CN103125399A - 一种白桦四倍体组培快繁的方法 - Google Patents

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刘子嘉
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一种白桦四倍体组培快繁的方法，涉及一种白桦四倍体组培快繁的方法。本发明是要解决现有白桦组培扩繁技术愈伤组织分化难、增值倍数低的问题。该方法包括以下内容：一、白桦四倍体外植体的选择；二、初代培养；三、愈伤组织分化培养；四、继代增殖培养；五、组培苗的生根培养；六、炼苗及移栽，即得到白桦四倍体。该方法通过对培养基激素种类、含量以及组培苗生根次数的调整，使初代培养获得的四倍体愈伤组织分化率达36%，白桦四倍体增殖倍数达14.89，移栽成活率在95%以上，从而满足白桦优良四倍体快速扩繁的需求。该方法可应用于白桦组培领域。

Description

一种白桦四倍体组培快繁的方法
技术领域
本发明涉及一种白桦四倍体组培快繁的方法。
背景技术
白桦（Betula platyphylla Suk.）是东北地区珍贵的阔叶树种之一，也是主要的造林树种和工业用材树种，我国对于白桦倍性育种的研究始于2004年，采用秋水仙素可以诱导白桦种子创制白桦四倍体。前期的研究表明，四倍体白桦的雄配子不育，而雌配体发育正常，即♀4x×♂2x杂交子代全部为三倍体，这为创制白桦三倍体提供一条最为有效的途径。然而，用于杂交的四倍体母本及杂交获得的三倍体子代家系间在生长、抗性方面存在较大差异，因此为了获得优质、抗逆的白桦三倍体新品种，必须选育优良双亲以满足需要。
白桦四倍体由于染色体组的加倍，伴随着生理代谢等方面的改变，目前采用白桦扦插和嫁接等方式进行无性繁殖十分困难，组培扩繁是最有效的方法，而现有的白桦组培扩繁技术存在愈伤组织分化难、增殖倍数低等诸多问题，已不适用于白桦四倍体的扩繁。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有白桦组培扩繁技术愈伤组织分化难、增值倍数低等问题，提供一种白桦四倍体组培快繁的方法。
本发明的一种白桦四倍体组培快繁的方法包括以下步骤：
一、外植体的选择与消毒：选取白桦四倍体当年生枝条流水冲洗1～2天，摘取腋芽在体积百分含量为70%～75%的乙醇溶液中浸泡1～2min，将乙醇倒掉，再将腋芽在灭菌蒸馏水中浸泡1～2min；在超净工作台中剥去外层芽鳞，在体积百分含量为0.1%～0.15%升汞中浸泡5～8min，再将腋芽置于质量百分含量为10%的次氯酸钙溶液中浸泡8～10min，再用灭菌蒸馏水漂洗3～5次，即得到消毒处理后的外植体；
二、初代培养：将步骤一中消毒处理后得到的外植体接种到初代培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d的条件下培养25～30d，得愈伤组织，所述的初代培养基包含WPM培养基和浓度为0.8mg/L～1.2mg/L的6-BA；
三、愈伤组织的分化培养：将步骤二中得到的愈伤组织接种于分化培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养25d，得不定芽，所述的分化培养基包含WPM培养基、浓度为0.8mg/L～1.2mg/L的6-BA及浓度为0.15mg/L的GA3；
四、不定芽增殖培养：将步骤三中得到的不定芽转接至继代增殖培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养25d～30d，得继代丛生芽，所述的继代增殖培养基包含WPM培养基和浓度为1.0mg/L～1.2mg/L的6-BA；
五、生根培养：将步骤四中得到的继代丛生芽转接至生根培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养20d至基部长出长度为0.5～1cm的根，再将上述生根组培苗转接至用生根培养液浸透的生根基质中，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照为16h/d条件下培养30～35d，得到具有发达根系的生根苗，所述的生根培养基为包含WPM培养基和浓度为0.2～0.4mg/L的IBA，所述的生根培养液为WPM培养液和浓度为0.2～0.4mg/L的IBA，所述的生根基质为3份草炭土、2份黑土、1份蛭石及1份河沙；
