CN112399974A - 与人Claudin 18.2结合的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种与人Claudin 18.2特异结合的分离的单克隆抗体。还提供编码该抗体的核酸分子，以及用于表达该抗体的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供包含该抗体的免疫交联物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本申请的Claudin 18.2抗体的诊断或治疗方法。

Description

与人Claudin 18.2结合的抗体及其用途
技术领域
本申请涉及一种与人Claudin 18.2特异结合的抗体、及其制备和用途，尤其是其在诊断、预防和治疗与表达Claudin 18.2的细胞相关的疾病中的用途，疾病包括肿瘤，例如胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌。
背景技术
癌症和抗体疗法
癌症是如今我们社会中的头号致命疾病之一。据2014世界癌症报告称，每年约新发生1410万例癌症，这还不包括除黑色素瘤之外的皮肤癌症。癌症每年造成约880万例死亡(GBD 2015 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators，(2016)Lancet 388(10053)：1545-1602)。例如，胃癌是发达国家中癌症相关死亡的第四(对于男性而言)和第五大(对于女性而言)常见原因。
很多癌症，特别是处于晚期的那些，很难治愈。例如，胃食管癌的五年存活率仅为20- 25％，尽管当前的标准治疗方法具有积极意义，其本身带来相当的副作用。对于胰腺癌而言，病人通常在晚期才被诊断出来，因此预后相当差，中位存活时间少于6个月，且5年存活率低于5.5％。
抗体疗法在多地被批准用于治疗多种癌症，且显著改善患者最终结果(Komeev etal.， (2017)Cytokine 89：127-135)。一旦结合到癌症抗原上，抗体可以引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，激活补体系统，或防止受体与其配体发生作用，所有这些均能引起癌细胞死亡。美国FDA批准的抗体药物包括阿仑单抗(Alemtuzumab)、纳武单抗(Nivolumab)、利妥昔单抗(Rituximab)和德瓦鲁单抗(Durvalumab)等。
Claudin 18.2
Claudin，由Shorichiro Tsukita等人在1998年首次报道(Furuse et al.，(1998)J Cell Biol 141(7)：1539-1550)，是一类建立细胞旁屏障并控制细胞间分子流动的细胞表面蛋白家族(Singh et al.，(2010)J Oncol 2010：541957)。Claudin是紧密结合的必需成分，在保持上皮细胞极性、控制细胞旁扩散、以及调控细胞生长分化方面起到重要作用。另两个主要的紧密结合家族蛋白是闭合蛋白和连接粘合分子(JAM)。各Claudin分子跨细胞膜4次，N端和C端均落在细胞质中。
迄今已在哺乳动物中发现24个claudin成员，其中Claudin 13不存在于人类中。不同的claudin成员在不同组织中表达，且其改变的功能与癌症形成相关联。Claudin 1、Claudin 18和Claudin 10的表达量变化分别与肠癌、胃癌和肝细胞癌相关，因此claudin成为了有前景的用于治疗策略的靶点(Swisshelm et al.，(2005)Adv Drug Deliv Rev 57(6)：919-928)。
Claudin 18，又称CLD18，有两种亚型。Claudin 18.1选择性地表达在正常肺和胃上皮。Claudin 18.2在正常组织中的表达也高度受限，仅限于胃上皮的分化短寿细胞中，而特别地不存在于胃干细胞区。
然而，Claudin 18.2在大比例的原发胃癌及其转移癌中大量存在，并在其恶变中发挥重要作用。例如，在胰腺、食道、卵巢和肺肿瘤中发现有Claudin 18.2的频繁异位激活((Niimi et al.，(2001)Mol Cell Biol 21(21)：7380-7390；Tanaka et al.(2011)JHistochem Cytochem 59(10)：942-952；Micke et al.，(2014)Int J Cancer 135(9)：2206-2214； Shimobaba et al.(2016)Biochim Biophys Acta 1863(6Pt A)：1170-1178；Singh et al.，(2017) J Hematol Oncol 10(1)：105；Tokumitsu et al.，(2017)Cytopathology 28(2)：116-121)。
Claudin 18.2含有暴露的胞外环，可用于单克隆抗体结合，且CLDN18.2抗体已经被用于治疗癌症的研究中。例如，Claudiximab(IMAB362)，由Ganymed开发的 Claudin 18.2嵌合IgG1抗体，在治疗晚期胃食道癌的I期和II期临床试验中表现出鼓舞人心的效力((Sahin et al.，(2018)Eur J Cancer 100：17-26)。
由于大量恶性肿瘤的未被满足的医学需求，需要具有更多所期望的药学特征的其他Claudin 18.2单克隆抗体。
发明内容
本申请提供一种分离的单克隆抗体，例如，与Claudin 18.2(例如，人Claudin18.2和猴Claudin 18.2)结合的小鼠源、人源、嵌合或人源化的单克隆抗体，与现有技术抗体相比，具有更高的ADCC活性、CDC活性和/或Claudin 18.2结合稳定性。
本申请的抗体可以用于多种应用，包括检测Claudin 18.2蛋白，以及诊断、治疗或预防Claudin 18.2相关癌症。
因此，在一个方面，本申请涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源化抗体)、或其抗原结合部分，其与Claudin 18.2结合，含有重链可变区，该重链可变区含有 CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，该CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含 (1)SEQ ID NOs：1、4和7；(2)SEQID NOs：2、4和8；(3)SEQ ID NOs：2、4 和9；(4)SEQ ID NOs：2、5和9；或(5)SEQ ID NOs：3、6和8的氨基酸序列；或分别包含与上述氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段与Claudin 18.2结合。
在一个方面，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其包含SEQ ID NOs：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、或49的氨基酸序列，或包含与上述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段与Claudin 18.2结合。
在一个方面，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分含有轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，该CDR1区、CDR2区和 CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：10、13和16；(2)SEQ ID NOs：11、13和16； (3)SEQ ID NOs：10、14和16；(4)SEQID NOs：12、13和16；或(5)SEQ ID NOs：10、15和16的氨基酸序列；或分别包含与上述序列具有至少80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段与 Claudin 18.2结合。
在一个方面，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，其包含SEQ ID NOs：50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65或66的氨基酸，或包含与上述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段与Claudin 18.2结合。
在一个方面，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，各含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链可变区CDR1区、CDR2 区和CDR3区，以及轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：1、4、7、10、13和16；(2)SEQID NOs：2、4、8、11、13和16；(3)SEQ ID NOs：2、4、9、10、14和16；(4)SEQ ID NOs：2、5、9、12、13和16；(5) SEQ ID NOs：3、6、8、10、15和16的氨基酸序列；或分别包含与上述序列具有至少 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段与Claudin 18.2结合。
在一个实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：17和50； (2)SEQID NOs：18和51；(3)SEQ ID NOs：19和52；(4)SEQ ID NOs：20和 53；(5)SEQ ID NOs：21和54；(6)SEQ ID NOs：22和55；(7)SEQ ID NOs：23 和55；(8)SEQ ID NOs：24和55；(9)SEQ IDNOs：25和55；(10)SEQ ID NOs：26和55；(11)SEQ ID NOs：27和55；(12)SEQ ID NOs：27和56；(13) SEQ ID NOs：27和57；(14)SEQ ID NOs：28和56；(15)SEQ ID NOs：28和57； (16)SEQID NOs：29和58；(17)SEQ ID NOs：30和58；(18)SEQ ID NOs：31 和58；(19)SEQ ID NOs：32和58；(20)SEQ ID NOs：33和58；(21)SEQ ID NOs：34和58；(22)SEQ ID NOs：34和59；(23)SEQ ID NOs：34和60；(24) SEQ ID NOs：35和58；(25)SEQ ID NOs：35和59；(26)SEQ IDNOs：35和60； (27)SEQ ID NOs：36和61；(28)SEQ ID NOs：37和61；(29)SEQ ID NOs：38 和61；(30)SEQ ID NOs：39和61；(31)SEQ ID NOs：40和61；(32)SEQ ID NOs：41和61；(33)SEQID NOs：41和62；(34)SEQ ID NOs：41和63；(35) SEQ ID NOs：42和61；(36)SEQ ID NOs：42和62；(37)SEQ ID NOs：42和63； (38)SEQ ID NOs：43和64；(39)SEQ ID NOs：44和64；(40)SEQ ID NOs：45 和64；(41)SEQ ID NOs：46和64；(42)SEQ ID NOs：47和64；(43)SEQ IDNOs：48和64；(44)SEQ ID NOs：48和65；(45)SEQ ID NOs：48和66；(46) SEQ ID NOs：49和65；或(47)SEQ ID NOs：49和66的氨基酸序列；或分别包含与上述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段与Claudin 18.2结合。
在一个实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链恒定区和轻链恒定区分别包含SEQ ID NOs：67和68、或SEQ ID NOs：89和90所示的氨基酸序列，或分别包含与上述序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％同一性的氨基酸序列，重链可变区和轻链可变区包含上述的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段与Claudin18.2结合。
本申请的抗体在一些实施方式中包含经二硫键结合的两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区、重链可变区或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区、轻链可变区或CDR序列，其中重链可变区的C 端与重链恒定区的N端相连，轻链可变区的C端与轻链可变区的N端相连。本申请的抗体可以是例如IgG1、IgG2或IgG4同种型的全长抗体。本申请的抗体，在一些实施方式中，可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或Fab‘2片段。
本申请的示例性抗体或其抗原结合片段与人Claudin 18.2结合，并引发针对Claudin 18.2表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖细胞毒性(CDC)。其不与人Claudin 18.1结合。本申请的示例性抗体、或其抗原结合片段，具有体内抗肿瘤效果。
本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的免疫交联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素相连接。本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本申请抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本申请的抗体或其抗原结合部分可以制备为嵌合抗原受体(CAR)的一部分。本申请的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒联合使用。
本申请还提供组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、或免疫交联物或双特异性分子等，以及药学上可接受的载体。
本申请还包括编码本申请抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备Claudin 18.2抗体的方法，包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及 (ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。
