CN117471014B - 一种奥扎格雷原料药中潜在基因毒性杂质的超高效液相色谱检测方法 - Google Patents
一种奥扎格雷原料药中潜在基因毒性杂质的超高效液相色谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种奥扎格雷原料药中潜在基因毒性杂质的超高效液相色谱检测方法，该方法采用亚乙基桥杂化颗粒填料（Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm）色谱柱，以0.05%甲酸水溶液为流动相A、乙腈为流动相B，本发明中所述基因毒性杂质为奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、（E）‑3‑（4‑醛基苯基）丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10中的一种或多种。本发明的方法灵敏度高、分离度好，可快速、有效地同时检测奥扎格雷原料药中8个潜在基因毒性杂质，对奥扎格雷原料药质量控制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种奥扎格雷中潜在基因毒性杂质同时检测的超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）检测方法。本发明属于药物分析技术领域。
背景技术
奥扎格雷，英文名：Ozagrel，化学名称为：反式-3-[4-(1H-咪唑基-1-甲基)苯基]-2-丙烯酸，结构式为：
奥扎格雷是一种高效、选择性血栓素合成酶抑制剂，能阻碍前列腺素H2(PGH2)生成血栓烷A2(TXA2)，同时促进前列环素(PGI2)的生成，从而调节TXA2与前列腺素PGI2的平衡，具有抗血小板聚集、降低血液粘度、促进血栓分解和扩张血管等作用。在临床上，以奥扎格雷为原料制备的奥扎格雷钠主要用于治疗急性血栓性脑梗死、蛛网膜下腔出血手术后血管痉挛所伴随的运动障碍及其并发脑缺血症状的改善。
在奥扎格雷合成过程中可能会引入一些含有警示结构的基因毒性杂质，这些杂质的存在可能会对人体产生致突变和基因毒性，所以对基因毒性杂质的检测是安全用药的一个重要方面。
目前虽有吉家玉等（专利公开号：CN 113390972 A）关于奥扎格雷有关物质检测方法的专利公开，但此专利申请主要是针对奥扎格雷中常规有关物质的HPLC检测方法，所描述的“有关物质”表示影响药物纯度的物质；本发明中所涉及的杂质属于痕量基因毒性杂质，其本身可直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向，其特点就是在很低浓度时就可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤发生，不仅仅会影响药物纯度，更对人体有着很强的毒性，由于其含量低，在灵敏度较低的常规HPLC上难以达到有效检出。随着药品质量管理体系的不断完善，各国的法规如ICH、FDA、EMA等都对基因毒性杂质有了更明确的要求。
因此，为进一步提高药品质量，保证用药安全，急需开发一种可有效控制奥扎格雷原料药中潜在基因毒性杂质的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种同时检测奥扎格雷中潜在基因毒性杂质的超高效液相色谱分析方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明提供了一种奥扎格雷原料药中潜在基因毒性杂质的超高效液相色谱检测方法，即采用超高效液相色谱法对奥扎格雷原料药中的潜在基因毒性杂质同时进行定性检测或定量分析；其中所述的超高效液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：亚乙基桥杂化颗粒为填料的色谱柱；
柱温：25℃至35℃；
检测波长：283nm至293nm；
流速：0.25 ml/min至0.35ml/ min；
样品室温度：3℃至7℃；
进样体积：1μl至10μl；
流动相：以0.05%v/v甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为B相，进行梯度洗脱，按体积百分含量计，洗脱开始采用85％至95%流动相A，5%至15％流动相B；18~20min为35％流动相A，65％流动相B；22~24min为90％流动相A，10％流动相B。
其中，优选的，所述的潜在基因毒性杂质包括奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10中的一种或多种，优选的，所述的潜在基因毒性杂质包括上述的8种基因毒性杂质，所述的奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10的分子式如下所示：
其中，优选的，所述色谱柱选自亚乙基桥杂化颗粒填料色谱柱Waters ACQUITYUPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm。
其中，优选的，所述检测波长为286nm至290nm，更优选288nm，所述柱温为28℃至32℃，更优选30℃，所述流速为0.28ml/min至0.32ml/min，更优选0.3ml/min，所述进样体积为5μl。
其中，优选的，所述流动相的洗脱梯度为：按体积百分含量计，洗脱开始采用88％至92%流动相A，优选90%流动相A，8％至12%流动相B，更优选10%流动相B。
其中，优选的，所述样品室温度为5℃。
