CN111855842A

CN111855842A - 一种奥扎格雷钠有关物质的检测方法及应用

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Publication number: CN111855842A
Application number: CN202010620974.5A
Authority: CN
Inventors: 刘松林; 许勇; 范昭泽; 顿伟
Original assignee: Wuhan Jiuzhou Yumin Medical Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Jiuzhou Yumin Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111855842B

Abstract

本发明公开了一种奥扎格雷钠中有关物质的检测方法及应用。本发明提供的一种奥扎格雷钠中有关物质的检测方法，其包含以下步骤：采用色谱法对奥扎格雷钠原料药或制剂中有关物质进行分离检测，即可；其中，所述的有关物质为奥扎格雷杂质A、杂质B和Z‑奥扎格雷中的一种或多种；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶型色谱柱；检测波长：272nm、220nm；以0.3％乙酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B。该奥扎格雷钠的检测方法可实现奥扎格雷钠中杂质有效分离，峰形和分离度情况良好，可以满足奥扎格雷钠中杂质的检出。解决了杂质A、杂质B、Z‑奥扎格雷的定量检测。

Description

一种奥扎格雷钠有关物质的检测方法及应用

技术领域

本发明涉及一种奥扎格雷钠有关物质的检测方法及应用。

背景技术

目前奥扎格雷钠(简称AG)收载于中国药典2015版(二部第1404-1405页)，采用等度洗脱方法检测奥扎格雷钠中的杂质，具体的有关物质检测方法为：使用C18色谱柱以0.3％乙酸铵-甲醇(80：20)为流动相等度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长272nm(参见中国药典2015版，二部第1404-1405页)。

该方案不足之处：

1)样品浓度0.05mg/mL。对于杂质检测来说过低，有些杂质灵敏度达不到；

2)有些潜在杂质无法分离或检出；

3)有些杂质属于低波长，无法检出；

4)无特性杂质(已知杂质)控制，不符合现在杂质研究要求。

依照现行法规要求，药典方法不足以进行奥扎格雷钠中潜在杂质的检出。例如不能检出杂质A，杂质B的检测容易受到干扰，Z-奥扎格雷的检测未计算校正因子不够准确。此外，试验发现在该条件下洗脱30min，奥扎格雷杂质A为末端吸收，不能洗脱起始物料AGSM01、中间体AG01、杂质AG-E等目标杂质。杂质定位溶液采用甲醇作为溶剂，发现杂质峰有前延肩峰现象。

因此，急需对有关物质检测方法进行优化开发一种适合的新的检测方法，以实现对目标杂质的定量检测。满足奥扎格雷钠中杂质的检出。但是，本产品的有关物质是可参考文献很少，涉及杂质比较多，杂质的洗脱性质和吸收情况差异很大，对方法开发带来难度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的奥扎格雷钠有关物质的检测方法不足的缺陷；而提供了一种奥扎格雷钠有关物质的检测方法及应用。该奥扎格雷钠的检测方法可实现奥扎格雷钠中杂质有效分离，峰形和分离度情况良好，可以满足奥扎格雷钠中杂质的检出。解决了杂质A、杂质B、Z-奥扎格雷的定量检测。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的。

本发明提供了一种奥扎格雷钠中有关物质的检测方法，其包含以下步骤：采用色谱法对奥扎格雷钠原料药或制剂中有关物质进行分离检测，即可；其中，所述的有关物质为奥扎格雷杂质A(AG-A)、杂质B(AG-B)、4-溴甲基肉桂酸甲酯(AGSM01)、奥扎格雷甲酯(AG01)、奥扎格雷杂质E(AG-E)和Z-奥扎格雷中的一种或多种；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶型色谱柱；

检测波长：272nm、220nm；

以0.3％乙酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按以下流量梯度进样检测；

在本发明的某一方案中，流动相梯度为

时间min	流动相A％	流动相B％
			0	86	14
4	86	14
			10	55	45
25.5	20	80
			30	20	80
31	86	14
			38	86	14

。

本发明中，所述的检测可为使用检测器进行检测，所述检测器例如DAD和/或UV检测器，再例如DAD和UV检测器。

在本发明的某一方案中，所述的流动相的流速可参考领域色谱法检测分析时的常规流速，例如0.8-1.1mL/min，例如1.0mL/min。

在本发明的某一方案中，柱温为25-35℃；优选28-32℃，例如30℃。

本发明中，所述色谱柱的填料颗粒度可为2.5μm～7.5μm，例如5μm；所述色谱柱的长度可为100mm～250mm，优选150mm；所述的色谱柱的内径可为3mm～5mm，例如4.6mm。

