KR20210116207A - 인간 ClAUDIN 18.2에 결합하는 항체 및 그 용도 - Google Patents

인간 ClAUDIN 18.2에 결합하는 항체 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20210116207A
KR20210116207A KR1020207037154A KR20207037154A KR20210116207A KR 20210116207 A KR20210116207 A KR 20210116207A KR 1020207037154 A KR1020207037154 A KR 1020207037154A KR 20207037154 A KR20207037154 A KR 20207037154A KR 20210116207 A KR20210116207 A KR 20210116207A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
thr
antibody
gly
val
Prior art date
Application number
KR1020207037154A
Other languages
English (en)
Inventor
웬치 후
지앙메이 리
샤 왕
펭 리
Original Assignee
베이징 맵웍스 바이오테크 컴퍼니 리미티드
베이징 맵브릿지 바이오파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베이징 맵웍스 바이오테크 컴퍼니 리미티드, 베이징 맵브릿지 바이오파마슈티컬 컴퍼니 리미티드 filed Critical 베이징 맵웍스 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20210116207A publication Critical patent/KR20210116207A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체를 제공한다. 또한, 항체를 암호화하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체를 발현하는 방법을 제공한다. 본 발명은 항체를 포함하는 면역접합체, 이중 특이성 분자, 키메라 항원 수용체, 종양용해 바이러스 및 약학적 조성물뿐 아니라 본 발명의 항-Claudin 18.2 항체를 이용한 진단 또는 치료 방법을 추가적으로 제공한다.

Description

인간 ClAUDIN 18.2에 결합하는 항체 및 그 용도
본 발명은 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 제조 및 용도, 특히 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 간암, 난소암, 폐암 및 방광암과 같은 종양을 비롯하여, Claudin 18.2를 발현하는 세포와 관련된 질환의 진단, 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.
암 및 항체 요법
암은 오늘날 우리 사회에서 가장 주요한 사망 원인 질환이다. 2014년 세계 암 보고서에 따르면, 흑색종 이외의 피부암을 제외한 새로운 암 사례가 매년 약 1,410만건 발생하고 있다. 암으로 인해 연간 약 880만명이 사망한다 (GBD 2015 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators, (2016) Lancet 388 (10053):1545-1602). 예를 들어, 위암은 선진국에서 암-관련 사망의 (남성의 경우) 4번째, (여성의 경우) 다섯번째를 차지하는 가장 일반적인 요인이다.
다수의 암은, 특히 진행된 병기에서는, 여전히 치유하기 어렵다. 예를 들어, 위식도암의 전체 5년 생존율은, 현행 표준 치료의 공격성과 이와 관련된 상당한 부작용에도 불구하고, 20-25%에 불과하다. 췌장암의 경우, 환자는 일반적으로 진행된 병기에서 진단되어, 예후가 매우 좋지 않으며, 그래서 중앙 생존 기간은 6개월 미만에 불과하고, 5년 생존율도 5.5% 미만이다.
항체 요법은 광범위한 암을 치료하기 위해 다양한 사법권에서 승인되었으며, 현저하게 개선된 환자 성과를 거두었다 (Komeev et al., (2017) Cytokine 89: 127-135). 항체는, 암 항원에 결합하면, 항체-의존적인 세포-매개 세포독성을 유도하거나, 보체 시스템을 활성화하거나, 또는 수용체가 이의 리간드와 상호작용하지 못하게 막을 수 있는데, 이러한 작용 모두 암 세포의 사멸을 유발할 수 있다. 미국 FDA 승인된 항체 약물로는 알렘투주맵 (Alemtuzumab), 니볼루맵 (Nivolumab), 리툭시맵 (Rituximab) 및 두르발루맵 (Durvalumab) 등이 있다.
Claudin 18.2
Claudin은 1998년에 Shorichiro Tsukita 등 (Furuse et al., (1998) J Cell Biol 141(7): 1539-1550)에 의해 최초로 발견되었으며, 세포 주위 장벽을 확립하고 세포 간의 분자 이동을 제어하는 세포-표면 단백질 계열에 속한다 (Singh et al., (2010) J Oncol 2010: 541957). Claudin은 상피 세포의 극성 유지, 세포 주변으로의 확산 제어 및 세포 증식과 분화 조절에 중요한 역할을 수행하는 밀착 접합 (tight junction)의 필수 구성성분이다. 밀착 접합 계열의 다른 주된 단백질 2종은 occludin과 접합 응착 분자 (junctional adhesion molecule, JAM)이다. 각각의 claudin 분자는 세포막을 4번 통과하고, N-말단과 C-말단은 둘다 세포질에 위치한다.
지금까지 claudin 구성원 24종이 포유류에서 보고되었으며, Claudin 13은 인간에 존재하지 않는다. 여러가지 claudin 구성원들은 서로 다른 조직 상에서 발현되며, 이의 변형된 기능이 암 형성과 연관되어 있다. Claudin 1, Claudin 18 및 Claudin 10의 발현 수준이 대장암, 위암 및 간세포암과 각각 관련있어, claudin은 치료학적 전략에서 기대되는 표적이 되었다 (Swisshelm et al., (2005) Adv Drug Deliv Rev 57(6): 919-928).
Claudin 18은 또한 CLD18으로도 알려져 있으며, 2개의 이소형이 존재한다. Claudin 18.1은 정상 폐 및 위의 상피 상에서 선택적으로 발현된다. Claudin 18.2는 정상 조직에서 매우 제한적인 발현 패턴을 보이는데, 위 상피 내 분화된 수명이 짧은 세포들에서만 한정적이고, 특히 위의 줄기 세포 영역에는 존재하지 않는다.
그러나, Claudin 18.2는 상당한 비율의 원발성 위암 및 전이에서 다량으로 존재하며, 악성 변환에 중요한 역할을 담당한다. 예를 들어, 췌장 종양, 식도 종양, 난소 종양 및 폐 종양에서 Claudin 18.2의 빈번한 이소성 활성화가 발견된 바 있다 (Niimi et al., (2001) Mol Cell Biol 21(21): 7380-7390; Tanaka et al. (2011) J Histochem Cytochem 59(10): 942-952; Micke et al., (2014) Int J Cancer 135(9): 2206-2214; Shimobaba et al. (2016) Biochim Biophys Acta 1863(6 Pt A): 1170-1178; Singh et al., (2017) J Hematol Oncol 10(1): 105; Tokumitsu et al., (2017) Cytopathology 28(2): 116-121).
Claudin 18.2에는 단일클론 항체 결합에 이용가능한 세포외 루프가 노출되어 있으며, 암을 치료하기 위한 실험들에서 CLDN18.2 항체가 이용된 바 있다. 예를 들어, Ganymed 사에서 개발한 키메라 항-Claudin 18.2 IgG1 항체인 Claudiximab (IMAB362)은 1상 및 2상 임상 실험에서 진행된 위식도암 치료에 대한 고무적인 효과가 밝혀졌다 (Sahin et al., (2018) Eur J Cancer 100: 17-26).
다수의 악성 종양들에서 충족되지 못한 의학적 요구로 인해, 더 바람직한 약학적 특징을 가진 부가적인 항-Claudin 18.2 단일클론 항체가 필요한 실정이다.
본 발명은, Claudin 18.2 (예를 들어, 인간 Claudin 18.2, 및 원숭이 Claudin 18.2)에 결합하고; 선행 기술 분야의 항체와 비교해, 더 높은 ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 Claudin 18.2 결합 안정성을 가진, 단리된 단일클론 항체, 예를 들어, 마우스, 인간, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체를 제공한다.
본 발명의 항체는, Claudin 18.2 단백질의 진단, 및 Claudin 18.2 관련 암의 진단, 치료 또는 예방 등의, 다양한 용도로 이용할 수 있다.
이에, 일 측면에서, 본 발명은, CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가지되, CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역이 하기와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가진 아미노산 서열 또는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, Claudin 18.2에 결합하는 단리된 단일클론 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 또는 이의 항원-결합부에 관한 것으로,
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Claudin 18.2에 결합한다:
(1) 각각 서열번호 1, 4 및 7,;
(2) 각각 서열번호 2, 4 및 8;
(3) 각각 서열번호 2, 4 및 9;
(4) 각각 서열번호 2, 5 및 9; 또는
(5) 각각 서열번호 3, 6 및 8.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부는, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지거나 또는 이에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Claudin 18.2에 결합한다.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부는, CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하되, CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역이 하기 서열에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지거나 또는 하기에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역을 포함하며:
(1) 각각 서열번호 10, 13 및 16;
(2) 각각 서열번호 11, 13 및 16;
(3) 각각 서열번호 10, 14 및 16;
(4) 각각 서열번호 12, 13 및 16; 또는
(5) 각각 서열번호 10, 15 및 16;
여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Claudin 18.2에 결합한다.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부는, 서열번호 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지거나 또는 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Claudin 18.2에 결합한다.
일 측면에서, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부는, 각각 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하는, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3와 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3는, (1) 각각 서열번호 1, 4, 7, 10, 13 및 16; (2) 각각 서열번호 2, 4, 8, 11, 13 및 16; (3) 각각 서열번호 2, 4, 9, 10, 14 및 16; (4) 각각 서열번호 2, 5, 9, 12, 13 및 16; 또는 (5) 각각 서열번호 3, 6, 8, 10, 15 및 16에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지거나 또는 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Claudin 18.2에 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 (1) 각각 서열번호 17 및 50; (2) 각각 서열번호 18 및 51; (3) 각각 서열번호 19 및 52; (4) 각각 서열번호 20 및 53; (5) 각각 서열번호 21 및 54; (6) 각각 서열번호 22 및 55; (7) 각각 서열번호 23 및 55; (8) 각각 서열번호 24 및 55; (9) 각각 서열번호 25 및 55; (10) 각각 서열번호 26 및 55; (11) 각각 서열번호 27 및 55; (12) 각각 서열번호 27 및 56; (13) 각각 서열번호 27 및 57; (14) 각각 서열번호 28 및 56; (15) 각각 서열번호 28 및 57; (16) 각각 서열번호 29 및 58; (17) 각각 서열번호 30 및 58; (18) 각각 서열번호 31 및 58; (19) 각각 서열번호 32 및 58; (20) 각각 서열번호 33 및 58; (21) 각각 서열번호 34 및 58; (22) 각각 서열번호 34 및 59; (23) 각각 서열번호 34 및 60; (24) 각각 서열번호 35 및 58; (25) 각각 서열번호 35 및 59; (26) 각각 서열번호 35 및 60; (27) 각각 서열번호 36 및 61; (28) 각각 서열번호 37 및 61; (29) 각각 서열번호 38 및 61; (30) 각각 서열번호 39 및 61; (31) 각각 서열번호 40 및 61; (32) 각각 서열번호 41 및 61; (33) 각각 서열번호 41 및 62; (34) 각각 서열번호 41 및 63; (35) 각각 서열번호 42 및 61; (36) 각각 서열번호 42 및 62; (37) 각각 서열번호 42 및 63; (38) 각각 서열번호 43 및 64; (39) 각각 서열번호 44 및 64; (40) 각각 서열번호 45 및 64; (41) 각각 서열번호 46 및 64; (42) 각각 서열번호 47 및 64; (43) 각각 서열번호 48 및 64; (44) 각각 서열번호 48 및 65; (45) 각각 서열번호 48 및 66; (46) 각각 서열번호 49 및 65; 또는 (47) 각각 서열번호 49 및 66에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지거나 또는 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Claudin 18.2에 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄는 중쇄 가변 영역과 중쇄 불변 영역을 포함하고, 경쇄는 경쇄 가변 영역과 경쇄 불변 영역을 포함하되, 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역은 각각 서열번호 67 및 68 또는 각각 서열번호 89 및 90에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지거나 또는 상기 서열번호에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 전술한 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Claudin 18.2에 결합한다.
본 발명의 항체는, 일부 구현예에서, 이황화 결합에 의해 연결된 중쇄 2개와 경쇄 2개를 포함하거나, 또는 이들로 구성되며, 여기서 각각의 중쇄는 중쇄 불변 영역, 중쇄 가변 영역 또는 전술한 CDR 서열을 포함하고, 각각의 경쇄는 경쇄 불변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 전술한 CDR 서열을 포함하며, 중쇄 가변 영역의 C-말단은 중쇄 불변 영역의 N-말단과 연결되고, 경쇄 가변 영역의 C-말단은 경쇄 불변 영역의 N-말단과 연결되며, 여기서 항체는 Claudin 18.2에 결합한다. 본 발명의 항체는 전장 항체, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형일 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 단쇄 항체일 수 있거나, 또는 Fab 또는 Rab' 단편과 같은 항체 단편으로 구성될 수 있다.
본 발명의 예시적인 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Claudin 18.2에 결합하며, Claudin 18.2-발현 세포에 대해 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존적인 세포독성 (CDC) 활성을 유도한다. 이는 인간 Claudin 18.1에는 결합하지 않는다. 본 발명의 예시적인 항체 또는 항원 결합 단편은 생체내 항-종양 효과를 가진다.
또한, 본 발명은 세포독소와 같은 치료학적 물질과 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 항체 또는 이의 항원-결합부와는 다른 결합 특이성을 가진 제2 기능성 모이어티 (예, 2차 항체)와 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 이중 특이성 분자를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 일부로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부는 종양용해 바이러스에 의해 암호화되거나, 또는 종양용해 바이러스와 조합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부, 면역접합체 또는 이중 특이성 분자, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부를 암호화하는 핵산 뿐 아니라 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. (i) 숙주 세포에서 항체를 발현하는 단계 및 (ii) 숙주 세포 또는 이의 세포 배양물로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 이용한 항-Claudin 18.2 항체의 제조 방법 역시 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 개체로부터 대상 조직 샘플을 수집하고, 조직 샘플을 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부와 접촉시키는 것을 포함하는, 개체에서 암 질환의 진단 방법을 제공한다. 개체는, Claudin 18.2가 소정의 양으로 검출되면, 특정 암에 걸린 것으로 진단될 수 있다. 암은 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 간암, 난소암, 폐암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고형 종양일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부를 치료학적 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 질환의 예방, 치료 또는 개선 방법을 제공한다. 암은 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 간암, 난소암, 폐암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고형 종양일 수 있다. 일부 구현예에서, 이 방법은 본 발명의 조성물, 이중 특이성 분자, 면역접합체, CAR-T 세포, 항체-암호화하는 종양용해 바이러스 또는 항체-보유성 종양용해 바이러스를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 부가적인 항암 항체가 항-PD-1 항체, 항-LAG-3 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부와 함께 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부는 사이토카인 (예를 들어, IL-2 및/또는 IL-21), 또는 공동-자극성 항체 (예를 들어, 항-CD137 및/또는 항-GITR 항체)와 함께 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부는 에피루비신, 옥살리플라틴 및/또는 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 세포독성제일 수 있는, 화학치료제와 함께 투여된다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 마우스, 인간, 키메라 또는 인간화된 항체일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 개체에게 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부를 치료학적 유효량으로 γδT 세포 자극제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. γδT 세포 자극제는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부를 투여하기 전, 투여와 동시에 또는 투여한 후에 투여할 수 있다. γδ T 세포는 Vγ9Vδ2 T 세포일 수 있다. 일 구현예에서, γδT 세포 자극제는 비스포스포네이트, 특히 질소-함유성 비스포스포네이트, 예를 들어 N-비스포스포네이트 및 아미노비스포스포네이트이다. 일 구현예에서, γδT 세포 자극제는 졸레드론산이며, 바람직하게는 인터루킨-2와 조합된다.
일 구현예에서, 본 발명의 암 질환의 치료 방법은 Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제를 투여하는 것을 더 포함한다. Claudin 18.2의 발현은 바람직하게는 암 세포의 세포 표면에서 이루어진다. Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제는 옥살리플라틴 및/또는 5-FU일 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 후술한 상세한 설명 및 실시예들로부터 명확해질 것이며, 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 전체에서 인용된 유전자은행 엔트리, 특허 및 공개된 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
도 1은 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 2는 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 MC38 세포에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 EOF 전처리된 KATOIII 세포 (A) 또는 NUGC4 세포 (B)에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 인간 Claudin 18.2 (A) 또는 인간 Claudin 18.1 (B)을 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 MC38 세포에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 CDC 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 FACS 분석에서 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 결합 안정성을 나타낸 것으로, HEK293A 세포를 항-Claudin 18.2 항체와 4℃에서 1시간 인큐베이션하고, 비-결합된 항체를 제거한 후 다시 0시간, 3시간 또는 5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
도 7은 FACS 분석에서 인간 Claudin 18.2 또는 인간 Claudin 18.1을 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 결합 친화성을 나타낸 것으로, 인간화된 항-Claudin 18.2 항체는 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3 및 18F2-30 (A), 18F2-35VH0VL0, 18F2-35VH7VL3 및 18F2-35 (B), 및 18F2-5VH0VL0, 18F2-5VH7VL3 및 18F2-5 (C)를 포함한다.
도 8은 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 MC38 세포에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 CDC 활성을 나타낸 것으로, 인간화된 항-Claudin 18.2 항체는 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3 및 18F2-30 (A), 18F2-35VH0VL0, 18F2-35VH7VL3 및 18F2-35 (B), 및 18F2-5VH0VL0, 18F2-5VH7VL3 및 18F2-5 (C)이다.
도 9는 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 MC38 세포에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것으로, 인간화된 항-Claudin 18.2 항체는 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3 및 18F2-30 (A), 18F2-35VH0VL0, 18F2-35VH7VL3 및 18F2-35 (B), 및 18F2-5VH0VL0, 18F2-5VH7VL3 및 18F2-5 (C)이다.
도 10은 EOF 전처리된 NUGC4 (A) 또는 KATOIII 세포 (B)에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 11은 인간 Claudin 18.1 (A) 또는 인간 Claudin 18.2 (B)를 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 12는 인간 Claudin 18.1 (A) 또는 인간 Claudin 18.2 (B)를 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 CDC 활성을 나타낸 것이다.
도 13은 분석한 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 결합 안정성을 나타낸 것으로, HEK293A 세포는 인간화된 항-Claudin 18.2 항체와 4℃에서 1시간 동안, 그리고 비-결합된 항체를 제거한 후 다시 0시간, 3시간 또는 5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
도 14는 인간 Claudin 18.1을 인간 Cluadin 18.2에 대해 아미노산 서열 정렬한 것으로, 박스는 세포외 루프 1 영역이고, 화살표는 이 영역에서 아미노산 차이를 가르킨다.
도 15는 돌연변이 14를 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 결합 친화성을 나타낸 것이다.
도 16은 인간 Claudin 18.1, 돌연변이 15 (Claudin 18.1/ S42A/Q45N/Q56E) 또는 돌연변이 16 (Claudin 18.1 /S42A/Q45N E47Q/Q56E)을 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 결합 친화성을 나타낸 것으로, 여기서 항체는 IMAB362(A), 18F2-35VH0VL0 (B), 18F2-30VH7VL3 (C) 및 18F2-30VH0VL0 (D)이다
도 17은 PBMC에 의한 인간 Claudin 18.2-발현성 MC38 세포 (A) 또는 NUGC-4 세포 (B)에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 18은 Vγ9Vδ2T 세포에 의한 인간 Claudin 18.2-발현성 MC38 세포 (A) 또는 NUGC-4 세포 (B)에 대한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것이다.
도 19는 항-Claudin 18.2 항체의 생체내 항-종양 효과를 보여주는, 본 발명의 인간화된 항-OX40 항체 또는 대조군 물질이 투여된 그룹에서 평균 종양 체적 (A) 및 개별 종양 무게 (B)를 나타낸 것이다.
