CN115136886A - 一种四倍体紫雨桦的创制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四倍体紫雨桦的创制方法，属于植物育种技术领域。上述创制方法包括以下步骤：(1)切取二倍体紫雨桦叶片或幼茎，接种于预培养基中，预培养0‑4天后，再转接于含有秋水仙素的诱导培养基中，诱导培养6‑10天；(2)经诱导培养后，再转接于所述预培养基培养至长出愈伤组织；(3)将所述愈伤组织转接于分化培养基中进行分化培养，获取不定芽；(4)不定芽长到2‑3cm高时，转接于生根培养基中进行生根培养，生根培养35‑45天；(5)炼苗及移栽，获得四倍体紫雨桦。由于四倍体紫雨桦具有红绿饱和度及花青素含量高的特点，对于提升紫雨桦的抗寒特性及观赏性，美化城市环境具有重要意义。

Description

一种四倍体紫雨桦的创制方法
技术领域
本发明涉及植物育种技术领域，特别是涉及一种四倍体紫雨桦的创制方法。
背景技术
紫雨桦(Betula pendula 'Purple Rain')是来自欧洲白桦(Betula pendulaRoth.)的一个彩叶树品种，其叶片紫色，树干灰白色，观赏价值较高，在欧洲及北美广泛应用于庭院装饰和城市绿化。哈尔滨市于2001年引进的是二倍体紫雨桦，试验多年后发现，该品种秋天结束生长较晚，枝条顶部常常受早霜危害，导致主干和侧枝弯曲，观赏价值明显降低。因此，提高紫雨桦的抗寒性是当前急需解决的问题。
研究团队前期对白桦四倍体研究显示，与其它林木多倍体一样，具有叶片、花序、果序形态均表现巨大性以及较强等特点。借鉴白桦倍性育种经验，紫雨桦多倍体育种途径有望突破其在寒冷北方生长差的问题。虽然利用秋水仙碱诱导染色体加倍选育四倍体在白桦等林木中都已成功应用，但在紫雨桦中利用该方法选育四倍体尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种四倍体紫雨桦的创制方法，以解决上述现有技术存在的问题，同时进一步提升紫雨桦的观赏性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种四倍体紫雨桦的创制方法，包括以下步骤：
(1)切取二倍体紫雨桦叶片或幼茎，接种于预培养基中，预培养0-4天后，再转接于含有秋水仙素的诱导培养基中，诱导培养6-10天；
(2)经诱导培养后，再转接于所述预培养基培养至长出愈伤组织；
(3)将所述愈伤组织转接于分化培养基中进行分化培养，获取不定芽；
(4)不定芽长到2cm-3cm高时，转接于生根培养基中进行生根培养，生根培养35-45天；
(5)炼苗及移栽，获得四倍体紫雨桦。
优选的是，在步骤(1)中，所述预培养基的组分包括WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+0.5mg/L GA3。
优选的是，在步骤(1)中，所述诱导培养基的组分包括WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+0.5mg/L GA3+(0.4-1.0)g/L秋水仙素。
优选的是，在步骤(3)中，所述分化培养基的组分包括WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA3。
优选的是，在步骤(4)中，所述生根培养基组分包括WPM+0.4mg/L IBA。
优选的是经分化培养得到所述不定芽，并且在所述不定芽转接所述生根培养基之前，还包括将所述不定芽转接于继代培养基继代培养的步骤。
优选的是，所述继代培养基组分包括WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用预培养2天的叶片，经0.04％秋水仙素诱导10天；或预培养2天的幼茎，经0.10％秋水仙素诱导8天，获得四倍体紫雨桦，诱导率分别为34.84％、20.97％，由于四倍体紫雨桦具有红绿饱和度及花青素含量高的特点，对于提升紫雨桦的抗寒特性及观赏性，美化城市环境具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为生根培养的二倍体紫雨桦；
图2为秋水仙素诱导获得的愈伤组织；
图3为获得的生根培养的四倍体紫雨桦；
图4为移栽2个月的紫雨桦；
图5为四倍体紫雨桦的染色体倍性分析仪检测结果；
图6为移栽的紫雨桦平视图(左：二倍体、右：四倍体)；
图7为移栽的紫雨桦俯视图，其中，a为二倍体紫雨桦，b为四倍体紫雨桦；
图8为二倍体及四倍体紫雨桦L*值及a*值的变化，其中，a为L*值的变化，b为a*值的变化；
图9为二倍体及四倍体紫雨桦花青素及叶绿素相对含量的变化，其中，a为花青素相对含量，b为叶绿素相对含量；
图10为二倍体及四倍体紫雨桦叶片长和叶片宽比较，其中，a为叶片长，b为叶片宽；
图11为二倍体及四倍体紫雨桦株高比较。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
在下文的描述中，所涉及的方法如无特别说明，则均为本领域的常规方法。所涉及的原料如无特别说明，则均是能从公开商业途径获得的原料。
实施例1秋水仙素诱导紫雨桦培育四倍体植株
1、材料与方法
