标。因此，有必要探索建立可靠、高效的测定方法，为维生素D的检测，相关疾病的诊断和预防提供有力的科学依据。

目前，针对婴幼儿及成人配方乳品中维生素D的分析主要存在以下3个难点：一是维生素D对温度、光照、氧气较敏感，一般需要经过包被制成分散微粒加入到食品基质中，所以前处理需要将维生素D从基质中释放出来；二是食品基质复杂，一般含有脂肪、乳化剂、类固醇、磷脂等与目标物极性类似的化合物，因此前处理过程需要净化；三是维生素D在样品中含量极低，尤其是母乳和牛奶中含量极低，因此对检测方法的灵敏度要求高。基于上述难点，目前食品中维生素D含量测定方法前处理繁琐，测定时间长，在检测应用中有不同程度的局限性。如GB5009.82-2016采用的方法需皂化破壁，有机溶剂萃取，浓缩，正相色谱净化等。

2006年国家饲料质量监督检验中心赵小阳等报道了VD3油测试方法，方法采用正己烷提取后，正相色谱分析。前处理仅使用正己烷溶解定容，并没有净化过程，方法适用范围有限，对于基质成分复杂的食品并不适合。同时使用正相色谱分析，需要使用大量的正己烷等有机溶剂，成本高，环境不友好。2016年陕西理工大学维生素D生理与应用研究所胡代花等报道了UPLC法快速测试婴幼儿维生素D滴剂，维生素D片中维生素D的检测方法。方法采用乙醇超声提取后离心，分离上层清液，残渣用乙醇重复提取两次，合并上清液再次离心后过滤测试。显然多次超声提取离心，操作耗时；乙醇超声提取的方式，也不能将维生素D从复杂的食品基质中完全释放出来。

[发明内容]

本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种测定奶粉中维生素D的方法，简化了操作步骤，大大缩短了前处理的时间，节省了人力和成本，实现了自动在线净化检测，提高了灵敏度，保证了测试结果的准确性和再现性。

为实现上述目的设计一种测定奶粉中维生素D的方法，包括以下步骤：

1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；

2)采用配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素D，若二维液相色谱显示样品疑似含有维生素D时，则比较样品与维生素D标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素D；

3)若确认样品中含有维生素D，则通过公式计算样品中维生素D的含量。

进一步地，步骤1)中，称取样品量为2g，样品中加入20mL温水、30mL无水乙醇、1g抗坏血酸、1g BHT与20mL 50％KOH水溶液，80℃水浴加热30min，完成后冷却至室温，用50％乙醇水溶液定容至100mL，取2mL过0.45μm滤膜，待上机分析。

进一步地，步骤1)中，若样品中含有淀粉，则皂化前加入适量淀粉酶。

进一步地，步骤2)中，配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定条件中，在线固相萃取部分的运行条件为：(1)维生素D富集净化柱采用PLRP-S柱，规格为4.6×12.5mm，孔径15-20um；(2)流动相为40％乙醇水溶液，运行时间为22min；流动相流速：0-4min为1mL/min；4-15min为0.2mL/min；15-22min为1mL/min，进样体积为200μL；(3)外置六通阀3的流路设置为：0-4min为4→5→7→6；8→9；4-18min为8→7→5→9；4→6；18-22min为4→5→7→6；8→9。

进一步地，步骤2)中，配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定条件中，一维液相色谱的运行条件为：(1)液相色谱柱采用Poroshell 120 EC-C8柱，规格为4.6×100mm，粒径4μm；(2)流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流动相流速为1.5mL/min；(3)采用紫外检测器，0-11min波长设置为325nm，11-22min波长设置为294nm；(4)箱内六通阀25的流路设置为：0-12.4min为17→16→19→18；14→15；12.4-13.1min为14→19→16→15；17→18；13.1-22min为17→16→19→18；14→15。

