CN111166874A - 一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，该口服卵黄抗体的有效组分及其体积份数比为：含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液70‑90份、正辛酸0.05‑0.15份、甲醛0.05‑0.15份、蔗糖0.1‑0.2份、脱脂牛奶0.01‑0.02份。制备中采用了分级超滤浓缩的纯化除杂工艺，利用截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱提升了抗体纯度降低了大分子杂质，降低了产品临床应用不良反应的发生率，同时，含有蔗糖和脱脂牛奶，这种方法制备的卵黄抗体稳定性好、生物活性高、微甜适口性好，可以减少口服时对抗体的不良影响，同时还可以提高饲料转化率。

Description

一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法。
背景技术
人类餐饮业的快速发展，消费水平不断提升，水禽动物源性食品备受青睐。水禽养殖量在逐日扩大，但是水禽养殖方式相对分散，养殖模式比较开放，导致许多禽类疾病在水禽上发生几率越来越大。小鹅瘟由鹅细小病毒引起的雏鹅急性败血性传染病。病雏鹅神经症状明显，死亡率高，对养鹅业的发展，影响极大，小鹅瘟不仅可以感染鹅，在一定程度上也可感染番鸭等其他禽类，搞好小鹅瘟的防治工作是当务之急。
卵黄抗体具有性质稳定、特异性强、制备成本低、口服安全等优点在家禽、家畜传染病的防治中已得到广泛的应用。产品的开发也在生态农业和食品安全方面产生了良好的经济效益和社会效益。在诊断、预防和治疗人类和动物各种疾病中具有良好的应用价值。
鉴于此，二者的有效结合成为水禽养殖业的新希望。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，该方法解决了常规卵黄抗体注射免疫应激大等不方便的问题，采用了分级超滤浓缩的纯化除杂工艺，利用截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱提升了抗体纯度降低了大分子杂质，降低了产品临床应用不良反应的发生率，抗体质量稳定，使用方便，无生物毒性，有利于环境卫生及食品安全。
本发明另一个目的在于解决了现有技术中卵黄抗体口服中活性及稳定性差的问题，本发明中加入蔗糖和脱脂牛奶后，形成一种蛋白膜保护，具有稳定性好、生物活性高、微甜适口性好的特点，可以减少口服时对抗体的不良影响，同时还可以提高饲料转化率。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其有效组分及其体积份数比为：含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液70-90份、正辛酸0.05-0.15份、甲醛0.05-0.15份、蔗糖0.1-0.2份、脱脂牛奶0.01-0.02份。
一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用小鹅瘟灭活疫苗对180日龄蛋鸭进行首次免疫，用量1ml/只，首次免疫7天后进行二次免疫1ml/只，二免后14天进行再次加强免疫1ml/只，检测小鹅瘟血清抗体效价至1:512～1:1024时收集高免蛋；
(2)取步骤(1)中所收集的高免蛋洗净消毒，而后收集蛋黄，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60～65℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用；
(3)向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤5)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2～4小时，离心取上清备用；
(4)加热步骤(3)分离的上清液至15-20℃，边搅拌边加入浓度为0.1％的正辛酸，充分搅拌0.5～1.5小时，室温放置2～6小时后，以4200～5500r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3～4倍后再用NaOH调整PH值为6.8～7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
(5)取步骤(4)所述滤液，加入甲醛、蔗糖和脱脂牛奶，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，2～8℃保存，即得到所述一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体。
而且，步骤(2)所述的消毒高免蛋和收集卵黄的方法为：取步骤(1)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。
而且，步骤(3)中所得的含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液：步骤(4)所述正辛酸体积份数比为(70-90份)：(0.05-0.15份)。
而且，步骤(3)中所得的含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液：步骤(5)所述甲醛、蔗糖和脱脂牛奶份数比为(70-90份)：(0.05-0.15份)：(0.05-0.15份)：(0.1-0.2份)：(0.01-0.02份)。
本发明的优点及有益效果在于：
1.本发明采用了高效价抗体和分级超滤浓缩的纯化除杂工艺，并利用截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱提升了抗体纯度，降低了因大分子杂质而引发的免疫应激，使用方便，利于生产养殖的发展。