试验材料取自黑龙江省帽儿山实验林场场部的二倍体紫雨桦单株。
1.1外植体消毒
采集带有腋芽的紫雨桦枝条带回实验室，将枝条上腋芽小心取下后放入组培瓶中，用清水清洗1遍后，再放入含有适量的洗洁精水溶液中清洗1遍，由自来水洗2-3遍，随后在超净工作台中用无菌水清洗2遍，加入75％的酒精摇晃1min，用无菌水清洗2遍，时间在2min左右，加入30％H2O2摇晃10min，再用无菌水冲洗3遍。
1.2二倍体紫雨桦(2n＝2x)腋芽的初代培养
在超净工作台中，用尖镊子剥离去除芽鳞，取出白色的腋芽接种于初代培养基上[1升培养基中：20g蔗糖+5-5.5g琼脂(优选5g琼脂)+1.99g WPM+1mL硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA，用NaOH将pH调到5.8--6.2之间]，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，由于刚刚接种的腋芽释放一些代谢物，导致培养基产生褐化现象，故此需要每日将腋芽转接至新鲜的初代培养基中，直至不再褐化为止(5天左右)。
1.3脱分化培养
在初代培养基中，待紫雨桦腋芽展叶后，立即切取叶片转接于脱分化培养基中[1升培养基中：20g蔗糖+5-5.5g琼脂(优选5g琼脂)+1.99g WPM+1mL硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA3，用NaOH将pH调到5.8--6.2之间]，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，25天更换一次培养基。待长出愈伤组织后立即切取愈伤组织转接于分化培养基中[1升培养基中：20g蔗糖+5-5.5g琼脂(优选5g琼脂)+1.99g WPM+1mL硝酸钙+1.0mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA，用NaOH将pH调到5.8--6.2之间]，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，待产生不定芽后，转接至继代培养基中[1升培养基中：20g蔗糖+5-5.5g琼脂(优选5g琼脂)+1.99g WPM+1mL硝酸钙+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA，用NaOH将pH调到5.8--6.2之间]，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，继代培养2次，25天更换一次培养基。
1.4二倍体紫雨桦的生根培养
切取高度在2cm左右的无根苗，接种于生根培养基中[1升培养基中20g蔗糖+5-5.5g琼脂(优选5g琼脂)+1.99g WPM+1mL硝酸钙+0.4mg/L IBA]，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，培养25-30天(优选为25天)，如图1。
1.5四倍体紫雨桦的诱导及鉴定
(1)叶片及幼茎的预培养及诱导
试验采用L9(33)正交试验设计，设计秋水仙素浓度(A)、预培养时间(B)、诱导时间(C)3个因素，每个因素3水平，共计9个处理，每处理10次重复(表1)。分别切取叶片(或幼茎)，接种于预培养基中(WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3)，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养0、2、4天，待预培养结束后，按试验设计分别转接于诱导培养基(WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3+不同浓度的秋水仙素)中，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，按试验设计分别暗处理下诱导6天、8天、10天。
表1三因素的L9(33)正交试验设计
Figure BDA0003777183110000051
待秋水仙素处理结束后，转接于预培养基(WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L GA3)中，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，待长出愈伤组织(如图2)后，立即切取愈伤组织转接于分化培养基(WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA3)中，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，长出不定芽后转接于继代培养基(WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA)中，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，不定芽长到2-3cm高时，转接于生根培养基(WPM+0.4mg/L IBA)中进行生根培养，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，如图3为获得的生根培养的四倍体紫雨桦。