도 20은 화학치료제와 조합할 경우 항-Claudin 18.2 항체의 생체내 항-종양 효과를 나타낸 것이다.
도 21은 EOF 전처리된 NUGC4에 대한 비-푸코실화된 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 나타낸 것으로, 비-푸코실화된 항-Claudin 18.2 항체는 18F2-30VH0VL0AF (A) 및 18F2-35VH7VL3AF (B)이다.
도 22는 인간 Claudin 18.2-발현성 MC38 세포에 대한 비-푸코실화된 항-Claudin 18.2 항체의 CDC 활성을 나타낸 것으로, 비-푸코실화된 항-Claudin 18.2 항체는 18F2-30VH0VL0AF (A) 및 18F2-35VH7VL3AF (B)이다.
본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 몇가지 용어들을 정의한다. 부가적인 정의들은 상세한 설명 전체에서 설명된다.
용어 "Claudin 18.2"는 Claudin 18, 이소형 2를 의미한다. 용어 "Claudin 18.2"는 변이체, 호몰로그 (homolog), 오솔로그 (ortholog) 및 파랄로그 (paralog)를 포함한다. 예를 들어, 인간 Claudin 18.2 단백질에 특이적인 항체는 일부 경우에 시노몰구스 원숭이와 같은 인간이 아닌 종으로부터 유래된 Claudin 18.2 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예들에서, 인간 Claudin 18.2 단백질에 특이적인 항체는 인간 Claudin 18.2 단백질에 전적으로 특이적일 수 있으며, 다른 종 또는 다른 타입과 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있거나, 또는 일부 다른 종으로부터 유래되는 Claudin 18.2와 교차 반응하지만 다른 종들 모두와 그런 것은 아니다.
용어 "인간 Claudin 18.2"는 유전자은행 등재 번호 NM_001002026의 아미노산 서열과 같이, 인간으로부터 유래된 아미노산 서열을 가진 Claudin 18.2 단백질을 지칭한다.
본원에서 언급되는 용어 "항체"는 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합부") 또는 단쇄를 포괄한다. 전체 (whole) 항체가 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 영역과 VL 영역은, 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역들이 그 사이에 존재하는, 친화성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 과변이 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은, 숙주 세포 또는 면역계의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 비롯한, 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서, 항체의 용어 "항원-결합부" (또는 간단하게 "항체 부분")는, 항원 (예를 들어, Claudin 18.2 단백질)에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가진 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합부는 전장 항체의 단편들에 의해 달성될 수 있는 것으로 입증되어 있다. 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 C H1 도메인들로 구성되는 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 연결된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편, 즉 F(ab')2 단편; (iii) VH 도메인과 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 싱글 팔의 VL 도메인과 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (vii) 가변성 도메인 하나와 불변 도메인 2개를 함유한 중쇄 가변 영역인 나노바디를 포함한다. 아울러, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH는 개별 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 형성하여 일가 분자 (단쇄 Fv (scFv)로 공지됨)를 형성하는 단백질 단쇄로서 제조할 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 이용해 서로 연결될 수 있다 (예로, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883을 참조함). 이러한 단쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 이용해 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 스크리닝한다.
본원에서, "단리된 항체"는 다른 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다 (예를 들어, Claudin 18.2 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 Claudin 18.2 단백질 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 인간 Claudin 18.2 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 그러나, 다른 종의 Claudin 18.2 단백질 등의 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수도 있다. 아울러, 단리된 항체에는 다른 세포성 물질 및/또는 화학제가 실질적으로 없을 수 있다.
본원에서, 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 분자 조성이 단일한 항체 분자들로 된 조제물을 지칭한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 친화성과 단일한 결합 특이성을 나타낸다.
본원에서, "마우스 항체"는 프래임워크와 CDR 영역이 모두 마우스 생식세포계열의 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 가진 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 마우스 생식세포계열의 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 마우스 항체는 마우스 생식세포계열의 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서, 용어 "마우스 항체"는 다른 포유류 종의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 마우스 프래임워크 서열 상에 삽입된 항체를 포함하는 것으로 의도되진 않는다.
용어 "키메라 항체"는 비-인간 소스의 유전 물질을 인간의 유전 물질과 조합하여 제조한 항체를 의미한다. 또한, 보다 일반적으로는, 키메라 항체는 특정 종의 유전 물질을 다른 종의 유전 물질과 함께 가지는 항체이다.
본원에서, 용어 "인간화 항체"는 천연적으로 인간에서 생기는 항체 변이체에 대한 유사성을 높이도록 변형된 단백질 서열을 가진 비-인간 종으로부터 유래된 항체를 의미한다.
"항원을 인지하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 표현은 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호 호환적으로 사용된다.
본원에서, "인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 Claudin 18.2 단백질 (및 잠재적으로 하나 이상의 비-인간 종으로부터 유래된 Claudin 18.2 단백질)에 결합하지만 Claudin 18.2가 아닌 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 항체는 "고 친화성"으로, 즉 KD 1.0 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 5.0 x 10-9 M 이하로, 인간 Claudin 18.2 단백질에 결합한다.
본원에서, 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는다"라는 표현은, 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 또는 고 친화성으로 결합하지 않는다는 것을 의미하며, 즉, KD 1.0 x 10-6 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-5 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-4 M 이상, 더 바람직하게는 1.0 x 10-3 M 이상, 보다 더 바람직하게는 1.0 x 10-2 M 이상으로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다.
IgG 항체에 대한 용어 "고 친화성"은 표적 항원에 대한 KD가 1.0 x 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 5.0 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1.0 x 10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5.0 x 10-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 1.0 x 10-9 M 이하인 항체를 지칭한다. 그러나, "고 친화성" 결합은 다른 항체 이소형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고 친화성" 결합은 KD 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 10-7 M 이하, 보다 더 바람직하게는 10-8 M 이하인 항체를 의미한다.
용어 "EC50"은 또한 최고 유효 농도의 1/2로도 알려져 있으며, 명시된 노출 시간이 경과된 후 베이스라인부터 최대 수준까지에서 중간 수준에 해당하는 반응을 유도하는 항체의 농도를 의미한다.
본원에서, 용어 "항체-의존적인 세포성 세포독성", "항체-의존적인 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 항-Claudin 18.2 항체와 같은 항체가 결합하는 막-표면 항원을 가진 종양 세포와 같은 표적 세포를 면역 시스템의 작동자 세포가 세포분해하는 세포-매개 면역 방어 기전을 지칭한다.
용어 "보체-의존적인 세포독성" 또는 "CDC"는 일반적으로 표면 항원에 결합하였을 때 고전적인 보체 경로를 촉발하여, 막 공격 복합체의 형성과 표적 세포의 세포분해를 유도하는, IgG 및 IgM 항체의 작동자 기능을 의미한다. 본 발명의 항체는 Claudin 18.2에 결합함으로써 암 세포에 대해 CDC를 유도한다.
용어 "개체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류 및 비-포유류, 예를 들어 인간을 제외한 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함하며, 인간을 제외한 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말과 같은 포유류가 바람직하다.
용어 "치료학적 유효량"은 질환 또는 병태 (예, 암)와 관련된 증상을 예방 또는 개선하거나, 및/또는 질환 또는 병태의 중증도를 낮추는데 충분한 본 발명의 항체의 양을 의미한다. 치료학적 유효량은 표적이 되는 병태 맥락에서 이해되며, 실제 유효량은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
용어 "γδ T 세포"는 γ 체인 하나와 δ 체인 하나로 구성된 T 세포 수용체를 가진 T 세포를 지칭한다. 인간 γδ T 세포는 감염성 질환, 자가면역 및 종양에서 형질전환-유발성 변화시 스트레스-감시 (stress-surveillance) 반응에 중요한 역할을 담당한다. 활성화된 γδ T 세포는 병소 부위에서 항원 결합시 다른 작동자 세포의 동원을 매개하는 사이토카인 및/또는 케모카인을 제공하며, ADCC와 같은 즉각적인 작동자 기능을 나타낸다. 말초혈에서 대부분의 γδ T 세포는 Vγ9Vδ2 T 세포 수용체를 발현하며, Vγ9Vδ2 T 세포로 지칭된다.
용어 "γδT 세포 자극제"는 γδ T 세포의, 특히 시험관내 및/또는 생체내에서 Vγ9Vδ2 T 세포의 형성을, 특히 γδ T 세포의 활성화 및 증폭을 유도함으로써 자극하는 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 이 용어는 시험관내 및/또는 생체내에서 포유류 세포에서 생산되는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를, 바람직하게는 메발로네이트 경로 효소 파르네실 피로포스페이트 신타제 (FPPS)를 저해함으로써 증가시키는, 화합물을 지칭한다.
본 발명의 다양한 측면들이 이하 세부 항목들에서 보다 상세하게 설명된다.
인간 Claudin 18. 2에 대한 결합 특이성 및 유익한 기능성 특성을 가진 항 -Claudin 18.2 항체
본 발명의 예시적인 항체는 인간 Claudin 18.2에 고 친화성으로 특이적으로 결합한다. 특히, 본 발명의 예시적인 항체는 IMAB362와 비슷한 EC50 값으로 인간 Claudin 18.2 단백질에 결합하며, 보다 우수한 ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 Claudin 18.2 결합 안정성을 가진다. 본 발명의 예시적인 항체는 Claudin 18.1에 결합하지 않는다.
본 발명의 바람직한 항체는 단일클론 항체이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 항체는 예를 들어 마우스, 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체일 수 있다.
단일클론 항- Claudin 18.2 항체
본 발명의 예시적인 항체는 하기 실시예 및 후술한 바와 같이 구조적으로 및 화학적으로 특정되는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부이다. 예시적인 항-Claudin 18.2 항체 또는 이의 항원 결합부의 VH 아미노산 서열은 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49에 기재된다. 예시적인 항-Claudin 18.2 항체 또는 항원 결합부의 VL 아미노산 서열은 서열번호 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66에 기재된다. 예시적인 항-Claudin 18.2 항체 또는 항원 결합부는 아래 표 1에 요약된 항체의 중쇄/경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 일부 클론들은 동일한 VH 또는 VL을 공유한다. 예시적인 항-Claudin 18.2 항체는 각각 서열번호 67 및 68, 또는 대안적으로 각각 서열번호 89 및 90에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 더 포함할 수 있으며, 중쇄 가변 영역의 C-말단은 중쇄 불변 영역의 N-말단과 연결되고, 경쇄 가변 영역의 C-말단은 경쇄 불변 영역의 N-말단과 연결된다.
표 1에서 중쇄 가변 영역 CDR 및 경쇄 가변 영역 CDR은 카바트 번호 지정 체계에 따라 정의된다. 그러나, 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, CDR 영역들은, 중쇄/경쇄 가변 영역 서열을 기반으로, Chothia, IMGT, AbM, 또는 Contact 번호 지정 체계/ 방법 등의 다른 체계에 의해 지정될 수 있다.
표 1. 중쇄/경쇄 가변 영역의 아미노산 서열번호
서열번호
클론		 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3 HV LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 LV
18F2 1 4 7 17 10 13 16 50
18F2-5 2 4 8 18 11 13 16 51
18F2-30 2 4 9 19 10 14 16 52
18F2-35 2 5 9 20 12 13 16 53
18F2-66 3 6 8 21 10 15 16 54
18F2-5VH0VL0 2 4 8 22 11 13 16 55
18F2-5VH2VL0 2 4 8 23 11 13 16 55
18F2-5VH3VL0 2 4 8 24 11 13 16 55
18F2-5VH4VL0 2 4 8 25 11 13 16 55
18F2-5VH5VL0 2 4 8 26 11 13 16 55
18F2-5VH6VL0 2 4 8 27 11 13 16 55
18F2-5VH6VL2 2 4 8 27 11 13 16 56
18F2-5VH6VL3 2 4 8 27 11 13 16 57
18F2-5VH7VL2 2 4 8 28 11 13 16 56
18F2-5VH7VL3 2 4 8 28 11 13 16 57
18F2-30-VH0VL0 2 4 9 29 10 14 16 58
18F2-30-VH2VL0 2 4 9 30 10 14 16 58
18F2-30-VH3VL0 2 4 9 31 10 14 16 58
18F2-30-VH4VL0 2 4 9 32 10 14 16 58
18F2-30-VH5VL0 2 4 9 33 10 14 16 58
18F2-30-VH6VL0 2 4 9 34 10 14 16 58
18F2-30-VH7VL0 2 4 9 35 10 14 16 58
18F2-30-VH6VL2 2 4 9 34 10 14 16 59
18F2-30-VH6VL3 2 4 9 34 10 14 16 60
18F2-30-VH7VL2 2 4 9 35 10 14 16 59
18F2-30-VH7VL3 2 4 9 35 10 14 16 60
18F2-35-VH0VL0 2 5 9 36 12 13 16 61
18F2-35VH2VL0 2 5 9 37 12 13 16 61
18F2-35VH3VL0 2 5 9 38 12 13 16 61
18F2-35VH4VL0 2 5 9 39 12 13 16 61
18F2-35VH5VL0 2 5 9 40 12 13 16 61
18F2-35VH6VL0 2 5 9 41 12 13 16 61
18F2-35VH7VL0 2 5 9 42 12 13 16 61
18F2-35VH6VL2 2 5 9 41 12 13 16 62
18F2-35VH6VL3 2 5 9 41 12 13 16 63
18F2-35VH7VL2 2 5 9 42 12 13 16 62
18F2-35VH7VL3 2 5 9 42 12 13 16 63
18F2-66VH0VL0 3 6 8 43 10 15 16 64
18F2-66VH2VL0 3 6 8 44 10 15 16 64
18F2-66VH3VL0 3 6 8 45 10 15 16 64
18F2-66VH4VL0 3 6 8 46 10 15 16 64
18F2-66VH5VL0 3 6 8 47 10 15 16 64
18F2-66VH6VL0 3 6 8 48 10 15 16 64
18F2-66VH6VL2 3 6 8 48 10 15 16 65
18F2-66VH6VL3 3 6 8 48 10 15 16 66
18F2-66VH7VL2 3 6 8 49 10 15 16 65
18F2-66VH7VL3 3 6 8 49 10 15 16 66
인간 Claudin 18.2에 결합하는 다른 항-Claudin 18.2 항체의 VH 및/또는 VL 서열 (또는 CDR 서열)은 본 발명의 항-Claudin 18.2 항체의 VH 및/또는 VL 서열 (또는 CDR 서열)과 "혼성 및 매칭"될 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VL 체인 (또는 이들 체인의 CDR들)이 혼성 및 매칭될 경우, 특정한 VH/VL 쌍에서 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 치환된다. 마찬가지로, 바람직하게는, 특정한 VH/VL 쌍에서 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 치환된다.
이에, 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는
(a) 상기 표 1에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 상기 표 1에 열거된 아미노산 서열 또는 다른 항-Claudin 18.2 항체의 VL을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항체는 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는
(a) 상기 표 1에 열거된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들; 및
(b) 상기 표 1에 열거된 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들 또는 다른 항-Claudin 18.2 항체의 CDR들을 포함하며, 항체는 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합부는, 인간 Claudin 18.2에 결합하는 다른 항체의 CDR들, 예를 들어 다른 항-Claudin 18.2 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR1 및/또는 CDR3 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3와 조합된, 항-Claudin 18.2 항체의 중쇄 가변성 CDR2 영역을 포함한다.
또한, CDR3 도메인은, CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, 단독으로 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있으며, CDR3 서열에 기반하여 동일한 결합 특이성을 가진 복수의 항체를 예측가능하게 구축할 수 있음은, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol . Biol . 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem . Soc . 116:2161-2162 (1994); Barbas et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 92:2529-2533 (1995); Ditzel et al., J. Immunol . 157:739-749 (1996); Berezov et al., BIAjournal 8: Scientific Review 8 (2001); Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998); Levi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 90:4374-8 (1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol . 152:5218-5329 (1994); 및 Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000)를 참조한다. 또한, 미국 특허 6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 및 5,760,185를 참조한다. 이들 참조문헌들 각각은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항-Claudin 18.2 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR2와 항-Claudin 18.2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 CDR3, 또는 다른 항-Claudin 18.2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR3를 포함하며, 이러한 항체는 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 항체는, 바람직하게는, (a) Claudin 18.2와의 결합에 대해 경쟁하고; (b) 기능적인 특성을 가지며; (c) 동일한 에피토프에 결합하며; 및/또는 (d) 본 발명의 항-Claudin 18.2 항체와 유사한 결합 친화성을 가진다. 또 다른 구현예에서, 항체는 항-Claudin 18.2 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2, 또는 다른 항-Claudin 18.2 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR2를 포함하며, 이 항체는 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항-Claudin 18.2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, 또는 다른 항-Claudin 18.2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1을 포함할 수 있으며, 이 항체는 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합할 수 있다.
보존적인 변형
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는, 본 발명의 항-Claudin 18.2 항체와 하나 이상의 보존적인 변형 차이를 가진, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 항원 결합성을 없애지 않는 특별한 보존적인 서열 변형이 행해질 수 있는 것으로 당해 기술 분야에서 이해된다. 예를 들어, Brummell et al., (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al., (1997) Prot . Eng . 10:835-41; Komissarov et al., (1997) J. Biol . Chem . 272:26864-26870; Hall et al., (1992) J. Immunol . 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem.32:6862-35; Adib-Conquy et al., (1998) Int . Immunol .10:341-6; 및 Beers et al., (2000) Clin . Can. Res. 6:2835-43을 참조한다.
이에, 일 구현예에서, 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서
(a) 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및/또는 이의 보존적인 변형을 포함하거나; 및/또는
(b) 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및 이의 보존적인 변형을 포함하거나; 및/또는
(c) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 상기 표 1에 열거된 서열, 및 이의 보존적인 변형을 포함하거나; 및/또는
(d) 경쇄 가변 영역 CDR1, 및/또는 CDR2, 및/또는 CDR3 서열은 상기 표 1에 열거된 서열(들); 및/또는 이의 보존적인 변형을 포함하고; 및
(e) 항체는 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는, 인간 Claudin 18.2에 대한 고 친화성 결합 및 Claudin 18.2-발현성 세포에 대해 ADCC 또는 CDC 활성을 유도하는 능력 등의, 전술한 다음과 같은 기능적인 특성들 중 한가지 이상을 가진다.
다양한 구현예들에서, 항체는 예를 들어, 마우스, 인간, 인간화된 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에서, 용어 "보존적인 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유한 항체의 결합 특징에 유의하게 영향을 미치지 않거나 또는 변형시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적인 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결손을 포함한다. 변형은 부위-특이적인 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발 등의 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적인 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가 비슷한 측쇄를 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 비슷한 측쇄를 가진 아미노산 잔기 계열들은 당해 기술 분야에 정의되어 있다. 이들 계열은 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비-하전된 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비-극성 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지형 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있으며, 변형된 항체는본원에 기술된 기능성 분석을 이용해 보유한 기능 (즉, 전술한 기능)을 검사할 수 있다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본 발명의 항-Claudin 18.2 항체의 VH/VL 서열들 중 하나 이상을 가진 항체를 이용해 제조할 수 있다. 항체는 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 중 하나 또는 둘다에서, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역에서 및/또는 하나 이상의 프래임워크 영역에서, 하나 이상의 잔기를 변형시켜, 특정 동물 종에서 자연적으로 생기는 항체 변이체에 대해 유사성을 높이거나 및/또는 결합 친화성을 개선하도록, 조작할 수 있다. 예를 들어, 프래임워크 영역을 변형하여 인간화된 항체를 제공한다. 부가적으로 또는 다른 예로, 항체는, 예를 들어, 항체의 작동자 기능(들)을 변형하기 위해, 불변 영역(들) 내 잔기를 변형시켜, 조작할 수 있다.