其中，优选的，所述定性检测包括如下步骤：
（1）以体积比15:85的0.3%w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液为空白溶剂，注入超高效液相色谱仪，记录第一色谱图；
（2）以待测奥扎格雷原料药为供试品、以体积比15:85的0.3%w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液为稀释剂，配制成供试品溶液，然后将所述供试品溶液注入所述超高效液相色谱仪，记录第二色谱图；
（3）以所述奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10为8个杂质定性样品，以体积比15:85的0.3%w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液为稀释剂，配制成相应定性溶液，将所述定性溶液注入所述超高效液相色谱仪，记录第三色谱图。
（4）若步骤（2）中所述供试品的所述第二色谱图中出现与步骤（3）中8个杂质定性样品中一个或多个的保留时间一致的色谱峰，则待测样品中含有所述相应的杂质。
其中，优选的，所述定量检测方法包括精密取混合对照品溶液、供试品溶液各5µl，分别注入超高效液相色谱仪，按外标法以峰面积计算。
其中，优选的，所述混合对照品溶液是含有奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10的溶液，所述供试品溶液是含有奥扎格雷原料药的溶液。
在本发明的一个实施例中，得到的奥扎格雷的定位色谱图如附图10所示；奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10的定位色谱图分别如附图2、3、4、5、6、7、8、9所示。
术语“原料药”表示由主要药物活性成分，以及含量可控的杂质组成。
本发明中，术语“外标法”是指用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
采用本发明的检测方法可以快速、有效地同时检测奥扎格雷原料药中一种或多种痕量的潜在基因毒性杂质，具有峰形美观、分离度好、灵敏度高、耐用性好等优点，能够高效的实现奥扎格雷中多种痕量潜在基因毒性杂质的同时定性和定量分析，对奥扎格雷原料药质量控制具有重要意义。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1为实施例1中空白溶剂色谱图；
图2为实施例1中奥扎格雷杂质5定位色谱图；
图3为实施例1中奥扎格雷杂质6定位色谱图；
图4为实施例1中奥扎格雷杂质7定位色谱图；
图5为实施例1中奥扎格雷钠杂质7定位色谱图；
图6为实施例1中奥扎格雷杂质8定位色谱图；
图7为实施例1中（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯定位色谱图；
图8为实施例1中奥扎格雷杂质9定位色谱图；
图9为实施例1中奥扎格雷杂质10定位色谱图；
图10为实施例1中奥扎格雷定位色谱图；
图11为实施例1中混合杂质溶液色谱图；
图12为实施例1中供试品加标溶液色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。
以下实施例涉及的杂质信息如下表1所示：
实施例1奥扎格雷原料药中杂质的定性检测
（1）以体积比15:85的0.3%w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液为空白溶剂，注入超高效液相色谱仪，记录第一色谱图；
（2）供试品溶液：取奥扎格雷原料药20mg，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释剂（体积比15:85的0.3%w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液）溶解并稀释至刻度，制成每1ml约含2mg的溶液。然后将所述供试品溶液注入所述超高效液相色谱仪，记录第二色谱图；
（3）以奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10为定性样品，以体积比15:85的0.3%w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液为稀释剂，配制成每1ml中约含125 ng的相应定性溶液，将所述定性溶液注入所述超高效液相色谱仪，记录第三色谱图。
（4）若步骤（2）中所述供试品的所述第二色谱图中出现与步骤（3）中所述8个杂质对照品中一个或多个的保留时间一致的色谱峰，则待测样品中含有所述相应的杂质。
实施例2奥扎格雷原料药中杂质的定量检测以及专属性与系统适用性
稀释剂：0.3%w/v乙酸铵水溶液-甲醇（15:85）。
对照品贮备液：取奥扎格雷杂质5对照品、奥扎格雷杂质6对照品、奥扎格雷杂质7对照品、奥扎格雷钠杂质7对照品、奥扎格雷杂质8对照品、（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯对照品、奥扎格雷杂质9对照品、奥扎格雷杂质10对照品适量，用乙腈分别溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液。