(2)四倍体紫雨桦的鉴定
生根培养基40天左右即可开始炼苗，置于温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为4000～5000lx(优选为4500lx)条件下培养，炼苗7天左右将分别移栽至40cm×40cm的育苗盘中(25孔)，置于组培室培养(图4)，培养温度为25℃±2℃(优选为25℃)，光照16h/黑暗8h，光照强度为6000lx～7000lx(优选为6500lx)，待幼苗长出4-5片叶时，摘取1片叶，采用倍性测定仪对移栽苗木进行倍性检测(检测结果如图5)，并统计每个处理获得四倍体紫雨桦的数量，求算四倍体诱导率。
诱导率＝四倍体紫雨桦株数/幼苗总株数。
结果显示，利用秋水仙素诱导叶片组织细胞染色体加倍的9个处理组合中，诱导率最高的为处理4和处理6，分别为34.84％、31.46％(表2)，显著高于其他处理组合；以幼茎为材料进行诱导，只有处理6组合的诱导率最高，为20.97％(表3)。
表2秋水仙素诱导紫雨桦叶片不同处理组合诱导率比较
Figure BDA0003777183110000061
Figure BDA0003777183110000071
表3秋水仙素诱导紫雨桦幼茎不同处理组合诱导率比较
Figure BDA0003777183110000072
1.6四倍体紫雨桦的生长及叶色调查
5月末将染色体倍性鉴定后的苗木分别移栽至直径为21cm的花盆中，置于塑料棚中培养(如图6、图7)。分别于6月1日、7月1日采用分光色差仪(CR-400，Japan)、便携式花青素含量测定仪(OPTI-SCIENCES ACM-200plus)、便携式叶绿素测定仪(SPAD-502 PLUS，KONICA MINOLTA)测定叶片亮度、花青素相对含量、叶绿素相对含量，同时测定叶长、叶宽和株高等性状。
采用CR–400色差仪测定L*值和a*值，其中L*表示叶片亮暗程度，该值越高则表示叶片亮度较高；a*表示红绿饱和度，“+”表示偏红，“-”表示偏绿，调查结果显示，在叶片亮暗程度方面，7月初四倍体紫雨桦叶片亮度显著低于二倍体；在红绿饱和度方面，6月初，四倍体与二倍体紫雨桦均为深紫色，a*值分别为3.18和3.58，在7月初，四倍体叶片仍为深紫色，而二倍体叶片a*值为-1.54，叶色偏绿(图8)；在花青素和叶绿素相对含量方面，四倍体紫雨桦显著高于二倍体紫雨桦或差异不显著(图9)。在叶片长、叶片宽方面：6月初，四倍体紫雨桦显著低于二倍体，到了7月初二者差异不显著(图10)，四倍体的株高生长显著低于二倍体紫雨桦(图11)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种四倍体紫雨桦的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)切取二倍体紫雨桦叶片或幼茎，接种于预培养基中，预培养0-4天后，再转接于含有秋水仙素的诱导培养基中，诱导培养6-10天；
(2)经诱导培养后，再转接于所述预培养基培养至长出愈伤组织；
(3)将所述愈伤组织转接于分化培养基中进行分化培养，获取不定芽；
(4)不定芽长到2-3cm高时，转接于生根培养基中进行生根培养，生根培养35-45天；
(5)炼苗及移栽，获得四倍体紫雨桦。
2.根据权利要求1所述的创制方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述预培养基的组分包括WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+0.5mg/L GA3。
3.根据权利要求1所述的创制方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述诱导培养基的组分包括WPM+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+0.5mg/L GA3+(0.4-1.0)g/L秋水仙素。
4.根据权利要求1所述的创制方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述分化培养基的组分包括WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA+0.5mg/L GA3。
5.根据权利要求1所述的创制方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述生根培养基组分包括WPM+0.4mg/L IBA。
6.根据权利要求1所述的创制方法，其特征在于，经分化培养得到所述不定芽，并且在所述不定芽转接所述生根培养基之前，还包括将所述不定芽转接于继代培养基继代培养的步骤。
7.根据权利要求7所述的创制方法，其特征在于，所述继代培养基组分包括WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA。
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