进一步地，步骤2)中，配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定条件中，二维液相色谱的运行条件为：(1)维生素D捕获柱采用Poroshell 120 EC-C18柱，规格为4.6*5mm，粒径4μm，液相色谱柱采用Eclipse PAH柱，规格为2.1*100mm，粒径3.5μm；(2)流动相为甲醇和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流速为0.4mL/min；(3)采用紫外检测器，波长设置为264nm。

进一步地，步骤2)中，经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物维生素D。

进一步地，步骤2)中，通过比较二维液相色谱中样品及标准物质的保留时间，确认样品中是否含有维生素D。

进一步地，步骤3)中，若样品中含有维生素D，则采用标准曲线外标法进行定量，并根据样品提取液中维生素D的含量，换算后计算样品中维生素D的含量。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：

(1)建立了一种采用结合多种分离机理的多维色谱模式对奶粉的皂化提取液直接进行在线净化，测试维生素D的高效液相色谱法，简化操作步骤，大大缩短前处理的时间，节省人力和成本，实现自动在线净化检测，提高灵敏度，保证测试结果的准确性和再现性，从源头防止维生素D强化剂量不准给消费者健康带来的不良影响。

(2)现有方法的前处理中，样品皂化液需要经过有机溶剂反复多次萃取转相，萃取后的有机溶剂经多次水洗至溶液呈中性后，旋转蒸发浓缩至近干。而这个过程就是整个前处理中最耗时和耗人力的步骤，限制了整个方法的效率和产能。本发明采用皂化液直接定容后上机分析，巧妙的避免了有机溶剂转相，浓缩，复溶的步骤，极大的简化样品前处理操作步骤，显著提高样品的分析效率。同时，由于使用皂化提取的方式，可确保样品中维生素D充分释放出来，皂化后定容上机分析，前处理过程简化，降低了维生素D在分析过程中氧化降解的风险，确保测试品结果的准确性和再现性。如说明书附图6所示。

(3)本发明采用皂化液直接定容后上机分析，即皂化液不需要调节pH，避免了由于样品溶液在调节pH过程中有固体析出现象而导致的目标物损失，扩大了方法的适用范围。

(4)本发明采用配有双阀三泵系统的高效液相色谱检测样品中的维生素D。固相萃取与高效液相色谱系统在线连接，实现了样品溶液的净化与二维色谱分析的自动连接。一维色谱可用于分析维生素A,E。二维色谱分析维生素D。二维色谱中首次使用了维生素D捕获柱，有效解决了目标物在色谱分配行为过程中由于扩散现象而导致的色谱峰过宽灵敏度降低的问题。

(5)本发明采用特殊填料和规格的净化柱和色谱柱，实现强碱性样品溶液的高效液相色谱分析。

(6)本发明中目标物富集在净化柱和捕获柱后，均采用与净化过程流路相反方向洗脱的方式，将目标物转移至分析柱中，获得的色谱峰，峰宽适中，对称性好。

(7)本发明中维生素D2的定量限为2μg/100g，维生素D3的定量限为2μg/100g。

[附图说明]

图1是本发明实施例1中维生素D的二维液相色谱图；

图2是本发明实施例1中配有双阀三泵分析系统的SPE上样时分析溶液流路示意图；

图3是本发明实施例1中配有双阀三泵分析系统的SPE洗脱时，VD转移至一维色谱柱时分析溶液流路示意图；

图4是本发明实施例1中配有双阀三泵分析系统的SPE清洗时，VD从一维色谱柱转移至捕获柱时分析溶液流路示意图；

图5是本发明实施例1中配有双阀三泵分析系统的SPE平衡时，VD从捕获柱转移是二维分析柱时分析溶液流路示意图；

图6是现有方法流程与本发明皂化液直接分析方法流程的对比图；

图中：1、固相萃取进样泵 2、自动进样器 3、外置六通阀 4、外置第一阀口 5、外置第二阀口 6、外置第三阀口 7、外置第四阀口 8、外置第五阀口 9、外置第六阀口 10、废液收集装置 11、固相萃取柱 12、一维分析泵 13、一维分析柱 14、箱内第一阀口 15、箱内第二阀口 16、箱内第三阀口 17、箱内第四阀口 18、箱内第五阀口 19、箱内第六阀口 20、可变波长检测器 21、二维分析泵 22、二维捕获柱 23、二维分析柱 24、二极管阵列检测器25、箱内六通阀。