특정 구현예에서, CDR 그래프팅 (grafting)을 이용해 항체의 가변 영역을 조작할 수 있다. 항체는 대개 중쇄 및 경쇄의 6개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열에 비해 개별 항체들 간에 다양성이 더 크다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하므로, 다른 특성을 가진 다른 항체로부터 유래되는 프래임워크 서열에 그래프팅된 특정한 자연 생성 항체로부터 유래된 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써, 특정한 자연 생성 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다 (예를 들어, Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) Proc . Natl . Acad U.S.A. 86:10029-10033; 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조함).
이에, 본 발명의 다른 구현예는, 전술한 바와 같이, 본 발명의 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 전술한 바와 같이, 본 발명의 서열을 포함하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 이들 항체는 본 발명의 단일클론 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하면서, 다른 프래임워크 서열을 포함할 수 있다.
이러한 프래임워크 서열은 생식세포계열의 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 참조문헌 또는 공개된 DNA 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자들에 대한 생식세포계열의 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식세포계열 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능) 뿐 아니라 전술한 Kabat et al., (1991); Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol . 227:776-798; and Cox et al., (1994) Eur . J. Immunol . 24:827-836에서 확인할 수 있으며; 이들 각각의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다. 다른 예로, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포계열의 DNA 서열은 유전자은행 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견되는 다음과 같은 생식세포계열의 중쇄 서열은 첨부된 유전자은행 등재 번호로 이용가능하다: 1-69 (NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 3-33 (NG--0010109 & NT--024637) 및 3-7 (NG--0010109 & NT--024637). 다른 예로, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견되는 다음과 같은 생식세포계열의 중쇄 서열은 첨부된 유전자은행 등재 번호로 이용가능하다: 1-69 (NG--0010109, NT--024637 & BC070333), 5-51 (NG--0010109 & NT--024637), 4-34 (NG--0010109 & NT--024637), 3-30.3 (CAJ556644) & 3-23 (AJ406678).
항체 단백질 서열들은, 편집된 단백질 서열 데이터베이스에서, 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지된, Gapped BLAST (상기 Altschul et al., (1997) 문헌)로 지칭되는 서열 유사성 검색 방법들 중 한가지를 사용해, 비교한다.
본 발명의 항체에 사용하기 바람직한 프래임워크 서열은 본 발명의 항체에 사용되는 프래임워크 서열과 구조적으로 비슷한 것이다. VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을, 프래임워크 서열이 유래된 생식세포계열의 면역글로불린 유전자에서 발견되는 서열과 동일한 서열을 가진 프래임워크 영역에 그래프팅하거나, 또는 CDR 서열을, 생식세포계열의 서열과 비교해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프래임워크 영역에 그래프팅할 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 강화하기 위해 프래임워크 영역 내 잔기를 돌연변이 유발하는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조함).
다른 타입의 가변 영역의 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내 아미노산 잔기에 돌연변이 유발하여, 대상 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예, 친화성)을 개선하는 것이다. 부위-특이적인 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있으며, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 목적한 기능성 특성을 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 시험관내 또는 생체내 분석으로 평가할 수 있다. 바람직하게는, (당해 기술 분야에 공지된 바와 같이) 보존적인 변형이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결손일 수 있으며, 바람직하게는 치환이다. 아울러, 전형적으로 CDR 영역 내 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 잔기가 변형된다.
이에, 다른 구현예에서, 본 발명은, (a) 본 발명의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는, VH CDR1 영역; (b) 본 발명의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는, VH CDR2 영역; (c) 본 발명의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는, VH CDR3 영역; (d) 본 발명의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는, VL CDR1 영역; (e) 본 발명의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는, VL CDR2 영역; 및 (f) 본 발명의 서열, 또는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 가진 아미노산 서열을 포함하는, VL CDR3 영역을 포함하는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항-Claudin 18.2 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다.
본 발명의 조작된 항체는, 예를 들어, 항체의 특성을 개선하기 위해, VH 및/또는 VL 내 프래임워크 잔기에 변형을 행하는 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프래임워크 변형은 항체의 면역원성을 낮추기 위해 수행된다. 예를 들어, 한가지 방법은 하나 이상의 프래임워크 잔기를 대응되는 생식세포계열의 서열로 "역 돌연변이"하는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이된 항체는 항체의 기원이 되는 생식세포계열의 서열과는 상이한 프래임워크 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프래임워크 서열을 항체가 유래된 생식세포계열의 서열과 비교함으로써 식별할 수 있다.
다른 타입의 프래임워크 변형은 프래임워크 영역 내, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역내 하나 이상의 잔기를 변형하여, T 세포 에피토프를 제거함으로써, 항체의 잠재적인 면역원성을 낮추는 것을 수반한다. 이러한 방식은 "면역원성 제거 (deimmunization)"로 지칭되며, 이는 미국 특허 공개번호 20030153043에 보다 상세하게 기술되어 있다.
프래임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형과 더불어 또는 이의 대안으로, 본 발명의 항체는, 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합성 및/또는 항원-의존적인 세포성 세포독성 등의 항체의 한가지 이상의 기능적인 특성을 변형하기 위해, Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는, 다시 항체의 한가지 이상의 기능적인 특성을 변형하기 위해, 화학적으로 변형되거나 (예, 하나 이상의 화학적 모이어티를 항체에 결합시킬 수 있음) 또는 이의 당화를 바꾸도록 변형될 수 있다.
일 구현예에서, CH1의 힌지부는, 힌지부 내 시스테인 잔기의 개수가 달라지 되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록, 변형된다. 이러한 방식은 미국 특허 5,677,425에 추가적으로 기술되어 있다. CH1의 힌지부 내 시스테인 잔기의 개수는, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 높이거나 또는 낮추도록, 변형된다.
다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지부는 항체의 생물학적 반감기를 줄이도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는, 항체가 네이티브 Fc-힌지 도메인 SpA 결합성과 비교해 손상된 스타필로코커스 단백질 A (SpA) 결합성을 가지도록, Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입된다. 이러한 방식은 미국 특허 6,165,745에 더 상세히 기술되어 있다.
또 다른 구현예에서, 항체의 당화가 변형된다. 예를 들어, 비-당화된 (aglycosylated) 항체를 제조할 수 있다 (즉, 항체에 당화가 결핍됨). 당화는, 예를 들어 항체의 항원 친화성을 높이도록 변형될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내 하나 이상의 당회 부위를 변형함으로써, 달성할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 수행하여, 하나 이상의 가변 영역 프래임워크 당화 부위를 제거함으로써, 그 부위에서 당화를 없앨 수 있다. 이러한 비-당화는 항원에 대한 항체의 친화성을 높일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,714,350 및 6,350,861을 참조한다.
부가적으로 또는 다른 예로, 푸코실 잔기가 양적으로 감소된 저-푸코실화 (hypofucosylated) 항체 또는 바이섹팅 (bisecting) GlcNac 구조가 증가된 항체 등의, 당화 타입이 변형된 항체를 제조할 수 있다. 이러한 변형된 당화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 높이는 것으로 입증되어 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변형된 당화 기전을 가진 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써, 달성할 수 있다. 당화 기전이 변형된 세포는 당해 기술 분야에 기술되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 숙주 세포로서 이용하여 당화가 변형된 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709에는 푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8 (α(1,6)-푸코실트랜스퍼라제)가 결핍되어 있어, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체에는 이의 탄수화물에 푸코스가 없다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는, 2개의 치환 벡터를 사용해 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자를 표적 파괴함으로써, 구축된다 (미국 특허 공개번호 20040110704 및 Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22를 참조함). 다른 예로, EP 1,176,195에는 푸코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴되어, 이러한 세포주에서 발현된 항체가 α-1,6-결합된-관련 효소를 줄이거나 또는 제거함으로써 저-푸코실화를 나타내는, 세포주가 개시되어 있다. 또한, EP 1,176,195에는 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 활성이 낮은 효소를 가지거나 또는 효소 활성이 없는 세포주, 예를 들어 랫 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)가 개시되어 있다. PCR 공개공보 WO 03/035835에는, Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 결합시키는 능력이 저하된, 또한 숙주 세포에서 발현되는 항체의 저-푸코실화를 달성하는, CHO 세포주 변이체, Lec13 세포가 개시되어 있다 (Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). 당화 프로파일이 변형된 항체는 또한 PCT 공개공보 WO 06/089231에 기술된 바와 같이 계란에서 생산할 수 있다. 다른 예로, 당화 프로파일이 변형된 항체는 렘나 (Lemna)와 같은 식물 세포에서 생산할 수 있다. PCT 공개공보 WO 99/54342에는, 조작된 세포주에서 발현된 항체가 항체의 ADCC 활성을 높이는 바이섹팅 GlcNac 구조 증가를 나타내도록, 당단백질-변형성 글리코실 트랜스퍼라제 (예, β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주가 개시되어 있다 (또한, Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180을 참조함). 대안적으로. 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용해 절단 제거할 수 있으며; 예를 들어, 푸코시다제 α-L-푸코시다제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다 (Tarentino et al., (1975) Biochem . 14:5516-23).
본 발명에서 고려되는 본 발명의 항체에 대한 다른 변형은 페길화 (pegylation)이다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예, 혈청) 반감기를 연장하기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체 또는 그 단편을, 전형적으로 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데하이드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 결합하는 조건 하에 반응시킨다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 폴리머)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에서, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은, 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 바 있는 임의 형태의 PEG를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 페길화되는 항체는 비-당화된 항체이다. 단백질의 페길화 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EPO 154 316 및 EP 0 401 384를 참조한다.
항체의 물리적 특성
본 발명의 항체는, 이의 서로 다른 클래스를 검출하거나 및/또는 구분하기 위해, 다양한 물리적 특성을 특징으로 할 수 있다.
예를 들어, 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에 하나 이상의 당화 부위를 포함할 수 있다. 이러한 당화 부위는 항원 결합성 변형으로 인해 항체의 pK 변형 또는 항체의 면역원성 증가를 유발할 수 있다 (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). 당화는 N-X-S/T 서열을 가진 모티프에서 생길 수 있는 것으로 알려져 있다. 일부 경우에, 가변 영역에 당화를 포함하지 않는 항-Claudin 18.2 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역에 당화 모티프를 포함하지 않는 항체를 선택하거나 또는 당화 영역 내 잔기를 돌연변이화함으로써, 달성할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 아스파라긴 이성질화 부위 (asparagine isomerism site)를 포함하지 않는다. N-G 또는 D-G 서열에서 아스파라긴의 탈아미드화가 발생할 수 있으며, 그래서 폴리펩타이드 체인에 킹크 (kink)를 도입하여 이의 안정성을 떨어뜨리는 (이소아스파르트산 효과) 이소아스파르트산을 형성시킬 수 있다.
각각의 항체는 고유한 등전점 (pI)을 가질 것이며, 이는 일반적으로 pH 6-9.5 범위에 포함된다. IgG1 항체의 pI는 전형적으로 pH 7-9.5 범위이고, IgG4 항체의 pI는 전형적으로 pH 6-8 범위이다. pI가 정상 범위를 벗어난 항체는 생체내 조건에서 일부 비-폴딩되며, 불안정할 수 있는 것으로, 추측된다. 따라서, 정상 범위의 pI 값을 가진 항-Claudin 18.2 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이는 pI가 정상 범위인 항체를 선택하거나 또는 하전된 표면 잔기를 변형함으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 CDR을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 완전한 세포 (whole cell) 내, 세포 용해물 내 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은, 다른 세포성 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 표준 기법에 의해 정제되는 경우, "단리"되거나 또는 "실질적으로 순수하게 제공"된다. 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물 기법으로 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예, 아래에서 추가적으로 기술된 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자를 운반하는 형질전환 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 표준적인 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해 하이브리도마에 의해 제조되는 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA를 수득할 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 (예, 파지 디스플레이 기법을 이용하여) 수득하는 항체의 경우, 이러한 항체를 암호화하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 Claudin 18.2 단일클론 항체의 VH 및 VL 서열 또는 CDR을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. VH 및 VL 세그먼트를 암호화하는 DNA 단편들이 수득되면, 이들 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 추가적으로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 체인 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 변환할 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-암호화하는 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 유연한 링커 등의 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 본원에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은, DNA 단편 2개에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 인-프래임으로 유지되도록 2개의 DNA 단편이 연결되는 것을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 단리된 DNA는, VH-암호화하는 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써, 전장 중쇄 유전자로 변환할 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이들 영역들을 포괄하는 DNA 단편들은 표준적인 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으며, 가장 바람직하게는, IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화하는 DNA에 오직 중쇄 CH1 불변 영역을 암호화하는 다른 DNA 분자를 작동가능하게 연결할 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 단리된 DNA는, VL-암호화하는 DNA에 경쇄 불변 영역, CL를 암호화하는 다른 DNA를 작동가능하게 연결함으로써, 전장 경쇄 유전자 (아울러, Fab 경쇄 유전자)로 변환할 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이들 영역을 포함하는 DNA 단편들은 표준적인 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 구축하기 위해, VH- 및 VL-암호화하는 DNA 단편들은, VL 영역과 VH 영역이 유연한 링커에 의해 연결되어 VH 및 VL 서열이 연속적인 단쇄 단백질로서 발현될 수 있도록, 유연한 링커를 암호화하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 암호화하는 다른 단편과 작동가능하게 연결된다 (예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,, (1990) Nature 348:552-554 참조).
본 발명의 단일클론 항체의 제조
본 발명의 단일클론 항체 (mAb)는 Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495의 잘-알려진 체세포 하이브리드화 (하이브리도마) 기법을 이용해 제조할 수 있다. 단일클론 항체를 제조하는 다른 구현예는 B 림프구의 바이러스성 또는 종양성 (oncogenic) 형질전환 및 파지 디스플레이 기법을 포함한다. 키메라 또는 인간화된 항체들은 당해 기술 분야에 또한 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370을 참조하며, 이들 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 형질전환체 ( transfectoma )의 구축
본 발명의 항체는, 또한 숙주 세포 형질전환체에서, 예를 들어 재조합 DNA 기법 및 유전지 형질감염 방법을 조합 사용하여, 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 생산할 수 있다 (예를 들어, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). 일 구현예에서, 표준 분자 생물학 기법으로 수득한 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 하나 이상의 발현 벡터에, 유전자들이 전사 및 번역 조절 서열과 작동가능하게 연결되도록 삽입한다. 이러한 맥락에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은, 벡터 내 전사 및 번역 제어 서열들이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도한 기능을 제공하도록, 항체 유전자가 벡터에 라이게이션되는 것을, 의미한다.
용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 항체 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 기타 발현 제어 요소 (예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))에 기술되어 있다. 포유류 숙주 세포에서 발현하기 위한 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서 고 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스성 인자, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 주 후기 프로모터 (AdMLP) 및 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 다른 예로, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터와 같은 비-바이러스성 조절 서열도 사용할 수 있다. 또한, 조절 요소들은, SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복체의 서열을 포함하는, SRα 프로모터 시스템 등의, 서로 다른 소스로부터 유래된 서열들로 구성된다 (Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 이용가능하게 선택된다.
항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 동일한 발현 벡터 또는 개별 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, VH 세그먼트가 벡터 내 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 세그먼트가 벡터 내 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결되도록, 바람직한 이소형의 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역이 이미 암호화된 발현 벡터에 가변 영역을 삽입함으로써, 가변 영역을 사용해 임의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 구축한다. 부가적으로 또는 다른 예로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 체인의 분비를 촉진하는 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 항체 체인 유전자는, 신호 펩타이드가 항체 체인 유전자의 아미노 말단에 인-프래임으로 연결되도록, 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종의 신호 펩타이드 (즉, 비-면역글로불린성 단백질의 신호 펩타이드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 항체 체인 유전자 및 조절 서열 외에도, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예, 복제 오리진) 및 선별가능한 마커 유전자와 같은 부가적인 서열을 운반할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별할 수 있게 해준다 (예를 들어, 미국 특허 4,399,216; 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 G418, 히드로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자로는 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr-숙주 세포에서 이용하는 경우) 및 neo 유전자 (G418 선별하는 경우)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄를 발현하기 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기법에 의해 숙주 세포에 형질감염시킨다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태들은 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기법, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침강, EDAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현하는 것은 이론적으로 가능하지만, 진핵생물 세포, 가장 바람직하게는 포유류 숙주 세포에서 항체를 발현하는 것이 가장 바람직하며, 그 이유는 진핵생물 세포, 특히 포유류 세포에서 원핵생물 세포에서보다 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립 및 분비할 가능성이 더 높기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 바람직한 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol . 159:601-621에 기술된 바와 같이 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는, Urlaub and Chasin, (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220에 기술된, dhfr- CHO 세포 등), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히 NSO 골수종 세포를 사용하는 경우, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 기술된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유류 숙주 세포에 도입하는 경우, 숙주 세포에서 항체의 발현, 또는 더 바람직하게는 숙주 세포를 배양한 배양 배지로의 항체의 분비를 허용하기 위한 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제 방법으로 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
면역접합체
본 발명의 항체는 치료학적 물질과 접합되어, 항체-약물 접합체 (ADC)와 같은 면역접합체를 형성할 수 있다. 적절한 치료학적 물질로는 세포독소, 알킬화제, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 인터칼레이터, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 핵 유출 저해제, 프로테아좀 저해제, 토포이소머라제 I 또는 II 저해제, 열 충격 단백질 저해제, 티로신 키나제 저해제, 항생제 및 항-유사분열제 등이 있다. ADC에서, 항체와 치료학적 물질은 바람직하게는 펩티딜, 다이설파이드 또는 하이드라존 링커와 같은 절단가능한 링커를 통해 접합된다. 더 바람직하게는, 링커는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser 또는 Glu와 같은 펩티딜 링커이다. ADC는 미국 특허 7,087,600; 6,989,452; 및 7,129,261; PCT 공개공보 WO 02/096910; WO 07/038,658; WO 07/051,081; WO 07/059,404; WO 08/083,312; 및 WO 08/103,693; 미국 특허 공개공보 20060024317; 20060004081; 및 20060247295에 기술된 바와 같이 제조할 수 있으며; 이들 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
이중 특이성 분자
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 다른 기능성 분자, 예를 들어, 다른 펩타이드 또는 단백질 (예, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어, 2 이상의 서로 다른 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중 특이성 분자를 구축하는, 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 이중 특이성 분자에 관한 것이다. 따라서, 본원에서, "이중 특이성 분자"는 특이성을 3개 이상 가진 분자를 포함한다.
일 구현예에서, 이중 특이성 분자는, 항-Fc 결합 특이성 및 항-Claudin 18.2 결합 특이성 외에도, 제3의 특이성을 가진다. 제3의 특이성은 항-강화 인자 (anti-enhancement factor)(EF), 예를 들어, 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합하여, 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자에 대한 것일 수 있다. 예를 들어, 항-강화 인자는 세포독성 T 세포 (예, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40 또는 ICAM-1을 경유하여) 또는 기타 면역 세포에 결합하여, 표적 세포에 대해 증가된 면역 반응을 일으킬 수 있다.