混合对照品贮备液：精密量取上述各杂质贮备液1ml，置同一20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含50 μg 的溶液；从中精密量取1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含2.5 μg 的溶液。
混合对照品溶液：精密量取0.5ml混合对照品贮备液，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含125 ng 的溶液。
供试品溶液：取奥扎格雷原料药20mg，精密称定，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，制成每1ml约含2mg的溶液。
供试品加标溶液：取奥扎格雷原料药20mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密加入0.5ml混合对照品贮备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
各杂质定位溶液：精密量取各对照品贮备液0.25ml，置不同的25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；再精密量取0.125ml，分别置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含125 ng 的各杂质定位溶液。
使用以亚乙基桥杂化颗粒为填料的色谱柱（Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm），柱温30℃，检测波长288nm。
以0.05%v/v甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为B相，流速为0.3ml/min，进样体积为5μl；样品室温度为5℃；按表2洗脱梯度进行检测：
专属性要求空白溶液、供试品溶液对已知杂质的检测均无干扰；系统适用性要求连续测定5针混合对照品溶液，各杂质保留时间RSD%均小于1.0%，峰面积RSD%均小于10%，各杂质间分离度均大于1.5，理论塔板数均大于3000，拖尾因子均小于2.0。
结果表明，8个杂质峰保留时间RSD%在0.01%~0.06%，均小于1.0%，峰面积RSD%在0.27%~3.57%，均小于10%，各杂质间分离度均大于1.5，理论塔板数均大于3000，拖尾因子均小于2.0，系统适用性良好。验证结果见下表3：
奥扎格雷的定位色谱图如附图10所示。各杂质（奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10）的定位色谱图分别如附图2、3、4、5、6、7、8、9所示。各杂质对照品配制的混合对照品溶液的色谱图如附图11 所示。供试品加标溶液的色谱图如附图12所示。
实施例3检测限
按照实施例2中的方法，在信噪比（S/N）≥3时，各杂质检测限分别为：奥扎格雷杂质5浓度12.801ng/mL，相当于供试品的6.40ppm；奥扎格雷杂质6浓度12.499ng/mL，相当于供试品的6.25ppm；奥扎格雷杂质7浓度12.506ng/mL，相当于供试品的6.25ppm；奥扎格雷钠杂质7浓度12.018ng/mL，相当于供试品的6.01ppm；奥扎格雷杂质8浓度12.696ng/mL，相当于供试品的6.35ppm；（E）-3-（4-醛基苯基）丙烯酸甲酯浓度13.048ng/mL，相当于供试品的6.52ppm；奥扎格雷杂质9浓度13.165ng/mL，相当于供试品的6.58ppm；奥扎格雷杂质10浓度13.301ng/mL，相当于供试品的6.65ppm；各杂质保留时间RSD%在0.02%~0.05%，均小于1.0%，峰面积RSD%在1.39%~12.52%，均小于20%，检测限符合要求。
实施例4重复性
按照实施例2中所述的供试品溶液、供试品加标溶液配制方法配制6份供试品溶液和6份供试品加标溶液；按照实施例2所述的色谱条件进行检测，以外标法计算各杂质含量。结果供试品溶液中均未检出各杂质；供试品加标溶液中各杂质保留时间RSD%在0.03%~0.07%，均小于1.0%，含量RSD%在0.69%~4.96%，均小于30%；重复性符合要求。
实施例5耐用性
按照实施例2中所述的混合对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液的配制方法配制混合对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液，按照实施例2所述的色谱条件，改变起始流动相比例（10%±2%乙腈）、柱温（30±2℃）、流速（0.3±0.02ml/min），其余色谱参数不变，考察系统适用性，测定供试品溶液和供试品加标溶液中各杂质的含量，要求系统适用性应符合要求，供试品溶液及供试品加标溶液中杂质含量测定结果的|变化|值应不大于限度的50%（31.25ppm）。结果表明，各条件下，系统适用性均符合要求，与原条件比，供试品溶液中均未检出各杂质，供试品加标溶液中各杂质含量|变化|值在0.02~4.14ppm，均小于31.25ppm，耐用性结果符合要求。
实施例6溶液稳定性
按照实施例2配制的混合对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液置样品室条件下放置，在59小时内，混合对照品溶液中各杂质峰面积变化值在0.07~18.88%，均小于20%，供试品溶液中均未检出各杂质，供试品加标溶液中各杂质含量变化值在0.05~4.42ppm，均小于31.25ppm，结果表明，各溶液在样品室条件下59小时内可保持稳定。