[具体实施方式]

本发明属于分析化学领域对奶粉中维生素D的测定，其原理为：将样品中的维生素D用水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容，经配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定含量，通过比较样品及标准物质色谱峰保留时间对检测结果进行确认。其具体步骤为：1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；2)采用配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素D，若二维液相色谱显示样品疑似含有维生素D时，则比较样品与维生素D标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素D；3)若确认样品中含有维生素D，则通过公式计算样品中维生素D的含量。

步骤1)中，若样品中含有淀粉，则皂化前加入适量淀粉酶。步骤2)中，经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物维生素D，即通过比较二维液相色谱中样品及标准物质的保留时间，确认样品中是否含有维生素D。步骤3)中，若样品中含有维生素D，则采用标准曲线外标法进行定量，并根据所得的维生素D的含量，换算后计算样品中维生素D的含量。

本发明所述的双阀三泵高效液相色谱系统，包括固相萃取进样泵1、自动进样器2、外置六通阀3、废液收集装置10、固相萃取柱11、一维分析泵12、一维分析柱13、可变波长检测器20、二维分析泵21、二维捕获柱22、二维分析柱23、二极管阵列检测器24、箱内六通阀25，外置六通阀3上设有外置第一阀口4、外置第二阀口5、外置第三阀口6、外置第四阀口7、外置第五阀口8、外置第六阀口9，箱内六通阀25上设有箱内第一阀口14、箱内第二阀口15、箱内第三阀口16、箱内第四阀口17、箱内第五阀口18、箱内第六阀口19；固相萃取进样泵1与自动进样器2连接，用于实现样品分析溶液的吸取和进样；自动进样器2另一端与外置六通阀3的外置第一阀口4连接；固相萃取柱11两端分别与外置六通阀3的外置第二阀口5和外置第四阀口7连接，其正向流路用于实现样品分析溶液的一次净化，反向流路用于实现富集分析物的洗脱进样；废液收集装置10与外置六通阀3的外置第三阀口6连接，用于收集洗脱液；一维分析泵12与外置六通阀3的外置第五阀口8连，用于运输流动相平衡一维分析柱13和反向洗脱富集在固相萃取柱11的目标物；一维分析柱13一端与外置六通阀3的外置第六阀口9连接，一维分析柱13另一端与箱内六通阀25的箱内第一阀口14连接，用于分析部分目标物；可变波长检测器20与箱内六通阀25的箱内第二阀口15连接，用于检测目标物；二维捕获柱22两端分别与箱内六通阀25的箱内第三阀口16和箱内第六阀口19连接，其正向流路用于实现富集分析物的洗脱进样，反向流路用于实现样品分析溶液的二次净化；二维分析泵21与箱内六通阀25的箱内第四阀口17连接，用于运输流动相平衡二维分析柱23和正向洗脱富集在二维捕获柱22的目标物；二维分析柱23一端与箱内六通阀25的箱内第五阀口18连接，二维分析柱23另一端与二极管阵列检测器24连接，用于检测目标物。

下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明：

实施例1：奶粉中生素D的测定

1.样品的制备：

准确称取混匀后的样品2g于150mL平底烧瓶中，加入20mL蒸馏水，30mL无水乙醇，1g抗坏血酸，1g BHT，20mL50％KOH水溶液，80℃水浴加热30min，完成后冷却至室温，用50％乙醇水溶液定容至100mL，取2mL过0.45μm滤膜，上机分析。

2.设定仪器参数：

在线固相萃取部分的运行条件为：

(1)维生素D富集净化柱采用PLRP-S柱，规格为4.6×12.5mm，孔径15-20um；

(2)流动相为40％乙醇水溶液，运行时间为22min；流动相流速：0-4min为1mL/min；4-15min为0.2mL/min；15-22min为1mL/min，进样体积为200μL；