六、炼苗及移栽：将步骤五得到的具有发达根系的生根苗在组培室中炼苗1～2d，然后将组培瓶移至塑料大棚中炼苗5～7d，然后移栽至育苗杯中继续生长，即完成白桦四倍体的组织培养。
本发明包含以下有益效果：
该方法通过对培养基激素种类、含量以及组培苗生根次数的调整，使初代培养获得的四倍体愈伤组织由已有技术的不分化，到分化率达36%，白桦四倍体增殖倍数达14.89，移栽成活率在95%以上，从而满足白桦优良四倍体快速扩繁的需求。
附图说明
图1是白桦四倍体初代培养的图片；
图2是腋芽基部生成愈伤组织的图片；
图3是白桦四倍体继代培养的图片；
图4是白桦四倍体生根培养的图片；
图5是白桦四倍体生根培养的图片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的一种白桦四倍体组培快繁的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行：
一、外植体的选择与消毒：选取白桦四倍体当年生枝条流水冲洗1～2天，摘取腋芽在体积百分含量为70%～75%的乙醇溶液中浸泡1～2min，将乙醇倒掉，再将腋芽在灭菌蒸馏水中浸泡1～2min；在超净工作台中剥去外层芽鳞，在体积百分含量为0.1%～0.15%升汞中浸泡5～8min，再将腋芽置于质量百分含量为10%的次氯酸钙溶液中浸泡8～10min，再用灭菌蒸馏水漂洗3～5次，即得到消毒处理后的外植体；
二、初代培养：将步骤一中消毒处理后得到的外植体接种到初代培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d的条件下培养25～30d，得愈伤组织，所述的初代培养基包含WPM培养基和0.8mg/L～1.2mg/L的6-BA；
三、愈伤组织的分化培养：将步骤二中得到的愈伤组织接种于分化培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养25d，得不定芽，所述的分化培养基包含WPM培养基、0.8mg/L～1.2mg/L的6-BA及0.15mg/L的GA3；
四、不定芽增殖培养：将步骤三中得到的不定芽转接至继代增殖培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养25d～30d，得继代丛生芽，所述的继代增殖培养基包含WPM培养基和1.0mg/L～1.2mg/L的6-BA；
五、生根培养：将步骤四中得到的继代丛生芽转接至生根培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养20d至基部长出长度为0.5～1cm的根，再将上述生根组培苗转接至用生根培养液浸透的生根基质中，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照为16h/d条件下培养30～35d，得到具有发达根系的生根苗，所述的生根培养基为包含WPM培养基和0.2～0.4mg/L的IBA，所述的生根培养液为WPM培养液和0.2～0.4mg/L的IBA，所述的生根基质为3份草炭土、2份黑土、1份蛭石及1份河沙；
六、炼苗及移栽：将步骤五得到的具有发达根系的生根苗在组培室中炼苗1～2d，然后将组培瓶移至塑料大棚中炼苗5～7d，然后移栽至育苗杯中继续生长，即完成白桦四倍体的组织培养。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中外植体为当年枝上的健康、饱满腋芽。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中乙醇的体积百分含量为70%。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中升汞的体积百分含量为0.1%。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二初代培养基中包含的6-BA的浓度为0.8mg/L。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三分化培养基中包含的6-BA的浓度为0.8mg/L。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四继代增殖培养基中包含的6-BA的浓度为1.2mg/L。