在一个方面，本申请提供在受试者中诊断癌症疾病的方法，包括从该受试者中收集目标组织样本，并将该组织样本与本申请的抗体或其抗原结合部分接触。如果检测出一定量的Claudin 18.2，则该受试者可以被诊断为患有某种癌症。癌症可以是选自胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌的实体瘤。
在另一个方面，本申请提供在受试者中预防、治疗或减缓癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请抗体或其抗原结合部分。癌症可以是选自胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌的实体瘤。在一些实施方式中，该方法包括施用本申请的组合物、双特异性分子、免疫交联物、CAR-T细胞、或编码或承载抗体的溶瘤病毒。在一些实施方式中，至少一种其他抗癌抗体可以与本申请抗体或其抗原结合部分一起施用，例如PD-1抗体、LAG-3抗体、和/或CTLA-4抗体。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2和/或 IL-21)、或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分与化疗剂一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂，例如表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-氟尿嘧啶(5-FU)。本申请的抗体可以是例如小鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
在一个方面，本申请提供在受试者中治疗或预防癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请抗体或其抗原结合部分，并组合施用γδ T细胞刺激剂。γδ T 细胞刺激剂可以在本申请抗体或其抗原结合部分施用之前、施用的同时、或施用之后进行施用。γδ T细胞可以是Vγ9Vδ2 T细胞。在一个实施方式中，γδ T细胞刺激剂是双膦酸盐，特别是含氮双膦酸盐，例如N-双膦酸盐和氨基双膦酸盐。在一个实施方式中，γδ T细胞刺激剂是唑来膦酸，优选与白介素-2组合使用。
在一个实施方式中，本申请的癌症疾病治疗方法还包括施用Claudin 18.2表达稳定剂或Claudin 18.2表达增加剂。Claudin 18.2优选在癌细胞的细胞表面表达。Claudin18.2表达稳定剂或Claudin 18.2表达增加剂可以是奥沙利铂、和/或5-FU。
基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank标签、专利和公开的专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
附图说明
图1示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞的结合亲和力。
图2示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2的MC38细胞的ADCC活性。
图3示出Claudin 18.2抗体对EOF预处理的KATOIII细胞(A)或NUGC4细胞 (B)的ADCC活性。
图4示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2(A)或人Claudin 18.1(B)的HEK293A细胞的ADCC活性。
图5示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2的MC38细胞的CDC活性。
图6示出FACS检测中Claudin 18.2抗体对过表达Claudin 18.2的HEK293A细胞的结合稳定性，其中HEK293A细胞于4℃与Claudin 18.2抗体孵育1小时，并在去除未结合抗体后于37℃再孵育0小时、3小时或5小时。
图7示出FACS检测中人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.2或人Claudin 18.1的HEK293A细胞的结合亲和力，其中人源化Claudin 18.2抗体包括18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-30(A)、18F2-35VH0VL0、18F2-35VH7VL3 和18F2-35(B)、以及18F2-5VH0VL0、18F2-5VH7VL3和18F2-5(C)。
图8示出人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.2的MC38细胞的CDC活性，其中人源化Claudin 18.2抗体为18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-30 (A)、18F2-35VH0VL0、18F2-35VH7VL3和18F2-35(B)、以及18F2-5VH0VL0、 18F2-5VH7VL3和18F2-5(C)。
图9示出人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.2的MC38细胞的ADCC 活性，其中人源化Claudin 18.2抗体为18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-30 (A)、18F2-35VH0VL0、18F2-35VH7VL3和18F2-35(B)、以及18F2-5VH0VL0、 18F2-5VH7VL3和18F2-5(C)。
图10示出人源化Claudin 18.2抗体对EOF预处理的MUGC4(A)或KATOIII细胞(B)的ADCC活性。
图11示出人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.1(A)或人Claudin18.2 (B)的HEK293A细胞的ADCC活性。
图12示出人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.1(A)或人Claudin18.2 (B)的HEK293A细胞的CDC活性。
图13示出人源化Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞的结合稳定性，其中HEK293A细胞于4℃与人源化Claudin 18.2抗体孵育1小时，并在去除未结合抗体后于37℃再孵育0小时、3小时或5小时。
图14示出人Claudin18.1与人Claudin 18.2的氨基酸序列比对，其中框示出胞外环 1区，箭头指出该区域的氨基酸差异。
图15示出Claudin 18.2抗体对过表达突变体14的HEK293A细胞的结合亲和力。
图16示出Claudin 18.2抗体对过表达人Claudin18.1、突变体15(Claudin 18.1/S42A/Q45N/Q56E)或突变体16(Claudin 18.1/S42A/Q45N E47Q/Q56E)的HEK293A 细胞的结合亲和力，其中抗体为IMAB362(A)、18F2-35VH0VL0(B)、18F2- 30VH7VL3(C)和18F2-30VH0VL0(D)。
图17示出人源化Claudin 18.2抗体通过PBMC对过表达人Claudin 18.2的MC38 细胞(A)或NUGC-4细胞(B)的ADCC活性。
图18示出人源化Claudin 18.2抗体通过Vγ9Vδ2T细胞对过表达人Claudin 18.2的 MC38细胞(A)或NUGC-4细胞(B)的ADCC活性。
图19示出施用本申请人源化OX40Claudin 18.2抗体或对照药物的组中的平均肿瘤体积(A)和个体肿瘤重量(B)，表明Claudin 18.2抗体的体内抗肿瘤效果。
图20示出Claudin 18.2抗体与化疗剂组合时的体内抗肿瘤效果。
图21示出去岩藻糖化的Claudin 18.2抗体对EOF预处理的NUGC4的ADCC活性，其中去岩藻糖化的Claudin 18.2抗体为18F2-30VH0VL0AF(A)和18F2- 35VH7VL3AF(B)。
图22示出去岩藻糖化的Claudin 18.2抗体对表达人Claudin 18.2的MC38细胞的CDC活性，其中去岩藻糖化的Claudin 18.2抗体为18F2-30VH0VL0AF(A)和18F2-35VH7VL3AF(B)。
具体实施方式
为确保更好地理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体描述而呈现。
术语“Claudin 18.2”是指Claudin18亚型2。该术语“Claudin 18.2”包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人Claudin 18.2蛋白特异的抗体可以，在某些情况下，与人以外的物种例如猴的Claudin 18.2蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人Claudin 18.2蛋白特异的抗体可以完全地对人Claudin 18.2蛋白特异而不呈现出与其他物种或其他类型的交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的Claudin 18.2交叉反应。
术语“人Claudin 18.2”是指具有人氨基酸序列的Claudin 18.2蛋白，序列为例如Genbank登录号为NM_001002026的氨基酸序列。
本文中的术语“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或其单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键相互连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2和CH3，构成。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由更为保守的称为框架区(FR)的区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
本文中所用术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，Claudin 18.2蛋白)能力的一个或多个片段。已表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含经铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段； (iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段； (v)由VH结构域构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science242：423- 426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以经筛选，以与完整抗体相同的方式进行应用。
本文所用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与Claudin 18.2蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合Claudin 18.2蛋白之外抗原的抗体)。但是，特异结合人Claudin 18.2蛋白的分离的抗体可能对其他抗原例如其他物种的Claudin 18.2蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文所用的术语“小鼠源抗体”意在包括可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，该恒定区也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本公开的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变)。然而，本文所用的术语“小鼠源抗体”不意在包括在小鼠框架序列中植入得自另一哺乳动物物种种系的CDR序列的抗体。
术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指具有某一物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。
本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改成增加其与人体内自然生成的抗体变体的相似度的抗体。
术语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
本文所用的，“特异结合人Claudin 18.2”的抗体是指与人Claudin 18.2蛋白(以及可能的来自一个或多个非人物种的Claudin 18.2蛋白)结合但不与非Claudin 18.2蛋白实质性结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人Claudin 18.2蛋白，即KD为1.0x10-8M以下，更优选为5.0x10-9M以下。
本文所用的术语“基本不结合”蛋白或细胞是说，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与蛋白或细胞结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0x 10-6M以上，更优选 1.0x 10-5M以上，更优选1.0x 10-4M以上、更优选1.0x 10-3M以上，甚至更优选1.0 x 10-2M以上。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于目标抗原的KD为1.0x 10-6M以下，优选5.0x 10-8M以下，更优选1.0x 10-8M以下，甚至更优选5.0x 10-9M以下，甚至更优选1.0x10-9M以下。然而，“高亲和性”结合对于其他抗体同种型可能会变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和性”结合是指抗体的KD为10-6M以下，更优选10-7M以下，甚至更优选10-8M以下。
术语“ECs0”，又叫半最大效应浓度，是指在一定暴露时间后引起基线与最大反应之间的50％反应的抗体浓度。
本文所用的术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御机制，其中免疫系统效应细胞主动地裂解细胞膜表面抗原被抗体例如Claudin 18.2抗体结合的靶细胞例如癌细胞。
术语“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”通常是指IgG和IgM抗体的效应功能，当与表面抗原结合时引发典型的补体途径，包括形成膜攻击复合体以及靶细胞裂解。本申请的抗体，通过结合Claudin 18.2，引发对癌细胞的CDC。