이중 특이성 분자는 많은 여러가지 포맷과 크기를 가질 수 있다. 이중 특이성 분자는, 크기 스펙트럼의 한쪽 끝에는, 동일한 특이성을 가진 결합 팔 2개를 가지는 대신, 각각 서로 다른 특이성을 가진 결합 팔 2개를 가지는 것을 제외하고는, 전통적인 항체 포맷을 유지한다. 다른 쪽 끝에는 펩타이드 체인에 의해 연결된 2개의 단쇄 항체 단편 (scFv's)으로 구성되는, 소위 Bs(scFv)2 구조체로 지칭되는, 이중 특이성 분자가 존재한다. 중간-크기의 이중 특이성 분자는 펩티딜 링커에 의해 연결된 2개의 서로 다른 F(ab) 단편을 포함한다. 이러한 포맷 및 다른 포맷의 이중 특이성 분자는 유전자 조작, 체세포 교잡 (somatic hybridization) 또는 화학적 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 인용된 Kufer et al; Cao and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); 및 van Spriel et al.,, Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000)과, 이들 문헌에 인용된 참조문헌들을 참조한다.
항체-암호화 종양용해 바이러스 또는 항체- 보유성 종양용해 바이러스
종양용해 바이러스는 암 세포에 선호적으로 감염하여 사멸시킨다. 본 발명의 항체는 종양용해 바이러스와 함께 사용할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 항체를 암호화하는 종양용해 바이러스를 인체에 도입할 수 있다.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 선택적으로 다른 항체 또는 약물과 같은 하나 이상의 부가적인 약학적 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 예를 들어 다른 항암제, 다른 항-염증제 또는 백신과의 병용 요법으로 투여할 수 있다.
약학적 조성물은 임의 개수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제로는 담체, 계면활성제, 증점제, 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 용해제, 착색제, 착향제, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장화제 및 이들의 조합 등이 있다. 적절한 부형제의 선택과 사용은 Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)에 교시되어 있으며, 이 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 상피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 성분은 이를 불활화할 수 있는 산 및 기타 천연 환경의 작용으로부터 이를 보호하기 위해 물질로 코팅할 수 있다. 본원에서, "비경구 투여"라는 표현은, 통상적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 이는, 비-제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복막내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 항체는 국소, 상피 또는 점막 투여 형태 등의 비경구가 아닌 경로를 통해, 예를 들어 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소적으로 투여할 수 있다.
약학적 조성물은 무균성 수성 용액 또는 분산물의 형태일 수 있다. 이는 또한 미세유제, 리포좀 또는 약물 고 농도에 적합한 정렬된 구조 내에 제형화될 수 있다.
단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료 중인 개체와 구체적인 투여 방식에 따라 결정될 것이며, 일반적으로 치료학적 효과를 발휘하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 그 양은, 100% 중에서, 활성 성분 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%이며, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합된다.
투약 용법은 최적의 원하는 반응 (예, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스 (single bolus)로 투여하거나, 여러 개로 분할한 투여량으로 시간에 걸쳐 투여하거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 투여량을 비례적으로 줄이거나 또는 높일 수 있다. 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위한 투여 단위 형태 (dosage unit form)로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유익하다. 본원에서, 투여 단위 형태는 치료할 개체에 대한 단위 투여 (unitary dosage)로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필수적인 약학적 담체와 조합하여, 원하는 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 미리 결정된 양으로 활성 성분을 포함한다. 다른 예로, 항체는, 지속 방출 (sustained release) 제형으로서 투여할 수 있으며, 이 경우 투여 빈도는 더 줄어든다.
항체를 투여하는 경우, 투여량은 숙주의 체중에 대해 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로는 0.01 내지 5 mg/kg 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/체중 kg, 1 mg/체중 kg, 3 mg/체중 kg, 5 mg/체중 kg 또는 10 mg/체중 kg 또는 1-10 mg/kg 범위일 수 있다. 예시적인 치료 용법은 주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회, 4주당 1회, 매달 1회, 3개월 마다 1회 또는 3-6개월 마다 1회 투여를 포함한다. 본 발명의 항-Claudin 18.2 항체에 대한 바람직한 투여 용법은 정맥내 투여를 통한 1 mg/체중 kg 또는 3 mg/체중 kg을 포함하며, 항체는 다음과 같은 투여 계획 중 한가지로 제공된다: (i) 4주 간격으로 6회 투여 후 3달 간격으로 투여; (ii) 3주 간격으로 투여; (iii) 3 mg/체중 kg으로 1회 투여 후 1 mg/체중 kg으로 3주 간격 투여. 일부 방법에서, 투여량은 항체의 혈장내 농도 약 1-1000 ㎍/ml을, 일부 방법에서는 약 25-300 ㎍/ml을 달성하도록 조정된다.
본 발명의 항-Claudin 18.2 항체의 "치료학적 유효량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도 저하, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속 기간 증가, 또는 병폐로 인한 장애 또는 불능의 예방을 달성한다. 예를 들어, 종양을 가진 개체를 치료하는 경우, "치료학적 유효량"은 바람직하게는 종양의 증식을 비-치료 개체에 비해 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80%까지 저해한다. 치료학적 항체의 치료학적 유효량은 전형적으로 인간이거나 또는 다른 포유류일 수 있는 개체에서 종양의 크기를 줄이거나 또는 증상을 개선할 수 있다.
약학적 조성물은 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템 등의 제어 방출형 제형 (controlled release formulation)일 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등의 생분해성의 생체적합한 폴리머를 이용할 수 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다.
치료학적 조성물은 (1) 무-바늘성 피하 주사 기구 (예, 미국 특허 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 및 4,596,556); (2) 미세-주입 펌프 (미국 특허 4,487,603); (3) 경피 기구 (미국 특허 4,486,194); (4) 주입 장치 (미국 특허 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 삼투압 기구 (미국 특허 4,439,196 및 4,475,196)와 같은 의료용 기구를 통해 투여할 수 있으며; 이들 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 단일클론 항체는 생체내 적절한 분포를 보장하도록 제형화할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료학적 항체가 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있도록 하기 위해, 리포좀 내에 제형화할 수 있으며, 리포좀은 특정 세포 또는 장기로의 선택적인 수송을 강화하기 위해 표적화 모이어티를 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; V. V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol.29:685; Umezawa et al.,, (1988) Biochem . Biophys . Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob . Agents Chemother . 39:180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem . 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett . 346:123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273을 참조한다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체 (조성물, 이중 특이성 및 면역접합체)는, 다수의 시험관내 및 생체내 유용성을 가지며, 예를 들어 암의 진단, 치료 및/또는 예후 예측을 포함하는 유용성을 가진다. 항체는 인간 개체에게, 예를 들어, 종양 증식을 저해하기 위해 생체내로 투여할 수 있다. 암의 진단 및 예후 예측에서, 대상 조직 샘플을 수집하여, 본 발명의 항체와 접촉시킬 수 있으며, 이때 특정 부위 또는 세포 타입에서 소정량의 Claudin 18.2가 검출되는 경우 개체는 암으로 진단될 수 있거나, 및/또는 Claudin 18.2 발현의 증가/감소는 암 발병/개선을 의미한다.
본 발명의 항-Claudin 18.2 항체가 암 세포의 증식 및 생존을 저해하는 능력을 감안하여, 본 발명은 본 발명의 항체를 개체에 투여하여 종양의 증식을 개체에서 저해하는 것을 포함하는 개체에서 종양 세포의 증식을 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체에 의해 치료할 수 있는 종양에 대한 비-제한적인 예로는, 비-제한적으로, 원발성 (original) 및/또는 전이성의, 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 간암, 난소암, 폐암 및 방광암을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체를 사용해 증식을 저해할 수 있는 불응성 또는 재발성 악성도 포함한다.
본 발명의 이러한 방법 및 그외 방법은 아래에서 추가적으로 상세히 기술된다.
병용 요법
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 예시적인 항-Claudin 18.2 항체 (또는 이의 항원-결합부)를, 개체에서 종양 증식을 저해하는데 효과적인 하나 이상의 부가적인 항체와 공동-투여하는, 병용 요법의 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 항-Claudin 18.2 항체 및 하나 이상의 부가적인 항체, 예를 들어 항-LAG-3 항체, 항-PD-1 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 증식을 저해하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 개체는 인간이다. 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 항-Claudin 18.2 항체 (또는 이의 항원-결합부)를, 세포독성제일 수 있는 화학치료제와 공동 투여하는, 암 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 에피투비신 (epitubicin), 옥살리플라틴 및/또는 5-FU를 항-Claudin 18.2 요법이 시술 중인 환자에게 투여할 수 있다. 옥살리플라틴 및 5-FU은 Claudin 18.2 발현을 안정화 또는 증가시키는 것으로 여겨진다.
또한, 본 발명은, 개체에게 항-Claudin 18.2 항체 및 γδT 세포 자극제, 특히 Vγ9Vδ2 T 세포를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 증식을 저해하는 방법을 제공한다. γδT 세포 자극제는 비스포스포네이트, 특히 질소-함유성 비스포스포네이트, 예를 들어 N-비스포스포네이트 및 아미노비스포스포네이트일 수 있다. 데이터에 따르면, 졸레드론산 (ZA)은, 특히 재조합 인터루킨-2 (IL-2)과 함께 투여될 경우, γδ T 세포를 자극하고, 따라서 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (WO2013174509).
또한, 본 발명은, 개체에게 항-Claudin 18.2 항체 및 Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 종양 증식을 저해하는 방법을 제공한다. Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제는 세포독성제 및/또는 세포생장억제제일 수 있다. Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제는 안트라사이클린, 플라티늄 화합물, 뉴클레오시드 유사체, 탁산 및 캄프토테신 유사체, 또는 이의 프로드럭, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함할 수 있다. Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제는 에피루비신, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 5-플루오로우라실로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함할 수 있다. Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제는 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실 또는 이들의 프로드럭으로 된 조합물, 시스플라틴 및 5-플루오로우라실 또는 이들의 프로드럭으로 된 조합물, 하나 이상의 탁산 및 옥살리플라틴으로 된 조합물, 하나 이상의 탁산 및 5-플루오로우라실 또는 이들의 프로드럭으로 된 조합물, 또는 하나 이상의 캄프토테신 유사체 및 5-플루오로우라실 또는 이들의 프로드럭으로 된 조합물을 포함할 수 있다. Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제는 면역에 의한 세포 사멸을 유도하는 물질일 수 있다. 면역에 의한 세포 사멸을 유도하는 물질은 안트라사이클린, 옥살리플라틴 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함할 수 있다. Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제는 에피루비신과 옥살리플라틴의 조합물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 안트라사이클린, 하나 이상의 플라티늄 화합물 및 하나 이상의 5-플루오로우라실 및 이들의 프로드럭을 투여하는 것을 포함한다. 안트라사이클린은 에피루비신, 독소루비신, 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin) 및 발루비신 (valrubicin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 안트라사이클린은 에피루비신이다. 플라티늄 화합물은 옥살리플라틴 및 시스플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 뉴클레오시드 유사체는 5-플루오로우라실 및 이의 프로드럭으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 탁산은 도세탁셀 (docetaxel) 및 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 캄프토테신 유사체는 이리노테칸 (irinotecan) 및 토포테칸 (topotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은, (i) 에피루비신, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실, (ii) 에피루비신, 옥살리플라틴 및 카페시타빈, (iii) 에피루비신, 시스플라틴 및 5-플루오로우라실, (iv) 에피루비신, 시스플라틴 및 카페시타빈, 또는 (v) 폴린산, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실의 투여를 포함한다.
항-Claudin 18.2 항체와 조합될 수 있는 다른 요법으로는, 비-제한적으로, 면역원성 물질의 투여, 인터루킨-2 (IL-2) 투여, 방사선, 수술 또는 호르몬 고갈을 포함한다.
본원에서 논의되는 치료학적 물질들의 조합은 약제학적으로 허용가능한 담체 중의 단일 조성물로서 동시에 또는 각각의 물질이 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 포함되는 개별 조성물로서 동시에 투여할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료학적 물질들의 조합은 연속적으로 투여할 수 있다.
또한, 병용 요법을 2회 이상 연속적으로 투여할 경우, 연속적인 투여 순서는 역 순서로 바뀌거나 또는 각각의 투여 시점에 동일한 순서로 유지될 수 있으며, 연속적인 투여는 동시 투여와 조합될 수 있거나, 또는 이의 임의 조합일 수 있다.
본 발명은 후술한 실시예를 들어 추가적으로 예시되지만, 실시예는 추가적인 제한으로서 해석되어서는 안된다. 본 명세서 전체에 인용된 모든 도면과 모든 참조문헌, 유전자은행 서열, 특허 및 공개된 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
실시예
실시예 1 인간 Claudin 18.1 또는 Claudin 18.2를 안정적으로 발현하는 HEK293A 세포주의 구축
인간 Claudin 18.1 또는 Claudin 18.2를 과다 발현하는 HEK293A 세포 (Cobioer, China)를 렌티바이러스 형질감염 시스템을 이용해 구축하였다. 간략하게는, 인간 Claudin 18.1 (서열번호 70) 및 Claudin 18.2 (서열번호 72)를 암호화하는 cDNA 서열 (서열번호 69 및 71)를 합성하여, 각각 pLV-EGFP(2A)-Puro 플라스미드에 EcoRI 및 BamHI 부위에 클로닝하였다. pLV-EGFP(2A)-Puro-Claudin 18.1 (또는 pLV-EGFP(2A)-Puro-Claudin 18.2), psPAX2 및 pMD2.G 플라스미드를 공동 형질감염시켜, HEK-293T (Cobioer, China) 세포에서 렌티바이러스를 구축하였다. 수득한 렌티바이러스를 HEK293A 세포에 감염시켜, 인간 Claudin 18.1 또는 Claudin 18.2를 과다 발현하는 안정한 세포주를 확립하였으며, 이후 이는 10% FBS (Cat #：FND500, Excell) 및 0.2 ㎍/ml 푸로마이신 (Cat #：A11138-03, Gibco)이 첨가된 DMEM 배지 (Cat #：SH30022.01, Gibco)에서 7일 이상 배양하였다.
Claudin 18.1 또는 Claudin 18.2의 발현을, 상업적으로 이용가능한 항-CLDN18 항체 (토끼 항-Claudin-18, Cat #：388100, Life Technology)를 이용한 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 검증하였다. 간략하게는, 형질감염된 세포 100,000개를 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 이후 항-인간 Claudin18 항체를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 배양한 후, 플레이트를 PBST로 3번 헹구었다. 그런 후, PE 커플링된 당나귀 항-토끼 IgG 이차 항체 (PE 당나귀 항-토끼 IgG 항체, Cat #: 406421, Biolegend)를 500x로 희석하여 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS로 3번 헹구고, FACS 장치 (BD)를 사용해 세포 형광을 모니터링하였다.
실시예 2 예시적인 항- Claudin 18.2 단일클론 항체의 구축 및 스크리닝
인간 Claudin 18.2에 결합하는 단일클론 항체를 구축하기 위해, 6주령의 BALB/c 마우스에 인간 Claudin 18.2 (실시예 1 참조)를 안정적으로 발현하는 HEK293A 세포를 접종하였다. 간략하게는, 마우스에 HEK293A/인간 Claudin 18.2 세포를 2x107/ml로 피하 주사한 다음, 4주 간격으로 3회 부스트 주사하였다. 혈청 샘플 내 항체 역가를 인간 Claudin 18.2를 발현하는 HEK293A 세포를 이용한 FACS에 의해 측정하였다. 동물이 적절한 항체 역가에 도달하면, 마우스에 PBS 중의 세포를 5x107/mL로 최종 면역화 부스팅으로 제공하였다. 3일 후, 마우스를 안락사시키고, 방혈 후 mRNA 추출 및 파지 디스플레이 라이브러리 구축을 위해 비장을 회수하였다.
scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하기 위해, 마우스 비장의 전체 RNA를 Trizol 키트 (Invitrogen)를 사용해 추출하고, 역 전사효소 키트 (Invitrogen)로 cDNA를 합성하였다. 주형으로서 합성한 cDNA를 이용한 PCR에 의해 유전자를 증폭시키고, 전매 파지미드 (proprietary phagemid) pTGS를 사용해 scFv 파지 라이브러리를 구축하였다. 간략하게는, 경쇄의 가변 영역을 PCR에 의해 증폭시키고, Qiagen PCR/정제 키트로 정제한 후 제한 효소 NheI 및 NotI (NEB)로 절단한 다음 (동일한 제한효소로 절단하여 아가로스 겔에서 정제한) 파지미드 pTGS의 NheI/Not1 제한효소 부위에 16℃에서 라이게이션하였다. 라이게이션한 후, 재조합 DNA를 석출시켜, 세척 후 증류수에 용해하였다. 그런 후, 재조합 DNA를 전기천공에 의해 E. coli TG1 세포에 형질전환하였다. 이후, 세포를 SOC 배지 10 ml에 현탁하여, 부드럽게 교반하면서 37℃에서 1시간 배양하였다. 세포 배양물을 2YT 아가/암피실린에 도말하고, 암피실린 내성 콜로니의 개수를 측정하였다. 중쇄의 가변 단편을 클로닝하기 위해, PCR 산물을 NcoI 및 XhoI로 절단하여, 경쇄 가변 영역 라이브러리에 라이게이션하고, 이를 E. coli TG1에 형질전환하였다. 라이브러리를 큰 플레이트로부터 긁어, 2YTAG 액체 배양 배지에 접종하였다. scFv 유전자 라이브러리가 함유된 TG1 샘플에 헬퍼 파지 약 1012 pfu를 첨가하고, 교반하면서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 카나마이신 70 ㎍/ml을 첨가하여, 배양물을 밤새 30℃에서 교반하였다. 세포를 4000 rpm으로 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 수득되는 상층액은 20% PEG 8000/2.5 M NaCl 5 ml과 혼합하여 얼음 위에서 30분간 인큐베이션한 다음 8000 rpm으로 20분간 4℃에서 원심분리하여 파지를 침전시켰다. 파지는 1% BSA가 함유된 PBS 1.5 ml에 재현탁하고, 볼텍싱한 다음 13000 rpm으로 5분간 원심분리하여 파편을 펠렛화하였다. 상층액은 4℃에서 보관하거나 또는 바이오패닝 (하기 참조)에 바로 사용하였다.
인간 Claudin 18.2 또는 Claudin 18.1을 안정적으로 발현하는 HEK293A 세포를 이용한 바이오패닝에 의해, 인간 Claudin 18.1이 아닌 인간 Claudin 18.2에 대한 항체를 선별하였다. 간략하게는, HEK293A/인간 Claudin 18.1 세포 1x107개를 먼저 파지 1013개가 수용된 15 ml 시험관에 넣었다. 세포/파지 혼합물을 교반기 위에 두어 실온에서 90분간 인큐베이션한 다음 다시 30분간 교반하지 않고 두었다. 세포 현탁액을 1000g로 5분간 실온에서 원심분리한 다음 상층액을 HEK293A/인간 Claudin 18.2 세포 1x107개가 든 시험관으로 이동시켰다. 세포 배양물을 교반기 상에 두어 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 파지는 PBS를 사용해 세척 제거하고, 0.1M 글리신-HC1 (pH2.2)로 항원에 결합된 파지를 용출시켰다. 용출된 파지는 1.5M Tris-HC1 (pH8.8)을 사용해 pH 7.0으로 중화하였다. 중화된 파지를 TG1 박테리아 10 ml에 감염시킨 후, OD 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 박테리아 배양물을 원심분리하여 펠렛화하고, 펠렛을 배양 배지에 재현탁한 다음 다음 라운드 스크리닝을 수행하기 위해 큰 2YTAG 플레이트 위에 코팅하였다. 이러한 농화 및 스크리닝 라운드를 총 3번 수행하였다.