在本发明的某一方案中，所述的色谱柱可为ACE Excel 5C18-PFP(150*4.6mm，5um)或极性相似的色谱柱。

在本发明的某一方案中，供试品溶液为将奥扎格雷供试品，用甲醇-水(1：9)制成每mL约含0.2mg的溶液得到。

本发明中，所述高效液相色谱法的进样量可参考本领域色谱法检测分析的常规进样量，例如5μL～20μL，再例如10-20μL。

在本发明的某一方案中，所述的检测方法可为外标法，所述的外标法以峰面积计算有关物质的含量。

在本发明的某一方案中，奥扎格雷杂质A对照品、杂质B对照品、Z-奥扎格雷对照品、AGSM01对照品、AG01对照品、杂质E对照品、奥扎格雷对照品的对照溶液为将奥扎格雷杂质A对照品、杂质B对照品、Z-奥扎格雷对照品、AGSM01对照品、AG01对照品、杂质E对照品、奥扎格雷对照品，用甲醇-水(1：9)溶解稀释制成杂质A浓度约为1ug/mL、杂质B浓度约为1ug/mL、Z-奥扎格雷浓度约为1ug/mL、AGSM01浓度约为1ug/mL、AG01浓度约为1ug/mL、杂质E浓度约为1ug/mL、奥扎格雷浓度约为1ug/mL的溶液。

本发明还提供了一种所述奥扎格雷钠中有关物质的检测方法在奥扎格雷钠的原料药或制剂中奥扎格雷钠及其有关物质含量检测中的应用；所述的有关物质为奥扎格雷杂质A、杂质B、AGSM01、AG01、杂质E和Z-奥扎格雷中的一种或多种。

术语“原料药”表示由主要药物活性成分，以及含量可控的杂质组成。

术语“制剂”表示由主要药物活性成分，以及含量可控的杂质和/或辅料组成的，根据药典或药品监督部门批准的标准，为满足临床治疗或预防的需要而制备的药物应用形式(剂型)的具体品种。

术语“有关物质”或“杂质”表示任何影响药物纯度的物质。所述杂质按其理化性质一般分为三类：有机杂质、无机杂质及残留溶剂。按照其来源，杂质可以分为工艺杂质(包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等)、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质等。

本发明中，术语“外标法”是指用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的奥扎格雷钠的检测方法可实现奥扎格雷钠中杂质，特别是奥扎格雷杂质A、杂质B、Z-奥扎格雷的有效分离，峰形和分离度情况良好，可以满足奥扎格雷钠中杂质的检出。通过对本方法专属性、准确度、线性和耐用性等方面的考察和验证，结果均符合《中国药典》2015版相关要求。

附图说明

图1为实施例1中Z-奥扎格雷定位色谱图。

图2为实施例1中奥扎格雷定位色谱图。

图3为实施例1中杂质B定位色谱图。

图4为实施例1中杂质A定位色谱图。

图5为实施例2中定量限色谱图。

图6为实施例2中线性(50％浓度水平)色谱图。

图7为实施例2中不加标供试品溶液色谱图。

图8为实施例2中100％加标供试品溶液色谱图。

图9为实施例2中80％加标供试品溶液色谱图。

图10为实施例2中120％加标供试品溶液色谱图。

图11为实施例1中杂质混合液1(220nm波长：1、杂质B，2、杂质A；272nm波长：1、杂质B，2、Z-奥扎格雷，3、奥扎格雷)色谱图。

图12为实施例1中杂质混合液2(220nm波长：1、咪唑；272nm波长：1、奥扎格雷，2、奥扎格雷甲酯(AG01)，3、杂质E)色谱图。

图13为实施例1中AGSM01定位色谱图。

图14为药典方法杂质混合液(2、AG-B(杂质B)，4、Z-奥扎格雷，5、奥扎格雷)色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

样品名称：奥扎格雷钠(来源：山东希尔康泰药业有限公司；批号：191101；含量：以奥扎格雷钠无水物计，含量98.7％)。

化合物名称：奥扎格雷杂质A(来源：Molcoo Chemicals Inc；批号：201801；含量：99.03％)

结构：

简称AG-A

化合物名称：奥扎格雷杂质B(来源：Molcoo Chemicals Inc；批号：201801；含量：97.97％)

结构：

简称AG-B

化合物名称：Z-奥扎格雷(来源：Molcoo Chemicals Inc；批号：201801；含量：99.71％)

结构：

化合物名称：杂质E(来源：SINCO PHARMA CHEM；批号：19-11-2901；含量：99.71％)