术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本申请抗体的量。治疗有效量应当放在被治疗的疾病背景下进行理解，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
术语“γδ T细胞”是指T细胞受体由一条γ链和一条δ链构成的T细胞。人γδ T 细胞在感染性疾病、自免疫疾病和癌变引起的肿瘤变化的压力监测反应中发挥重要作用。病变位点处的激活的γδ T细胞，与抗原结合时，提供细胞因子和/或趋化因子，以介导其他效应细胞的募集，并表现即刻的效应功能例如ADCC。外周血中的大多数γδ T细胞表达Vγ9Vδ2 T细胞受体并称为Vγ9Vδ2 T细胞。
术语“γδ T细胞刺激剂”是指刺激γδ T细胞，特别是Vγ9Vδ2 T细胞，的体外和体内发生的化合物，特别是通过诱导γδ T细胞的活化和扩张。优选地，该术语涉及体外和/或体内(优选通过抑制甲羟戊酸通路酶法呢基焦磷酸合酶(FPPS))增加哺乳动物细胞中生成的异戊烯焦磷酸(IPP)的化合物。
本申请的多个方面在以下亚章节中更加具体地加以描述。
Claudin 18.2抗体具有对人Claudin 18.2的结合特异性以及有益的功能特征
本申请中的示例性抗体以高亲和力特异性地结合人Claudin 18.2。具体而言，本申请中的示例性抗体以与IMAB362相当的EC50值与人Claudin 18.2蛋白结合，但具有更高的ADCC活性、CDC活性和/或Claudin 18.2结合稳定性。本申请的示例性抗体不与Claudin18.1结合。
本申请的优选抗体是单克隆抗体。额外地或可选地，抗体可以是例如小鼠源、嵌合、或人源化的单克隆抗体。
Claudin 18.2单克隆抗体
本申请的示例性抗体是结构上和化学上如以下和实施例中所表征的单克隆抗体、或其抗原结合部分。示例性Claudin 18.2抗体或其抗原结合部分的VH氨基酸序列为SEQ IDNOs：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、或49。示例性Claudin18.2抗体或其抗原结合部分的VL氨基酸序列为SEQ ID NOs：50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66。示例性Claudin 18.2抗体或其抗原结合部分可以包含的抗体重/轻链可变区总结在以下表1中，一些克隆具有相同的VH或VL。示例性Claudin 18.2抗体还可以包含重链恒定区和轻链恒定区，其分别具有SEQ ID NOs：67和68的氨基酸序列，或者分别具有SEQ ID NOs：89和90的氨基酸序列，重链可变区的C端与重链恒定区的N端连接，且轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端连接。
表1中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR由Kabat编码系统确定。然而，如本领域所公知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列，通过其他体系，例如 Chothia、IMGT、AbM、或Contact编码系统/方法确定。
与人Claudin 18.2结合的其他Claudin 18.2抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本申请的Claudin 18.2抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当VH和VL链(或这些链中的CDR)混合并配对时，特定VH/VL配对中的 VH序列可以由结构近似的VH序列取代。类似地，优选特定VH/VL配对中的VL序列由结构近似的VL序列取代。
因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包含列于以上表1中氨基酸序列的重链可变区；以及
(b)包含列于以上表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一Claudin 18.2抗体的VL，其中该抗体特异结合人Claudin 18.2。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)列于以上表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区；以及
(b)列于以上表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区，或者另一Claudin 18.2抗体的CDR，其中该抗体特异结合人Claudin 18.2。
在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分包括Claudin 18.2抗体的重链可变CDR2 区以及其他结合人Claudin 18.2的抗体的CDR，例如不同Claudin 18.2抗体的重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
Figure BDA0002818834470000111
Figure BDA0002818834470000121
此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2结构域，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260 (2000)；Beiboer et al.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739- 749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashi et al.，J. Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis and Stoller，J.Immunol. 152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos. 6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和 5,760,185。这些参考文献中的每一个通过引用的方式全部并入本文。
在另一实施方式中，本申请的抗体包含Claudin 18.2抗体的重链可变区CDR2以及Claudin 18.2抗体的至少重链和/或轻链可变区CDR3，或另一Claudin 18.2抗体的重链和/或轻链可变区CDR3，其中该抗体能够特异结合人Claudin 18.2。优选这些抗体 (a)竞争结合Claudin 18.2；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请Claudin18.2抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含Claudin 18.2抗体的轻链可变区CDR2，或者另一Claudin 18.2抗体的轻链可变区 CDR2，其中该抗体能够特异结合人Claudin 18.2。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包括Claudin 18.2抗体的重链/轻链可变区CDR1，或另一Claudin 18.2抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体能够特异结合人Claudin 18.2。
保守修饰
在另一实施方式中，本申请的抗体包含与本申请Claudin 18.2抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，可以做出一些不会使抗原结合性消失的保守序列修改。参见，例如，Brummell et al.， (1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341- 6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。
因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)重链可变区CDR1序列包含以上表1列出的序列，和/或其保守修饰；和/或
(b)重链可变区CDR2序列包含以上表1列出的序列，和/或其保守修饰；和/或
(c)重链可变区CDR3序列包含以上表1列出的序列，和/或其保守修饰；和/或
(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3序列包含以上表1列出的序列，和/ 或其保守修饰；且
(e)该抗体特异结合人Claudin 18.2。
本申请的抗体具有以下一个或多个上述功能特征，例如对人Claudin 18.2的高亲和力结合，以及引发对Claudin 18.2表达细胞的ADCC或CDC活性的能力。
在多个实施方式中，抗体可以是例如小鼠源、人源、人源化、或嵌合抗体。
本文所用的术语“保守序列修饰”是指氨基酸修饰，其不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基的组已在领域内定义。这些组包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有B-支链侧链的氨基酸 (例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同一侧链组的其他氨基酸残基替换，且改变的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。
基因修饰的抗体
本申请的抗体可以以具备本申请Claudin 18.2抗体的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即， VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些动物物种天然产生的抗体变体的相似性。例如，框架区修饰成提供人源化的抗体。此外地或可选地，抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，以例如改变抗体的效应功能。
在某些实施方式中，CDR植入可以用来基因改造抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶向抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸序列比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的 CDR序列植入到具有不同特性的不同抗体的框架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(参见，例如Riechmann et al.，(1998)Nature 332：323-327； Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queen et al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A. 86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含如上所述的重链可变区和/或如上所述的轻链可变区，重链可变区包含具有本申请序列的CDR1、CDR2和CDR3序列，轻链可变区包含具有本申请序列的CDR1、CDR2和 CDR3序列。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的VH和VL CDR序列，它们可以含有不同的框架序列。
这样的框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“Vbase”人种系序列数据库(可通过网络连接，www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.， (1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得，其各个的内容通过引用的方式明确并入本文。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7 HuMAb小鼠中的重链种系序列可通过所附的Genbank登录号 1-69(NG-0010109、NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637) 和3-7(NG--0010109&NT--024637)得到。作为另一例子，以下来自Hco12 HuMAb 小鼠的重链种系序列可通过所附的Genbank登录号1-69(NG--0010109，NT--024637& BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT-- 024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)得到。
通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschμl et al.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与编纂的蛋白序列数据库进行比较。
用于本申请抗体的优选框架序列是结构上与本申请抗体所用的框架序列相似的那些。VH CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该框架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的框架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的框架区中。例如，已发现，在一些情况下，将框架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合能力(参见例如U.S.专利Nos. 5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类型的可变区修饰是将VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
因此，在另一实施方式中，本申请提供分离的Claudin 18.2单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)VH CDR1区，包含本申请的序列，或具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，包含本申请的序列，或具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包含本申请的序列，或具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d) VL CDR1区，包含本申请的序列，或具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，包含本申请的序列，或具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VL CDR3区，包含本申请的序列，或具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