바이오패닝을 3라운드 수행한 후, Claudin 18.2에 결합하는 파지를 수집해, 박테리아 세포 감염에 사용하였다. 박테리아 콜로니 하나를 취해, 96웰 플레이트에서 배양하였다. 세포-기반의 ELISA에 의해, 인간 Claudin 18.2 또는 Claudin 18.1을 발현하는 HEK293A 세포를 이용해 결합성이 높은 것을 식별하였다. 파지 ELISA에서 Claudin 18.1이 아닌 인간 Claudin 18.2에 특이적인 높은 결합 능력을 나타내는 클론을 선별하였으며, 이에 대해 DNA 서열분석하여, 결합성이 높은 클론들에서 판독가능한 scFv 서열 38개를 동정하였고, scFv 항체 10개를 추가적인 특징 규명을 위해 선택하였다.
실시예 3 예시적인 전장 항- Claudin 18.2 단일클론 항체의 발현, 정제 및 특징 규명
선택한 scFv 항체 10개를 추가적인 특징 규명을 위해 전장 단일클론 항체로서 HEK293F (Cobioer, China) 세포에서 발현시켰다. 간략하게는, 각각의 중쇄/경쇄 가변 영역 + 인간 IgG1/카파 불변 영역 (서열번호 67 및 68)을 pCDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, USA)의 EcoRI/BamHI에 클로닝하여 발현 벡터를 구축하였으며, 이때 중쇄 가변 영역의 C-말단은 인간 IgG1 불변 영역의 N-말단에, 경쇄 가변 영역의 C-말단은 인간 카파 불변 영역의 N-말단에 연결하였다.
키메라 항-인간 Claudin 18.2 항체를 제조사의 매뉴얼에 따라 PEI 형질감염을 이용해 HEK-293F 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 간략하게는, HEK-293F 세포에 제조한 벡터를 폴리에틸렌이민 (PEI)을 사용해 DNA:PEI 1:3 비율로 형질감염시켰다. 형질감염 당 사용된 전체 DNA는 1.5 ㎍/ml이었다. 형질감염된 HEK-293F 세포를 인큐베이터에서 120 RPM으로 교반하면서 5% CO2 및 37℃에서 인큐베이션하였다. 10-12일 후, 상층액을 회수하여, 단일클론 항체를 정제하였다. 간략하게는, 세포 배양물을 수집하여 3500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 0.22 ㎛ 캡슐을 사용해 여과하여 세포 파편을 제거하였다. 이후, 단일클론 항체를 사전-평형화한 단백질-A 친화성 컬럼 (GE; USA；Cat#：17040501; Lot#：10252250)으로 정제하고, 용출 완충제 (20 mM 구연산, pH3.0-3.5)로 용출시켰다. 완충제를 교체한 후, 항체를 PBS 완충제 (pH 7.0) 중에 두었으며, 그 농도를 NanoDrop 장치를 사용해 측정하였다. 정제된 단일클론 항체는 추가적으로 특징 규명하였다.
인간 Claudin 18.2 또는 Claudin 18.1을 발현하는 HEK293A 세포를 이용한 FACS에 의해 전장 항-Claudin 18.2 항체 10개에서 결합 친화성과 특이성을 검사하였다. 간략하게는, 세포 100,000개를 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 연속 희석한 항-Claudin 18.2 항체를 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3번 헹구었다. 그런 후, RPE 커플링된 염소 항-인간 IgG 이차 항체 (Thermo Cat #: PAI-86078)를 500x로 희석해 플레이트에 첨가하였다. 이를 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS로 3번 헹구고, 세포 형광을 FACS 장치 (BD)로 모니터링하였다.
정제된 항체는 또한 인간 Claudin 18.2를 안정적으로 과다 발현하는 MC38 세포 (Cober, China)(MC38/hClaudin 18.2)에 대한 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 유도하는 능력에 대해 분석하였다. 간략하게는, MC38/hClaudin 18.2 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 렌티바이러스 형질감염 시스템에 의해 구축하였다. MC38/hClaudin 18.2 세포 및 작동자 세포 NK92MI-CD16a (Huabo Bio)를 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 그런 후, 세포를 ADCC 분석 배양 배지 (MEM 배지, Gibco, Cat #: 12561-056; 1% FBS, EX-cell, Cat #：FND500; 1% BSA, VETEC, Cat #:V900933-1KG)에 현탁하였으며, 세포 생존성은 세포 카운팅에 따르면 ~90%이었다. MC38/hClaudin 18.2 세포 밀도를 4x105/ml로, NK92MI-CD16a 세포 밀도를 2x106/ml로 적정하였다. 그런 후, MC38/hClaudin 18.2 세포 50 ㎕ 및 NK92MI-CD16a 세포 50 ㎕ (작동자-타겟 비율은 5:1임)를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 여러가지 농도로 희석한 항체를 각각 각 웰에 최종 농도 32000 ng/ml, 6400 ng/ml, 1280 ng/ml, 256 ng/ml, 51.2 ng/ml, 10.24 ng/ml, 2.048 ng/ml로 각각 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 4시간 인큐베이션한 다음 LDH 현상액 (세포독성 검출 키트 PLUS (LDH), Roche, Cat #：04744926001)을 농도 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 혼합물을 암 조건에서 실온 하 20분간 인큐베이션한 후, 플레이트를 MD SpectraMax i3을 사용해 판독하였다. 항-HEL 이소형 대조군 항체 (LifeTein, LLC, Cat. #: LT12031)를 음성 대조군으로 사용하였으며, 특허 출원 WO2014/146672 Al에 기술된 아미노산 서열을 사용해 합성한 참조 항-Claudin 18.2 항체인 IMAB362는 항-Claudin 18.2 참조 항체로 사용하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 대부분의 전장 항체는 인간 Claudin 18.1이 아닌 인간 Claudin 18.2에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 전장 항체에 의해 유발되는 ADCC의 EC50 값을 표 2에 요약 개시하였으며, 항체들 모두 MC38/CLDN18.2 세포에 대해 ADCC를 유도하였다. 결합 친화성 및 ADCC 효과 순위를 토대로, 18F2를 추가적인 조사 대상으로 선정하였다.
표 2. 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC EC50
클론 ADCC(EC50: M)
MC38 /h Claudin 18.2
IMAB362 7.2E-8
18F2 9.3E-9
1E6 4.5E-8
3A8 3.5E-8
3H10 2.1E-7
10D5 1.2E-8
9F4 5.6E-8
15C3 3.3E-7
6G12 8.6E-8
6A2 6.1E-7
7H12 5.5E-8
실시예 4 파지 디스플레이에 의한 18F2의 친화성 성숙
결합 친화성을 추가적으로 개선하기 위해, 클론 18F2를 파지 디스플레이 기법에 의한 친화성 성숙에 선택하였다. 간략하게는, 3차원 구조의 모델링 시뮬레이션을 수행하여, 클론 18F2의 중쇄 및 경쇄 CDR들에서 결합 친화성에 중요할 수 있는 잠재적인 잔기들을 식별하였다. 식별된 CDR 잔기는 부위-특이적인 돌연변이 유발용 표준 프로토콜과 특수 설계한 프라이머를 사용해 PCR에 의해 돌연변이 유발하였다. 그런 후, 파지 디스플레이 라이브러리를 구축한 다음 인간 Claudin 18.2 또는 Claudin 18.1을 안정적으로 발현하는 HEK293A 세포를 이용해 전술한 바와 같이 바이오패닝을 수행하였다. 바이오패닝 라운드를 3회 수행한 후, 결합성이 높은 것을 선별 및 회수하여 박테리아 세포에 감염시켰다. 박테리아 콜로니를 취하여 96웰 플레이트에서 배양하였으며, 이후 세포-기반의 ELISA를 수행해, 높은 결합성을 보이는 것을 식별하여 이후 서열분석하였다. 중쇄 및 경쇄 CDR에서 유익한 돌연변이들이 식별되었으며, 이를 조합해 새로운 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하고, 이에 대해 전술한 바와 같이 다시 3라운드 바이오패닝을 실시하였으며, 서열분석으로 검증하였다. 모 클론 18F2와 비교해, 돌연변이 하나 내지 수개를 가진, 결합성이 높은 클론 20종 이상이 동정되었으며, 클론 12종을 선택해 전장으로서 키메라 인간 IgG1/카파 항체를 HEK293F 세포에서 발현시켰다. 전장 항체의 결합 친화성을 인간 Claudin 18.2 또는 인간 Claudin 18.1을 발현하는 HEK293 세포를 이용한 FACS에 의해 검사하였다. 간략하게는, 세포 100,000개를 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 연속 희석한 항-Claudin 18.2 항체를 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3번 헹구었다. 그런 후, RPE 커플링된 염소 항-인간 IgG 이차 항체 (Thermo Cat #: PAI-86078)를 500x로 희석해 플레이트에 첨가하였다. 이를 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS로 3번 헹구고, 세포 형광을 FACS 장치 (BD)로 모니터링하였다. 결합 친화성과 특이성에 기반하여, 모 클론 18F2와 비교해 더 높은 결합 친화성을 나타내는 클론 4종 18F2-5, 18F2-30, 18F2-35 및 18F2-66을 추가적으로 조사하기 위해 선택하였다. 선택된 키메라 단일클론 항체 4종의 EC50을, IMAB362에 대한 EC50과 더불어, 표 3에 나타낸다.
표 3. 항-Claudin 18.2 항체의 결합 친화성 EC50
클론 FACS(EC50: M)
HEK-293A/h Claudin 18.2 HEK-293A/h Claudin 18.1
IMAB362 6.34E-10 N/A
18F2 1.26E-9 N/A
18F2-30 5.62E-10 N/A
18F2-35 5.09E-10 N/A
18F2-66 5.24E-10 N/A
18F2-5 6.16E-10 N/A
실시예 5 예시적인 항- Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성
정제한 항체는, 인간 Claudin 18.2를 안정적으로 과다 발현하는 MC38 세포 (Cober, China)(MC38/hClaudin 18.2)에 대한 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 유도하는 능력에 대해 분석하였다. 간략하게는, MC38/hClaudin 18.2 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 렌티바이러스 형질감염 시스템에 의해 구축하였다. MC38/hClaudin 18.2 세포 및 작동자 세포 NK92MI-CD16a (Huabo Bio)를 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 그런 후, 세포를 ADCC 분석 배양 배지 (MEM 배지, Gibco, Cat #: 12561-056; 1% FBS, EX-cell, Cat #：FND500; 1% BSA, VETEC, Cat #:V900933-1KG)에 현탁하였으며, 세포 생존성은 세포 카운팅에 따르면 ~90%이었다. MC38/hClaudin 18.2 세포 밀도를 4x105/ml로, NK92MI-CD16a 세포 밀도를 2x106/ml로 적정하였다. 그런 후, MC38/hClaudin 18.2 세포 50 ㎕ 및 NK92MI-CD16a 세포 50 ㎕ (작동자-타겟 비율은 5:1임)를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 여러가지 농도로 희석한 항체를 각각 각 웰에 최종 농도 32000 ng/ml, 6400 ng/ml, 1280 ng/ml, 256 ng/ml, 51.2 ng/ml, 10.24 ng/ml, 2.048 ng/ml로 각각 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 4시간 인큐베이션한 다음 LDH 현상액 (세포독성 검출 키트 PLUS (LDH), Roche, Cat #：04744926001)을 농도 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 혼합물을 암 조건에서 실온 하 20분간 인큐베이션한 후, 플레이트를 MD SpectraMax i3을 사용해 판독하였다. 항-HEL 이소형 대조군 항체 (LifeTein, LLC, Cat. #: LT12031)를 음성 대조군으로 사용하였으며, IMAB362는 참조 항-Claudin 18.2 항체로 사용하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 선택한 키메라 항체 4종 18F2-5, 18F2-30, 18F2-35 및 18F2-66은 NK92MI-CD16a에 의해 MC38/hClaudin 18.2 세포의 사멸을 유도할 수 있었다.
항-Claudin 18.2 항체를 대상으로, 인간 Claudin 18.2를 높은 수준으로 내인성 발현하는 것으로 보고된 2가지 세포주, 즉 KATO-III (Cobioer, China) 및 NUGC-4 세포 (Cobioer, China)에 대해 ADCC 활성을 추가적으로 조사하였다. 간략하게는, 표적 세포에 10 ng/ml 에피투비신 (Apexbio, Cat #. A2451-100 mg), 500 ng/ml 옥살리플라틴 (Ark pharm, Cat #. Ak-72813) 및 10 ng/ml 5-FU (Acros, Cat #. Un12811) (EOF)을 72시간 동안 전처리한 다음, 약물은 제거하고, 세포를 정상 배양 배지 (DMEM + 10%FBS)에서 24시간 더 배양하였다. ADCC 분석은 표적 세포로서 KATO-III 또는 NUGC-4 세포를 사용하여 전술한 프로토콜에 따라 수행하였다. 2x105 NK92MI-CD16a 세포 및 2x104 KATO-III 세포 또는 NUGC-4 세포 (작동자:타겟의 비율은 10:1임)를 각 분석에서 이용하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 단일클론 항체 4종, 즉 18F2-5, 18F2-30, 18F2-35 및 18F2-66은 NK92MI-CD16a 세포에 의한 KATO-III 또는 NUGC-4 세포의 사멸을 유도할 수 있었다.
항-Claudin 18.2 항체가 Claudin 18.2 양성 세포에 대해 ADCC 활성을 특이적으로 유도하는지를 추가적으로 검증하기 위해, 이들 항체에서, 인간 Claudin 18.2 또는 Claudin 18.1을 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대한 ADCC 활성을 유도하는 능력을 조사하였다. 간략하게는, 인간 Claudin 18.1 또는 18.2를 과다 발현하는 1x105 NK92MI-CD16a 세포 및 2x104 HEK293A 세포 (작동자:타겟의 비율은 5:1임)를 각각의 분석에 사용하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 검사 항체 4종, 즉 18F2-5, 18F2-66, 18F2-30 및 18F2-35는 인간 Claudin 18.2를 발현하는 HEK293A 세포에 대해 ADCC 활성을 특이적으로 유도하였으며, 인간 Claudin 18.1을 과다 발현하는 HEK293A 세포에 대해서는 세포독성 효과가 관찰되지 않았다.
실시예 6 예시적인 항- Claudin 18.2 항체의 CDC 활성
예시적인 항-Claudin 18.2 항체가 인간 Claudin 18.2를 안정적으로 과다 발현하는 MC38 세포 (MC38/hClaudin 18.2, 실시예 5에서 구축됨)에 대해 CDC 활성을 유도하는 능력을, 세포독성 검출 키트 (Roche, Cat #：04744926001)를 사용해 측정하였다. 간략하게는, 표적 세포 MC38/인간 Claudin 18.2 세포를 1200 rpm으로 4분간 원심분리한 다음, 세포를 1% FBS가 첨가된 DMEM 배지에 현탁하였다. MC38/hClaudin 18.2 세포의 세포 밀도를 3x105 세포/ml로 조정하여, 세포 100 ㎕를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 다양한 농도로 희석한 항체를 각각 첨가하였으며, 이의 최종 농도는 각각 20 ㎍/ml, 4 ㎍/ml, 0.8 ㎍/ml, 0.16 ㎍/ml, 0.032 ㎍/ml, 0.0064 ㎍/ml 및 0.00128 ㎍/ml이었다. 정상 인간 혈청 보체 (Quidel, Cat #：A113)를 최종 농도 5%로 첨가하고, 제조되는 혼합물을 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. LDH 현상액을 100 ㎕/웰의 농도로 첨가한 다음 샘플은 암 조건에서 20분간 실온에서 인큐베이션하였다. MD SpectraMax i3 장치를 사용해 플레이트를 판독하였다. 항-Claudin 18.2 항체 IMAB362를 참조로 사용하였으며, 항-HEL 단일클론 항체는 음성 대조군으로 사용하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 검사 항체, 18F2-5, 18F2-30, 18F2-35 및 18F2-66은 농도 의존적인 방식으로 강력한 CDC 활성을 나타내었다.
실시예 7 인간 Claudin 18.2에 대한 예시적인 항- Claudin 18.2 항체의 결합 안전성
정제한 항-Claudin 18.2 항체를 FACS에 의해 HEK293A/hClaudin 18.2 세포에 대한 결합 안정성을 추가적으로 분석하였다. 간략하게는, 105 HEK293A/hClaudin 18.2 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 플레이트에 10 ㎍/ml 항-Claudin 18.2 항체를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBST로 3번 헹구고, 세포를 세포 배양 배지 (DMEM)에 현탁하였다. 세포는 37℃에서 0, 3시간 또는 5시간 각각 추가적으로 인큐베이션하였다. 그런 후, RPE 커플링된 염소 항-인간 IgG 이차 항체 (Thermo, Cat #： PAI-86078)를 500x로 희석하여, 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS로 3번 헹군 다음 FACS 장치 (BD)에서 세포 형광을 모니터링하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 항체 4종 (18F2-5, 18F2-30, 18F2-35 및 18F2-66) 모두 분석에서 IMAB362보다 높은 결합 안정성을 나타내었으며, 이는 이들의 높은 ADCC 및 CDC 활성과 부합하는 것으로 보이는 바, 이는 높은 결합 안정성이 높은 ADCC 및 CDC 활성에 기여할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 8 예시적인 항- Claudin 18.2 항체의 인간화
항-Claudin 18.2 항체, 18F2-5, 8F2-30, 18F2-35 및 18F2-66을 인간화 및 추가적인 조사를 위해 선택하였다. 뮤라인 항체의 인간화는 아래에서 상세히 기술된 바와 같이 잘-확립된 CDR-그래프팅 방법을 이용해 구축하였다.
키메라 항체 18F2-5, 18F2-30, 18F2-35 및 18F2-66을 인간화하기 위한 어셉터 프래임워크를 스크리닝하기 위해, 이들 항체의 경쇄 및 중쇄 가변성 체인의 서열을 NCBI 웹사이트 (http:// www.ncbi.nlm.nih. gov/igblast/)에서 인간 면역글로불린 유전자 데이터베이스에 대해 블라스트 검색하여, 가장 상동적인 인간 생식세포계열의 IGVH 및 IGVK를 각각 인간화를 위한 어셉터로서 식별하였다. 상기 항체 4종에서, 선택된 인간 중쇄 어셉터는 IGHV1-46*01이었으며, 선택된 인간 경쇄 어셉터는 IGKV4-1*01이었다.