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤五生根培养基中包含的IBA的浓度为0.3mg/L，生根培养液中包含的IBA的浓度为0.3mg/L。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤六中塑料大棚温度条件为：白天25℃～28℃，夜间15℃～20℃。其它与具体实施方式一至八之一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：一种白桦四倍体（SB4）组培快繁方法，按以下步骤进行：一、外植体的选择与消毒：选取白桦四倍体（SB4）当年生枝条，切断后流水冲洗2d，摘取腋芽置于体积百分含量为70%的乙醇中浸泡1min，再用灭菌蒸馏水浸泡1min，于超净台上剥去外层芽鳞，随后在体积百分含量为0.1%升汞中浸泡8min后，置于质量百分含量为10%的次氯酸钙溶液中浸泡10min，期间不断搅动，最后用灭菌蒸馏水漂洗5次；二、初代培养：将消毒后的腋芽接种到初代培养基上，如图1所示，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养27d至基部形成愈伤组织，结果如图2所示；三、愈伤组织的分化培养：切取愈伤组织接种于分化培养基上，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养25d至形成不定芽；四、芽增殖培养：将不定芽转接至继代增殖培养基上，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养25d至形成继代丛生芽，结果如图3所示，根据对丛生芽数量的需求，每隔25天左右按同样方法进行一次再增殖；五、生根培养：切取继代苗单株转接至生根培养基上，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养20d至基部长出0.5～1cm的根系，结果如图4所示，再将上述生根组培苗转接至用生根培养液浸透的生根基质中，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养30d至生根，结果如图5所示；六、炼苗及移栽：在组培室中将瓶盖打开1/5炼苗2d，然后将组培瓶移至塑料大棚中，瓶盖打开1/3继续炼苗5d，最后直接带土坨移栽；
其中步骤二所用的初代培养基为：WPM+6-BA0.8mg/L；步骤三所用的分化培养基为：WPM+6-BA0.8mg/L+GA30.15mg/L；其中步骤四所用的继代增殖培养基为：WPM+6-BA1.0mg/L；其中步骤五所用的生根培养基为：WPM+IBA0.4mg/L，生根培养液为：WPM+IBA0.4mg/L，生根基质为3份草炭土、2份黑土、1份蛭石、1份河沙。
通过本实施例进行白桦四倍体（SB4）组培扩繁，愈伤增殖倍数为15.11，移栽成活率为99%。
实施例二：一种白桦四倍体（SB9）组培快繁方法，按以下步骤进行：一、外植体的选择与消毒：选取白桦四倍体（SB9）当年生枝条，切断后流水冲洗1d，摘取腋芽置于体积百分含量为70%乙醇中2min，再用灭菌蒸馏水浸泡2min，于超净台上剥去外层芽鳞，随后在体积百分含量为0.1%升汞中浸泡5min后，置于质量百分含量为10%的次氯酸钙溶液中8min，期间不断搅动，最后用灭菌蒸馏水漂洗4次；二、初代培养：在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养30d至基部形成愈伤组织；三、愈伤组织的分化培养：切取愈伤组织接种于分化培养基上，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养25d至形成不定芽；四、芽增殖培养：将不定芽转接至继代增殖培养基上，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养27d至形成继代丛生芽，根据对丛生芽数量的需求，每隔25天左右按同样方法进行一次再增殖。五、生根培养：切取继代苗单株转接至生根培养基上，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养20d至基部长出0.5～1cm的根系，再将上述生根组培苗转接至用生根培养液浸透的生根基质中，在温度为25℃，光照强度为1500Lx，光照时间为16h/d条件下培养30d至生根。六、炼苗及移栽：在组培室中将瓶盖打开1/5炼苗2d，然后将组培瓶移至塑料大棚中，瓶盖打开1/3继续炼苗6d，最后直接带土坨移栽；