本申请的基因改造抗体包括在VH和/或VL的框架残基中做出修饰的那些，以例如改变抗体的特性。通常而言，做出这些框架修饰，用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可以包含不同于得到抗体的种系序列的框架残基。这些残基可以通过将抗体框架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。
另一类型的框架修饰包括对框架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开No.20030153043中有更加详细的描述。
此外，或者作为框架或CDR区内做出的修饰的另一种选择，本申请的抗体可以基因改造成包括Fc区的修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的抗体可以化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来再次改变抗体的一个或多个功能特性。
在一个实施方式中，修饰CH1的铰链区，从而改变，例如增加或减少，铰链区中半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利No.5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区的半胱氨酸残基的数量，来例如促进轻链和重链的组装，或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域交界区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的金黄色葡萄球菌A蛋白(SpA) 结合力。该方法在美国专利No.6,165,745中有更详细的描述。
在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利 5,714,350和6,350,861。
另外地，或者可选地，抗体可以制备成具有改变的糖基化类型，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。如此改变的糖基化形式已被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已有描述，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开No.20040110704和Yamane- Ohnuki et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP 1,176,195记载了FUT8基因(编码岩藻糖基转移酶)功能破坏的细胞系，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。 PCT公开WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向 Asn(297)-连接的糖添加岩藻糖的能力，也引起宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化 (参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如PCT公开WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。PCT公开WO 99/54342公开了细胞系，其基因改造成表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III (GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(另外参见Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176- 180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除，例如岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体处移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。
包含在本申请中的另一种本文抗体的修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG 基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子 (或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”意在包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。聚乙二醇化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用至本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
抗体的物理特性
本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其不同类别。
例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起抗体增加的免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK (Marshallet al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)JExp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选 Claudin18.2抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域内的残基来实现。
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性 (异天冬氨酸效果)。
各抗体将具有独特的等电点(pI)，其基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的 pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI 在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构和不稳定性。因此，优选 Claudin18.2抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。
编码本申请抗体的核酸分子
在另一方面，本申请提供编码本申请抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在完整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈现为基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可以包含或可以不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。
本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，将在下文中进一步描述)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。
优选的本申请核酸分子包括编码Claudin 18.2单克隆抗体的VH和VL序列或CDR 的那些。一旦获得了编码VH和VL片段的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一蛋白的另一 DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。在上下文中使用的术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在阅读框内。
分离的编码VH区的DNA可以通过可操作地连接VH编码DNA与编码重链恒定区 (CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选 IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接VL编码DNA与编码轻链恒定区 CL的另一DNA分子而转换成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段连接，从而VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中VL和VH区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988) Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883； McCaffertyet al.，(1990)Nature 348：552-554)。
本申请单克隆抗体的制备
本申请的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利No.4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，其内容具体通过引用的方式全部并入本文。
制备本申请单克隆抗体的转染瘤的生成
本申请的抗体还可以使用例如本领域公知的重组DNA技术与基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入到一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
术语“调控序列”包括控制抗体基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif. (1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒 40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell. Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而用于构建任意抗体同种型的全长抗体基因，从而VH片段与载体中的CH片段可操作地连接，VL片段与载体中的CL片段可操作地连接。额外地或者可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择的标记物基因。可选择的标记物基因促进已导入载体的宿主细胞的选择(参见，例如，美国专利No. 4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择的标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，药物为例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤。优选的可选择的标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”意在包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，最优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。
优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin， (1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达系统是GS基因表达系统，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或更优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用标准的蛋白纯化方法从培养基中回收。
免疫交联物
本申请的抗体可以与治疗剂交联，形成免疫交联物，例如抗体-药物交联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II 抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过可切割的接头交联，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val- Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Git-Git、Val-Lys、Lys、Git、 Ser或Glu。ADC可以如美国专利No.7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中描述般进行制备，这些公开内容通过引用的方式并入本文。
双特异性分子
另一方面，本申请涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体的配体)相连接的一种或多种本申请抗体的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。因此，本文所用的“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
在实施方式中，除Fc结合特异性和Claudin 18.2结合特异性外，双特异性分子具有第三特异性。第三特异性可以是增强因子(EF)抗体，例如与参与细胞毒性活性并从而增加针对靶细胞的免疫应答的表面蛋白结合的分子。例如，增强因子抗体可以与细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40或ICAM-1)或其他免疫细胞结合，引起增强的针对靶细胞的免疫应答。
双特异性分子可以为多种不同形式和尺寸。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，而非具有两个特异性相同的结合臂。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段 (scFv)构成，称为Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.,Immunology Today，21(8)，391-397 (2000)。
编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒
溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本申请的抗体可以与溶瘤病毒一起使用。或者，编码本申请抗体的溶瘤病毒可以引入到人体中。
药物组合物