CDR 루프 구조를 뒷받침하는데 중요한 역할을 수행할 수 있는 주요 프래임워크 잔기를 동정하기 위해, 상기 항체 4종의 가변성 도메인에 대해 3차원 구조를 시뮬레이션하였으며, 즉 인간화된 항체에서 역 돌연변이를 설계하였다. 선택된 구조 주형은 18F2-5, 8F2-30, 18F2-35 및 18F2-66 각각에 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 내 동일한 계열의 정준 루프 (canonical loop) 구조를 가지고 있었다. 이들 선택된 구조 주형을 이용해, 뮤라인 프래임워크를 중쇄 및 경쇄에 대한 인간 어셉터 프래임워크로 치환하여 구조 모델을 구축하였다. 그런 후, 3차원 구조 모델링 시뮬레이션을 수행하여, 중쇄 및 경쇄 계면 또는 CDR-루프 구조를 뒷받침하는데 중요할 수 있는 주요 프래임워크 잔기를 동정하였다. 뮤라인 항체 및 인간 어셉터 프래임워크 둘다 프래임워크내 특정 부위에 동일한 잔기를 공유하는 경우, 인간 생식세포계열의 잔기를 유지시켰다. 한편, 뮤라인 항체와 인간 생식세포계열의 어셉터 프래임워크가 프로임워크내 특정 부위에서 서로 다른 잔기를 가진 경우에는, 그 잔기의 중요성을 구조 모델링을 통해 평가하였다. 뮤라인 항체의 프래임워크 내 잔기가 CDR 잔기와 상호작용하여 영향을 미치는 것으로 확인된다면, 그 잔기를 뮤라인 잔기로 역 돌연변이하였다. 아래 표 4는 항체 구조 시뮬레이션에 사용된 구조 주형을 열거한다.
표 4. 항체 구조 시뮬레이션에 사용된 구조 주형들
항체 체인 주형 구조의 PDB 코드 서열 동일성 서열 유사성
18F2-30 중쇄 1WT5 81% 88%
18F2-30 경쇄 4LEO 93% 98%
18F2-35 중쇄 1WT5 81% 88%
18F2-35 경쇄 4LEO 94% 97%
18F2-5 중쇄 1WT5 81% 87%
18F2-5 경쇄 4LEO 92% 97%
18F2-66 중쇄 3SQO 83% 88%
18F2-66 경쇄 4LEO 93% 98%
표 5. 항-Claudin 18.2 항체에 고안된 역-돌연변이
중쇄 가변 영역 중쇄 역-돌연변이 경쇄 가변 영역 경쇄 역-돌연변이
VH0 없음 VL0 없음
VH2 M48I, M70L, R72V ,T74K VL2 D9S, A12T, R18K, V89L
VH3 M48I, M70L, R72V VL3 D9S, A12T, R18K, N22S, V89L, Q106S
VH4 A40R, M48I, M70L, R72V, T74K
VH5 A40R, M48I, M70L, R72V, T74K, V79A, A97T
VH6 A40R, M48I, M70L, R72V, T74K, T76S, V79A, R87T, A97T
VH7 A40R, R38K, M48I, R67K, M70L, R72V, T74K, V79A, A97T
전술한 구조 모델링에 기반하여, 항-Claudin 18.2 항체의 중쇄에서 잠재적인 역-돌연변이 11개 (R38K, A40R, M48I, R67K, M70L, R72V, T74K, T76S, V79A, R87T, A97T)와, 경쇄에서 잠재적인 역-돌연변이 6개 (D9S, A12T, R18K, N22S, V89L, Q106S)를 동정하였다.
상기 표 5에 요약 개시된 바와 같이, 친화성-성숙화된 각각의 항-Claudin 18.2 항체에 대해, 인간화된 중쇄 가변 영역 7종과 인간화된 경쇄 가변 영역 3종을 설계하였다.
인간화된 전장 항체 (각각의 중쇄/경쇄 가변 영역 (표 1에 요약 개시됨))을 암호화하는 DNA 서열 + 인간 IgG1/카파 불변 영역 (서열번호 67 및 68)을 화학 합성한 다음, 발현 벡터 pCDNA3 (Invitrogen)에 EcoR I 및 Xho I, Cla I 및 Hind III 제한효소 부위를 각각 이용해 서브클로닝하였다. 모든 발현 구조체들은 DNA 서열분석에 의해 검증하였다. 인간화된 Claudin 18.2 항체 42종 (18F2-5 10종, 18F2-30 11종, 18F2-35 11종 및 18F2-66 10종)을 실시예 3에 기술된 프로토콜을 사용해 일시적으로 발현시켜 정제하였다. 이후, 정제한 인간화된 항체는 아래에서 상세히 기술된 바와 같이 추가적으로 특징을 분석하였다.
실시예 9 HEK293A 세포 상에 발현된 인간 Cludin 18.2에 결합된 인간화된 항-Claudin 18.2 항체 예
인간화된 항-Claudin 18.2 항체 42종을 대상으로, 각각 HEK293A/hClaudin 18.2 세포 또는 HEK293A/hClaudin 18.1 세포 상에 발현된 인간 Claudin 18.2 또는 인간 Claudin 18.1에 결합하는 능력을 추가적으로 검사하였다. FACS를 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다.
대표적인 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 결합 친화성을 도 7에 나타내었다. 인간화된 항체 전체의 결합 친화성은 이의 모 항체와 비슷하였으며, 인간 Claudin 18.1에 결합 친화성을 가진 것은 없었는데, 이는 이들 항체가 인간 Claudin 18.2에 대해 높은 특이적인 결합성을 가짐을 의미한다. 결합 친화성에 기반하여, 이들 항체들 중 6종 (18F2-5VH0VL0, 18F2-5VH7VL3, 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3, 18F2-35VH0VL0, 18F2-35VH7VL3)을 추가적으로 조사하기 위해 선택하였다.
실시예 10 예시적인 인간화된 항- Claudin 18.2 항체의 CDC 활성
인간 Claduin 18.2-과다 발현성 MC38 세포에 대해 CDC 활성을 유도하는 능력을 인간화된 항체들에서 추가적으로 분석하였다. CDC 분석을 실시예 6에 기술된 프로토콜에 따라 수행하였다. 항-Claudin 18.2 항체 IMAB362를 참조 항체로, 항-HEL 단일클론 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
CDC 분석 결과는 도 8에 나타내었으며, 도 8은 검사한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체들 모두 강력한 CDC 활성을 나타냄을 보여준다.
실시예 11 예시적인 인간화된 항- Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성
작동자 세포로서 NK92MI-CD16a 세포를 사용해 인간화된 항체가 ADCC 효과를 유도하는 능력을 분석하였다. ADCC 분석은 실시예 5의 프로토콜에 따라 수행하였다.
먼저, 인간화된 항-Claudin 18.2 항체에서 MC38/hClaudin 18.2 세포에 대한 ADCC 유도 능력을 분석하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 인간화 항체 18F2-35VH0VL0 및 18F2-30VH7VL3는 모든 인간화된 항체들 중에서도 ADCC 분석에서 더 강한 효과를 나타내었다.
이러한 결과를 토대로, Claudin 18.2 단백질을 내인성으로 높은 수준으로 발현하는 것으로 알려져 있는 2종, 즉 EOF 전처리된 KATO-III 세포 및 NUGC-4 세포에 대한 이들 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 효과를 추가적으로 조사하였다. KATO-III 세포와 NUGC-4 세포에 10 ng/ml 에피투비신 (Apexbio, Cat. A2451-100 mg), 500ng/ml 옥살리플라틴 (Ark pharm, Cat. Ak-72813) 및 10 ng/ml 5-FU (Acros, Cat. Un12811) (EOF)을 72시간 전처리한 다음, 세포를 정상 배양 배지 (DMEM+10%FBS)에서 다시 24시간 배양하였다. ADCC 분석을 실시예 5에 언급된 프로토콜에 따라 수행하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 검사한 인간화된 항-Claudin 18.2 항체 6종 모두 참조 항체 IMAB362와 비교해 표적 세포 KATO-III 또는 NUGC-4 세포에 대해 강력한 ADCC 활성을 나타내었다.
실시예 12 예시적인 인간화된 항- Claudin 18.2 항체의 ADCC 및 CDC 활성의 특이성
항-Claudin 18.2 항체가 Claudin 18.1을 발현하는 세포가 아닌 Claudin 18.2를 발현하는 표적 세포에 대해 특이적으로 ADCC 또는 CDC 활성을 발휘하는지를 검증하기 위해, 표적 세포로서 인간 Claudin 18.1을 발현하는 HEK293A 세포 (HEK293A/hClaudin 18.1 세포) 또는 인간 Claudin 18.2를 발현하는 HEK293A 세포 (HEK293A/hClaudin 18.2 세포)를 이용해, 실시예 5 및 6에 기술된 프로토콜에 따라 ADCC 및 CDC 분석을 수행하였다. 도 11 (ADCC 분석) 및 도 12 (CDC 분석)에 나타낸 바와 같이, 검사한 항-Claudin 18.2 항체들 모두 인간 Claudin 18.1을 발현하는 세포가 아닌 인간 Claudin 18.2를 발현하는 HEK293A 세포에서만 ADCC 및 CDC 활성을 유도하였으며, 이는 항-Claudin 18.2 항체에 의해 유도된 ADCC 및 CDC 활성이 인간 Claudin 18.2를 발현하는 세포에 매우 특이적임을 시사해준다.
실시예 13 예시적인 인간화된 항- Claudin 18.2 항체의 인간 Claudin 18. 2에 대한 결합 안정성
인간화된 항-Claudin 18.2 항체 10종을 선택하여, 인간 Claudin 18.2를 안정적으로 과다 발현하는 HEK293A 세포 (HEK293A/hClaudin 18.2)와의 결합 안정성을 실시예 7에 기술된 프로토콜에 따라 FACS에 의해 분석하였다. 항-CLaudin 18.2 항체 IMAB362를 참조 항체로 사용하고, 항-HEL 단일클론 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 인간화된 항체들은 여러가지 결합 안정성을 나타내었으며, 결합 안정성은 ADCC 및 CDC 검사 결과와 일치하는 경향을 보였다.
실시예 14 예시적인 인간화된 항- Claudin 18.2 항체의 에피토프 맵핑
각각의 인간화된 항-Claudin 18.2 항체에 대한 결합 에피토프를 조사하였다. 세포외 루프 1에 다양한 돌연변이를 가진 인간 Claudin 18.2 또는 Claudin 18.1을 발현하는 HEK293A 세포주 16주를 구축하였으며, 인간 Claudin 18.2 또는 Claudin 18.1 돌연변이의 아미노산 서열들은 아래 표 6에서 확인할 수 있다. 특히, 인간 Claudin 18.2 돌연변이 8종을 설계하였으며, 세포외 루프 1 내 단일 아미노산 잔기를 Claudin 18.1의 세포외 루프 1의 이의 카운터파트로 치환하였다. 이들 Claudin 18.2 또는 Claudin 18.1 돌연변이를 안정적으로 과다 발현하는 HEK-293A 세포주를 실시예 1의 프로토콜에 따른 렌티바이러스 감염에 의해 구축하였다. 그런 후, FACS를 수행하여, 각 돌연변이에 대한 항-Claudin 18.2 항체의 결합 안정성을 조사하였다.
표 6. 인간 Claudin 18.1 및 인간 Claudin 18.2 돌연변이의 아미노산 서열번호 및 항체의 돌연변이 결합 능력
단백질 돌연변이 번호 아미노산 잔기 돌연변이 서열번호 WT/돌연변이 Claudin 18.1/18.2에 대한 항체의 결합 능력
IMAB362 18F2-30VH0VL0 18F2-30VH7VL3 18F2-35VH0VL0
Claudin 18.2 WT / 72 +++ +++ +++ +++
돌연변이 1 Q29M 73 ++ ++ ++ ++
돌연변이 2 N37D 74 ++ ++ ++ ++
돌연변이 3 A42S 75 - ++ ++ ++
돌연변이 4 N45Q 76 - ++ ++ ++
돌연변이 5 Q47E 77 ++ ++ ++ ++
돌연변이 6 E56Q 78 - - - -
돌연변이 7 G65P 79 ++ ++ ++ ++
돌연변이 8 L69I 80 ++ ++ ++ ++
돌연변이 9 A42S/N45Q 81 - + + +
돌연변이 10 A42S/Q47E 82 - ++ ++ +
돌연변이 11 N45Q/Q47E 83 - ++ ++ +
돌연변이 12 A42S/N45Q/Q47E 84 - + + -
돌연변이 13 A42S/N45Q/Q47E/E56Q 85 - - - -
Claudin 18.1 WT / 70 - - - -
돌연변이 14 Q56E 86 - + + +
돌연변이 15 S42A/Q45N/Q56E 87 ++ ++ ++ ++
돌연변이 16 S42A/Q45N/E47Q/Q56E 88 ++ ++ ++ ++
표 6에 나타낸 바와 같이, IMAB362를 포함한 항-Claudin 18.2 항체들 모두 E56Q 돌연변이를 가진 돌연변이 6-발현성 세포에 결합하지 않았으며, 이는 E56이 항체-Claudin 18.2 상호작용에 필수적인 아미노산 잔기임을 시사한다. 또한, 데이터에 따르면, A42S (돌연변이 3) 또는 N45Q (돌연변이 4) 돌연변이를 가진 Claudin 18.2는 IMAB362에 의한 결합성을 완전히 상실하였고, 인간화된 항-Claudin 18.2 항체 18F2-30VH0VL0, 18F2-30 VH7VL3 또는 18F2-35VH0VL0에 의한 결합성을 일부 상실하였다. 요컨대, 이들 데이터는, 항체 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3 및 18F2-35VH0VL0이 IMAB362와 비교해 인간 Claudin 18.2의 세포외 루프 1 내 여러가지 에피토프에 결합함을 시사해준다.
이러한 결과에 기반하여, 2중 또는 다중-부위 돌연변이를 가진 다른 돌연변이 5종을 설계하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, IMAB362는 이들 돌연변이 5종 모두에 결합하지 않았지만, 인간화된 항체들은 모두 돌연변이 9, 10 및 11에 대해 완전 또는 부분적인 결합 친화성을 나타내었는 바, 이는 인간 Claudin 18.2의 A42 및 N45가 IMAB362 결합 친화성에 필수적인 아미노산 잔기이지만, 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3 또는 18F2-35VH0VL0에서는 그렇지 않다는 것을 검증해준다.
이러한 결론을 추가적으로 검증하기 위해 인간 Claduin18.1 돌연변이를 과다 발현하는 다른 세포주 3종을 구축하였다. 상기 결과와 부합하여, IMAB362를 제외한 항체들 모두 돌변연이 14-발현 세포에 결합할 수 있었으며, 이는 본 발명의 인간화된 항체는 IMAB362와 서로 다른 결합 패턴을 가진다는 것을 의미한다 (도 15 참조). 나아가, 도 16에서, E47Q 역 돌연변이가 IMAB362의 Claudin 18.2 결합 친화성을 개선하진 못하지만, 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3 및 18F2-35VH0VL0의 결합 친화성은 강화함을 알 수 있었는데, 이는 인간 Claudin 18.2/Q47이 IMAB362가 아닌 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3 및 18F2-35VH0VL0의 Claudin 18.2 결합 친화성에 중요한 아미노산 잔기임을 의미한다.
요컨대, 본 발명자들은, 인간화된 항-Claudin 18.2 항체 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3 및 18F2-35VH0VL0가 참조 항체 IMAB362와 비교해 인간 Claudin 18.2의 세포외 루프 1 내 매우 다른 에피토프들에 결합한다고, 결론내렸다.
실시예 15 인간 PBMC 또는 Vγ9Vδ2 T 세포에 의한 예시적인 인간화된 항-Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성
인간화된 항-Claudin 18.2 항체에서, 인간 PBMC에 의한 MC38/hClaudin 18.2 세포 (실시예 5에서 제조됨) 또는 EOF 전처리된 NUGC-4 세포에 대해 ADCC 활성을 유도하는 능력을 추가적으로 분석하였으며, MC38/hClaudin 18.2 세포를 GFP 단백질을 발현하는 pLV-EGFP(2A)-Puro로 감염시켜 구축하였다. 림프구 분리 용액을 이용한 밀도 구배 원심분리에 의해 인간 PBMC를 준비하여, 배지 (RIPM1640+10% FBS+300IU IL-2)에서 밤새 배양하였다.
생/사멸 고정가능한 사멸 세포 염색 키트 (Thermo Fisher, USA, Cat #: L34964)를 사용해 ADCC 분석을 수행하였다. 표적 세포 및 작동자 세포 (PBMC) 둘다 1200 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 그런 후, 세포를 ADCC 실험의 배양 배지 (RIPM1640 배지 + 1% FBS)에 현탁하였으며, 세포 생존성은 세포 카운팅에 따르면 ~90%이어야 하였다. 표적 세포의 밀도를 4x105/ml로 조정하였으며, PBMC 세포 밀도는 8x106/ml로 조정하였다. 그런 후, MC38/hClaudin 18.2 세포 50 ㎕ 및 PBMC (작동자:표적의 비는 20:1임) 50 ㎕을 각각의 웰에 첨가하였다. 항체를 여러가지 농도로 분리하여 첨가하여, 최종 농도에 도달하게 하였다. MC38/hClaudin 18.2 세포에 대한 항체의 최종 농도는 800 ng/ml, 32 ng/ml 및 6.4 ng/ml이었으며, NUGC-4 세포에 대한 농도는 4000 ng/ml, 160 ng/ml, 64 ng/ml 및 2.5 ng/ml이었다. 이후, 샘플을 37℃에서 12시간 인큐베이션하였다. 혼합물을 PBS로 3번 헹군 다음 생/사멸 고정가능한 사멸 세포 염료와 함께 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3번 헹군 후 FACS로 분석하였다. GFP 양성 세포 (MC38/hClaudin 18.2 세포)의 세포자살 비율을 계산하였다.
NUGC-4 세포에 대한 분석으로, NUGC-4 세포에 10 ng/ml 에피투비신 (Apexbio, Cat. A2451-100 mg), 500 ng/ml 옥살리플라틴 (Ark pharm, Cat. Ak-72813) 및 10 ng/ml 5-FU (Acros, Cat. Un12811) (EOF)을 72시간 전처리한 다음 물질을 제거하였다. 세포를 정상 배양 배지 (DMEM + 10% FBS)에서 다시 24시간 배양하였다. NUGC-4 세포를 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Invitrogen, USA, Cat #：C34554)로 제조사의 지침에 따라 표지하였다. ADCC 분석을 전술한 바와 같이 수행하였으며, 단 ADCC 작동자 세포 : 표적 세포의 비는 50:1이었다.
이전의 실험들에서, Vγ9Vδ2T 세포는 항-인간 Claudin 18.2 항체의 ADCC 활성에 중요한 것으로 밝혀졌다. 본 실시예에서는 인간 PBMC에서 Vγ9Vδ2 T 세포를 농화하였다. 구체적으로, PBMC를 수집하고, 10% FBS, 300IU IL-2 및 1 μM 졸레드론산 (ZA)이 첨가된 Vγ9Vδ2 T 세포-유도성 DMEM 배지에서 배양하였다. 14일 후, 세포를 회수하여, ADCC 분석에서 작동자 세포로 사용하였다. 표적 세포로서 MC38/hClaudin 18.2 세포를 이용한 분석에서, E/T 비율은 20:1이었으며; EOF 전처리한 NUGC-4 세포를 표적 세포로 사용할 경우에는 E/T 비율은 50:1이었다. ADCC 프로토콜의 상세 내용은 전술한 바와 동일하였다.
도 17 (작동자 세포로서 PBMC) 및 도 18 (작동자 세포로서 Vγ9Vδ2T 세포)에 나타낸 바와 같이, 모든 항체는 농도 의존적인 방식으로 PBMC 및 Vγ9Vδ2T 세포에 의해 표적화된 세포에 대해 강력한 ADCC 활성을 유도할 수 있었다. Vγ9Vδ2T 세포에 의한 ADCC 활성은 PBMC에 의한 것 보다 실제 강하였으며, 이는 이전 실험과 일치하였다.