结构：

简称：AG-E

化合物名称：4-溴甲基肉桂酸甲酯(来源：Fluorochem Ltd；批号：FCC15608；含量：N/A)

结构：

简称：AGSM01

化合物名称：奥扎格雷甲酯(来源：武汉睿立达生物医药科技有限公司；批号：AG011912011；含量：99.97％)

结构：

简称：AG01

实施例1

取本品适量，用甲醇-水(1：9)制成每mL约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液。精密移取供试品溶液，用甲醇-水(1：9)稀释1000倍，作为对照溶液。取奥扎格雷杂质A对照品、杂质B对照品、Z-奥扎格雷对照品、AGSM01对照品、AG01对照品、杂质E对照品、奥扎格雷对照品适量，用甲醇-水(1：9)溶解稀释制成杂质A浓度约为1ug/mL、杂质B浓度约为1ug/mL、Z-奥扎格雷浓度约为1ug/mL、AGSM01浓度约为1ug/mL、AG01浓度约为1ug/mL、杂质E浓度约为1ug/mL、奥扎格雷浓度约为1ug/mL的溶液，作为系统适用性溶液。

使用ACE Excel 5C18-PFP(150*4.6mm，5um)，柱温30℃，检测波长272nm、220nm。DAD检测器.

以0.3％乙酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按以下流量梯度进样检测，流速：1.0mL/min，进样量20μL。

系统适用性溶液272nm波长下色谱图中，杂质B、Z-奥扎格雷、奥扎格雷依次流出，分离度应不小于1.5；理论塔板数按奥扎格雷峰计应不低于10000；220nm波长下色谱图中，杂质B、杂质A依次流出，分离度应不小于1.5。供试品溶液220nm波长下色谱图中若检出杂质A峰，272nm波长下色谱图中若检出杂质峰，以对照溶液在272nm波长下色谱图中主峰面积为对照峰面积，按加校正因子的自身对照法计，校正因子及杂质限度如下表。

杂质	校正因子f	限度
			杂质A	2.25	0.10％
杂质B	0.98	0.10％
			Z-奥扎格雷	2.06	0.10％
未知单杂	1.00	0.10％
			总杂	-	0.50％

。

该系统还可以洗脱并分离检测“包括AGSM01、杂质01(AG01)、杂质E(AG-E)等在内的杂质。

奥扎格雷的定位色谱如附图2所示。各杂质(杂质A、杂质B、Z-奥扎格雷、AGSM01)的定位色谱分别如附图4、3、1、13所示。各杂质对照品配置的混合液1和2的色谱如附图11、12所示。

实施例2

(1)定量限与检测限

杂质B定量限浓度0.02457ug/mL，相当于样品浓度的0.0123％；检测限浓度0.01229ug/mL，相当于样品浓度的0.0061％。

杂质A定量限浓度0.06144ug/mL，相当于样品浓度的0.0307％；检测限浓度0.03072ug/mL，相当于样品浓度的0.0154％。

Z-奥扎格雷定量限浓度0.03780ug/mL，相当于样品浓度的0.0189％；检测限浓度0.01890ug/mL，相当于样品浓度的0.0094％。

(2)线性与范围

线性储备液：取各储备液混合，用甲醇-水(1：9)稀释制成每1mL约含10ug各组分的溶液，作为的线性储备液。

线性溶液：取线性储备液，用甲醇-水(1：9)稀释制成不同浓度水平的线性溶液。

杂质B在0.02457ug/mL-0.3072ug/mL浓度范围内，浓度与响应信号线性相关。线性方程：y＝1.8659x-0.0030，相关系数r＝1.0000。

杂质A在0.06144ug/mL-0.3072ug/mL浓度范围内，浓度与响应信号线性相关。线性方程：y＝0.8128x-0.0062，相关系数r＝0.9981。

Z-奥扎格雷在0.03780ug/mL-0.3150ug/mL浓度范围内，浓度与响应信号线性相关。线性方程：y＝0.8880x-0.0011，相关系数r＝0.9999。

(3)重复性

3.1溶液配制

100％加标供试品溶液：取供试品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加线性储备液1.0mL，用甲醇-水(1：9)稀释至刻度，摇匀。平行配制6份。

100％加标对照溶液：精密移取100％加标供试品溶液100μL，置100mL量瓶中，用甲醇-水(1：9)稀释至刻度，摇匀。

不加标供试品溶液：取供试品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，用甲醇-水(1：9)稀释至刻度，摇匀。