在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的一种或多种抗体，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上有效的成分，例如另一抗体或药物。本申请的药学组合物也可以在与例如另一抗癌剂、另一抗炎剂或疫苗的联合疗法中进行施用。
药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬助剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在 Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受可能使其失活的酸和其他自然条件的影响。本文使用的术语“肠道外施用”是指不同于肠道施用和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用途径，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
可以与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。通常而言，以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最优选为约1％-约30％的有效成分。
给药方案经调整提供最佳的所期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个大丸药，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配制肠道外组合物。本文所用的剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与所需药学载体一起产生所期望疗效的预定量的活性成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下需要较低的施用频率。
对于抗体的施用，剂量可以为约0.0001-100mg/kg宿主体重，更常见的为0.01-5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案涉及每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。本申请 Claudin 18.2抗体的优选给药方案包括静脉内施用，1mg/kg体重或3mg/kg体重，抗体以以下给药时间表中的一个进行给药：(i)每四周给药六次，然后每三个月一次； (ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，之后1mg/kg体重每三周一次。在一些方法中，剂量调整成实现约1-1000μg/ml的血液抗体浓度，在一些方法中为约25-300 μg/ml。
“治疗有效剂量”的本申请Claudin 18.2抗体优选地引起疾病症状严重程度的降低、无疾病症状期频率和持续时间的增加、或对感病性引起的损伤或无能的预防。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效剂量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤大小，或者减轻受试者的症状，受试者通常为人或另一哺乳动物。
药物组合物可以是缓释制剂，包括植入体、透皮贴剂、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利No.4,487,603)；(3)经皮设备(美国专利No. 4,486,194)；(4)推注设备(美国专利No.4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利No.4,439,196和4,475,196)，其公开内容通过引用的方式并入本文。
在一些实施方式中，本申请的单抗可以配制成，确保合适的体内分布。例如，为确保本申请的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利No. 4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J. Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038； Bloeman et al.，(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe et al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBSLett.346：123；和Killion andFidler(1994)Immunomethods 4：273。
本申请的用途和方法
本申请的抗体(组合物、双特异性分子和免疫交联物)具有多种体外和外内用途，涉及例如癌症的诊断、治疗和/或预后。抗体可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。在癌症的诊断和预后中，可以收集目标组织样本，并与本申请的抗体接触，其中，如果在某些区域或细胞类型中检测到一定量的Claudin 18.2，则该受试者可以诊断为患有癌症，且Claudin 18.2表达的增加/减少表明癌症的发展/减轻。
考虑到本申请Claudin 18.2抗体的抑制癌症细胞增殖和存活的能力，本申请提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本申请的抗体，从而在该受试者中抑制肿瘤生长。可以由本申请抗体治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌，原发或转移的。此外，难治的或复发的恶性肿瘤的生长可能可以用本申请的抗体抑制。
本申请的这些和其他方法在以下进一步讨论。
联合疗法
在另一方面，本申请提供本申请示例性Claudin 18.2抗体(或其抗原结合部分)与一种或多种其他抗体一起施用的联合疗法，其能有效抑制受试者中的肿瘤生长。在一个实施方式中，本申请提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用 Claudin18.2抗体以及一种或多种其他抗体，例如LAG-3抗体、PD-1抗体和/或CTLA- 4抗体。在某些实施方式中，受试者是人。在另一个方面，本申请提供癌症治疗方法，其中本申请的Claudin18.2抗体(或其抗原结合部分)与化疗剂一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。例如，可以向接受Claudin 18.2抗体疗法的患者施用表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-FU。奥沙利铂、和5-FU被认为能稳定或增加Claudin 18.2的表达。
本申请还提供一种抑制受试者中肿瘤生长的方法，包括向受试者施用Claudin18.2 抗体和γδ T细胞刺激剂，特别是Vγ9V82 T细胞刺激剂。γδ T细胞刺激剂可以是双膦酸盐，特别是含氮双膦酸盐，例如N-双膦酸盐和氨基双膦酸盐。数据表明唑来膦酸(ZA)，特别是与白介素-2组合时，能够刺激Vγ9Vδ2 T细胞生成，并从而增强 Claudin 18.2抗体的ADCC活性(WO2013174509)。
本发明还提供抑制受试者中肿瘤生长的方法，包括向受试者施用Claudin 18.2抗体以及Claudin 18.2表达稳定或增加剂。该Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以是细胞毒性剂和/或细胞生长抑制剂。Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以包括选自蒽环类药物、铂类化合物、核苷类似物、紫杉烷、和喜树碱类似物，或其前药、及其组合的药剂。Claudin18.2表达稳定或增加剂可以包含选自表阿霉素、奥沙利铂、顺铂、5-氟尿嘧啶的药剂。Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以包含奥沙利铂与5-氟尿嘧啶或其前药的组合，顺铂与5-氟尿嘧啶或其前药的组合，至少一种紫杉烷与奥沙利铂的组合，至少一种紫杉烷与5-氟尿嘧啶或其前药的组合，或至少一种喜树碱类似物与5-氟尿嘧啶或其前药的组合。Claudin18.2表达稳定或增加剂可以是引发免疫细胞死亡的药剂。引发免疫细胞死亡的药剂可以包括选自蒽环类药物、奥沙利铂及其组合的药剂。Claudin 18.2表达稳定或增加剂可以包括表阿霉素与奥沙利铂的组合。在一个实施方式中，本申请的方法包括施用至少一种蒽环类药物、至少一种铂类化合物、以及5-氟尿嘧啶和其前药中的至少一种。蒽环类药物可以选自表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、伊达比星和戊柔比星。优选地，蒽环类药物是表阿霉素。铂类化合物选自奥沙利铂和顺铂。核苷类似物可以选自5-氟尿嘧啶及其前药。紫杉烷可以选自多西他赛和紫杉醇。喜树碱类似物可以选自伊立替康和托泊替康。在一个实施方式中，本申请的方法包括施用(i) 表阿霉素、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶；(ii)表阿霉素、奥沙利铂和卡培他滨；(iii)表阿霉素、顺铂和5-氟尿嘧啶；(iv)表阿霉素、顺铂和卡培他滨；或(v)亚叶酸、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶。
其他可以与Claudin 18.2抗体联合的疗法包括但不限于免疫原性剂施用、白介素2 (IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。
本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。
此外，如果按序施用多于一个剂量的联合疗法，则在各施用时间点的按序施用次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。
本申请还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为进一步的限制。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请均通过引用的方式明确并入本文。
实施例
实施例1稳定表达人Claudin 18.1或Claudin 18.2的HEK293A细胞系的构建
使用慢病毒转染体系，生成过表达人Claudin 18.1或Claudin 18.2的HEK293A细胞(Cobioer，中国)。简单而言，合成编码人Claudin 18.1(SEQIDNO：70)和 Claudin 18.2(SEQIDNO：72)的cDNA序列(SEQIDNOs：69和71)，分别克隆到于pLV-sfGFP(2A)puro质粒的EcoRI和BamHI位点。通过pLV-EGFP(2A)-Puro- Claudin 18.1(或pLV-EGFP(2A)-Puro-Claudin 18.2)、psPAX2和pMD2.G质粒的共转染，在HEK-293T细胞(Cobioer，中国)中生成慢病毒。得到的慢病毒用于转染 HEK-293A细胞，以生成过表达人Claudin 18.1或Claudin18.2的稳定细胞系，其之后在具有10％FBS(Cat：FND500，Excell)和0.2μg/ml嘌呤霉素(Cat：A11138- 03，Gibco)的DMEM培养基(Cat：SH30022.01，Gibco)中培养多于7天。
Claudin 18.1和Claudin 18.2的表达经荧光激活细胞分选术(FACS)，使用市售CLDN18抗体(兔抗Claudin-18，Cat#：388100，Life Technology)进行证实。简单而言， 100,000个转染细胞在96孔板的各孔中铺板，并在之后加入抗人Claudin 18抗体。4℃孵育1小时后，板用PBST洗涤3遍。之后，向板加入稀释500×的PE耦联驴抗兔IgG 二抗(PE驴抗兔IgG抗体，Cat#：406421，Biolegend)。4℃孵育1小时后，板用PBS 洗涤3遍，之后使用FACS仪器(BD)监测细胞荧光度。
实施例2示例性Claudin 18.2单克隆抗体的生成和筛选
为生成结合人Claudin 18.2的单克隆抗体，对6周龄BALB/c小鼠接种稳定表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞(参见实施例1)。简单而言，小鼠皮下注射2×107/mlHEK293A/人Claudin 18.2细胞，之后每四周进行一次加强免疫，共三次。血清样本中的抗体效价通过FACS使用表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞进行确定。当动物达到合适的抗体效价后，小鼠用PBS中的5×107/mL细胞进行最后一次免疫加强。三天后，处死小鼠，放血，收集脾脏，供mRNA提取和噬菌体展示库构建用。
为构建scFv噬菌体展示库，小鼠的脾脏总RNA用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取，并使用反转录试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。使用上述合成的cDNA为模板，通过PCR进行基因扩增，scFv噬菌体库通过专用噬菌粒pTGS进行构建。简单而言，轻链可变区通过PCR扩增，用Qiagen PCR/纯化试剂盒纯化，用限制性内切酶NheI和 NotI(NEB)切割，并于16℃连入(用相同限制性内切酶消化并用琼脂糖凝胶纯化的) 噬菌粒pTGS的NheI/NotI限制性酶切位点。在连接后，沉淀、洗涤重组DNA，并将其溶解于蒸馏水。重组DNA之后经电穿孔转化到大肠杆菌TG1细胞中。之后，细胞混悬在10ml SOC培养基中，37℃轻摇培养1小时。细胞培养物在2YT琼脂/氨苄上铺板，数出氨苄抗性菌落的数量。对于重链可变片段的克隆，将PCR产物用NcoI和 XhoI酶切，并连入轻链可变区库，并转化到大肠杆菌TG1中。从大板中刮出库，并接种到2YTAG液体培养基中。将约1012pfu辅助噬菌体加入含有scFv基因库的TG1样本中，并在震摇中于37℃孵育1小时。加入70μg/ml的卡那霉素，且培养物于30℃震摇过夜。细胞于4℃以4000rpm离心15分钟。所得的上清液与5ml 20％PEG 8000/2.5M NaCl混合，并在冰上孵育30分钟，之后噬菌体于4℃以8000rpm离心20 分钟进行沉淀。噬菌体混悬于1.5ml含1％BSA的PBS，于涡旋混合器上震动，并以 13000rpm离心5分钟，得到成团的碎片。上清液于4℃保存，或直接用于生物筛选 (参见以下)。