실시예 16 예시적인 항- Claudin 18.2 항체의 생체내 항-종양 효과
항-Claudin 18.2 항체 6종 (18F2-5VH0VL0, 18F2-5VH7VL3, 18F2-30VH0VL0, 18F2-30VH7VL3, 18F2-35VH0VL0 및 18F2-35VH7VL3)을 뮤라인 대장 선암종을 가진 C57 마우스에서 생체내 항-종양 활성 실험용으로 선택하였다. 동물 모델에서 항체의 ADCC 활성을 발휘하기 위해, 항체의 가변 영역을 마우스 IgG 2a/카파 불변 영역과 융합하여, 전장 항체를 제조하였으며, mIgG2a 및 카파 불변 영역 아미노산 서열은 서열번호 89 및 90에 각각 나타내었다.
C57 마우스에 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 MC38 세포 (MC38/hClaudin 18.2) 1x106개를 0일에 옆구리에 주사하였다. 종양의 크기가 약 80 mm3에 도달하면, 동물을 여러가지 그룹으로 할당하고 (n=8), 항체 하나를 5일, 7일, 10일, 12일, 14일, 17일 및 19일에 투여량 10 mg/kg으로 i.p. 투여하였다. 종양 증식을 경시적으로 모니터링하였으며, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일, 17일 및 19일에 체적을 측정하였다. 종양 측정 (너비 및 길이)은 캘리퍼를 사용해 수행하였으며, 종양 체적은 식 TV=(길이 x 너비2)/2로 계산하였다. 실험은 종양 용적이 3 cm3에 도달하기 전에 종료하였다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 검사한 항체들 모두 종양 증식을 저해하였으며, 18F2-30VH0VL0 가변 영역을 가진 항체가 최상의 항-종양 효과를 나타내었다.
실시예 17 예시적인 항- Claudin 18.2 항체의 화학요법과의 조합시 항-종양 효과
C57 마우스에 인간 Claudin 18.2를 과다 발현하는 MC38 세포 (MC38/hClaudin 18.2) 1x106개를 0일에 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 약 80 mm3에 도달하면, 동물을 여러 그룹 (n=10)으로 할당하고, EOF (에피투비신 (1.25 mg/kg), 옥살리플라틴 (3.25 mg/kg) 및 5-FU (56.25 mg/kg)) 또는 대조군 비히클을 5일 및 12일에 복막내 투여하였으며, 이때 대조군에는 EOF 전처리를 투여하지 않았다. 그런 후, 6일, 8일, 11일, 13일, 15일 및 18일에, 이들 마우스에 18F2-30-VH0VL0, 18F2-5-VH0VL0, 18F2-35-VH7VL3 (3종 모두 마우스 IgG 2a/카파 불변 영역을 가짐， mIgG2a와 카파 불변 영역 아미노산 서열을 각각 서열번호 89 및 90에 나타냄) 또는 대조군을 투여량 10 mg/kg으로 복막내 주사하였다. 종양의 증식을 경시적으로 모니터링하였으며, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일, 17일 및 19일에 크기를 측정하였다. 종양 측정 (너비 및 길이)은 캘리퍼를 사용해 수행하였으며, 종양 체적은 식 TV=(길이 x 너비2)/2로 계산하였다. 실험은 종양 체적이 3 cm3에 도달하기 전에 종료하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 검사 항체들 모두 화학치료제와 상승적인 항-종양 효과를 나타내었으며, 이중 18F2-30VH0VL0 가변 영역을 가진 항체가 최상의 상승적인 항-종양 효과를 나타내었다.
실시예 18 비 - 푸코실화된 항- Claudin 18.2 항체의 ADCC 및 CDC 활성
US2018/0022820 A1에 기술된 바와 같이 Mabworks에서 SLC35c1-넉아웃 CHOK1-AF 세포를 구축하였으며, 이들 세포주에 의해 발현된 단백질에는 푸코실화 변형이 거의 존재하지 않았다.
18F2-30VH0VL0 및 18F2-35VH7VL3에 대한 각각의 중쇄/경쇄 가변 영역 + 인간 IgG1/카파 불변 영역 (서열번호 67 및 68)을 pCDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, USA)의 적절한 제한효소 부위에 클로닝하여 발현 벡터를 구축한 다음, SLC35c1-넉아웃 CHOK1-AF 세포에 형질전환하였다. 18F2-30VH0VL0AF 및 18F2-35VH7VL3AF로 지칭되는 2가지 종류의 비-푸코실화된 항-Claduin18.2 항체를 SLC35c1-넉아웃 CHOK1-AF 세포에서 일시적으로 발현시킨 후 실시예 3의 프로토콜에 따라 정제하였다.
비-푸코실화된 항-Claudin 18.2 항체 2종의 ADCC 활성을 작동자 세포로서 NK92MI-CD16a 세포를, 표적 세포로서 EOF 전처리된 NUGC-4 세포를 이용해 분석하였다. ADCC 분석은 실시예 5의 프로토콜에 따라 수행하였다.
비-푸코실화된 항체를 대상으로, 인간 Claduin 18.2-과다 발현성 MC38 세포에 대해 CDC 활성을 유도하는 능력을 추가적으로 분석하였다. CDC 분석은 실시예 6에 기술된 프로토콜에 따라 수행하였다. 항-Claudin 18.2 항체 IMAB362를 참조 항체로 사용하고, 항-HEL 단일클론 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 18F2-30VH0VL0AF 및 18F2-35VH7VL3AF 둘다 각각의 모 항체보다 ADCC 활성이 더 높았다. 도 22의 결과는, 이들 2종의 항체의 CDC 활성이 모 항체와 다르지 않다는 것을 시사해준다.
예시적인 항체의 중쇄/경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 아래에 요약 개시한다.
설명/
서열/서열번호
마우스 및 키메라 18F2 항체의 VH-CDR1
SFWVN (서열번호 1)
마우스 및 키메라 18F2 항체의 VH-CDR2
NIYPSTSYTVYNQKFKD (서열번호 4)
마우스 및 키메라 18F2 항체의 VH-CDR3
SWRGNSFDH (서열번호 7)
마우스 및 키메라 18F2 항체의 VL-CDR1
KSSQSLLNSGNQKNYVT (서열번호 10)
마우스 및 키메라 18F2 항체의 VL-CDR2
WGSTRVR (서열번호 13)
마우스 및 키메라 18F2 항체의 VL-CDR3
Q NDYTYPFT (서열번호 16)
마우스 및 키메라 18F2 항체의 VH 항체
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT SFWVN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD KATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTR SWRGNSFDH WGQGTTLTVSS (서열번호 17)
마우스 및 키메라 18F2 항체의 VL 항체
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQ NDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 50)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-5 항체의 VH-CDR1
SFWLN (서열번호 2)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-5 항체의 VH-CDR2
NIYPSTSYTVYNQKFKD (서열번호 4)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-5 항체의 VH-CDR3
TWRGNSFDL (서열번호 8)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-5 항체의 VL-CDR1
KSNQSLLNSGNQKNYVT (서열번호 11)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-5 항체의 VL-CDR2
WGSTRVR (서열번호 13)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-5 항체의 VL-CDR3
QNDYTYPFT (서열번호 16)
마우스 및 키메라 18F2-5 항체의 VH
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT SFWLN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD KATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTR TWRGNSFDL WGQGTTLTVSS (서열번호 18)
마우스 및 키메라 18F2-5 항체의 VL
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSNQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 51)
인간화된 18F2-5VH0VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWMG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 22)
인간화된 18F2-5VH2VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 23)
인간화된 18F2-5VH3VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 24)
인간화된 18F2-5VH4VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 25)
인간화된 18F2-5VH5VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 26)
인간화된 18F2-5VH6VL0, 18F2-5VH6VL2 및 18F2-5VH6VL3의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 27)
인간화된 18F2-5VH7VL2 및 18F2-5VH7VL3의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD KVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 28)
인간화된 18F2-5VH0VL0, 18F2-5VH2VL0, 18F2-5VH3VL0, 18F2-5VH4VL0, 18F2-5VH5VL0, 및 18F2-5VH6VL0의 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSNQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYTYPFT FGQGTKLEIK (서열번호 55)
인간화된 18F2-5VH6VL2, 및 18F2-5VH7VL2의 VL
DIVMTQSPSSLTVSLGEKATINC KSNQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGQGTKLEIK (서열번호 56)
인간화된 18F2-5VH6VL3 및 18F2-5VH7VL3의 VL
DIVMTQSPSSLTVSLGEKATISC KSNQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 57)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-30 항체의 VH-CDR1
SFWLN (서열번호 2)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-30 항체의 VH-CDR2
NIYPSTSYTVYNQKFKD (서열번호 4)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-30 항체의 VH-CDR3
TWRGNSFDY (서열번호 9)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-30 항체의 VL-CDR1
KSSQSLLNSGNQKNYVT (서열번호 10)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-30 항체의 VL-CDR2
WGSTRST (서열번호 14)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-30 항체의 VL-CDR3
QNDYTYPFT (서열번호 16)
마우스 및 키메라 18F2-30 항체의 VH
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT SFWLN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD KATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTR TWRGNSFDY WGQGTTLTVSS (서열번호 19)
마우스 및 키메라 18F2-30 항체의 VL
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRST GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 52)
인간화된 18F2-30-VH0VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWMG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 29)
인간화된 18F2-30-VH2VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 30)
인간화된 18F2-30-VH3VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 31)
인간화된 18F2-30-VH4VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 32)
인간화된 18F2-30-VH5VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 33)
인간화된 18F2-30-VH6VL0, 18F2-30-VH6VL2 및 18F2-30-VH6VL3의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD RVTLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 34)
인간화된 18F2-30-VH7VL0, 18F2-30-VH7VL2 및 18F2-30-VH7VL3의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTVYNQKFKD KVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 35)
인간화된 18F2-30-VH0VL0, 18F2-30-VH2VL0, 18F2-30-VH3VL0, 18F2-30-VH4VL0, 18F2-30-VH5VL0, 18F2-30-VH6VL0 및 18F2-30-VH7VL0의 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRST GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYTYPFT FGQGTKLEIK (서열번호 58)
인간화된 18F2-30-VH6VL2, 및 18F2-30-VH7VL2의 VL
DIVMTQSPSSLTVSLGEKATINC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRST GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGQGTKLEIK (서열번호 59)
인간화된 18F2-30-VH6VL3, 및 18F2-30-VH7VL3의 VL
DIVMTQSPSSLTVSLGEKATISC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRST GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 60)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-35 항체의 VH-CDR1
SFWLN (서열번호 2)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-35 항체의 VH-CDR2
NIYPSTSYTIYNQKFKD (서열번호 5)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-35 항체의 VH-CDR3
TWRGNSFDY (서열번호 9)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-35 항체의 VL-CDR1
KSSQSLLNSGNQKNYLT (서열번호 12)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-35 항체의 VL-CDR2
WGSTRVR (서열번호 13)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-35 항체의 VL-CDR3
QNDYTYPFT (서열번호 16)
마우스 및 키메라 18F2-35 항체의 VH
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT SFWLN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTIYNQKFKD KATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTR TWRGNSFDY WGQGTTLTVSS (서열번호 20)
마우스 및 키메라 18F2-35 항체의 VL
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQSLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 53)
인간화된 18F2-35-VH0VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWMG NIYPSTSYTIYNQKFKD RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 36)
인간화된 18F2-35-VH2VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWIG NIYPSTSYTIYNQKFKD RVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 37)
인간화된 18F2-35-VH3VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQAPGQGLEWIG NIYPSTSYTIYNQKFKD RVTLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 38)
인간화된 18F2-35-VH4VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTIYNQKFKD RVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 39)
인간화된 18F2-35-VH5VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIGNIYPSTSYTIYNQKFKDRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 40)
인간화된 18F2-35-VH6VL0, 18F2-35-VH6VL2 및 18F2-35-VH6VL3의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTIYNQKFKD RVTLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 41)
인간화된 18F2-35-VH7VL0, 18F2-35-VH7VL2 및 18F2-35-VH7VL3의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWLN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSTSYTIYNQKFKD KVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR TWRGNSFDY WGQGTTVTVSS (서열번호 42)
인간화된 18F2-35-VH0VL0, 18F2-35-VH2VL0, 18F2-35-VH3VL0, 18F2-35-VH4VL0, 18F2-35-VH5VL0, 18F2-35-VH6VL0, 및 18F2-35-VH7VL0의 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYTYPFT FGQGTKLEIK (서열번호 61)
인간화된 18F2-35-VH6VL2, 및 18F2-35-VH7VL2의 VL
DIVMTQSPSSLTVSLGEKATINC KSSQSLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGQGTKLEIK (서열번호 62)
인간화된 18F2-35-VH6VL3, 및 18F2-35-VH7VL3의 VL
DIVMTQSPSSLTVSLGEKATISC KSSQSLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIY WGSTRVR GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 63)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-66 항체의 VH-CDR1
SFWIN (서열번호 3)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-66 항체의 VH-CDR2
NIYPSASYTVYNQKFKD (서열번호 6)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-66 항체의 VH-CDR3
TWRGNSFDL (서열번호 8)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-66 항체의 VL-CDR1
KSSQSLLNSGNQKNYVT (서열번호 10)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-66 항체의 VL-CDR2
WSSTRSF (서열번호 15)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-66 항체의 VL-CDR3
QNDYTYPFT (서열번호 16)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-66 항체의 VH
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFT SFWIN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSASYTVYNQKFKD KATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTR TWRGNSFDL WGQGTTLTVSS (서열번호 21)
마우스, 키메라 및 인간화된 18F2-66 항체의 VL
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WSSTRSF GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 54)
인간화된 18F2-66-VH0VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWIN WVRQAPGQGLEWMG NIYPSASYTVYNQKFKD RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 43)
인간화된 18F2-66-VH2VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWIN WVRQAPGQGLEWIG NIYPSASYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 44)
인간화된 18F2-66-VH3VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWIN WVRQAPGQGLEWIG NIYPSASYTVYNQKFKD RVTLTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 45)
인간화된 18F2-66-VH4VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWIN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSASYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 46)
인간화된 18F2-66-VH5VL0의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWIN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSASYTVYNQKFKD RVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 47)
인간화된 18F2-66-VH6VL0, 18F2-66-VH6VL2 및 18F2-66-VH6VL3의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWIN WVRQRPGQGLEWIG NIYPSASYTVYNQKFKD RVTLTVDKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCTR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 48)
인간화된 18F2-66-VH7VL2 및 18F2-66-VH7VL3의 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SFWIN WVKQRPGQGLEWIG NIYPSASYTVYNQKFKD KVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR TWRGNSFDL WGQGTTVTVSS (서열번호 49)
인간화된 18F2-66-VH0VL0, 18F2-66-VH2VL0, 18F2-66-VH3VL0, 18F2-66-VH4VL0, 18F2-66-VH5VL0, 및 18F2-66-VH6VL0의 VL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WSSTRSF GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QNDYTYPFT FGQGTKLEIK (서열번호 64)
인간화된 18F2-66-VH6VL2, 및 18F2-66-VH7VL2의 VL
DIVMTQSPSSLTVSLGEKATINC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WSSTRSF GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGQGTKLEIK (서열번호 65)
인간화된 18F2-66-VH6VL3, 및 18F2-66-VH7VL3의 VL
DIVMTQSPSSLTVSLGEKATISC KSSQSLLNSGNQKNYVT WYQQKPGQPPKLLIY WSSTRSF GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYC QNDYTYPFT FGSGTKLEIK (서열번호 66)
본원의 내용은 하나 이상의 구현예와 연계하여 상기에서 기술되었지만, 본원의 내용은 이들 구현예로 제한되지 않으며, 본원의 내용은 첨부된 청구항의 사상 및 범위에 포함될 수 있으므로 모든 대안, 변형 및 등가를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 추가적으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd <120> ANTIBODIES BINDING HUMAN CLAUDIN 18.2 AND USES THEREOF <130> 55566 00016 <150> CN201910043626.3 <151> 2019-01-17 <160> 90 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR1 <400> 1 Ser Phe Trp Val Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR1 <400> 2 Ser Phe Trp Leu Asn 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR3 <400> 3 Ser Phe Trp Ile Asn 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR2 <400> 4 Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR2 <400> 5 Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR2 <400> 6 Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR3 <400> 7 Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp His 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR3 <400> 8 Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV-CDR3 <400> 9 Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV-CDR1 <400> 10 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val 1 5 10 15 Thr <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV-CDR2 <400> 11 Lys Ser Asn Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val 1 5 10 15 Thr <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV-CDR1 <400> 12 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV-CDR2 <400> 13 Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV-CDR2 <400> 14 Trp Gly Ser Thr Arg Ser Thr 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV-CDR2 <400> 15 Trp Ser Ser Thr Arg Ser Phe 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV-CDR3 <400> 16 Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 17 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Leu Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Thr Ser Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 43 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HV <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Ala Ser Tyr Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 51 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Asn Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 52 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Ser Thr Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 53 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 54 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 54 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Ser Phe Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 55 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 55 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 56 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 56 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Asn Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 57 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 57 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Asn Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 58 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 58 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Ser Thr Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 59 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 59 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Ser Thr Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 60 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 60 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Ser Thr Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 61 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 61 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 62 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 62 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 63 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 63 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Thr Arg Val Arg Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 64 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 64 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Ser Phe Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 65 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 65 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Ser Phe Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 66 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV <400> 66 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Ser Phe Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 67 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC <400> 67 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 68 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC <400> 68 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 69 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 atgagcacca ccacctgcca ggtggtggcc ttcctgctga gcatcctggg cctggccggc 60 tgcatcgccg ccaccggcat ggacatgtgg agcacccagg acctgtacga caaccccgtg 120 accagcgtgt tccagtacga gggcctgtgg cgcagctgcg tgcgccagag cagcggcttc 180 accgagtgcc gcccctactt caccatcctg ggcctgcccg ccatgctgca ggccgtgcgc 240 gccctgatga tcgtgggcat cgtgctgggc gccatcggcc tgctggtgag catcttcgcc 300 ctgaagtgca tccgcatcgg cagcatggag gacagcgcca aggccaacat gaccctgacc 360 agcggcatca tgttcatcgt gagcggcctg tgcgccatcg ccggcgtgag cgtgttcgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt ctggatgagc accgccaaca tgtacaccgg catgggcggc 480 atggtgcaga ccgtgcagac ccgctacacc ttcggcgccg ccctgttcgt gggctgggtg 540 gccggcggcc tgaccctgat cggcggcgtg atgatgtgca tcgcctgccg cggcctggcc 600 cccgaggaga ccaactacaa ggccgtgagc taccacgcca gcggccacag cgtggcctac 660 aagcccggcg gcttcaaggc cagcaccggc ttcggcagca acaccaagaa caagaagatc 720 tacgacggcg gcgcccgcac cgaggacgag gtgcagagct accccagcaa gcacgactac 780 gtgtaa 786 <210> 70 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 71 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 atggccgtga ccgcctgcca gggcctgggc ttcgtggtga gcctgatcgg catcgccggc 60 atcatcgccg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccagg acctgtacaa caaccccgtg 120 accgccgtgt tcaactacca gggcctgtgg cgcagctgcg tgcgcgagag cagcggcttc 180 accgagtgcc gcggctactt caccctgctg ggcctgcccg ccatgctgca ggccgtgcgc 240 gccctgatga tcgtgggcat cgtgctgggc gccatcggcc tgctggtgag catcttcgcc 300 ctgaagtgca tccgcatcgg cagcatggag gacagcgcca aggccaacat gaccctgacc 360 agcggcatca tgttcatcgt gagcggcctg tgcgccatcg ccggcgtgag cgtgttcgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt ctggatgagc accgccaaca tgtacaccgg catgggcggc 480 atggtgcaga ccgtgcagac ccgctacacc ttcggcgccg ccctgttcgt gggctgggtg 540 gccggcggcc tgaccctgat cggcggcgtg atgatgtgca tcgcctgccg cggcctggcc 600 cccgaggaga ccaactacaa ggccgtgagc taccacgcca gcggccacag cgtggcctac 660 aagcccggcg gcttcaaggc cagcaccggc ttcggcagca acaccaagaa caagaagatc 720 tacgacggcg gcgcccgcac cgaggacgag gtgcagagct accccagcaa gcacgactac 780 gtgtaa 786 <210> 72 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 73 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 1 <400> 73 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 74 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 2 <400> 74 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 75 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 3 <400> 75 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 76 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 4 <400> 76 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Gln Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 77 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 5 <400> 77 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 78 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 6 <400> 78 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 79 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 7 <400> 79 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 80 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 8 <400> 80 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 81 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 9 <400> 81 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 82 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 10 <400> 82 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Asn Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 83 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 11 <400> 83 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 84 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 12 <400> 84 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 85 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 13 <400> 85 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 86 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 14 <400> 86 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 87 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 15 <400> 87 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 88 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant 16 <400> 88 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 89 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse IgG2a constant region <400> 89 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 145 150 155 160 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 165 170 175 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 180 185 190 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 195 200 205 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 210 215 220 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 245 250 255 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 305 310 315 320 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 90 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse kappa constant region <400> 90 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105

Claims (19)

  1. Claudin 18.2에 결합하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부로서,
    CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 중쇄 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역과 상기 경쇄 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역이 하기 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부:
    (1) 각각 서열번호 1, 4, 7, 10, 13 및 16;
    (2) 각각 서열번호 2, 4, 8, 11, 13 및 16;
    (3) 각각 서열번호 2, 4, 9, 10, 14 및 16;
    (4) 각각 서열번호 2, 5, 9, 12, 13 및 16; 또는
    (5) 각각 서열번호 3, 6, 8, 10, 15 및 16.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역이, (1) 각각 서열번호 17 및 50; (2) 각각 서열번호 18 및 51; (3) 각각 서열번호 19 및 52; (4) 각각 서열번호 20 및 53; (5) 각각 서열번호 21 및 54; (6) 각각 서열번호 22 및 55; (7) 각각 서열번호 23 및 55; (8) 각각 서열번호 24 및 55; (9) 각각 서열번호 25 및 55; (10) 각각 서열번호 26 및 55; (11) 각각 서열번호 27 및 55; (12) 각각 서열번호 27 및 56; (13) 각각 서열번호 27 및 57; (14) 각각 서열번호 28 및 56; (15) 각각 서열번호 28 및 57; (16) 각각 서열번호 29 및 58; (17) 각각 서열번호 30 및 58; (18) 각각 서열번호 31 및 58; (19) 각각 서열번호 32 및 58; (20) 각각 서열번호 33 및 58; (21) 각각 서열번호 34 및 58; (22) 각각 서열번호 34 및 59; (23) 각각 서열번호 34 및 60; (24) 각각 서열번호 35 및 58; (25) 각각 서열번호 35 및 59; (26) 각각 서열번호 35 및 60; (27) 각각 서열번호 36 및 61; (28) 각각 서열번호 37 및 61; (29) 각각 서열번호 38 및 61; (30) 각각 서열번호 39 및 61; (31) 각각 서열번호 40 및 61; (32) 각각 서열번호 41 및 61; (33) 각각 서열번호 41 및 62; (34) 각각 서열번호 41 및 63; (35) 각각 서열번호 42 및 61; (36) 각각 서열번호 42 및 62; (37) 각각 서열번호 42 및 63; (38) 각각 서열번호 43 및 64; (39) 각각 서열번호 44 및 64; (40) 각각 서열번호 45 및 64; (41) 각각 서열번호 46 및 64; (42) 각각 서열번호 47 및 64; (43) 각각 서열번호 48 및 64; (44) 각각 서열번호 48 및 65; (45) 각각 서열번호 48 및 66; (46) 각각 서열번호 49 및 65; 또는 (47) 각각 서열번호 49 및 66에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  5. 제1항에 있어서,
    서열번호 67 또는 89에 대해 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 가진 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 68 또는 90에 대해 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 가진 경쇄 불변 영역을 더 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  6. 제1항에 있어서,
    (a) 인간 Claudin 18.2에 결합하고; (b) Claudin 18.1에 결합하지 않으며; (c) 인간 Claudin 18.2-발현성 세포에 대해 항체 의존적인 세포-매개 세포독성을 유도하고; 및 (d) 인간 Claudin 18.2-발현성 세포에 대해 보체 의존적인 세포독성 활성을 유도하는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  7. 제1항에 있어서,
    IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소형인, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  8. 제1항에 있어서,
    마우스 항체, 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  9. 제1항에 있어서,
    비-푸코실화된 (afucosylated) 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  10. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는, 이중 특이성 분자, 면역접합체, 키메라 항원 수용체, 조작된 T 세포 수용체 또는 종양용해 바이러스 (oncolytic virus).