2、本发明中加入蔗糖和脱脂牛奶可促进稳定性、生物活性及适口性的提升，同时也可减少口服时对抗体的不良影响，从而提高饲料转化率。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所涉及的小鹅瘟灭活疫苗、正辛酸、甲醛、蔗糖、脱脂牛奶均可以从市场购买得到。
实施例1
一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体，其有效组分及其体积份数为：含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液70份、正辛酸0.05份、甲醛0.05份、蔗糖0.1份、脱脂牛奶0.01份。
一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其制备方法的步骤为：
(1)采用小鹅瘟灭活疫苗对180日龄蛋鸭进行首次免疫，用量1ml/只，首次免疫7天后进行二次免疫1ml/只，二免后14天进行再次加强免疫1ml/只，检测小鹅瘟血清抗体效价至1:512时收集高免蛋；
(2)取步骤(1)中所收集的高免蛋用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用；
(3)向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤(2)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2小时，离心取上清备用；
(4)加热步骤(3)分离的上清液至15℃，边搅拌边加入浓度为0.1％的正辛酸(上清液与正辛酸体积份数比为70:0.05)，充分搅拌0.5小时，室温放置2小时后，以4200r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3～4倍后再用NaOH调整PH值为6.8，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
(5)取步骤(4)所述滤液，加入甲醛、蔗糖和脱脂牛奶，其中三组分体积份数比为(0.05：0.1：0.01)，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，2℃保存，即得到所述一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体。
实施例2
一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体，其有效组分及其体积份数为：含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液90份、正辛酸0.15份、甲醛0.15份、蔗糖0.2份、脱脂牛奶0.02份。
一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其制备方法的步骤为：
(1)采用小鹅瘟灭活疫苗对180日龄蛋鸭进行首次免疫，用量1ml/只，首次免疫7天后进行二次免疫1ml/只，二免后14天进行再次加强免疫1ml/只，检测小鹅瘟血清抗体效价至1:1024时收集高免蛋；
(2)取步骤(1)中所收集的高免蛋用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，65℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用；
(3)向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤(2)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置4小时，离心取上清备用；
(4)加热步骤(3)分离的上清液至20℃，边搅拌边加入浓度为0.1％的正辛酸(上清液与正辛酸体积份数比为90:0.15)，充分搅拌1.5小时，室温放置6小时后，以5500r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩4倍后再用NaOH调整PH值为7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
(5)取步骤(4)所述滤液，加入甲醛、蔗糖和脱脂牛奶，其中三组分体积份数比为(0.15：0.2：0.02)，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，8℃保存，即得到所述一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体。
实施例3
一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体，其有效组分及其体积份数为：含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液80份、正辛酸0.1份、甲醛0.1份、蔗糖0.15份、脱脂牛奶0.02份。
一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其制备方法的步骤为：
(1)采用小鹅瘟灭活疫苗对180日龄蛋鸭进行首次免疫，用量1ml/只，首次免疫7天后进行二次免疫1ml/只，二免后14天进行再次加强免疫1ml/只，检测小鹅瘟血清抗体效价至1:512时收集高免蛋；
(2)取步骤(1)中所收集的高免蛋用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，65℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用；
(3)向无菌的酸化罐中先加入蛋黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤(2)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置3小时，离心取上清备用；