针对人Claudin 1 8.2而非人Claudin 18.1的抗体使用稳定表达人Claudin 18.2或 Claudin 18.1的HEK293A细胞进行生物筛选。简单而言，首先将1×107HEK293A/人Claudin 18.1细胞加入含1013噬菌体的15ml管中。细胞/噬菌体混合物在摇床上室温孵育90分钟，然后静置30分钟。细胞混悬液以1000g室温离心5分钟，上清液转移到含有1×107HEK293A/人Claudin18.2细胞的管中。细胞培养物在摇床上室温孵育2h。未结合的噬菌体用PBS洗掉，使用0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.2)洗脱抗原结合的噬菌体。洗脱的噬菌体使用1.5M Tris-HC1(pH 8.8)中和至pH 7.0。上述中和的噬菌体用于侵染10ml的TG1细菌，其于37℃培养直至OD达到0.6。细菌培养物经离心成团，且团状物重新混悬在培养基中，并包被于2YTAG大板，用于下轮筛选。总共进行三轮这样的富集和筛选。
三轮生物筛选后，收集与Claudin 18.2结合的噬菌体，并用于侵染细菌细胞。挑取单细胞菌落，并使其在96孔板中生长。使用表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞，经基于细胞的ELISA来识别高结合力的克隆。选出在噬菌体ELISA 中显示出特异结合人Claudin 18.2而非Claudin 18.1的高结合力的克隆，进行DNA测序，并从高结合克隆中鉴定出38个可读scFv序列，并从中选出10个scFv抗体用于进一步表征。
实施例3全长Claudin 18.2单克隆抗体的表达、纯化和表征
将10个选出的scFv抗体以全长单克隆抗体在HEK293F细胞(Cobioer，中国)中表达，进行进一步表征。简单而言，将各自的重链/轻链可变区分别加上人IgG1/κ恒定区 (SEQID Nos.：67和68)克隆到pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，USA)的 EcoRI/BamHI中，构建表达载体，其中重链可变区的C端与人IgG1恒定区的N端连接，且轻链的C端与人κ恒定区的N端连接。
根据生产商的说明，使用PEI转染，在HEK-293F细胞中瞬时表达嵌合抗人Claudin18.2抗体。简单而言，使用聚乙烯亚胺(PEI)，用所得的载体转染HEK293F细胞， DNA∶PEI比为1∶3。用于每次转染的总DNA为1.5μg/ml。转染的HEK293F细胞在 37℃、5％CO2的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集上清，纯化抗体。具体而言，收集细胞培养物，之后3500rpm离心5分钟，并用0.22μm胶囊过滤除去细胞残骸。之后，单克隆抗体使用预平衡的Protein-A柱(GE；USA；Cat#：17040501； Lot#：10252250)进行纯化，并用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-3.5)洗脱。在缓冲液交换外，抗体保存在PBS缓冲液中(pH 7.0)，其浓度通过NanoDrop仪确定。纯化的单克隆抗体进行进一步表征。
使用表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞，通过FACS检测10个全长 Claudin 18.2抗体的结合亲和力和特异性。简单而言，将100,000个细胞在96孔板的各孔中铺板，并向板中加入梯度稀释的Claudin 18.2抗体。于4℃孵育1小时后，板用 PBST洗涤3遍。之后，向板加入500×稀释的RPE耦合的山羊抗人IgG二抗(Thermo Cat#：PAI-86078)。在4℃孵育1小时后，板用PBS洗涤3遍，之后使用FACS仪 (BD)监测细胞荧光。
另外对纯化的抗体分析其引起对稳定过表达人Claudin 18.2的MC38细胞(Cober，中国)(MC38/hClaudin18.2)的抗体依赖细胞毒性(ADCC)活性的能力。简单而言， MC38/hClaudin18.2细胞如实施例1所述通过慢病毒转染系统而生成。 MC38/hClaudin18.2细胞和效应细胞NK92MI-CD16a(Huabo Bio)均以1200rpm离心 5分钟。这些细胞随后混悬在ADCC检测培养基中(MEM培养基，Gibco，Cat#：12561- 056；1％FBS，EX-cell，Cat#：FND500；1％BSA，VETEC，Cat#：V900933-1KG)，根据细胞计数，细胞活力为约90％。调整MC38/hClaudin18.2的细胞密度至4x105/mi， NK92MI-CD16a的细胞密度调整为2x106/ml。之后将50μl的MC38/hClaudin18.2细胞和50μl的NK92MI-CD16a细胞(效靶比为5∶1)加至96孔板的各孔中。向各孔分别加入稀释成不同浓度的抗体，终浓度分别为32000ng/ml、6400ng/ml、1280ng/ml、 256ng/ml、51.2ng/ml、10.24ng/ml、2.048ng/ml。样本在37℃孵育4小时，然后以 100μl/孔的浓度加入LDH显色液(细胞毒性检测试剂盒PLUS(LDH)，Roche，Cat#：04744926001)。混合物避光室温孵育20分钟，之后板用MD SpectraMax i3进行读数。 HEL同型对照抗体(LifeTein，LLC，Cat.#：LT12031)用作阴性对照，IMAB362作为 Claudin 18.2参照抗体。
如图1所示，大多数全长抗体特异地结合人Claudin 18.2而非Claudin 18.1。由全长抗体诱导的ADCCEC50值总结在表2中，所有抗体均引发了对于MC38/CLDN18.2 细胞的ADCC。基于结合亲和力和ADCC效果的评分，选择18F2进行进一步研究。
表2.Claudin 18.2抗体的ADCC EC50
Figure BDA0002818834470000271
实施例4通过噬菌体展示对18F2进行亲和力熟化
为进一步改善结合亲和力，选择克隆18F2，通过噬菌体展示技术进行亲和力熟化。简单而言，进行3D结构建模模拟来识别克隆18F2的重链和轻链CDR中可能对结合亲和力重要的残基。识别出的CDR残基通过PCR进行突变，使用针对点突变特别设计的引物和标准方法步骤。构建出噬菌体展示库，并如上所述，使用稳定表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞，进行生物筛选。在3轮生物筛选后，选出高结合力克隆，收集并用于侵染细菌细胞。挑取细菌菌落并在96孔板上生长，然后使用基于细胞的ELISA来识别高结合力克隆，并进行测序。识别出重链和轻链CDR中的有益突变，并结合到新的噬菌体展示库中，再进行3轮生物筛选，并测序证实，如上所述。识别出20多种与亲本克隆18F2相比包含单至多突变的高结合力克隆，并选出12 个克隆在HEK293F细胞中以全长嵌合人IgG/κ抗体进行表达。全长抗体的结合亲和力通过FACS使用表达人Claudin18.2或Claudin18.1的HEK293A细胞进行测试。简单而言，将100,000个细胞在96孔板的各孔中铺板，并向板中加入梯度稀释的Claudin 18.2抗体。于4℃孵育1小时后，板用PBST洗涤3遍。之后，加入500×稀释的RPE 耦合的山羊抗人IgG二抗(Thermo Cat#：PAI-86078)。在4℃孵育1小时后，板用 PBS洗涤3遍，之后使用FACS仪(BD)监测细胞荧光。基于结合亲和力和特异性，选出4个克隆进行进一步研究，即18D2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66，其显示出与亲本克隆18F2相比更高的结合亲和力。4个所选的嵌合单克隆抗体的EC50示于表3， EC50与IMAB362的相当，其中IMAB362是根据专利申请WO2014/146672Al中公开的氨基酸序列合成的Claudin18.2参照抗体。
表3.Claudin18.2抗体的结合亲和力EC50
Figure BDA0002818834470000281
实施例5示例性Claudin 18.2抗体的ADCC活性
对纯化的抗体检测其引导对稳定过表达人Claudin18.2的MC38细胞(Cober，中国)(MC38/hClaudin18.2)的抗体依赖细胞毒性(ADCC)活性的能力。简单而言， MC38/hClaudin18.2细胞如实施例1所述通过慢病毒转染系统而生成。 MC38/hClaudin18.2细胞和效应细胞NK92MI-CD16a(Huabo Bio)均以1200rpm离心 5分钟。这些细胞随后混悬在ADCC检测培养基中(MEM培养基，Gibco，Cat#：12561- 056；1％FBS，EX-cell，Cat#：FND500；1％BSA，VETEC，Cat#：V900933-1KG)，根据细胞计数，细胞活力为约90％。调整MC38/hClaudin18.2的细胞密度至4x105/ml，NK92MI-CD16a的细胞密度调整为2x106/ml。之后将50μl的MC38/hClaudin18.2细胞和50μl的NK92MI-CD16a细胞(效靶比为5∶1)加至96孔板的各孔中。向各孔分别加入稀释成不同浓度的抗体，终浓度分别为32000ng/ml、6400ng/ml、1280ng/ml、 256ng/ml、51.2ng/ml、10.24ng/ml、2.048ng/ml。样本在37℃孵育4小时，然后以 100μl/孔的浓度加入LDH显色液(细胞毒性检测试剂盒PLUS(LDH)，Roche，Cat#：04744926001)。混合物避光室温孵育20分钟，之后板用MD SpectraMax i3进行读数。 HEL同型对照抗体(LifeTein，LLC，Cat.#：LT12031)用作阴性对照，IMAB362用作 Claudin 18.2参照抗体。如图2所示，4个所选的嵌合抗体18F2-5、18F2-30、18F2-35 和18F2-66都能诱导NK92MI-CD16a对MC38/hClaudin18.2细胞的杀伤。
还对Claudin 18.2抗体测试其针对KATO-III细胞(Cobioer，中国)和NUGC-4细胞(Cobioer，中国)的ADCC活性，据报道，这两种细胞具有较高的内源性人 Claudin18.2表达。简单而言，靶细胞用10ng/ml表阿霉素(Apexbio，Cat#.A2451-100 mg)、500ng/ml奥沙利铂(Ark pharm，Cat#.Ak-72813)和10ng/ml 5-FU(Acros， Cat#.Un12811)(EOF)预处理72小时，将药物清除后用常规培养基 (DMEM+10％FBS)继续培养细胞24小时。使用上述的方法步骤，使用KATO-III或 NUGC-4细胞作为靶细胞进行ADCC检测。2×105NK92MI-CD16a细胞和2× 104KATO-III细胞或者NUGC-4细胞(效靶比为10∶1)用在各测试中。如图3所示，四个单克隆抗体18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66均能诱导NK92MI-CD16a细胞对KATO-III或NUGC-4细胞的杀伤。
为进一步证实Claudin 18.2抗体是否特异性地引起对Claudin 18.2阳性细胞的ADCC效应，检测这些抗体针对过表达人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞引起ADCC效应的能力。简单而言，1×105NK92MI-CD16a细胞和2×104过表达人 Claudin 18.1或18.2的HEK293A细胞(效靶比5∶1)用在各测试中。如图4所示，4种检测的抗体18F2-5、18F2-66、18F2-30和18F2-35特异性地引发对表达人Claudin18.2 的HEK293A细胞的ADCC效应，而在过表达人Claudin18.1的HEK-293细胞上没有观察到细胞毒性效果。
实施例6示例性Claudin 18.2抗体的CDC活性
使用细胞毒性检测试剂盒(Roche，Cat#：04744926001)，测试示例性 Claudin18.2抗体针对稳定过表达人Claudin 18.2的MC38细胞(MC38/hClaudin18.2，实施例5中生成)引发CDC效应的能力。简单而言，靶细胞MC38/人Claudin18.2细胞于1200rpm离心4分钟，然后细胞用具有1％FBS的DMEM培养基重悬。 MC38/hClaudin18.2细胞的细胞密度调整到3x105细胞/ml，在96孔板的各孔内加入100 μl细胞。分别加入稀释成多种浓度的抗体，使其最终浓度分别为20μg/ml、4μg/ml、 0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml、0.0064μg/ml和0.00128μg/ml。加入终浓度为5％的正常人血清补体(Quidel，Cat#：A113)，获得的混合物于37℃孵育2小时。LDH 显色液以100μl/孔的浓度添加，之后样品避光室温孵育20分钟。用MDSpectraMax i3 仪器读板。Claudin 18.2抗体IMAB362作为参照，HEL单克隆抗体作为阴性对照。如图5所示，所有检测抗体，18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66，呈现出剂量依赖方式的强CDC活性。
实施例7示例性Claudin18.2抗体对人Claudin18.2的结合稳定性
对纯化的Claudin 18.2抗体进一步FACS分析其对HEK293A/hClaudin18.2细胞的结合稳定性。简单而言，105个HEK293A/hClaudin18.2细胞铺至96孔板的各孔中，并向板加入10μg/ml Claudin18.2抗体。在4℃孵育1小时后，板用PBST清洗3遍，细胞重悬于细胞培养基(DMEM)。细胞分别继续在37℃孵育0小时、3小时或者5小时。之后，向板加入500×稀释的RPE耦合的山羊抗人IgG二抗(Thermo，Cat#：PAI- 86078)。4℃孵育1小时后，板用PBS清洗3遍，然后使用FACS仪(BD)监控细胞荧光。
如图6所示，所有4个抗体(18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66)在检测中均表现出比IMAB362更高的结合稳定性，该结果似乎与其更高的ADCC和CDC活性一致，说明更高的ADCC和CDC活性可能是由更高的结合稳定性带来的。
实施例8示例性Claudin18.2抗体的人源化
挑选Claudin 18.2抗体18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66进行人源化，并进一步研究。小鼠抗体的人源化通过已知的并以下详细描述的CDR移植法进行。
为筛选用于嵌合抗体18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66的人源化的受体骨架，将上述抗体的轻链和重链可变区序列与NCBI网站的人免疫球蛋白基因数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对，以确定最同源的人种系IGVH和 IGVK，分别作为人源化的受体。对于上述4个抗体，所选择的人重链受体是IGHV1- 46*01，所选择的人轻链受体是IGKV4-1*01。