其中步骤二所用的初代培养基为：WPM+6-BA0.8mg/L；步骤三所用的分化培养基为：WPM+6-BA0.8mg/L+GA30.15mg/L；其中步骤四所用的继代增殖培养基为：WPM+6-BA1.0mg/L；其中步骤五所用的生根培养基为：WPM+IBA0.4mg/L，生根培养液为：WPM+IBA0.4mg/L，生根基质为3份草炭土、2份黑土、1份蛭石、1份河沙。
通过本实施例进行白桦四倍体（SB9）组培扩繁，增殖倍数为14.67，移栽成活率为95%。

Claims (9)

1.一种白桦四倍体组培快繁的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
一、外植体的选择与消毒：选取白桦四倍体当年生枝条，采用流水冲洗1～2天，然后摘取枝条上的腋芽在体积百分含量为70%～75%的乙醇溶液中浸泡1～2min，将乙醇倒掉，再将腋芽在灭菌蒸馏水中浸泡1～2min；然后在超净工作台中剥去外层芽鳞，在体积百分含量为0.1%～0.15%升汞中浸泡5～8min，再将腋芽置于质量百分含量为10%的次氯酸钙溶液中浸泡8～10min，再用灭菌蒸馏水漂洗3～5次，即得到消毒处理后的外植体；
二、初代培养：将步骤一中消毒处理后得到的外植体接种到初代培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d的条件下培养25～30d，得愈伤组织，所述的初代培养基包含WPM培养基和浓度为0.8mg/L～1.2mg/L的6-BA；
三、愈伤组织的分化培养：将步骤二中得到的愈伤组织接种于分化培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养25d，得不定芽，所述的分化培养基包含WPM培养基、浓度为0.8mg/L～1.2mg/L的6-BA和浓度为0.15mg/L的GA3；
四、不定芽增殖培养：将步骤三中得到的不定芽转接至继代增殖培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养25d～30d，得继代丛生芽，所述的继代增殖培养基包含WPM培养基和浓度为1.0mg/L～1.2mg/L的6-BA；
五、生根培养：将步骤四中得到的继代丛生芽转接至生根培养基上，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照时间为16h/d条件下培养20d至基部长出长度为0.5～1cm的根，再将上述生根组培苗转接至用生根培养液浸透的生根基质中，在温度为23～27℃、光照强度为1000～1500Lx、光照为16h/d条件下培养30～35d，得到具有发达根系的生根苗，所述的生根培养基为包含WPM培养基和浓度为0.2～0.4mg/L的IBA，所述的生根培养液包含WPM培养液和浓度为0.2～0.4mg/L的IBA，所述的生根基质包含3份草炭土、2份黑土、1份蛭石以及1份河沙；
六、炼苗及移栽：将步骤五得到的具有发达根系的生根苗在组培室中炼苗1～2d，然后将组培瓶移至塑料大棚中炼苗5～7d，然后移栽至育苗杯中继续生长，即完成白桦四倍体的组织培养。
2.根据权利要求1所述的一种白桦四倍体组培快繁的方法，其特征在于步骤一中外植体为当年枝上的健康、饱满腋芽。
3.根据权利要求2所述的一种白桦四倍体组培快繁的方法，其特征在于步骤一中乙醇的体积百分含量为70%。
4.根据权利要求3所述的一种白桦四倍体组培快繁的方法，其特征在于步骤一中升汞的体积百分含量为0.1%。
5.根据权利要求4所述的一种白桦四倍体组培快繁方法，其特征在于步骤二初代培养基中包含的6-BA的浓度为0.8mg/L。
6.根据权利要求5所述的一种白桦四倍体组培快繁方法，其特征在于步骤三分化培养基中包含的6-BA的浓度为0.8mg/L。
7.根据权利要求6所述的一种白桦四倍体组培快繁方法，其特征在于步骤四继代增殖培养基中包含的6-BA的浓度为1.2mg/L。
8.根据权利要求7所述的一种白桦四倍体组培快繁方法，其特征在于步骤五生根培养基中包含的IBA的浓度为0.3mg/L，生根培养液中包含的IBA的浓度为0.3mg/L。
9.根据权利要求8所述的一种白桦四倍体组培快繁方法，其特征在于步骤六中塑料大棚温度条件为：白天25℃～28℃，夜间15℃～20℃。
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