(4)加热步骤(3)分离的上清液至20℃，边搅拌边加入浓度为0.1％的正辛酸(上清液与正辛酸体积份数比为80:0.1)，充分搅拌0.1小时，室温放置4小时后，以5000r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩4倍后再用NaOH调整PH值为6.8，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
(5)取步骤(4)所述滤液，加入甲醛、蔗糖和脱脂牛奶，其中三组分体积份数比为(0.1：0.1：0.02)，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，4℃保存，即得到所述一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体。
临床应用
1、小鹅瘟口服精制卵黄抗体效果(治疗雏鹅小鹅瘟效果)试验
2018年4月在山东潍坊诸城某鹅场，选取2-3日龄已确诊小鹅瘟的雏鹅60只，随机分为6组(A\B\C\D\E\F)，每组10只，相同环境下6组隔离饲养，F组为空白对照，未进行任何处理，其他各组组按表1进行了试验分组及处理，通过一个疗程两周的治疗试验，治疗情况结果如表1。
表1实验结果说明：现有技术得到的普通小鹅瘟抗体治疗组死亡率20％，同时存在群体应激反应大；未治疗组死亡率则高达80％，即本病自愈效果差，生产实践中需要人工干预，而本发明中、高效价组治疗效果较好，治愈率均为100％，效果明显，而且治疗过程中未出现应激反应。
表1本发明效果试验分组及处理
Figure BDA0002343863970000061
2、小鹅瘟口服精制卵黄抗体效果(促生长)试验
2018年4月在山东潍坊诸城某鹅场，选取5日龄已确诊的小鹅瘟雏鹅40只，随机分为4组(A\B\C\D)，每组10只，按表2进行试验处理，相同环境下4组隔离饲养，观察20天，饲料转化率及日增重情况试验结果如表2。
表2本发明促生长试验结果
Figure BDA0002343863970000062
从表2可见本发明组成活率100％，其他三组成活率仅20％-30％；本发明平均日增重42.24g/d，高出普通抗体组7g/d，超化药组和对照组10g/d以上，料肉比方面，本发明组最低1.75，也显著优于其他三组。
结论
可见，本发明小鹅瘟口服精制卵黄抗体在治疗养殖生产中治疗小鹅瘟临床效果明显，成活率高，同时口服方便，适口性好，可以有效提高饲料转化率。

Claims (5)

1.一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：该口服小鹅瘟精制卵黄抗体的有效组分及其体积份数比为：含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液70-90份、正辛酸0.05-0.15份、甲醛0.05-0.15份、蔗糖0.1-0.2份、脱脂牛奶0.01-0.02份。
2.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
(1)采用小鹅瘟灭活疫苗对180日龄蛋鸭进行首次免疫，用量1ml/只，首次免疫7天后进行二次免疫1ml/只，二免后14天进行再次加强免疫1ml/只，检测小鹅瘟血清抗体效价至1:512～1:1024时收集高免蛋；
(2)取步骤(1)中所收集的高免蛋洗净消毒，而后收集蛋黄，充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60～65℃保温灭活30分钟，得卵黄匀浆备用；
(3)向无菌的酸化罐中先加入卵黄匀浆体积6倍的酸化用水，然后将步骤(2)所得卵黄匀浆缓缓中加入无菌的酸化罐中，边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2～4小时，离心取上清备用；
(4)加热步骤(3)分离的上清液至15-20℃，边搅拌边加入浓度为0.1％的正辛酸，充分搅拌0.5～1.5小时，室温放置2～6小时后，以4200～5500r/min的转速离心15min，弃沉淀；用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤上清液，再经截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3～4倍后再用NaOH调整PH值为6.8～7.0，并以0.45μm和0.22μm筒式滤芯过滤除菌。
(5)取步骤(4)所述滤液，加入甲醛、蔗糖和脱脂牛奶，于37℃灭活2h，定量分装，加盖密封，2～8℃保存，即得到所述一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体。
3.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的消毒高免蛋和收集卵黄的方法为：取步骤(1)所得高免蛋，用清水冲洗干净后浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟后，送入蛋清蛋黄分离机分离得到卵黄，搅拌得到卵黄匀浆。
4.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤(3)中所得的含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液：步骤(4)所述正辛酸体积量为(70-90份)：(0.05-0.15份)。
5.根据权利要求1所述的一种小鹅瘟口服精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤(3)中所得的含小鹅瘟卵黄抗体的卵黄酸化液：步骤(5)所述甲醛、蔗糖和脱脂牛奶体积量为(70-90份)：(0.05-0.15份)：(0.05-0.15份)：(0.1-0.2份)：(0.01-0.02份)。
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