对上述4个抗体的可变结构域进行3D结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构而言起重要作用的关键骨架残基，从而设计人源化抗体中的回复突变。所选结构模板分别与18F2-5、18F2-30、18F2-35和18F2-66有同类的典型L-CDR1、L-CDR2、 L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3环状结构。利用所选择的结构模板，用重链和轻链的人受体骨架代替小鼠骨架从而构建结构模型。随后进行3D结构建模，以鉴定出可能对维持CDR环状结构或重链和轻链接合较为重要的关键框架残基。当小鼠源抗体和人受体骨架在骨架某一位点上拥有相同的残基时，保留人种系残基。另一方面，当小鼠源抗体和人种系受体骨架在骨架某一位点上拥有不同的残基时，通过结构建模来评价该残基的重要性。如果发现小鼠源抗体骨架的残基与CDR残基相互作用并产生影响，那么该残基则回复突变为小鼠源残基。以下表4列出了用于抗体结构模拟的结构模板。
表4.抗体结构模拟中使用的结构模板
Figure BDA0002818834470000301
Figure BDA0002818834470000311
在上述结构建模的基础上，对于Claudin 18.2抗体重链鉴定出11个潜在的回复突变(R38K、A40R、M48I、R67K、M70L、R72V、T74K、T76S、V79A、R87T、A97T)，对于轻链鉴定出6个潜在的回复突变(D9S、A12T、R18K、N22S、V89L、 Q106S)。
表5.设计用于Claudin 18.2抗体的回复突变
Figure BDA0002818834470000312
如以上表5所总结的，对于各个亲和力熟化的Claudin 18.2抗体，共设计出7个人源化重链可变区和3个人源化轻链可变区。
化学合成编码人源化全长抗体的DNA序列(各重链/轻链可变区(总结在表1中) +人IgG1/κ恒定区(SEQ ID Nos.：67和68))，并分别利用EcoR I和Xho I、Cla I和 Hind III酶切位点克隆到表达载体pCDNA3(Invitrogen)中。所有的表达构建体通过DNA测序证实。这42个人源化Claudin 18.2抗体(18F2-5为10个，18F2-30为11个， 18F2-35为11个，18F2-66为10个)用实施例3中所述的方法步骤瞬时表达，并纯化。纯化的人源化抗体进一步如下进行表征。
实施例9示例性人源化Claudin 18.2抗体与HEK293A细胞上表达的Claudin 18.2 结合
对42个人源化Claudin18.2抗体进一步检测与分别表达于HEK293A/hClaudin18.2细胞或HEK293A/hClaudin18.1细胞的人Claudin 18.2或人Claudin 18.1的结合能力。FACS操作同实施例4。
代表性的人源化Claudin18.2抗体的结合亲和力显示在图7中。所有人源化抗体的结合亲和力与其亲本抗体近似，且没有一个表现出对人Claudin 18.1的结合亲和性，表明它们对于人Claudin 18.2的高特异结合。基于该结合亲和性，其中的6个(18F2- 5VH0VL0、18F2-5VH7VL3、18F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3、18F2-35VH0VL0、 18F2-35VH7VL3)选出进行进一步研究。
实施例10示例性人源化Claudin18.2抗体的CDC活性
对人源化抗体进一步检测其引发对过表达人Claudin18.2的MC38细胞的CDC效应的能力。根据实施例6中所述的方法步骤进行CDC检测。Claudin 18.2抗体 IMAB362用作参照抗体，HEL单克隆抗体作为阴性对照。
CDC检测结果示于图8，其表明所有测试的人源化Claudin 18.2抗体均表现出较强的CDC效应。
实施例11示例性人源化Claudin18.2抗体的ADCC活性
使用NK92MI-CD16a细胞作为效应细胞，检测人源化抗体引发ADCC效应的能力。根据实施例5的方法步骤进行ADCC检测。
首先分析人源化Claudin 18.2抗体引发对MC38/hClaudin18.2细胞的ADCC的能力。如图9所示，在所有人源化抗体中，人源化抗体18F2-5VH0VL0和18F2-30VH7VL3 在ADCC检测中表现出较强的ADCC效应。
基于该结果，进一步检测这些人源化Claudin 18.2抗体对EOF预处理的KATO-III细胞和NUGC-4细胞的ADCC效应，该两种细胞均已知具有较高的内源性Claudin 18.2蛋白表达。KATO-III细胞和NUGC-4细胞用10ng/ml表阿霉素(Apexbio，Cat#. A2451-100mg)、500ng/ml奥沙利铂(Ark pharm，Cat#.Ak-72813)和10ng/ml 5-FU (Acros，Cat#.Un12811)(EOF)预处理72小时，除去药物后，细胞在正常培养基 (DMEM+10％FBS)中再培养24小时。按照实施例5提到的方法步骤进行ADCC检测。
如图10所示，与参照抗体IMAB362相比，所有6种测试的人源化Claudin18.2抗体均对KATO-III或NUGC-4细胞表现出较强的ADCC活性。
实施例12示例性人源化Claudin18.2抗体ADCC和CDC效应的特异性
为证实Claudin18.2抗体对表达Claudin 18.2的靶细胞而非表达Claudin 18.1的细胞特异性地表现出ADCC或CDC效应，使用表达人Claudin 18.1或人Claudin 18.2的HEK293A细胞(HEK293A/hClaudin18.1细胞、HEK293A/hClaudin18.2细胞)作为靶细胞，根据实施例5和6中的方法步骤，进行ADCC和CDC检测。如图11(ADCC 检测)和图12(CDC检测)所示，所有测试的Claudin 18.2抗体仅对表达人Claudin 18.2的HEK293A细胞而非表达人Claudin 18.1的细胞引发ADCC和CDC活性，表明由Claudin18.2抗体引起的ADCC和CDC活性对于人Claudin18.2表达细胞是高度特异的。
实施例13示例性人源化Claudin18.2抗体对人Claudin18.2的结合稳定性
选择10个人源化Claudin18.2抗体，根据实施例7中所述的方法步骤，通过FACS 分析其与稳定过表达人Claudin18.2的HEK293A细胞(HEK293A/hClaudin18.2)的结合稳定性。Claudin 18.2抗体IMAB362用作参照，HEL单克隆抗体用作阴性对照。
如图13所示，人源化抗体具有不同的结合稳定性，且结合稳定性趋于与ADCC 和CDC测试结果一致。
实施例14示例性人源化Claudin18.2抗体的结合表位分析
研究各人源化Claudin18.2抗体的结合表位。生成16个表达胞外环1中有各种突变的人Claudin 18.2或Claudin 18.1的HEK293A细胞系，人Claudin 18.2或Claudin 18.1突变体的氨基酸序列列于以下表6中。具体而言，设计8个人Claudin 18.2突变体，其中胞外环1中的单氨基酸残基用Claudin 18.1胞外环的对应氨基酸残基替换。稳定过表达这些Claudin 18.2或Claudin 18.1突变体的HEK293A细胞系根据实施例1中的方法步骤经慢病毒侵染而生成。之后进行FACS来研究Claudin 18.2抗体对各突变体的结合亲和力。
表6.人Claudin 18.1和人Claudin 18.2突变体的氨基酸SEQIDNO.以及抗体对突变体的结合能力
Figure BDA0002818834470000331
Figure BDA0002818834470000341
如表6所示，所有Claudin 18.2抗体，包括IMAB362，均不结合表达突变体6 (带有E56Q突变)的细胞，表明E56是对于抗体-Claudin 18.2相互作用必要的氨基酸残基。此外，数据表明，带有A42S(突变体3)或N45Q(突变体4)突变的Claudin 18.2完全丧失了IMAB362的结合，并部分丧失了人源化Claudin 18.2抗体18F2- 30VH0VL0、18F2-30 VH7VL3或18F2-35VH0VL0的结合。综上，这些数据表明，与 IMAB362相比，抗体1 8F2-30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-35VH0VL0与人 Claudin 18.2胞外环1中的不同表位结合。
基于上述结果，设计了另外5个具有双点或多点突变的Claudin 18.2突变体。如表6所示，IMAB362对所有5个突变体没有结合性，而所有人源化抗体表现出对突变体 9、10和11的完全或部分结合亲和性，表明人Claudin 18.2的A42和N45是对于 IMAB362的结合亲和性必要的氨基酸残基，但不是对于18F2-30VH0VL0、18F2-30 VH7VL3和18F2-35VH0VL0结合必要的氨基酸残基。
为进一步证实该结论，制备了另外3个过表达人Claduin18.1突变体的细胞系。与上述结果一致，除IMAB362外的所有抗体均结合表达突变体14的细胞，表明本申请人源化抗体与IMAB362之间的不同结合方式，参见图15。此外，从图16中可以看出，E47Q回复突变并没有改善IMAB362对Claudin 18.2的结合亲和性，但是增强了18F2- 30VH0VL0、18F2-30VH7VL3和18F2-35VH0VL0的结合亲和性，表明人Claudin 18.2/Q47是对于18F2-30VH0VL0、18F2-30 VH7VL3和18F2-35VH0VL0的Claudin 18.2结合亲和力是重要的氨基酸残基，但不是对于IMAB362重要的氨基酸残基。
综上，我们总结，与参照抗体IMAB362相比，人源化Claudin 18.2抗体18F2-30VH0VL0、18F2-30 VH7VL3和18F2-35VH0VL0与人Claudin 18.2胞外环1中的不同表位结合。
实施例15示例性人源化Claudin18.2抗体经PBMC或Vγ9Vδ2T细胞的ADCC活性
对人源化Claudin18.2抗体进一步分析其经人PBMC引发对MC38/hClaudin18.2 细胞(实施例5中制备)或EOF预处理的NUGC-4细胞的ADCC活性，其中 MC38/hClaudin 18.2细胞通过表达GFP蛋白的pLV-EGFP(2A)-Puro的侵染而产生。人 PBMC使用淋巴分离液通过密度梯度离心而制备，并在培养基 (RIPM1640+10％FBS+300IU IL-2)中培养过夜。
ADCC检测通过使用LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher，USA，Cat#：L34964)进行。靶细胞和效应细胞(PBMC)1200rpm离心5分钟。细胞用 ADCC实验培养基(RIPM1640培养基+1％FBS)重悬，根据细胞计数，细胞活率为约90％。靶细胞密度调整成4x105/ml，PBMC细胞密度调整成8x106/ml。之后将50μl 的MC38/hClaudin18.2细胞和50μl的PBMC(效靶比为20∶1)加入各孔。分别加入不同浓度的抗体，达到最终浓度。用于MC38/hClaudin18.2细胞的抗体终浓度为 800ng/ml、32ng/ml和6.4ng/ml，用于NUGC-4细胞的浓度为4000ng/ml、160ng/ml、 64ng/ml和2.5ng/ml。然后样本于37℃孵育12小时。混合物用PBS洗3遍，然后与 LIVE/DEAD可固定死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用PBS洗3遍，用FACS进行分析。计算出GFP阳性细胞(MC38/hClaudin18.2细胞)的细胞凋亡率。
针对NUGC-4细胞的检测，将NUGC-4细胞预先用10ng/ml表阿霉素(Apexbio， Cat#.A2451-100mg)、500ng/ml奥沙利铂(Ark pharm，Cat#.Ak-72813)和10ng/ml 5-FU(Acros，Cat#.Un12811)(EOF)处理72小时，然后除去药物。细胞在正常培养基继续(DMEM+10％FBS)中继续培养24小时。根据制造商的说明书，NUGC-4细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯CSFE(Invitrogen，USA，Cat#：C34554)标记。ADCC检测如上所述进行，除ADCC效应细胞与靶细胞的比为50∶1外。
之前的研究表明，Vγ9Vδ2T细胞对于抗人Claudin 18.2抗体的ADCC活性很重要。在本实施例中，在人PBMC中富集培养Vγ9Vδ2T细胞。具体而言，收集PBMC，并培养在诱导Vγ9Vδ2 T细胞的DMEM培养基，该培养基含有10％FBS、300IU IL-2、和1μM唑来膦酸(ZA)。14天后，收集细胞，用作ADCC检测中的效应细胞。在以 MC38/hClaudin18.2细胞作为靶细胞的检测中，E/T比是20∶1；而以EOF预处理的 NUGC-4细胞为靶细胞时，E/T比是50∶1。具体的ADCC方法步骤与上述一致。
如图17(PBMC为效应细胞)和图18(Vγ9Vδ2T细胞为效应细胞)所示，所有抗体能够以剂量依赖的方式诱导PBMC和Vγ9Vδ2T细胞对靶细胞的ADCC效应。 Vγ9Vδ2T细胞的ADCC活性确实强于PBMC，与之前的研究一致。
实施例16示例性Claudin18.2抗体的体内抗肿瘤效果
选择6个Claudin18.2抗体(18F2-5VH0VL0、18F2-5VH7VL3、18F2-30VH0VL0、 18F2-30VH7VL3、18F2-35VH0VL0、18F2-35VH7VL3)，用于在带有小鼠结肠腺癌的 C57小鼠中的体内抗肿瘤活性研究。为更好地体现抗体在动物模型中的ADCC效应，抗体的可变区与小鼠IgG2a/κ恒定区融合来制备全长抗体，mIgG 2a和κ恒定区氨基酸序列分别显示在SEQ ID NOs.：89和90中。
在第0天，用1×106过表达人Claudin18.2的MC38细胞(MC38/hClaudin18.2)注射小鼠侧腹区域。待肿瘤长到约80mm3时，动物随机分为不同组(n＝8)，在第5、7、 10、12、14、17和19天，腹腔注射一种抗体，剂量为10mg/kg。随时间推移监测肿瘤生长，体积在第5、7、10、12、14、17和19天测量。肿瘤测量采用游标卡尺(长和宽)，并通过公式TV＝(长×宽2)/2计算肿瘤体积。当肿瘤体积达到3cm3时停止实验。
如图19所示，所有测试的抗体均能抑制肿瘤生长，具有18F2-30VH0VL0可变区的抗体展示出最佳的抗肿瘤效果。
实施例17示例性Claudin 18.2抗体与化疗结合的抗肿瘤效果
在第0天，用1×106过表达人Claudin18.2的MC38细胞(MC38/hClaudin18.2)皮下注射小鼠侧腹区域。待肿瘤长到约80mm3时，动物随机分成不同组(n＝10)，在第 5和12天腹腔注射EOF(表柔比星(1.25mg/kg)、奥沙利铂(3.25mg/kg)和5-FU (56.25mg/kg))或对照溶剂，其中对照组不接受EOF预处理。之后，在第6、8、11、 13、15和18天，这些小鼠腹腔注射18F2-30-VH0VL0、18F2-5-VH0VL0、18F2-35- VH7VL3(所有三种具有小鼠IgG 2a/κ恒定区，mIgG 2a和κ恒定区氨基酸序列分别显示在SEQ ID NOs.：89和90中)或对照剂，剂量为10mg/kg。随时间推移监测肿瘤生长，体积在第5、7、10、12、14、17和19天测量。肿瘤测量采用游标卡尺(长和宽)，并通过公式TV＝(长×宽2)/2计算肿瘤体积。当肿瘤体积达到3cm3时停止实验。
如图20所示，所有测试抗体均展示出与化疗剂的协同抗肿瘤效果，在这些抗体中，具有18F2-30VH0VL0可变区的抗体展示出最佳的协同抗肿瘤效果.