不加标对照溶液：精密移取不加标供试品溶液100μL，置100mL量瓶中，用甲醇-水(1：9)稀释至刻度，摇匀。

3.2验证程序

按以下表格中的进样顺序进行进样：

待测溶液	进样
		空白溶液	至少1针
不加标供试品溶液	1针
		不加标对照溶液	1针
100％加标供试品溶液	每份进样1针
		100％加标对照溶液	每份进样1针

3.3可接受标准

已知杂质测得结果的RSD应不大于20％。

3.4验证结果

(4)中间精密度

4.1溶液配制

更换试验人员在不同时间按重复性试验要求进行试验。

4.2验证程序

按以下表格中的要求进样：

待测溶液	进样
		空白溶液	至少1针
对照溶液	连续六针
		不加标供试品溶液	1针
不加标对照溶液	1针
		100％加标供试品溶液	每份进样1针
100％加标对照溶液	每份进样1针

4.3可接受标准

已知杂质结果的RSD应不大于30％。

4.4验证结果

指标项目	杂质B	杂质A	Z-奥扎格雷
				结果1	81.1％	81.9％	79.6％
结果2	95.6％	94.5％	95.6％
				结果3	93.8％	87.4％	92.7％
结果4	98.6％	92.3％	97.4％
				结果5	101.7％	104.3％	101.8％
结果6	99.6％	97.3％	96.3％
				重复性结果1	93.3％	87.3％	90.1％
重复性结果2	98.4％	95.0％	96.1％
				重复性结果3	98.1％	92.7％	96.0％
重复性结果4	95.1％	103.5％	94.6％
				重复性结果5	95.0％	85.2％	93.2％
重复性结果6	90.3％	86.3％	89.0％
				RSD	7.7％	5.7％	6.0％

(5)准确度

5.1溶液配制

80％加标供试品溶液：精密移取供试品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加杂质储备液0.8mL，用甲醇-水(1：9)稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。

120％加标供试品溶液：精密移取供试品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加杂质储备液1.2mL，用甲醇-水(1：9)稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。

加标对照溶液：精密移取加标供试品溶液100μL，置100mL量瓶中，用甲醇-水(1：9)稀释至刻度，摇匀。

5.2验证程序

按以下表格中的要求进样：

待测溶液	进样
		空白溶液	至少1针
不加标供试品溶液	进样1针
		不加标对照溶液	进样1针
80％加标供试品溶液	三份各进样1针
		80％加标对照溶液	三份各进样1针
100％加标供试品溶液	三份各进样1针
		100％加标对照溶液	三份各进样1针
120％加标供试品溶液	三份各进样1针
		120％加标对照溶液	三份各进样1针

杂质A、杂质B、Z-奥扎格雷回收率在80％-120％，RSD应不大于10％。

(6)溶液稳定性

溶液配制

配制100％加标供试品溶液及其对照溶液。

验证程序

按以下表格中的要求进样：

待测溶液	进样
		空白溶液	至少1针
加标供试品溶液、对照溶液	每间隔一段时间每份进样1针，至少进样4次

在44h进样，供试品溶液测得结果的变化不大于20％，对照溶液峰面积变化不大于5％。

(7)结论

本方案在给定的分离条件下，在220nm波长下对杂质A进行定量检测，在272nm波长下对杂质B、Z-奥扎格雷进行定量检测，并计算了校正因子，使检测结果更准确。

对比例1改变流动相体系梯度洗脱

使用C18色谱柱，以0.1％磷酸为流动相A，以乙腈为流动相C，按梯度洗脱：

时间min	流动相A％	流动相B％
			0	80	20
10	80	20
			20	30	70
23	30	70
			24	80	20
30	80	20

流速1mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。

主成分奥扎格雷被快速洗脱，在溶剂峰前出峰。

对比例2改变色谱柱使用甲醇体系梯度洗脱

使用色谱柱：ACE Excel 5C18-PFP(150*4.6mm，5um)；以0.3％乙酸铵溶液-甲醇(80：20)为流动相A，以甲醇为流动相C；按以下梯度程序洗脱：

时间min	流动相A％	流动相C％
			0	70	30
11	40	60
			20	25	75
24	20	80
			25	70	30
30	70	30

流速：1ml/min，柱温：30℃，检测波长280nm。

主成分奥扎格雷和杂质AG-B、Z-奥扎格雷被快速洗脱，3min前出峰。

对比例3改变流动相梯度洗脱

使用色谱柱：ACE Excel 5C18-PFP(150*4.6mm，5um)；以0.3％乙酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相C；按以下梯度程序洗脱：