(3)外置六通阀3的流路设置为：0-4min为4→5→7→6；8→9；4-18min为8→7→5→9；4→6；18-22min为4→5→7→6；8→9。

一维液相色谱的测定条件为：

(1)液相色谱柱采用Poroshell 120EC-C8柱，规格为4.6×100mm，粒径4μm；

(2)流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流动相流速为1.5mL/min；

(3)采用紫外检测器，0-11min波长设置为325nm，11-22min波长设置为294nm；

(4)箱内六通阀25的流路设置为：0-12.4min为17→16→19→18；14→15；12.4-13.1min为14→19→16→15；17→18；13.1-22min为17→16→19→18；14→15。

二维液相色谱的测定条件为：

(1)维生素D捕获柱采用Poroshell 120EC-C18柱，规格为4.6*5mm，粒径4μm；

(2)液相色谱柱采用Eclipse PAH柱，规格为2.1*100mm，粒径3.5μm；

(3)流动相为甲醇和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流动相流速为0.4mL/min

(4)采用紫外检测器，波长设置为264nm。

3.定性

经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物。

4.定量

采用标准曲线外标法定量。

5.计算

根据样品提取液中维生素D的含量，进行样品中维生素D含量的计算。

本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种测定奶粉中维生素D的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)样品处理：将奶粉样品混匀，称取适量，加入水、无水乙醇、抗坏血酸、BHT及KOH水溶液，加热皂化，皂化完成后冷却定容；

2)采用配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定步骤1)所得的溶液中是否含有维生素D，若二维液相色谱显示样品疑似含有维生素D时，则比较样品与维生素D标准物质的保留时间，以确认样品中是否含有维生素D；

3)若确认样品中含有维生素D，则通过公式计算样品中维生素D的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，称取样品量为2g，样品中加入20mL温水、30mL无水乙醇、1g抗坏血酸、1g BHT与20mL 50％KOH水溶液，80℃水浴加热30min，完成后冷却至室温，用50％乙醇水溶液定容至100mL，取2mL过0.45μm滤膜，待上机分析。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，若样品中含有淀粉，则皂化前加入适量淀粉酶。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定条件中，在线固相萃取部分的运行条件为：

(1)维生素D富集净化柱采用PLRP-S柱，规格为4.6×12.5mm，孔径15-20um；

(2)流动相为40％乙醇水溶液，运行时间为22min；流动相流速：0-4min为1mL/min；4-15min为0.2mL/min；15-22min为1mL/min，进样体积为200μL；

(3)外置六通阀3的流路设置为：0-4min为4→5→7→6；8→9；4-18min为8→7→5→9；4→6；18-22min为4→5→7→6；8→9。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定条件中，一维液相色谱的运行条件为：

(1)液相色谱柱采用Poroshell 120EC-C8柱，规格为4.6×100mm，粒径4μm；

(2)流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流动相流速为1.5mL/min；

(3)采用紫外检测器，0-11min波长设置为325nm，11-22min波长设置为294nm；

(4)箱内六通阀25的流路设置为：0-12.4min为17→16→19→18；14→15；12.4-13.1min为14→19→16→15；17→18；13.1-22min为17→16→19→18；14→15。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，配有双阀三泵系统的高效液相色谱仪测定条件中，二维液相色谱的运行条件为：

(1)维生素D捕获柱采用Poroshell 120EC-C18柱，规格为4.6*5mm，粒径4μm，液相色谱柱采用Eclipse PAH柱，规格为2.1*100mm，粒径3.5μm；

(2)流动相为甲醇和乙腈，采用梯度洗脱，运行时间为22min；流速为0.4mL/min；

(3)采用紫外检测器，波长设置为264nm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，经样品峰和标准品峰的保留时间相比较，确认色谱峰保留时间是否一致，从而确定样品中是否检出待测物维生素D。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，通过比较二维液相色谱中样品及标准物质的保留时间，确认样品中是否含有维生素D。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，若样品中含有维生素D，则采用标准曲线外标法进行定量，并根据样品提取液中维生素D的含量，换算后计算样品中维生素D的含量。