实施例18去岩藻糖化Claudin18.2抗体的ADCC和CDC效应
SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞由天广实公司如US2018/0022820 A1中所述而构建，该细胞系表达的蛋白几乎没有岩藻糖化修饰。
通过将18F2-30VH0VL0和18F2-35VH7VL3重链/轻链可变区加上人IgG1/κ恒定区(SEQ ID Nos.：67and 68)克隆到pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，USA)的合适酶切位点而构建表达载体，之后转染到SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞中。两种去岩藻糖化的Claudin18.2抗体，称为18F2-30VH0VL0AF和18F2-35VH7VL3AF，根据实施例3的方法步骤，在SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞中瞬时表达并纯化。
使用NK92MI-CD16a细胞为效应细胞，使用EOF预处理的NUGC-4细胞作为靶细胞，检测两种去岩藻糖化Claudin 18.2抗体的ADCC活性。根据实施例5的方法步骤进行ADCC检测。
对去岩藻糖化抗体进一步检测其引发对表达人Claudin18.2的MC38细胞的CDC 效应的能力。根据实施例6的方法步骤进行CDC检测。Claudin 18.2抗体IMAB362用作参照抗体，HEL单克隆抗体用作阴性对照。
如图21所示，18F2-30VH0VL0 AF和18F2-35VH7VL3 AF均比其各自的亲本抗体具有更强的ADCC效应。图22的结果显示出，这两种抗体的CDC活性并没有不同于其亲本抗体。
示例性抗体的重链/轻链可变区氨基酸序列总结如下。
Figure BDA0002818834470000371
Figure BDA0002818834470000381
Figure BDA0002818834470000391
Figure BDA0002818834470000401
Figure BDA0002818834470000411
Figure BDA0002818834470000421
尽管本申请已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本申请不限于那些实施方式，且说明书意在涵盖可包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。
序列表
<110> 北京天广实生物技术股份有限公司
北京华放天实生物制药有限责任公司
<120> 与人Claudin 18.2结合的抗体及其用途
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<151> 2019-01-17
<160> 90
<170> PatentIn版本3.5
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<223> HV
<400> 31
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
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<223> HV
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC
<400> 68
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 69
<211> 786
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
atgagcacca ccacctgcca ggtggtggcc ttcctgctga gcatcctggg cctggccggc 60
tgcatcgccg ccaccggcat ggacatgtgg agcacccagg acctgtacga caaccccgtg 120
accagcgtgt tccagtacga gggcctgtgg cgcagctgcg tgcgccagag cagcggcttc 180
accgagtgcc gcccctactt caccatcctg ggcctgcccg ccatgctgca ggccgtgcgc 240
gccctgatga tcgtgggcat cgtgctgggc gccatcggcc tgctggtgag catcttcgcc 300
ctgaagtgca tccgcatcgg cagcatggag gacagcgcca aggccaacat gaccctgacc 360
agcggcatca tgttcatcgt gagcggcctg tgcgccatcg ccggcgtgag cgtgttcgcc 420
aacatgctgg tgaccaactt ctggatgagc accgccaaca tgtacaccgg catgggcggc 480
atggtgcaga ccgtgcagac ccgctacacc ttcggcgccg ccctgttcgt gggctgggtg 540
gccggcggcc tgaccctgat cggcggcgtg atgatgtgca tcgcctgccg cggcctggcc 600
cccgaggaga ccaactacaa ggccgtgagc taccacgcca gcggccacag cgtggcctac 660
aagcccggcg gcttcaaggc cagcaccggc ttcggcagca acaccaagaa caagaagatc 720
tacgacggcg gcgcccgcac cgaggacgag gtgcagagct accccagcaa gcacgactac 780
gtgtaa 786
<210> 70
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 71
<211> 786
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
atggccgtga ccgcctgcca gggcctgggc ttcgtggtga gcctgatcgg catcgccggc 60
atcatcgccg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccagg acctgtacaa caaccccgtg 120
accgccgtgt tcaactacca gggcctgtgg cgcagctgcg tgcgcgagag cagcggcttc 180
accgagtgcc gcggctactt caccctgctg ggcctgcccg ccatgctgca ggccgtgcgc 240
gccctgatga tcgtgggcat cgtgctgggc gccatcggcc tgctggtgag catcttcgcc 300
ctgaagtgca tccgcatcgg cagcatggag gacagcgcca aggccaacat gaccctgacc 360
agcggcatca tgttcatcgt gagcggcctg tgcgccatcg ccggcgtgag cgtgttcgcc 420
aacatgctgg tgaccaactt ctggatgagc accgccaaca tgtacaccgg catgggcggc 480
atggtgcaga ccgtgcagac ccgctacacc ttcggcgccg ccctgttcgt gggctgggtg 540
gccggcggcc tgaccctgat cggcggcgtg atgatgtgca tcgcctgccg cggcctggcc 600
cccgaggaga ccaactacaa ggccgtgagc taccacgcca gcggccacag cgtggcctac 660
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tacgacggcg gcgcccgcac cgaggacgag gtgcagagct accccagcaa gcacgactac 780
gtgtaa 786
<210> 72
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 73
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体1
<400> 73
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 74
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体2
<400> 74
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 75
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体3
<400> 75
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 76
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体4
<400> 76
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Gln Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 77
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体5
<400> 77
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 78
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体6
<400> 78
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 79
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体7
<400> 79
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 80
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体8
<400> 80
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 81
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体9
<400> 81
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 82
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体10
<400> 82
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Asn Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 83
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体11
<400> 83
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 84
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体12
<400> 84
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 85
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体13
<400> 85
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 86
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体14
<400> 86
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 87
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体15
<400> 87
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 88
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体16
<400> 88
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
260
<210> 89
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠IgG2a恒定区
<400> 89
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠kappa恒定区
<400> 90
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105

Claims (19)

1.一种分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，与Claudin 18.2结合，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中所述重链CDR1区、CDR2区和CDR3区、以及所述轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs:1、4、7、10、13和16；(2)SEQ ID NOs:2、4、8、11、13和16；(3)SEQ ID NOs:2、4、9、10、14和16；(4)SEQ ID NOs:2、5、9、12、13和16；(5)SEQ ID NOs:3、6、8、10、15和16的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含与SEQ IDNOs:17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、或49具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区包含与SEQ IDNOs:50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含与(1)SEQ ID NOs:17和50；(2)SEQ ID NOs:18和51；(3)SEQ ID NOs:19和52；(4)SEQ ID NOs:20和53；(5)SEQ ID NOs:21和54；(6)SEQ ID NOs:22和55；(7)SEQ ID NOs:23和55；(8)SEQ ID NOs:24和55；(9)SEQ ID NOs:25和55；(10)SEQ ID NOs:26和55；(11)SEQ ID NOs:27和55；(12)SEQ ID NOs:27和56；(13)SEQ ID NOs:27和57；(14)SEQ ID NOs:28和56；(15)SEQ ID NOs:28和57；(16)SEQ ID NOs:29和58；(17)SEQ ID NOs:30和58；(18)SEQ ID NOs:31和58；(19)SEQ ID NOs:32和58；(20)SEQ ID NOs:33和58；(21)SEQ ID NOs:34和58；(22)SEQ ID NOs:34和59；(23)SEQ ID NOs:34和60；(24)SEQ ID NOs:35和58；(25)SEQ ID NOs:35和59；(26)SEQ ID NOs:35和60；(27)SEQ ID NOs:36和61；(28)SEQ ID NOs:37和61；(29)SEQ ID NOs:38和61；(30)SEQ ID NOs:39和61；(31)SEQ ID NOs:40和61；(32)SEQ ID NOs:41和61；(33)SEQ ID NOs:41和62；(34)SEQ ID NOs:41和63；(35)SEQ ID NOs:42和61；(36)SEQ ID NOs:42和62；(37)SEQ ID NOs:42和63；(38)SEQ ID NOs:43和64；(39)SEQ ID NOs:44和64；(40)SEQ ID NOs:45和64；(41)SEQ ID NOs:46和64；(42)SEQ ID NOs:47和64；(43)SEQ ID NOs:48和64；(44)SEQ ID NOs:48和65；(45)SEQ ID NOs:48和66；(46)SEQ ID NOs:49和65；或(47)SEQ ID NOs:49和66具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，还包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含与SEQ ID NOs:67或89具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NOs:68或90具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其(a)与人Claudin 18.2结合；(b)不与Claudin 18.1结合；(c)诱导对表达人Claudin 18.2的细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性；和(d)诱导对表达人Claudin 18.2的细胞的补体依赖的细胞毒性效应。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其为小鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其为去岩藻糖化的抗体。
10.一种双特异性分子、免疫交联物、嵌合抗原受体、基因改造的T细胞受体、或溶瘤病毒，包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分。
11.一种宿主细胞，包含编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分的核苷酸。
12.一种药物组合物，包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，还包含抗肿瘤药物。
14.权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，用于治疗与Claudin 18.2表达相关的癌症疾病。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌症疾病选自胰腺癌、胃癌、肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌。
16.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合部分，其中权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分与免疫刺激抗体、共刺激抗体、化疗剂、γδT细胞刺激剂、和/或Claudin18.2表达稳定剂或表达增加剂共同施用。
17.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述免疫刺激抗体选自PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、STAT3抗体和ROR1抗体。
18.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述γδT细胞刺激剂为唑来膦酸。
19.根据权利要求16所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述Claudin18.2表达稳定剂或表达增加剂包含(i)表阿霉素、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶；(ii)表阿霉素、奥沙利铂和卡培他滨；(iii)表阿霉素、顺铂和5-氟尿嘧啶；(iv)表阿霉素、顺铂和卡培他滨；或(v)亚叶酸、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶。
CN201980037720.6A 2019-01-17 2019-09-12 与人Claudin 18.2结合的抗体及其用途 Active CN112399974B (zh)

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