时间min	流动相A％	流动相C％
			0	90	10
2	90	10
			20	20	80
24	20	80
			25	90	10
30	90	10

流速：1mL/min，柱温：30℃，280nm、220nm双波长检测。

280nm波长下色谱图中，AG-B保留时间7.26min、Z-奥扎格雷保留时间9.50min、奥扎格雷保留时间10.25min、AG01保留时间18.74min、AG-E保留时间19.78min、AGSM01保留时间23.04min依次出峰。

咪唑、奥扎格雷杂质A在220nm波长下色谱图中出峰，咪唑保留时间在2.76min附近被溶剂(10％乙腈)峰干扰；奥扎格雷杂质A保留时间7.49min，出峰在由于梯度形成的基线漂移斜坡上且与AG-B峰分离程度不好。

对比例4改变检测波长与流量梯度

奥扎格雷最大吸收波长在272nm，考虑在终产品中以272nm波长检测主要杂质；以220nm辅助检测咪唑、奥扎格雷杂质A等其它杂质。

调节流量梯度：

时间min	流动相A％	流动相C％
			0	90	10
8	90	10
			20	20	80
24	20	80
			25	90	10
30	90	10

220nm波长下色谱图中，奥扎格雷杂质A保留时间9.057min，AG-B保留时间10.107min。

咪唑峰被溶剂峰干扰，考虑更换样品配制溶剂为10％甲醇，基线在咪唑峰保留时间附件轻微波动。

272nm下色谱图中，AG-B保留时间10.107min、Z-奥扎格雷保留时间13.907min、奥扎格雷保留时间14.770min、AG01保留时间20.973min、AG-E保留时间21.580min、AGSM01未出峰。

对比例5按药典方法进行检测

具体如附图14所示。结果显示分离效果差。

杂质B：保留时间3.463min

Z-奥扎格雷：保留时间8.297min

奥扎格雷：保留时间9.417min

杂质A：在该方法检测条件(220nm波长)下无吸收。

奥扎格雷甲酯(AG01)、杂质E在该方法洗脱条件下洗脱30min内不能流出。

Claims

1.一种奥扎格雷钠中有关物质的检测方法，其特征在于，其包含以下步骤：采用色谱法对奥扎格雷钠原料药或制剂中有关物质进行分离检测，即可；其中，所述的有关物质为奥扎格雷杂质A、杂质B、4-溴甲基肉桂酸甲酯、奥扎格雷甲酯、奥扎格雷杂质E和Z-奥扎格雷中的一种或多种；

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶型色谱柱；

检测波长：272nm、220nm；

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相梯度为

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测器例如DAD和/或UV检测器；

和/或，所述的流动相的流速为0.8-1.1mL/min。

4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测器例如DAD和UV检测器；

和/或，所述的流动相的流速为1.0mL/min。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，柱温为25-35℃；

和/或，所述色谱柱的填料颗粒度为2.5μm～7.5μm；

和/或，所述色谱柱的长度为100mm～250mm；

和/或，所述的色谱柱的内径为3mm～5mm。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，柱温为28-32℃；

和/或，所述色谱柱的填料颗粒度为5μm；

和/或，所述色谱柱的长度为150mm；

和/或，所述的色谱柱的内径为4.6mm。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，柱温为30℃；

和/或，所述的色谱柱为ACE Excel 5C18-PFP，150*4.6mm，5um或极性相似的色谱柱。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，供试品溶液为将奥扎格雷供试品，用甲醇-水(1：9)制成每mL约含0.2mg的溶液得到；

和/或，所述高效液相色谱法的进样量为5μL～20μL；

和/或，所述的检测方法为外标法；

和/或，奥扎格雷杂质A对照品、杂质B对照品、Z-奥扎格雷对照品、AGSM01对照品、AG01对照品、杂质E对照品、奥扎格雷对照品的对照溶液为将奥扎格雷杂质A对照品、杂质B对照品、Z-奥扎格雷对照品、AGSM01对照品、AG01对照品、杂质E对照品、奥扎格雷对照品，用甲醇-水(1：9)溶解稀释制成杂质A浓度为1ug/mL、杂质B浓度为1ug/mL、Z-奥扎格雷浓度为1ug/mL、AGSM01浓度为1ug/mL、AG01浓度为1ug/mL、杂质E浓度为1ug/mL、奥扎格雷浓度为1ug/mL的溶液。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的进样量为10μL～20μL；

和/或，所述的检测方法为外标法以峰面积计算有关物质的含量。

10.一种如权利要求1-9中任一项所述的奥扎格雷钠中有关物质的检测方法在奥扎格雷钠的原料药或制剂中奥扎格雷钠及其有关物质含量检测中的应用；所述的有关物质为奥扎格雷杂质A、杂质B、AGSM01、AG01、杂质E和Z-奥扎格雷中的一种或多种。