上述实施例结果证明：本发明一种奥扎格雷中8个潜在基因毒性杂质检测方法，专属性高、重复性好、灵敏度高、耐用性好、分析效率快，为奥扎格雷原料药中一种或多种潜在基因毒性杂质的质量控制提供了有效保障，进一步保障临床用药的安全性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种奥扎格雷原料药中潜在基因毒性杂质的超高效液相色谱检测方法，其特征在于：采用超高效液相色谱法对奥扎格雷原料药中的潜在基因毒性杂质进行定性检测或定量分析；其中所述的超高效液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：亚乙基桥杂化颗粒填料色谱柱WatersACQUITYUPLCBEH C18，2.1×100mm，1.7μm；
柱温：25℃至35℃；
检测波长：283nm至293nm；
流速：0.25ml/min至0.35ml/min；
样品室温度：3℃至7℃；
进样体积：1μl至10μl；
流动相：以0.05％v/v甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为B相，进行梯度洗脱，按体积百分含量计，洗脱开始采用85％至95％流动相A，5％至15％流动相B；18～20min为35％流动相A，65％流动相B；22～24min为90％流动相A，10％流动相B；
所述的潜在基因毒性杂质包括奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、(E)-3-(4-醛基苯基)丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10中的一种或多种，所述的奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、(E)-3-(4-醛基苯基)丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9和奥扎格雷杂质10的分子式如下所示：
奥扎格雷杂质5
奥扎格雷杂质6
奥扎格雷杂质7
奥扎格雷钠杂质7
奥扎格雷杂质8
(E)-3-(4-醛基苯基)丙烯酸甲酯
奥扎格雷杂质9
奥扎格雷杂质10
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测波长为286nm至290nm，所述柱温为28℃至32℃，所述流速为0.28ml/min至0.32ml/min，所述进样体积为5μl；所述流动相的洗脱梯度为：按体积百分含量计，洗脱开始采用88％至92％流动相A，8％至12％流动相B；18～20min为35％流动相A，65％流动相B；22～24min为90％流动相A，10％流动相B。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述检测波长为288nm，所述柱温为30℃，所述流速为0.3ml/min；所述流动相的洗脱梯度为：按体积百分含量计，洗脱开始采用90％流动相A，10％流动相B；18～20min为35％流动相A，65％流动相B；22～24min为90％流动相A，10％流动相B。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样品室温度为5℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述定性检测包括如下步骤：
(1)以体积比15:85的0.3％w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液为空白溶剂，注入超高效液相色谱仪，记录第一色谱图；
(2)以待测奥扎格雷原料药为供试品，以体积比15:85的0.3％w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液为稀释剂，配制成供试品溶液，然后将所述供试品溶液注入所述超高效液相色谱仪，记录第二色谱图；
(3)以权利要求1中所述的奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、(E)-3-(4-醛基苯基)丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9、奥扎格雷杂质10为8个杂质定性样品，以体积比15:85的0.3％w/v乙酸铵水溶液-甲醇溶液为稀释剂，配制成相应定性溶液，将所述定性溶液注入所述超高效液相色谱仪，记录第三色谱图；
(4)若步骤(2)中所述供试品的所述第二色谱图中出现与步骤(3)中8个杂质定性样品中一个或多个的保留时间一致的色谱峰，则待测样品中含有相应的杂质。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定量分析方法包括精密取混合对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入超高效液相色谱仪，按外标法以峰面积计算。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述混合对照品溶液是含有奥扎格雷杂质5、奥扎格雷杂质6、奥扎格雷杂质7、奥扎格雷钠杂质7、奥扎格雷杂质8、(E)-3-(4-醛基苯基)丙烯酸甲酯、奥扎格雷杂质9和奥扎格雷杂质10的溶液，所述供试品溶液是含有奥扎格雷原料药的溶液。
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