  11. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주 세포.
  12. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    항-종양제를 더 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    Claudin 18.2 발현과 관련있는 암 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암 질환이 췌장암, 위암, 대장암, 식도암, 간암, 난소암, 폐암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  16. 제14항에 있어서,
    제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합부가 면역자극성 항체, 공동-자극성 항체, 화학치료제, γδT 세포 자극제 및/또는 Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제와 함께 투여되는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 면역자극성 항체가 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM 3 항체, 항-STAT3 항체 및 항-ROR1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 γδT 세포 자극제가 졸레드론산인, 항체 또는 이의 항원-결합부.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 Claudin 18.2 발현의 안정화제 또는 강화제가 (i) 에피루비신, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실, (ii) 에피루비신, 옥살리플라틴 및 카페시타빈, (iii) 에피루비신, 시스플라틴 및 5-플루오로우라실, (iv) 에피루비신, 시스플라틴 및 카페시타빈, 또는 (v) 폴린산, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합부.
KR1020207037154A 2019-01-17 2019-09-12 인간 ClAUDIN 18.2에 결합하는 항체 및 그 용도 KR20210116207A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910043626.3 2019-01-17
CN201910043626.3A CN109762067B (zh) 2019-01-17 2019-01-17 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
PCT/CN2019/105619 WO2020147321A1 (en) 2019-01-17 2019-09-12 Antibodies binding human claudin 18.2 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210116207A true KR20210116207A (ko) 2021-09-27

Family

ID=66452258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207037154A KR20210116207A (ko) 2019-01-17 2019-09-12 인간 ClAUDIN 18.2에 결합하는 항체 및 그 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10421817B1 (ko)
EP (2) EP3683239B1 (ko)
JP (1) JP6927639B2 (ko)
KR (1) KR20210116207A (ko)
CN (2) CN109762067B (ko)
AU (1) AU2019422603B2 (ko)
CA (1) CA3104383C (ko)
WO (1) WO2020147321A1 (ko)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
WO2020160560A2 (en) 2019-02-01 2020-08-06 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Anti-claudin 18 antibodies and methods of use thereof
CN111978403B (zh) * 2019-05-24 2023-08-04 三优生物医药(上海)有限公司 新型cldn18.2结合分子
CN111978402B (zh) * 2019-05-24 2022-06-28 三优生物医药(上海)有限公司 新型cldn18.2结合分子
KR20220012262A (ko) * 2019-05-24 2022-02-03 산유 바이오파마슈티컬스 씨오., 엘티디. 신형 cldn18.2 결합분자
CN114127109B (zh) * 2019-05-30 2022-06-21 山东博安生物技术股份有限公司 靶向Claudin18.2的抗体或嵌合抗原受体
WO2021008463A1 (zh) * 2019-07-12 2021-01-21 明济生物制药（北京）有限公司 Cldn18.2抗体及其用途
MX2022000652A (es) * 2019-07-17 2022-06-02 Univ California Anticuerpos contra claudina 18 y metodos de tratamiento del cancer.
WO2021024020A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
CN112574307B (zh) * 2019-09-29 2023-11-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Claudin18.2抗体及其应用
CN112707965A (zh) * 2019-09-30 2021-04-27 和铂医药(苏州)有限公司 靶向cldn18.2的抗体及其制备方法和应用
WO2021111003A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 SOTIO a.s. Humanized cldn18.2 antibodies
CN114761433A (zh) * 2019-12-11 2022-07-15 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种抗Claudin18.2单克隆抗体、其制备方法及用途
KR20220113728A (ko) * 2019-12-12 2022-08-16 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항 클라우딘 항체 약물 접합체 및 그 의약 용도
WO2021130291A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 SOTIO a.s. Tumor-specific claudin 18.2 antibodies
CA3165585A1 (en) * 2019-12-27 2021-07-01 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Claudin18.2 binding moieties and uses thereof
AU2021204861A1 (en) * 2020-01-03 2022-07-28 Crage Medical Co., Limited Anti-claudin 18.2 antibody and use thereof
CN111440245B (zh) * 2020-04-10 2022-05-24 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司 一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体t淋巴细胞
CN113637082A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 启愈生物技术(上海)有限公司 一种靶向人claudin和人PDL1蛋白的双特异抗体及其应用
WO2021239026A1 (zh) * 2020-05-29 2021-12-02 杭州邦顺制药有限公司 针对Claudin18.2的抗体及其用途
JP2023530003A (ja) * 2020-06-19 2023-07-12 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド 抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体およびその使用
MX2022015966A (es) * 2020-06-23 2023-04-03 Antengene Biologics Ltd Anticuerpos y metodos para tratar enfermedades asociadas a claudina.
CN111777681B (zh) * 2020-07-06 2022-10-11 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种结合紧密连接蛋白-18.2的抗体及其用途
CN113929780A (zh) * 2020-07-13 2022-01-14 北京凯因科技股份有限公司 一种结合密蛋白的用于治疗癌症的人源化抗体
CN111961135B (zh) * 2020-07-13 2022-08-16 北京亦庄国际蛋白药物技术有限公司 一种用于预防或治疗癌症的抗体
CN114222761B (zh) * 2020-07-14 2024-02-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
WO2022037582A1 (zh) * 2020-08-18 2022-02-24 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗cd3和抗cldn-18.2双特异性抗体及其用途
CN114316046A (zh) * 2020-09-29 2022-04-12 北京凯因科技股份有限公司 一种稳定的抗体组合物
EP4222174A1 (en) * 2020-09-30 2023-08-09 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Antibodies targeting human claudin 18.2 and uses thereof
CN114437221B (zh) * 2020-11-05 2023-08-01 北京天广实生物技术股份有限公司 一种癌症检测抗体及其用途
CN112480248B (zh) * 2020-11-24 2023-05-05 三优生物医药(上海)有限公司 与cld18a2特异性结合的分子
EP4251652A1 (en) * 2020-11-27 2023-10-04 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Cldn18.2 antibody and use thereof
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
CN114634566B (zh) * 2020-12-16 2023-09-19 广州百暨基因科技有限公司 一种抗Claudin18_2的抗原结合片段、抗体及其应用
TW202241519A (zh) 2020-12-23 2022-11-01 捷克商舒迪安生物技術公司 腫瘤特異性密連蛋白１８﹒２抗體藥物結合物
CN114805571B (zh) * 2021-01-28 2023-08-25 广西鹭港生物医药科技有限公司 抗cldn18.2抗体及其应用
WO2022166940A1 (en) * 2021-02-08 2022-08-11 Shandong Boan Biotechnology Co., Ltd. Cldn18.2/cd3 bispecific antibodies for the therapy of cldn18.2-expressing solid tumors
CN117460528A (zh) * 2021-02-19 2024-01-26 苏州创胜医药集团有限公司 抗cldn18.2抗体缀合物
TW202304506A (zh) * 2021-03-25 2023-02-01 日商安斯泰來製藥公司 涉及抗claudin 18.2抗體的組合治療以治療癌症
CN113416260B (zh) * 2021-04-14 2022-02-01 南京凯地医疗技术有限公司 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
AU2022275043A1 (en) * 2021-05-08 2023-02-16 Remegen Co., Ltd. Anti-Claudin 18.2 antibody and antibody-drug conjugate thereof
CA3220892A1 (en) * 2021-05-31 2022-12-08 Zhenhua Jia Monoclonal antibodies against cldn18.2 and fc-engineered versions thereof
CN117897403A (zh) * 2021-09-24 2024-04-16 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种抗Claudin18.2抗体及其应用
AU2022350588A1 (en) * 2021-09-27 2024-05-02 Evopoint Biosciences Co., Ltd. Antibody, antibody-drug conjugate thereof and use thereof
WO2023070201A1 (en) * 2021-10-25 2023-05-04 Fusion Pharmaceuticals Inc. Claudin 18.2-binding antibodies and fragments thereof
AR127444A1 (es) * 2021-10-25 2024-01-24 Fusion Pharmaceuticals Inc Compuestos objetivo de claudina 18.2 y sus usos en el tratamiento de cánceres gastroesofágicos
WO2023078386A1 (zh) * 2021-11-05 2023-05-11 正大天晴药业集团股份有限公司 抗cldn18.2抗体及其用途
TW202333785A (zh) * 2021-11-16 2023-09-01 中國大陸商蘇州創勝醫藥集團有限公司 Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２拮抗劑和ｐｄ－１／ｐｄ－ｌ１軸抑制劑的組合療法
CN114507287B (zh) * 2022-04-20 2022-07-05 苏州百道医疗科技有限公司 一种抗cldn18.2重组兔单克隆抗体及其应用
CN114790244B (zh) * 2022-06-07 2023-06-23 任殿明 Dc瘤苗联合单克隆抗体在制备用于癌症治疗的药物组合物中的用途
CN117924501A (zh) * 2022-11-30 2024-04-26 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗cldn18.2的重链抗体、相关产品和用途
CN115947851B (zh) * 2022-12-19 2024-02-13 华润生物医药有限公司 结合cldn18.2的抗体及其用途
CN115969997B (zh) * 2022-12-19 2024-02-13 华润生物医药有限公司 一种靶向cldn18.2的抗体药物偶联物及其应用
CN116284224B (zh) * 2023-05-12 2023-07-25 中国农业大学 一种结合Claudin 18.2的环肽及其应用
CN116751302B (zh) * 2023-08-03 2023-11-10 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 靶向Claudin18.2的抗体、衍生产品及其在肿瘤治疗中的应用
CN116903737B (zh) * 2023-08-30 2023-12-12 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 Claudin-18.2特异性抗体及其应用
CN116903745B (zh) * 2023-09-13 2023-11-14 苏州仁端生物医药科技有限公司 一种抗人Claudin18.2的单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9108652D0 (en) 1991-04-23 1991-06-12 Antisoma Ltd Immunoreactive compounds
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
CA2144043C (en) 1992-09-16 2005-01-18 Dennis R. Burton Human neutralizing monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus
JP3919830B2 (ja) 1992-11-28 2007-05-30 財団法人化学及血清療法研究所 抗ネコヘルペスウイルス−１組換え抗体および該抗体をコードする遺伝子断片
AU1866895A (en) 1994-01-04 1995-08-01 Scripps Research Institute, The Human monoclonal antibodies to herpes simplex virus and methods therefor
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
JP2000508892A (ja) * 1996-04-04 2000-07-18 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ 多価および多特異的抗原結合タンパク
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
CN1325517C (zh) 1998-07-21 2007-07-11 展马博联合股份有限公司 抗丙型肝炎病毒抗体及其用途
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
ES2568899T3 (es) 1999-04-09 2016-05-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US6818216B2 (en) 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
CN101671335A (zh) 2001-05-31 2010-03-17 梅达莱克斯公司 细胞毒素、其有用的前体药物、连接基团和稳定剂
CN100423777C (zh) 2001-10-25 2008-10-08 杰南技术公司 糖蛋白组合物
CN1930288B (zh) 2002-04-09 2012-08-08 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
NZ550934A (en) 2004-05-19 2010-05-28 Medarex Inc Chemical linkers and conjugates thereof
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
NZ560414A (en) 2005-02-18 2011-04-29 Medarex Inc Monoclonal antibodies against prostate specific membrane antigen (PSMA) lacking in fucosyl residues
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
NZ566982A (en) 2005-09-26 2011-06-30 Medarex Inc Duocarmycin drug conjugates
PL1940789T3 (pl) 2005-10-26 2012-04-30 Squibb & Sons Llc Metody i związki do otrzymywania analogów cc-1065
CA2627190A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
EP2121667B1 (en) 2007-02-21 2016-06-08 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
CN101584860A (zh) * 2009-04-27 2009-11-25 西安杰诺瓦生物科技有限公司 重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法
WO2013167153A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
PL2852408T3 (pl) * 2012-05-23 2017-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Terapia skojarzona obejmująca przeciwciała przeciwko Klaudynie 18.2 do leczenia nowotworu
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014127785A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
CN105315375B (zh) * 2014-07-17 2021-04-23 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
WO2016165765A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Methods and compositions for prediction of therapeutic efficacy of cancer treatments and cancer prognosis
WO2016165762A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
CN106084058B (zh) * 2015-07-15 2019-08-27 北京天广实生物技术股份有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体
BR112019000327A8 (pt) * 2016-07-08 2022-10-18 Carsgen Therapeutics Co Ltd Anticorpo para anticlaudina 18a2 e uso do mesmo
US10377833B2 (en) 2016-07-22 2019-08-13 Beijing Mabworks Biotech Co., Ltd. Bispecific anti-HER2 antibody
WO2018054484A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
CN106519034B (zh) * 2016-12-22 2020-09-18 鲁南制药集团股份有限公司 抗pd-1抗体及其用途
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019422603A1 (en) 2021-01-07
WO2020147321A1 (en) 2020-07-23
CN109762067A (zh) 2019-05-17
JP2021509889A (ja) 2021-04-08
CA3104383A1 (en) 2020-07-23
CN109762067B (zh) 2020-02-28
CN112399974A (zh) 2021-02-23
JP6927639B2 (ja) 2021-09-01
AU2019422603B2 (en) 2023-08-31
EP4219558A1 (en) 2023-08-02
EP3683239B1 (en) 2022-12-21
CN112399974B (zh) 2022-08-09
US10421817B1 (en) 2019-09-24
CA3104383C (en) 2023-10-03
EP3683239A1 (en) 2020-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3683239B1 (en) Antibodies binding human claudin 18.2 and uses thereof
US11091558B2 (en) Anti-OX40 antibodies and uses thereof
CN111454364B (zh) 结合cd40的抗体及其用途
KR20180004277A (ko) Pdl-1 항체, 그 약학적 조성물 및 그 용도
US10654937B1 (en) CD40 specific antibodies and uses thereof
US10946092B1 (en) Antibodies binding LAG3 and methods of treatment using them
US10577424B1 (en) Antibodies binding VISTA and uses thereof
KR20220147642A (ko) Il4r에 결합하는 항체 및 이의 용도
KR20210010998A (ko) 항체 결합 피디 1 및 그의 용도
CN115073599B (zh) 结合pd-l1的抗体及其用途
WO2022257279A1 (en) Antibodies binding tigit and uses thereof
CN117917435A (zh) 结合fgfr2b的抗体及其用途
CN116059341A (zh) 药物组合物及用途
CN117186222A (zh) Pd-l1结合分子及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination