CN1113100C - 用于制备抗坏血酸、2－酮－l－古洛糖酸及2－酮－l－古洛糖酸酯的酶促方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于用于制备抗坏血酸、2-酮-L-古洛糖酸及2-酮-L-古洛糖酸酯的有效、高产的方法。该方法包括将合适的起始原料与水解酶催化剂、比如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或酰胺酶反应。

Description

用于制备抗坏血酸、2-酮-L-古洛糖酸及 2-酮-L-古洛糖酸酯的酶促方法
                       发明领域
本发明涉及用于制备抗坏血酸、2-酮(keto)-L-古洛糖酸(KLG)和KLG的酯的方法。更具体地说，本发明涉及酶催化剂在制备抗坏血酸、KLG或KLG的酯中的用途。
                       发明背景
抗坏血酸、又名维生素C是一种必须存在于人类饮食中以预防坏血病并且已经鉴定为可以提高对传染的抗性的试剂的饮食因子。在商业方面，抗坏血酸例如用作营养添加物、固色剂、肉类和其它食品中的调味剂和防腐剂、面包生面团中的氧化剂、收获中的柑橘类水果的切除(abscission)以及分析化学中的还原剂。
一种用于制备抗坏血酸的通用方法使用了原始Reichstein-Grossner合成的改进方法(Reichstein等，Helv.Chim.Acta，17：311(1934)；Reichstein的美国专利2,301,811；本文中所引用的所有文献逐一插入本文仅供参考)。在该方法中把葡萄糖源转化成抗坏血酸。在转化过程中生成了KLG的双丙酮化合物的中间体。
有几种两阶段方法用于制备抗坏血酸。在第一阶段中，通过发酵方法将葡萄糖或者转化为分离了的KLG的中间体(Sonoyama等，应用与环境微生物学，43：1064-1069(1982)；Anderson等，科学，230：144-149(1985)；Shinjoh等，应用与环境微生物学，61：413-420(1995))或者转化为Reichstein-Grossner合成的中间体、即KLG的双丙酮化合物。
把上述两种中间体之一转化为抗坏血酸的第二阶段是通过两条已经报道的路线中的一条路线进行的。第一条路线、即Reichstein-Grossner合成的后继步骤的改进需要多个步骤，由此在强酸条件下使中间体与甲醇发生酯化以生成甲基-2-酮-L-古洛糖酸(MeKLG)。然后使MeKLG与碱反应以生成金属抗坏血酸盐。最后，用酸化剂处理金属抗坏血酸盐以得到抗坏血酸。第二条路线为一步法，该方法包括如最初在Reichstein的英国专利466548中公开、随后由Yamazaki改进(Yamazaki，日本农业化学协会杂志，28：890-894(1954)与化学文摘，50：5992d)并且再由Yodice改进(WO 87/00839)的酸催化KLG的成环。Yodice的方法在商业上不受欢迎，因为它使用了大量的气态氯化氢、需要非常昂贵的加工设备并且生产出需要进一步纯化的抗坏血酸产品。
脂肪酶、即一组水解酶已经成功地用于一些有机酸酯的合成中。具体说来，脂肪酶已经用于其中的酯化剂为不可逆的醇的酯基转移作用，比如当醋酸乙烯酯用作酯化剂时(Thiel，今日催化，517-536(1994))。Gutman等(四面体通讯，28：3861-3864(1987))描述了一种使用猪胰脂肪酶作为催化剂由γ-羟甲基酯制备简单的5-元环内酯的方法。但是，Gutman等(四面体通讯，28：5367-5368(1987))随后报道了用δ-羟甲基酯代替γ-羟甲基酯并且使用同样的催化剂仅生产出聚合物。在Sakashita等的EP 0 515 694 A1中，抗坏血酸酯的合成(在伯羟基上进行酰化)包括在有脂肪酶存在的条件下在极性有机溶剂中使抗坏血酸与多种脂肪酸的活性酯(即脂肪酸乙烯酯)反应。
因此，在现有技术中需要有生产下列物质的方法：(a)由KLG或KLG的酯生产抗坏血酸或其金属盐，(b)由KLG的酯生产KLG和(c)由KLG生产KLG的酯，所述方法具有高产率和高纯度、极少或者没有副产物产生并且在温和的条件下进行。因此，本发明主要的目的在于提供上述方法。
                         发明概述
本发明公开了在化学和生物学领域中的进步，其中用于制备抗坏血酸的方法包括使KLG或KLG的酯与水解酶催化剂接触。
在本发明的另一个实施方案中，用于生产KLG的方法包括在水溶液中使KLG的酯与水解酶催化剂接触。
在本发明的再一个实施方案中，用于由KLG生产KLG酯的方法包括使KLG的醇溶液与水解酶催化剂接触。醇溶液含有与将要制得的KLG酯的烷基部分相对应的醇。
在本发明的再一个实施方案中，用于由KLG的酯生产KLG的酯的方法包括使第一种KLG酯的醇溶液与水解酶催化剂接触。该醇溶液含有与将要制得的第二种KLG酯的烷基部分相对应的醇。
                      发明详述
本发明的目的在于出乎意料地发现使用水解酶作为催化剂通过诱导KLG或KLG酯的闭环，可以由KLG、或者更优选地可以由KLG的酯生成抗坏血酸。可以在熔化状态或者在溶液中进行用于生产抗坏血酸的方法。该方法也可以在体内或在体外进行。对体内方法而言，水解酶催化剂可以天然存在于宿主细胞中或者可以通过重组DNA方法引入到宿主细胞或者生物体中。
本发明的目的还在于出乎意料地发现KLG可以在可逆反应中通过在水溶液中使用水解酶作为催化剂使KLG的酯发生反应来制备。此外，本发明的目的在于出乎意料地发现KLG的酯可以通过使用水解酶作为催化剂在醇溶液中使KLG或另一种KLG的酯发生反应来制备。用于制备上述溶液的醇对应于将要制得的KLG的酯的烷基部分。
在本发明的方法中用作催化剂的水解酶可以从任何来源适宜的生物体中得到或者分离出来。其中包括的实例有、但却不限于植物、微生物以及动物，比如酵母、细菌、霉菌、真菌、鸟类、爬行动物、鱼类和哺乳动物。正如在酶命名(学术出版社，1992)中规定的那样，对本发明而言的水解酶通常被定义为E.C.3.-.-.-的酶类，并且这些酶可以通过商业途径得到。
优选的水解酶为那些能够影响含有羰基或者磷酸基团的分子水解的酶。更具体地说，优选的水解酶为能够影响在含有一个杂原子单键的羰基碳上发生水解的酶。这些含有一个杂原子单键的羰基碳的实例包括、但却不限于酯、硫酯、酰胺、酸、酰基卤及类似物。优选的水解酶包括E.C.3.1.-.-的酶类，它包括作用于酯键的水解酶、比如酯酶和脂肪酶；E.C.3.2-.-的酶类，它包括糖苷酶；E.C.3.4-.-的酶类，它包括肽的水解酶，比如蛋白酶；以及E.C.3.5.-.-的酶类，它包括作用于除肽键以外的键的酰胺酶。最优选的水解酶包括蛋白酶、酰胺酶、脂肪酶和酯酶。
最优选的水解酶含有活性位点的丝氨酸残基，它能够与KLG或KLG的酯进行酯化或者酯基转移作用。甚至更为优选的为那些含有丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的催化三联体的水解酶。
优选的蛋白酶包括那些来源于芽胞杆菌属或曲霉属细菌的蛋白酶。特别优选的蛋白酶为那些从地衣形芽胞杆菌细菌中得到的蛋白酶。优选的蛋白酶为那些与枯草蛋白酶之间至少具有70％的序列同源性的蛋白酶。与枯草蛋白酶具有序列同源性的蛋白酶用于洗涤剂工业中，因此可以方便地得到。更优选的为与枯草蛋白酶之间至少具有80％序列同源性的蛋白酶，甚至更为优选的为与枯草蛋白酶之间至少具有90％序列同源性的蛋白酶，特别是与枯草蛋白酶之间至少具有95％序列同源性的蛋白酶。一种非常优选的蛋白酶为枯草蛋白酶自身，它具有由Smith等在《生物化学杂志》243：2184-2191(1968)中所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)并且如下所示：
MMRKKSFWLG MLTAFMLVFT MAFSDSASAA QPAKNVEKDY
IVGFKSGVKT ASVKKDIIKE SGGKVDKQFR IINAAKAKLD
KEALKEVKND PDVAYVEEDH VAHALAQTVP YGIPLIKADK
VQAQGFKGAN VKVAVLDTGI QASHPDLNVV GGASFVAGEA
YNTDGNGHGT HVAGTVAALD NTTGVLGVAP SVSLYAVKVL
NSSGSGTYSG IVSGIEWATT NGMDVINMSL GGPSGSTAMK
QAVDNAYARG VVVVAAAGNS GSSGNTNTIG YPAKYDSVIA
VGAVDSNSNR ASFSSVGAEL EVMAPGAGVY STYPTSTYAT
LNGTSMASPH VAGAAALILS KHPNLSASQV RNRLSSTATY
LGSSFYYGKG LINVEAAAQ.
为了方便读者，表1提供了以上以及在本说明书其余部分中使用的氨基酸简写形式的一览表。
                       表1氨基酸符号              三字母缩写       一字母丙氨酸                    Ala               A精氨酸                    Arg               R天冬酰胺                  Asn               N天冬氨酸                  Asp               D半胱氨酸                  Cys               C谷氨酰胺                  Gln               Q谷氨酸                    Glu               E甘氨酸                    Gly               G组氨酸                    His               H异亮氨酸                  Ile               I亮氨酸                    Leu               L赖氨酸                    Lys               K甲硫氨酸                  Met               M苯丙氨酸                  Phe               F脯氨酸                    Pro               P丝氨酸                    Ser               S苏氨酸                    Thr               T色氨酸                    Trp               W酪氨酸                    Tyr               Y缬氨酸                    Val               V
另外也包括在本发明范围之内的为与以上所示序列的对1至6个位点具有特异性的突变体、序列添加以及序列缺失相对应的蛋白酶。甚至更优选的为对应于以上所示枯草蛋白酶序列的对0至2个位点具有特异性的突变体的蛋白酶。
适用于本发明的酯酶包括那些由猪肝提取物中得到的酶。优选的酯酶为那些与猪肝酯酶之间至少具有70％序列同源性的酯酶，所述的猪肝酯酶具有由Matsushima等在《FEBS Lett.》293：37(1991)中所述的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)并且如下所示：MWLLPLVLTS    LASSATWAGQ    PASPPVVDTA    QGRVLGKYVSLEGLAFTQPV    AVFLGVPFAK    PPLGSLRFAP    PQPAEPWSFVKNTTSYPPMC    CQDPVVEQMT    SDLFTNFTGK    ERLTLEFSEDCLYLNIYTPA    DLTKRGRLPV    MVWIHGGGLV    LGGAPMYDGVVLAAHENFTV    VVVAIQYRLG    IWGFFSTGDE    HSRGNWGHLDQVAALHWVQE    NIANFGGDPG    SVTIFGESFT    AGGESVSVLVLSPLAKNLFH    RAISESGVAL    TVALVRKDMK    AAAKQIAVLAGCKTTTSAVF    TFVHCLRQKS    EDELLDLTLK    MKFLTLDFHGDQRESHPFLP    TVVDGVLLPK    MPEEILAEKD    FTFNTVPYIVGINKQEFGWL    LPTMMGFPLS    EGKLDQKTAT    SLLWKSYPIANIPEELTPVA    TFTDKYLGGT    DDPVKKKDLF    LDLMGDVVFGVPSVTVARQH    RDAGAPTYMY    EFQYRPSFSS    DKFTKPKTVIGDHGDEIFSV    FGFPLLKGDA    PEEEVSLSKT    VMKFWANFARSGNPNGEGLP    HWPFTMYDQE    EGYLQIGVNT    QAAKRLKGEEVAFWNDLLSK    EAAKKPPKIK    HAEL.
酯酶更优选与以上所示的猪肝酯酶的序列之间至少具有80％的序列同源性、甚至更优选至少有90％的序列同源性、特别优选至少有95％的序列同源性。非常优选的为具有以上所示序列的猪肝酯酶。
另外也包括在本发明范围之内的为与以上所示序列的对1至6个位点具有特异性的突变体、序列添加以及序列缺失相对应的酯酶。甚至更优选的为对应于以上所示猪肝酯酶序列的对0至2个位点具有特异性的突变体的酯酶。
优选的脂肪酶包括那些从猪和其它哺乳动物。微生物以及植物中分离出来的酶。这包括、但却不限于从曲霉属、毛霉菌属、假丝酵母属、假单胞菌属、腐质霉属、根霉属、色杆菌属、产碱杆菌属、地霉属和青霉属得到的脂肪酶。优选的脂肪酶也包括胞外脂肪酶、比如角质酶(cutinase)。更优选的脂肪酶与南极洲假丝酵母(CandidaAntartica)B型脂肪酶之间至少具有70％的序列同源性、甚至更优选至少具有80％的序列同源性、愈加更优选至少具有90％的序列同源性、甚至更优选至少具有95％的序列同源性。一种非常优选的脂肪酶为南极洲假丝酵母B型脂肪酶自身，它具有由Uppenberg等在《结构》2：293，453(1994)中所述的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)并且如下所示：
MKLLSLTGVA    GVLATCVAAT    PLVKRLPSGS    DPAFSQPKSV
LDAGLTCQGA    SPSSVSKPIL    LVPGTGTTGP    QSFDSNWIPL
STQLGYTPCW    ISPPPFMLND    TQVNTEYMVN    AITALYAGSG
NNKLPVLTWS    QGGLVAQWGL    TFFPSIRSKV    DRLMAFAPDY
KGTVLAGPLD    ALAVSAPSVW    QQTTGSALTT    ALRNAGGLTQ
IVPTTNLYSA    TDEIVQPQVS    NSPLDSSYLF    NGKNVQAQAV
CGPLFVIDHA    GSLTSQFSYV    VGRSALRSTT    GQARSADYGI
TDCNPLPAND    LTPEQKVAAA    ALLAPAAAAI    VAGPKQNCEP
DLMPYARPFA    VGKRTCSGIV    TP.
另外也包括在本发明范围之内的为与以上所示序列的对1至6个位点具有特异性的突变体、序列添加以及序列缺失相对应的脂肪酶。甚至更优选的为对应于以上所示B型南极洲假丝酵母序列的对0至2个位点具有特异性的突变体的脂肪酶。
优选的酰胺酶包括那些从青霉菌属的细菌中分离出来的酰胺酶。更优选的酰胺酶与青霉素酰基转移酶之间至少具有80％的序列同源性。特别优选的酰胺酶为青霉素酰基转移酶，它也称作青霉素酰胺水解酶E.C.3.5.1.11(Duggleby等，自然，373：264-266(1995))。
对于在其活性位点上含有丝氨酸的水解酶来说，人们认为在KLG或KLG酯的反应中的第一步涉及通过由活性位点丝氨酸的KLG的酰化形成了KLG-酶酯。人们认为分子内的闭环生成了抗坏血酸(或其盐)，而醇解则生成了KLG的酯、水解则生成了KLG。
本发明的方法包括将KLG或者KLG的酯与水解酶接触以生成抗坏血酸。优选地，该反应是在有机溶剂系统、水溶剂系统或其混合物的条件下进行的。有机溶剂优选为C1-C6的醇。水溶剂系统或者水和有机溶剂混合的系统更为优选，这是因为抗坏血酸、KLG以及KLG的酯通常更易溶于水溶剂系统中。对于在体外从KLG的酯生产抗坏血酸而言，优选水和有机溶剂混合的系统或者有机溶剂系统以便使能够生产出副产物KLG的竞争水解反应降到最低的程度。当使用完整细胞系统在体内生产抗坏血酸时，特别优选水溶剂系统。
在本发明的一个方面，抗坏血酸是由KLG或KLG的酯在有水解酶催化剂存在下，在体内在完整细胞以及完整生物体生产系统中生成的。在一个具体实施方案中，水解酶是由宿主生物体天然产生的。在另一个具体实施方案中，水解酶是通过重组DNA技术由宿主生物体产生的。例如，将编码水解酶的基因序列插入宿主生物体中，其中所述的宿主生物体可以是能够表达水解酶的微生物、植物或动物。培养产生水解酶的宿主生物体、即在有KLG或KLG的酯存在的情况下提供适于生长的营养和合适的环境以生产出抗坏血酸。优选的宿主生物体为柠檬泛菌(Pantoea Citrea)，以前在如Anderson等的美国专利5,008,193中所公开的将其称为草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)。
另外优选的宿主生物体为一种除了生产水解酶之外还生产KLG的生物体。具有代表性的生物体为来自泛菌属或葡糖杆菌属的生物体、比如Shinjoh等在《应用与环境微生物学》61：413-420(1995)中公开的生物体，以及如Sonoyama等在《应用与环境微生物学》43：1064-1069(1982)中公开的棒状杆菌属的生物体。
正如本文所使用的那样，重组DNA技术包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内重组/遗传重组，并且该技术在现有技术中是众所周知的。例如可以参阅在下列文献中所述的技术：Maniatis等，《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室，纽约(1989)；Ausubel等，《分子生物学通用实验方案》，Greene出版协会与WileyInterscience，纽约(1989)；Anderson等，《科学》，230：144-149(1985)；以及Estell等的美国专利5,441,882。
为了从KLG的酯制备KLG，使KLG的酯的水溶液与水解酶反应。在制备KLG中可以使用助溶剂并且优选C-C6的醇。
为了从KLG或者从KLG的其它酯制备KLG的酯，将起始原料溶于醇溶液中，其中的醇对应于将要制得的KLG的酯的烷基部分。从中可以得到优选的KLG酯的醇ROH的烷基部分R可以选自支链或直链的、饱和或不饱和的烷基、芳烷基、芳基以及取代的芳基。优选的R基团包括C1至C6的直链或支链的、饱和或不饱和的烷基。针对烷基部分衍生的甚至更优选的KLG的酯包括MeKLG、乙基-KLG、正丙基-KLG、异丙基-KLG、正丁基-KLG、异丁基-KLG、t-丁基-KLG以及正戊基-KLG。生成的最优选的KLG的酯为MeKLG、这是因为它可以很方便地进行生产，以及丁基-KLG、这是由于在除去水分时可以便利地使用丁醇水的共沸物。在制备KLG的酯的过程中可以使用助溶剂并且优选水、C1-C6的醇或其混合物。
用于进行本发明的反应的优选温度为5℃至120℃。甚至更优选的温度为25℃至100℃，并且特别优选的温度为38℃至80℃。
用于本发明的方法的优选pH介于1.5和10之间，并且更优选的pH介于3和10之间。为了从KLG的酯制备抗坏血酸盐，特别优选的pH范围在6和10之间。为了制备呈游离酸形式的抗坏血酸，优选的pH在抗坏血酸的pKa下，并且更优选在4.2下。为了从KLG的酯制备KLG，特别优选的pH范围介于5和10之间，这是因为在该pH范围内通常能提高酶协助的水解的速率。另一方面，为了生成呈质子化形式的KLG，介于1.5和2.5之间的pH尤其合乎要求。最后，为了从KLG制备KLG的酯，特别优选的pH范围介于3和6之间。
每种水解酶都具有最适温度、最适pH以及与活性有关的pH和温度范围。因此对给定的水解酶而言，适宜的pH和温度范围为可以为水解酶的活性创造条件并且避免使水解酶变性或失活的条件。对于可以发生变性的条件而言、比如高温或者使用变性溶剂(如甲醇或者类似物)，可以要求进行最小量的测试以限定那些在一系列给定的条件下仍保持活性的水解酶。
下面的实施例是通过解释的方式提供的，并且这些实施例不打算限制所要求保护的本发明的范围。
                        实施例
在质子模式为300MHZ和碳模式为75MHZ下操作的Varian Gemini300NMR仪上记录质子和碳核磁共振(NMR)光谱。除非另作说明的以外，所有的NMR光谱都以0百万分率(ppm)的四甲基硅烷(TMS)为基准并且以ppm记录峰的频率。使用紫外(UV)检测进行HPLC(高效液相层析)的分析。使用Fisons VG分析有限公司的Autospec质谱仪在FD(场解吸)模式下得到质谱(MS)。
在本实验中使用的KLG是根据Lazarus等、Anderson等在《科学》230：144-149(1985)中的方法通过发酵得到的，并且通过浓缩和结晶进行纯化。另外，KLG也可以根据本领域中众所周知的方法通过化学转化由L-山梨糖制得(例如参见Reichstein的美国专利2,301,811)。甲基-2-酮-L-古洛糖酸的标准品可以从Aldrich化学公司(稀有和特殊化学药品目录)买到，另外可以通过如下所述的与用于制备丁基-KLG的方法类似的方法由KLG的酯化来制备。
水解酶样品是从商业来源得到的，包括Sigma化学公司、AltusBiologics、重组生物催化公司、Boehringer Mannheim、NovoNordisk、Genencor国际公司、Thermogen和Fluka。实施例1
本实施例描述了丁基2-酮-L-古洛糖酸的制备和纯化。
在氩气环境中将KLG水合物(51.62g)装入一个500ml的反应容器中。该反应器配备有一个连接到迪安-斯达克榻分水器上的30.48cm(12”)的维格罗分馏柱。然后向反应器中装入正丁醇(310g)和对甲苯磺酸(2.3g)。在适度真空的条件下[大约19.95kPa(150mmHg)]在搅拌下使反应混合物回流(81-82℃)。持续回流共计2小时40分钟。不再继续加热。使反应冷却并在室温下保持大约3天。得到的晶体通过粗多孔玻璃过滤器过滤并用两份正丁醇(139g、随后为37g)洗涤。将得到的固体(24.4g)溶解在热的醋酸乙酯(250ml)中，并在室温下通过静置过夜进行重结晶。通过过滤分离出重结晶的丁基-KLG并在真空下[0.1995kPa(1.5mmHg)]干燥至恒重(15.97g)来实现。
人们发现如此制得的丁基-KLG在水中具有至少50％重量百分数的溶解度，因为在50％重量百分数的情况下在所有的浓度下它都可以溶解在水中。本实施例重结晶的丁基-KLG具有令人满意的质子和碳NMR光谱并且通过场解吸质谱测定给出了预测的分子量。
1H NMR(DMSO，数字式分辨率＝0.11Hz，在半高度下的TMS＝0.5Hz)：6.49(OH，d，J＝1.4Hz)，4.96(OH，d，J＝5.0Hz)，4.84(OH，d，J＝4.8Hz)，4.78(OH，d，J＝7.4Hz)，4.17-4.0(m，2H)，3.5-3.2(m，约为5H)，1.64-1.5(m，2H)，1.4-1.35(m，2H)，0.89(CH3，t，J＝7.3)。
13C NMR(DMSO，去偶的)：169.4，96.3，73.8，72.8，69.8，64.5，62.8，30.0，18.4，13.5.
FDMS：M＝250实施例2
以下的方法用于说明在具体的pH和水溶剂组合物条件下酶的活性。
如下进行起始酶的筛选。把酶(一般为10mg)、水性缓冲溶液(一般为860微升(ul)或550ul)、0.2M CaCl2水溶液(10ul)、甲醇(一般为90ul或400ul)和底物的水溶液(一般为90ul的丁基-KLG、其常用的浓度为110,000ppm)加入2ml聚丙烯离心管中。把得到的溶液简短地旋转一下并放置在300rpm、38℃下的水浴摇床中(通常处理18小时或者更长的时间)。在温育后，将样品在14,000G’s(14,000倍的重力)下离心20分钟以除去酶、取样(300ul)并用蒸馏水稀释到1毫升。如果不在当天用HPLC进行分析的话，在分析前冷冻样品。
在下面的表2中总结的是在丁基-KLG(BuKLG)与多种水解酶在水/甲醇溶液中反应时的产物(以及残留底物)的HPLC数据。这些数据是以KLG、MeKLG、抗坏血酸(ASA)和丁基-KLG的百万分率报道的。报道值为0(零)表明存在的物质的量低于仪器的检测阈值。在给定的试验中，标记为“无酶”的样品为对照物。这些对照物含有底物、但却不含酶，因而可以代表实验和HPLC的本底数据。
                         表2
         针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
       (38℃处理41小时/38％甲醇-水/0.1MES缓冲溶液)酶                         测量的，KLG   MeKLG   ASA   BuKLG
                       pH                           (ppm)ESL-001-01                  5.8    1180   2352   766    4603ESL-001-02                  5.6    704    1084   302    7736ESL-001-03                  5.7    386    527    257    8931ESL-001-04                  5.8    550    752    833    6229ESL-001-05                  5.9    456    684    469    7942ESL-001-06                  5.6    547    661    129    8896ESL-001-07                  5.7    311    755    489    6540无酶                               108    325    33     10177无酶    (重复)                     107    303    0      9459无酶                               117    327    42     9878无酶    (重复)                     103    269    2      8593无酶                               116    322    0      9473
表2说明由重组生物催化公司提供的水解酶(ESL-001-01至ESL-001-07)显示出在用吗啉代乙磺酸(MES)半钠盐缓冲的、将pH控制在5.5与6之间的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化为抗坏血酸、MeKLG和KLG。这些水解酶为通过商业途径由重组生物催化公司销售的重组酯酶以及来自嗜热生物体、商品名为CloneZyme(商标)的脂肪酶。
实施例3
下面的表3说明多种酰基转移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH为4.8至5.8的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。标明为ChiroClec(商标)的酶为可以通过商业途径从Altus Biologics购得的结晶状的交联酶。ChiroClec-CR为来自皱摺假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶，ChiroClec-BL为枯草蛋白酶(一种蛋白酶)的结晶形式，而ChiroClec-PC为来自葱头假单胞菌(Pseudomonas Cepacia)的脂肪酶。南极洲假丝酵母B(Candida Antartica)(一种脂肪酶)、猪肝酯酶(一种水解酶)和芽胞杆菌属物种的蛋白酶均显示出特别高水平的活性。
                            表3
           针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
      (38℃处理16小时/38％甲醇-水/0.1M MES缓冲溶液)酶                                测量的   KLG   MeKLG   ASA   BuKLG
                               pH                          (ppm)猪肝酯酶                           5.3     446    4377    294   5711葱头假单胞菌脂肪酶                 5.3     98     295     65    11355猪胰脂肪酶                         5.4     81     316     49    10709皱摺假丝酵母脂肪酶                 5.7     122    197     130   10689α-胰凝乳蛋白酶                    4.9     57     152     20    11174青霉素酰基转移酶                   5.6     83     1307    15    12007黑色曲霉脂肪酶                     5.7     302    541     55    12290无酶                               5.1     88     210     5     10393无酶                               5.1     87     199     1     11553南极洲假丝酵母‘A’脂肪酶
                               5.4     88     242     37    10670解脂假丝酵母脂肪酶
                               5.3     91     92      5     11604南极洲假丝酵母‘B’脂肪酶Humicola lanuginosa脂肪酶          4.8     2915   6807    0     0芽胞杆菌属物种的蛋白酶             5       63     90      6     10191无酶                               4.8     2587   5386    9     1251ChiroCLEC-CR(干燥的)               5.2     94     194     1     11552ChiroCLEC-BL(干燥的)               5.1     113    222     2     10988ChiroCLEC-PC(葱头假单胞菌)         5.4     194    642     3     5123
                               5.7     147    566     1     10471德列马根霉脂肪酶雪白根霉脂肪酶                     5.5     51     99      1     7392米根霉脂肪酶                       5.1     80     252     17    10453粘稠色杆菌脂肪酶                   5.5     58     172     5     10873白地霉脂肪酶                       5.5     433    187     1     10843爪哇毛霉脂肪酶米曲霉蛋白酶                       5       33     407     7     10000Amano-脂肪酶                       5.5     33     167     97    9950PS30(假单胞菌属)                   5.8     289    781     96    7429Amano-脂肪酶AK                     5.3     56     300     49    9143(假单胞菌属)
                               5.6     74     167     93    11372实施例4
下面的表4说明多种酰基转移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH为5至5.8的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。猪肝酯酶、枯草蛋白酶Carlsberg(一种蛋白酶)、芽胞杆菌属物种的蛋白酶、ChiroClec-BL与南极洲假丝酵母B脂肪酶均显示出特别高水平的活性。
                          表4
              针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
          (38℃处理47.5小时/38％甲醇-水/0.1M MES缓冲溶液)酶                              测量的     KLG    MeKLG   ASA   BuKLG
                             pH                             (ppm)猪肝酯酶                         5.3       705     2720   246    1368葱头假单胞菌脂肪酶               5.5       77      288    46     6222猪胰脂肪酶                       5.4       229     613    222    10899皱摺假丝酵母脂肪酶               5.8       104     205    155    5417α-胰凝乳蛋白酶                  5.1       82      248    54     6092青霉素酰基转移酶                 5.8       100     1607   30     6192黑色曲霉脂肪酶                   5.3       214     391    29     6470米赫毛霉脂肪酶                   5.6       54      189    108    7041ChiroCLEC-CR                     5.5       115     218    99     3769枯草蛋白酶Carlsberg              5.1       3072    47     0      0南极洲假丝酶母A                  5.4       166     316    35     5943解脂假丝酵母脂肪酶               5.7       150     166    0      6445南极洲假丝酵母B                  5.3       2210    3520   60     0Humicola lanuginosa脂肪酶
                             5.2       129     241    42     8017芽胞杆菌属物种的蛋白酶
                             5.3       3722    1940   29     38ChiroCLEC-BL蛋白酶
                             5         3744    1724   54     634ChiroCLEC-PC脂肪酶
                             5.7       108     196    5      4148皱摺假丝酵母酯酶L-1(假单胞菌属)                  5.6       70      309    61     6734L-2(南极洲假丝酵母B)             5.4       90      336    11     7066L-3(Candida cylindracea)         5.5       2622    3764   14     913L-5(南极洲假丝酵母A)             5.7       88      158    37     10343L-6(假单胞菌属)                  5.5       153     665    42     4626L-7猪胰                          5.7       0       379    13     6183L-8(腐质霉属)                    5.8       94      884    120    5488无酶                             5.5       98      219    7      7299无酶                             5.6       75      234    5      5508无酶                             5.5       68      209    6      4968
                             5.6       65      277    16     5320实施例5
下面的表5说明多种脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH为5.7至6.1的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。在该表中根据与其它酶进行比较，Prozyme 6(一种来自米曲霉的蛋白酶)、蛋白酶2A(来自米曲霉)与GC899(一种来自Genencor国际公司的商品洗涤剂蛋白酶)显示出更高水平的活性。
                               表5
              针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
           (38℃处理19小时/38％甲醇-水/0.1M MES缓冲溶液)酶                           注释        测量的 pH KLG    MeKLG    ASA    BuKLG(ppm)PS30(假单胞菌属)             脂肪酶        5.9     83      213     32       10424GC4(白地霉)                  脂肪酶        5.7     0       166     0        7475AK(假单胞菌属)               脂肪酶        6       27      205     26       9815G(青霉属)                    脂肪酶        5.8     0       0       0        9441Newlase A(曲霉属)            蛋白酶        5.9     83      299     6        10368蛋白酶M(曲霉属)              蛋白酶        6       498     1054    281      6990Prozyme 6(曲霉属)            蛋白酶        6       1489    2259    0        4965MAP10(毛霉菌属)              脂肪酶        6.1     21      148     145      8968无酶                                       5.9     71      169     22       9463无酶                                       5.9     75      191     6        9391无酶                                       5.9     79      196     7        9539D(根霉属)                    脂肪酶        5.7     44      156     3        8562Newlase II(根霉属)           蛋白酶        5.9     36      164     12       9586AY30(假丝酵母属)             脂肪酶        60      0       192     33       8725L-10(假丝酵母属)             脂肪酶        5.7     0       0       0        9608CES(假单胞菌属)              脂肪酶        5.8     52      296     42       9491N(根霉属)                    脂肪酶        5.8     78      404     27       98342A(蛋白酶，曲霉属)           蛋白酶        6.1     937     1158    215      8951猪胰脂肪酶                                 6       58      529     130      11114脂肪酶(Sigma-1754)            Fluka        5.8     57      98      47       9845脂肪酶(Sigma-1754)           脂肪酶        5.8     46      88      82       9428脂肪酶(Sigma-8525)           脂肪酶        5.9     178     222     60       9041脂肪酶(Sigma-1754)           脂肪酶        5.7     76      145     89       14267脂肪酶(Sigma-3126)           脂肪酶        5.9     90      415     130      12756F-15(根霉属)                 脂肪酶        5.8     55      165     14       10262Lipozyme(Novo-液态)          脂肪酶        6       82      122     160      9100GC899(蛋白酶)                蛋白酶        5.8     791     2735    312      11607实施例6
下面的表6说明多种脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH为5.3至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。蛋白酶M(米曲霉)、Prozyme 6(一种来自米曲霉的蛋白酶)、蛋白酶N(枯草蛋白酶)与蛋白酶2A(米曲霉)均显示出特别高水平的活性。
                                 表6
                针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
                (38℃处理19小时/8.6％甲醇-水/0.1M MES)
                                         测量的
               酶                 注释              KLG     MeKLG     ASA      BuKLG
                                           pH                                  (ppm)PS30(假单胞菌属)                     脂肪酶    5.9      341      163      157       8363GC4(白地霉)                          脂肪酶    5.9      424      0        8         4192AK(假单胞菌属)                       脂肪酶    6        295      432      125       8255G(青霉属)                            脂肪酶    5.8      253      323      0         7678Newlase A(曲霉属)                    蛋白酶    5.7      692      302      126       13408R-10(青霉属)                         脂肪酶    6        527      208      583       5570蛋白酶M(曲霉属)                      蛋白酶    6        3650     2262     328       1696Prozyme 6(曲霉属)                    蛋白酶    5.3      7207     694      0         0MAP10(毛霉菌属)                      脂肪酶    6        369      0        231       8334无酶                                           5.8      378      239      132       8272无酶                                           5.8      380      205      19        8582无酶                                           5.8      382      295      43        8785D(根霉属)                            脂肪酶    5.9      595      326      76        11656Newlase II(根霉属)                   蛋白酶    5.9      323      212      28        8535AY30(假丝酵母属)                     脂肪酶    5.9      330      249      254       10195L-10(假丝酵母属)                     脂肪酶    5.8      302      69       55        11057AP12(曲霉属)                         脂肪酶    6        1448     738      129       7730CES(假单胞菌属)                      脂肪酶    5.9      197      252      0         8092N(根霉属)                            脂肪酶    6        582      348      61        9598N(蛋白酶，芽跑杆菌属)                蛋白酶    5.7      1572     1289     26        18222A(蛋白酶，曲霉属)                   蛋白酶    5.7      5891     616      160       764猪胰脂肪酶                           Fluka      5.8     890     791     158      5284脂肪酶(Sigma-1754)                   脂肪酶     5.9     283     116     148      6196脂肪酶(Sigma-1754)                   脂肪酶     6       348     189     415      8098脂肪酶(Sigma-8525)                   脂肪酶     6       326     93      15       4112脂肪酶(Sigma-1754)                   脂肪酶     6       300     150     154      8057脂肪酶(Sigma-3126)                   脂肪酶     5.8     787     488     99       8829F-15(根霉属)                         脂肪酶     5.9     218     124     0        8682Lipozyme(Novo-液态)                  脂肪酶     5.8     380     95      101      7251GC899(蛋白酶)                        蛋白酶     5.6     3354    1765    201      6991实施例7
下面的表7说明多种酰基转移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH约为5至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。南极洲假丝酵母B脂肪酶、猪肝酯酶与芽胞杆菌属物种的蛋白酶均显示出特别高水平的活性。
                           表7
          针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
         (38℃处理19小时/8.6％甲醇-水/0.1M MES)酶                                   注释       KLG      MeKLG      ASA     BuKLGL-1(假单胞菌属)                     脂肪酶      137      116        47      7601L-2(南极洲假丝酵母B)                脂肪酶      5249     1921       0       768L-3(Candida cylindiacea)            脂肪酶      183      64         107     6920L-4(假单胞菌属)                     脂肪酶      239      163        88      9957L-5(南极洲假丝酵母A)                脂肪酶      278      344        0       6245L-6(假单胞菌属)                     脂肪酶      90       219        15      6613L-7(猪胰)                           脂肪酶      1007     575        106     5392L-8(腐质霉属)                       脂肪酶      209      70         150     7957无酶                                            168      152        6       8753无酶                                            152      144        3       8233无酶                                            170      137        18      8157ESL-001-01                      重组生物催      1271     906        375     4635ESL-001-02                      化公司的酶      883      329        332     5949ESL-001-03                                      290      123        447     7333ESL-001-04                                      511      161        306     6207ESL-001-05                                      364      124        299     6402ESL-001-06                                      329      117        118     6934ESL-001-07                                      0        122        430     15752猪肝酯酶                                        2726     3731       423     10葱头假单胞菌脂肪酶                              241      109        224     9135猪胰脂肪酶                                      333      291        314     7888皱摺假丝酵母脂肪酶                              296      86         451     8697无酶                                            153      116        8       8234
                             蛋白酶       330      1076     65    3855α-胰凝乳蛋白酶青霉素酰基转移酶                              187      1248     157   8110无酶                                          100      73       3     5296无酶                                          144      113      7     8106黑色曲霉脂肪酶                                479      72       84    8455米赫毛霉脂肪酶                                229      278      156   8620ChiroCLEC-CR                     脂肪酶       233      155      11    7569枯草蛋白酶                                    4463     93       0     4428南极洲假丝酵母A                  脂肪酶       215      0        175   7573解脂假丝酵母脂肪酶                            198      62       92    8445芽胞杆菌属物种的蛋白酶                        4920     642      13    72ChiroCLEC-BL蛋白酶                            2860     1233     135   4051ChiroCLEC PC脂肪酶                            127      62       2     5653皱摺假丝酵母酯酶                              178      120      225   9382实施例8
下面的表8说明多种酰基转移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH约为5.8至6.2的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。猪肝酯酶、南极洲假丝酵母B脂肪酶、芽胞杆菌属物种的蛋白酶和轻度交联的结晶状枯草蛋白酶(ChirClec-BL)均显示出特别高水平的活性。
                          表8
          针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
          (38℃处理21小时/8.6％甲醇-水/0.2M MES)
      酶                        注释      pH     KLG     MeKLG     ASA     BuKLG
                                                                            (ppm)猪肝酯酶                                      5.8    2373     4167     717       83葱头假单胞菌脂肪酶                            5.9    173      169      25        7384猪胰脂肪酶                                    5.9    303      320      78        6860皱摺假丝酵母脂肪酶                            5.9    260      112      271       7351α-胰凝乳蛋白酶                               5.9    506      1239     146       4707青霉素酰基转移酶                              6      176      1172     98        5392黑色曲霉脂肪酶                                5.9    493      259      84        6364米赫毛霉脂肪酶                                5.9    243      283      54        7067无酶                                          5.9    198      173      2         7137无酶                                          5.9    216      153      0         7115无酶                                       5.9    223      154      1         7319南极洲假丝酵母‘A’脂肪酶                     5.9    222      142      148       6683解脂假丝酵母脂肪酶                            6      721      123      25        6721南极洲假丝酵母‘B’脂肪酶                     5.9    2708     709      20        28Humicola lanuginosa脂肪酶                     5.9    176      129      10        7215芽胞杆菌属物种的蛋白酶                        5.8    5553     603      0         33ChiroCLEC-CR(干燥的)                          6.1    229      170      2         7191ChiroCLEC-BL(干燥的)                          5.9    4293     1282     6         1376ChiroCLEC-PC(葱头假单胞菌-干燥的)             6.1    240      268      2         7539德列马根霉脂肪酶                             6     178      0      0      7097雪白根霉脂肪酶                               6.2   178      181    61     7102米根霉脂肪酶                                 6.1   159      119    26     7611粘稠色杆菌脂肪酶                             6     415      181    2      7275白地霉脂肪酶                                 6.1   146      122    6      6140爪哇毛霉脂肪酶                               6.2   167      95     141    7422米曲霉蛋白酶                                 6.1   2193     1462   39     2904皱摺假丝酵母酯酶                             5.8   129      132    17     7164实施例9
下面的表9说明对前述实施例中高活性的酶检测其活性的统计再现性。在严格控制pH的条件下比较来自上述实施例的8种酶，它们均被鉴定为显示出特别高水平的活性。在重新进行分析的过程中，所有以前鉴定的具有高水平活性的酶均保持了高水平的活性。这些酶显示出在用0.2M MES缓冲溶液缓冲的、pH约为5.6至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。在该比较实施例中，南极洲假丝酵母B脂肪酶、猪肝酯酶与芽胞杆菌属物种的蛋白酶均显示出特别高水平的活性。猪肝酯酶显示出对酯基转移作用以及明显地转化为抗坏血酸的选择性。
                            表9
          针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
     (38℃处理19小时/8.6％甲醇-水/0.2M MES缓冲溶液)酶                         注释          PH       KLG      MeKLG      ASA      BuKLG
                                                                           (ppm)N蛋白酶                   蛋白酶        6        700      1166       297       5435南极洲假丝酵母B           脂肪酶        5.8      4347     2207       283       0猪肝酯酶                  酯酶          5.9      1947     4258       650       0芽胞杆菌属物种的蛋白酶    蛋白酶        5.6      5137     745        55        0ChiroClec-BL(干燥的)      枯草蛋白酶    5.8      3485     1235       215       3045Prozyme-6                 蛋白酶        5.8      3405     1518       73        1624蛋白酶M                   蛋白酶        6        554      668        271       63292A蛋白酶                  蛋白酶        5.9      1585     1501       153       3954无酶                                    6        135      149        14        8170无酶                                    5.9      136      127        16        8418无酶                                    6        142      133        13        8570实施例10
下面的表10比较了除有机溶剂的浓度更高以外其它与实施例9中相同的酶。南极洲假丝酵母B和芽胞杆菌属物种的蛋白酶显示出特别高水平的活性，这是因为在用0.2M MES缓冲溶液缓冲的、pH约为5.6至6.2的38％甲醇-水溶液中它们显示出把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。对猪肝酯酶而言，与实施例9所示的结果相比，尽管其活性仍很显著、但却观察到活性有所下降。
                               表10
             针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
          (38℃处理19小时/38％甲醇-水/0.2M MES缓冲溶液)酶                          注释       pH      KLG      MeKLG      ASA      BuKLG
                                                                        (ppm)N蛋白酶                     蛋白酶     5.9     176      1144       126      8153南极洲假丝酵母B             脂肪酶     5.8     1701     5710       213      199猪肝酯酶                    酯酶       6       203      1654       173      7030芽胞杆菌属物种的蛋白酶      蛋白酶     5.6     3104     4032       182      213ChiroClec-BL(干燥的)        蛋白酶     5.8     1261     1693       102      5572Prozyme-6                   蛋白酶     6       350      1268       47       7517蛋白酶M                     蛋白酶     6.2     141      408        199      94002A蛋白酶                    蛋白酶     6.1     178      626        90       8666无酶                                   6       69       221        8        9418无酶                                   5.9     61       189        7        8790无酶                                   6       63       203        9        9367实施例11
下面的表11比较了除将pH缓冲到大约5.2以外其它与实施例9中相同的酶。南极洲假丝酵母B和猪肝酯酶显示出特别高水平的活性，这是因为在用0.2M吡啶/吡啶  盐酸化物缓冲溶液缓冲的、pH约为4.9至5.3的8.6％甲醇-水溶液中它们显示出把丁基-KLG明显地转化成MeKLG和KLG。对芽胞杆菌属物种的蛋白酶而言，与实施例9相比，尽管其活性仍很显著、但却观察到活性有所下降。
                                 表11
                   针对BUKLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
           (38℃处理约19小时/8.6％甲醇-水/0.2M吡啶/吡啶鎓盐酸化物)
           酶              注释      pH       KLG     MeKLG     ASA     BuKLG
                                                                        (ppm)N蛋白酶                        蛋白酶    5.2      87       237      47       8320南极洲假丝酵母B                脂肪酶    4.9      3460     3097     53       0猪肝酯酶                       酯酶      5.2      1613     5787     37       390芽胞杆菌属物种的蛋白酶         蛋白酶    5.1      1613     2473     70       3757ChiroClec-BL(干燥的)           蛋白酶    5.1      987      1360     67       5603Prozyme-G                      蛋白酶    5.2      700      840      7        6470蛋白酶M                        蛋白酶    5.3      187      357      0        83872A蛋白酶                       蛋白酶    5.2      480      643      0        7523无酶                                     5.3      97       0        153      9750无酶                                     5.2      73       0         80      9547实施例12
下面的表12比较了除有机溶剂的浓度更高以外其它与实施例11中相同的酶。南极洲假丝酵母B显示出特别高水平的活性，这是因为在用0.2M吡啶/吡啶  盐酸化物缓冲溶液缓冲的、pH约为4.7至5.1的38％甲醇-水溶液中它显示出把丁基-KLG明显地转化成MeKLG和KLG。与实施例9和11相比，所有酶均显示出活性有所下降。
                           表12
              针对BUKLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
              (38℃处理约19小时/H4.9/38％甲醇-水)酶                          注释      PH     KLG     MeKLG     ASA     BuKLGN蛋白酶                    蛋白酶     4.8     0       0        17      9093南极洲假丝酵母B            脂肪酶     4.7     1953    6470     0       5373猪肝酯酶                   酯酶       4.9     47      197      0       11750芽胞杆菌属物种的蛋白酶     蛋白酶     4.9     333     2113     30      10043ChiroClec-BL(干燥的)       蛋白酶     4.9     97      447      7       10950Prozyme-6                  蛋白酶     4.9     0       113      3       12730蛋白酶M                    蛋白酶     5.1     73      203      0       158872A蛋白酶                   蛋白酶     5       67      150      0       13920无酶                                  4.9     87      13       27      11753实施例13
下面的表13比较了除将pH缓冲到大约2.3以外其它与实施例9和11中相同的酶。对于在用0.2M磷酸盐缓冲溶液缓冲的、pH约为2.3-2.7的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG而言，与实施例9和11相比，所有测试的酶均显示出活性有所下降。
                           表13
               针对BUKLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选
     (38℃处理20小时/8.6％甲醇-水/pH2.3 0.2M磷酸盐缓冲溶液)酶                       注释         PH      KLG      MeKLG      ASA     BuKLGN蛋白酶                  蛋白酶       2.4     203        0         3       8980南极洲假丝酵母B          脂肪酶       2.4     397        323       0       8463猪肝酯酶                 酯酶         2.4     417        93        0       9500芽胞杆菌属物种的蛋白酶   蛋白酶       2.3     347        0         0       10987ChiroClec-BL(干燥的)     蛋白酶       2.3     387        0         0       10580Prozyme-6                蛋白酶       2.4     440        0         0       12357蛋白酶M                  蛋白酶       2.6     137        333       0       122372A蛋白酶                 蛋白酶       2.7     163        347       0       10600无酶                                  2.3     487        0         0       10417无酶                                  2.3     413        0         0       9897无酶                                  2.3     407        0         0       9873实施例14
下面的表14比较了在将pH缓冲到大约6时实施例9和11的前5种酶催化KLG酯化为甲基KLG(MeKLG)的能力或其催化KLG的环闭合以生成抗坏血酸的能力。与实施例9和11相比均观察到低水平的活性。
                              表14
                    针对KLG的甲醇分解进行酶的筛选
            (38℃处理19小时/8.6％甲醇-水/0.2M MES缓冲溶液)
      酶                   注释        pH      KLG     MeKLG    ASA    BuKLGN蛋白酶                        蛋白酶      6       3791      0       0       0南极洲假丝酵母B                脂肪酶      6       4258      0       0       0猪肝酯酶                       酯酶        6       4393      0       0       0芽胞杆菌属物种的蛋白酶         蛋白酶      6       4099      0       0       0ChiroClec-BL(干燥的)           枯草蛋白酶  6.1     3270      0       0       0无酶                                       6       4340      0       0       0无酶                                       6       3295      0       0       0无酶                                       6       4029      0       0       0实施例15
下面的表15说明了在pH为3-3.2的8.6％甲醇水溶液中使用南极洲假丝酵母B脂肪酶作为催化剂由KLG生产MeKLG。选取该缓冲溶液作为KLG及其钠盐的混合物(约为1/9)。前三项包括酶催化剂并且在相同的条件下一式三份。随后的三项也一式三份，并且除没有酶存在之外其它与前三项的条件相同。前三项显示出在有南极洲假丝酵母B脂肪酶的情况下KLG明显地酯化为MeKLG。随后的三项说明在没有南极洲假丝酵母B脂肪酶的情况下没有进行上述转化。
                                     表15
                      针对KLG的酯化进行酶的筛选在38℃下处理
                 68小时/在水相中含8.6％的甲醇/缓冲溶液＝KLG+NaKLG酶                          注释          pH      KLG     MeKLG     ASA    BuKLG南极洲假丝酵母B         8.6％MeOH+KLG    3.1     9227     460       0       0南极洲假丝酵母B         8.6％MeOH+KLG    3.1     9303     530       0       0南极洲假丝酵母B         8.6％MeOH+KLG    3.2     9213     413       0       0无酶                    8.6％MeOH+KLG    2.9     9530     0         0       0无酶                    8.6％MeOH+KLG    2.9     9477     0         0       0无酶                    8.6％MeOH+KLG    2.9     9600     0         0       0实施例16
本实施例说明在进行HPLC分析的条件下抗坏血酸的缓慢分解。通过在水中溶解KLG、MeKLG、抗坏血酸(ASA)和丁基-KLG至合适的浓度来制备HPLC样品的标准品。把这些标准品样品放入管形瓶中、装满并密封，在窒温下储存，并定期进行分析。根据标准品的面积响应来标定HPLC，其中在标准品制备完毕之后应尽可能快地将其注入HPLC中。下面的表16显示出50、100和500ppm的KLG、MeKLG、抗坏血酸和丁基-KLG标准品在制备样品后的0时(标定时间)、在大约6.5小时以及在大约12小时时记录的响应。
                      表16
      制备的量      发现的量时间                           KLG     MeKLG    ASA    BuKLG(分钟)0           50ppm   标准品     51      51.4     53.4    50.6400                            39.9    47.7     28.3    42.7715                            52      43       0       38.20           100ppm  标准品     102     103      107     101400                            94.3    106.8    96.6    100.1715                            81.8    90.2     57.2    94.20           500ppm  标准品     510     514      534     506400                            479     496      487     512715                            493     495      473     499
对于其它的标准品、尤其是针对100ppm或者更低浓度的标准品而言，抗坏血酸的响应在整个时间范围内是非线性的。假定在HPLC分析之前对实施例2-16的处理包括在38℃下、在水浴摇床上处理大约16小时或者更长的时间，那么由此可见生成的抗坏血酸的实际水平要高于报道值。
具体地参考本发明优选的具体实例已经对本发明进行了详细的描述，但应当了解的是可以在本发明的精神和范围内实现变化和改进。
                          序列表
(1)一般信息：
  (i)申请人：Hubbs，John C.
  (ii)发明名称：用于制备抗坏血酸、2-酮-L-古洛糖酸及2-酮-L-古洛糖酸酯的酶促方法
  (iii)序列数：3
  (iv)通讯地址：
      (A)收信人：Eastman化学公司
      (B)街道：邮政信箱511
      (C)城市：Kingsport
      (D)州：田纳西
      (E)国家：美国
      (F)邮政编码：37662-5075
 (v)计算机可读形式：
      (A)存储媒体类型：*
      (B)计算机：*
      (C)操作系统：*
      (D)软件：*
(vi)目前申请资料：
      (A)申请号：*
      (B)申请日：*
      (C)分类：*
(vii)在先申请资料：
      (A)申请号：US 60/017,879
      (B)申请日：1996年5月17日
(viii)律师/代理人资料：
      (A)姓名：Cheryl J.Tubach
      (B)登记号：*
      (C)参考/案件目录号：70432
(ix)电信资料：
      (A)电话：423-229-6189
      (B)传真：423-229-1239(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
   (A)长度：379个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met1               5                  10                  15Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro
         20                  25                  30Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val
     35                  40                  45Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys
 50                  55                  60Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp65                  70                  75                  80Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val
             85                  90                  95Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly
        100                 105                 110Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly
    115                 120                 125Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His
130                 135                 140Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala145                 150                 155                 160Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val
            165                 170                 175Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val
        180                 185                 190Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr
    195                 200                 205Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp
210                 215                 220Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys225                 230                 235                 240Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala
            245                 250                 255Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro
        260                 265                 270Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser
    275                 280                 285Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala
290                 295                 300Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Ser Thr Tyr Ala Thr305                 310                 315                 320Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala
            325                 330                 335Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn
        340                 345                 350Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly
    355                 360                 365Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
370                 375(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：584个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Trp Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Leu Ala Ser Ser Ala Thr1               5                  10                  15Trp Ala Gly Gln Pro Ala Ser Pro Pro Val Val Asp Thr Ala Gln Gly
         20                  25                  30Arg Val Leu Gly Lys Tyr Val Ser Leu Glu Gly Leu Ala Phe Thr Gln
     35                  40                  45Pro Val Ala Val Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly
 50                  55                  60Ser Leu Arg Phe Ala Pro Pro Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val65                  70                  75                 80Lys Asn Thr Thr Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Asp Pro Val Val
             85                  90                  95Glu Gln Met Thr Ser Asp Leu Phe Thr Asn Phe Thr Gly Lys Glu Arg
        100                 105                 110Leu Thr Leu Glu Phe Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr
    115                 120                 125Pro Ala Asp Leu Thr Lys Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile
130                 135                 140His Gly Gly Gly Leu Val Leu Gly Gly Ala Pro Met Tyr Asp Gly Val145                 150                 155                 160Val Leu Ala Ala His Glu Asn Phe Thr Val Val Val Val Ala Ile Gln
            165                 170                 175Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly Phe Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser
        180                 185                 190Arg Gly Asn Trp Gly His Leu Asp Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val
    195                 200                 205Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe Gly Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile
210                 215                 220Phe Gly Glu Ser Phe Thr Ala Gly Gly Glu Ser Val Ser Val Leu Val225                 230                 235                 240Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe His Arg Ala Ile Ser Glu Ser
            245                 250                 255Gly Val Ala Leu Thr Val Ala Leu Val Arg Lys Asp Met Lys Ala Ala
        260                 265                 270Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly Cys Lys Thr Thr Thr Ser Ala
    275                 280                 285Val Phe Thr Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys Ser Glu Asp Glu Leu
290                 295                 300Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Leu Thr Leu Asp Phe His Gly305                 310                 315                 320Asp Gln Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Pro Thr Val Val Asp Gly Val
            325                 330                 335Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala Glu Lys Asp Phe Thr
        340                 345                 350Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln Glu Phe Gly
    355                 360                 365Trp Leu Leu Pro Thr Met Met Gly Phe Pro Leu Ser Glu Gly Lys Leu
370                 375                 380Asp Gln Lys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr Pro Ile Ala385                 390                 395                 400Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Phe Thr Asp Lys Tyr
            405                 410                 415Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu Asp
        420                 425                 430Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala Arg
    435                 440                 445Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln Tyr
450                 455                 460Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Phe Thr Lys Pro Lys Thr Val Ile465                 470                 475                 480Gly Asp His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu
            485                 490                 495Lys Gly Asp Ala Pro Glu Glu Glu Val Ser Leu Ser Lys Thr Val Met
        500                 505                 510Lys Phe Trp Ala Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asn Pro Asn Gly Glu Gly
    515                 520                 525Leu Pro His Trp Pro Phe Thr Met Tyr Asp Gln Glu Glu Gly Tyr Leu
530                 535                 540Gln Ile Gly Val Asn Thr Gln Ala Ala Lys Arg Leu Lys Gly Glu Glu545                 550                 555                 560Val Ala Phe Trp Asn Asp Leu Leu Ser Lys Glu Ala Ala Lys Lys Pro
            565                 570                 575Pro Lys Ile Lys His Ala Glu Leu
        580(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：342个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID N0：3：NO：3：Met Lys Leu Leu Ser Leu Thr Gly Val Ala Gly Val Leu Ala Thr Cys1               5                  10                  15Val Ala Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro
         20                  25                  30Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln
     35                  40                  45Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly
 50                  55                  60Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu65                  70                  75                  80Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe
             85                 90                  95Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile
        100                 105                 110Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr
    115                 120                 125Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro
130                 135                 140Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr145                 150                 155                 160Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala
            165                 170                 175Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu
        180                 185                 190Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr
    195                 200                 205Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu
210                 215                 220Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val225                 230                 235                 240Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln
            245                 250                 255Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln
        260                 265                 270Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala
    275                 280                 285Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala
290                 295                 300Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro305                 310                 315                 320Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys
            325                 330                 335Ser Gly Ile Val Thr Pro
        340

Claims (21)

1.一种用于制备抗坏血酸的方法，该方法包括将选自由2-酮(keto)-L-古洛糖酸和2-酮(keto)-L-古洛糖酸酯组成的组中的化合物与水解酶催化剂接触以生成抗坏血酸。
2.权利要求1的方法，其中所说的水解酶催化剂选自由蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶组成的组中。
3.权利要求2的方法，其中所说的蛋白酶由选自由芽胞杆菌属或曲霉属组成的组的属中获得。
4.权利要求3的方法，其中所说的蛋白酶由地衣形芽胞杆菌细菌获得。
5.权利要求4的方法，其中所说的蛋白酶为具有如SEQ ID NO：1所示序列的枯草蛋白酶。
6.权利要求2的方法，其中所说的酯酶由猪肝提取物获得。
7.权利要求6的方法，其中所说的酯酶为具有如SEQ ID NO：2所示序列的猪肝酯酶。
8.权利要求2的方法，其中所说的脂肪酶由选自由曲霉属、毛霉菌属、假丝酵母属、假单胞菌属、腐质霉属、根霉属、色杆菌属、产碱杆菌属、地霉属和青霉属组成的组的属中获得。
9.权利要求8的方法，其中所说的脂肪酶为具有如SEQ ID NO：3所示序列的B型南极洲假丝酵母脂肪酶。
10.权利要求2的方法，其中所说的酰胺酶由青霉属获得。
11.权利要求10的方法，其中所说的酰胺酶为青霉素酰基转移酶。
12.权利要求1的方法，其中所说的水解酶催化剂含有一个活性位点的丝氨酸残基。
13.权利要求12的方法，其中所说的水解酶催化剂含有一个丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的催化三联体。
14.权利要求1的方法，其中在将所说化合物与所说水解酶催化剂接触之前，将所说化合物与溶剂一起形成溶液。
15.权利要求14的方法，其中所说的溶剂选自由水、C1至C6的醇及其混合物组成的组中。
16.权利要求1的方法，其中将所说化合物与所说水解酶催化剂接触发生在pH介于1.5和10之间的情况下。
17.权利要求1的方法，其中将所说化合物与所说水解酶催化剂接触发生在5℃至120℃的温度下。
18.权利要求1的方法，其中在将所说化合物与所说水解酶催化剂接触之前，所说水解酶催化剂是由宿主生物体在体内天然表达的。
19.权利要求1的方法，其中在将所说化合物与所说水解酶催化剂接触之前，将编码所说水解酶催化剂的基因序列插入宿主生物体中，并且培养所说的宿主生物体以在体内表达所说的水解酶催化剂。
20.权利要求19的方法，其中所说的宿主生物体为柠檬泛菌。
21.权利要求18或权利要求19的方法，其中所说的宿主生物体生产2-酮-L-古洛糖酸。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5817490A (en) * 1996-05-17 1998-10-06 Eastman Chemical Company Enzymatic process for the manufacture of ascorbic acid 2-keto-L-gulonic acid and esters of 2-keto-L-gulonic acid
EP1026257B1 (en) * 1999-01-18 2006-04-12 DSM IP Assets B.V. Manufacture of L-ascorbic acid and D-erythorbic acid
CA2296020A1 (en) * 1999-01-18 2000-07-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Manufacture of l-ascorbic acid and d-erythorbic acid
DE19938980A1 (de) * 1999-08-19 2001-02-22 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäureestern
US6720168B2 (en) 2000-08-04 2004-04-13 Genencor International, Inc. 2,5-DKG permeases
JP4975937B2 (ja) * 2000-08-04 2012-07-11 マイクロゲノミックス・インコーポレーテッド ２，５−ｄｋｇパーミアーゼ
AU781277B2 (en) * 2000-08-23 2005-05-12 Dsm Ip Assets B.V. Microbial production of L-ascorbic acid and D-erythorbic acid
EP1182262A1 (en) * 2000-08-23 2002-02-27 Roche Vitamins AG Microbial production of l-ascorbic acid and d-erythorbic acid
US6642035B2 (en) * 2001-01-26 2003-11-04 The Scripps Research Institute Synthesis of B-keto esters
US7229811B2 (en) * 2001-08-03 2007-06-12 Genencor International, Inc. 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) permeases
US20070298474A1 (en) * 2001-08-03 2007-12-27 Manoj Kumar Enhanced 2-Keto-L-Gulonic acid production
EP1446494B1 (en) * 2001-11-09 2006-01-04 DSM IP Assets B.V. Enzymatic process for the manufacture of l-ascorbic acid and d-erythorbic acid
US7091375B2 (en) 2002-11-11 2006-08-15 Basf Aktiengesellschaft Method for the production of 2=-keto-l-gulonic acid C4C10 alkyl esters
BRPI0608223A2 (pt) * 2005-02-11 2009-11-24 Dsm Ip Assets Bv gene sms 05
AT502990A1 (de) * 2005-12-27 2007-07-15 Dsm Fine Chem Austria Gmbh Neues polypeptid mit esteraseaktivität, und rekombinante esterase sowie deren verwendung
BRPI0709344A2 (pt) * 2006-03-20 2011-07-12 Duramed Pharmaceuticals Inc anel intravaginal comprimido flexìvel, seu uso e processo de preparação, método de fornecer um agente ativo, kit terapêutico e produto
JP5438259B2 (ja) * 2006-04-13 2014-03-12 Ｂｉｏ−ｅｎｅｒｇｙ株式会社 カンジダ・アンタークティカ由来リパーゼｂを細胞表層に提示する酵母
US8759044B2 (en) 2011-03-23 2014-06-24 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
US8765425B2 (en) 2011-03-23 2014-07-01 Butamax Advanced Biofuels Llc In situ expression of lipase for enzymatic production of alcohol esters during fermentation
BR112013022335A2 (pt) * 2011-03-30 2017-02-14 Novozymes As processo para a produção de alquil ésteres do ácido graxo
CN103344719B (zh) * 2013-06-27 2015-04-15 东北制药集团股份有限公司 一种可同时检测古龙酸、古龙酸甲酯、甲醇和乙醇的高效液相方法
CN111377543A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 南京百斯杰生物工程有限公司 脂肪酶在降低黄水酸度中的应用
KR102357426B1 (ko) * 2019-12-10 2022-01-28 건국대학교 산학협력단 신규 에스터 가수분해효소를 이용한 베타 아미노산의 효소적 생산방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0207763A2 (en) * 1985-07-01 1987-01-07 Bio-Technical Resources, Inc. L-Ascorbic acid production in microorganisms
EP0292303A1 (en) * 1987-05-21 1988-11-23 Genentech, Inc. Ascorbic acid intermediates and process enzymes

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES135896A1 (es) * 1933-10-25 1934-12-16 Hoffmann La Roche PROCEDIMIENTO PARA LA FABRICACIoN DEL áCIDO 2-CETO-1-GULoNICO
GB466548A (en) * 1935-11-26 1937-05-31 Tadeus Reichstein Process for the manufacture of laevo-ascorbic acid (vitamin-c)
US4760025A (en) * 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US4595659A (en) * 1983-10-20 1986-06-17 Kraft, Inc. Fermentation production of ascorbic acid from L-galactonic substrate
CN86105960A (zh) * 1985-08-09 1987-05-13 鲁布里佐尔公司 在基本无水条件下从2-酮-l-古洛糖酸制备l-抗坏血酸
US5079153A (en) * 1989-06-03 1992-01-07 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Process for the preparation of organic esters of ascorbic acid or erythorbic acid using ester hydralases in organic solvents containing 100-10,000 ppm of water
JPH04141093A (ja) * 1990-10-03 1992-05-14 Mitsubishi Rayon Co Ltd 有機酸エステルの製造法
JPH04335893A (ja) * 1991-05-07 1992-11-24 Mitsubishi Rayon Co Ltd 固定化酵素を用いるエステル合成方法
DE69221024T2 (de) * 1991-05-18 1997-12-18 Mitsubishi Rayon Co Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäure-Estern oder Erythorbinsäure-Estern
JPH061783A (ja) * 1992-06-17 1994-01-11 Mitsubishi Rayon Co Ltd 有機酸エステルの製造法
US5817490A (en) * 1996-05-17 1998-10-06 Eastman Chemical Company Enzymatic process for the manufacture of ascorbic acid 2-keto-L-gulonic acid and esters of 2-keto-L-gulonic acid

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0207763A2 (en) * 1985-07-01 1987-01-07 Bio-Technical Resources, Inc. L-Ascorbic acid production in microorganisms
EP0292303A1 (en) * 1987-05-21 1988-11-23 Genentech, Inc. Ascorbic acid intermediates and process enzymes

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