CN108813098B - 含天然抗菌组分的微生物发酵复合无抗饲料 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含天然抗菌组分的微生物发酵复合无抗饲料，包括基于好氧‑厌氧复合菌种联合分段发酵的发酵物、复合天然抗菌组分、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及至少包含大豆蛋白基氨基酸/多肽复合螯合物的添加剂，所述复合菌种至少包括乳酸菌、枯草芽孢杆菌、选自产朊假丝酵母或酿酒酵母的酵母菌，以及粪肠球菌。其中，联合分段发酵的发酵物由好氧‑厌氧复合菌种通过对发酵原料进行二次发酵制备得到。本发明通过微生物发酵饲料和天然抗菌组分的组合，有益于动物肠道菌群平衡，可防止消化道菌群失调，提高动物机体免疫功能，减少或代替饲料抗生素的使用，显著提高饲料消化吸收效率和动物肉质品质。

Description

含天然抗菌组分的微生物发酵复合无抗饲料

技术领域

本发明涉及发酵饲料及生产领域，特别涉及一种复配天然抗菌组分包埋物和添加剂的微生物发酵饲料及其制备方法。

背景技术

现代畜牧业根据科学理论和禽畜能量代谢特点，能够针对每种动物科学地规定出合理的能量和所需的各种营养物质的数量，为追求能量最大化利用，这种现代饲养标准越来越细化。而养殖业的传统饲料例如玉米、豆粕、麸皮等在现代饲料标准中逐渐地被改变利用方式，一方面是由于这些粗原料很难完全被动物消化吸收，热量利用率低；而且营养不够均衡，因此养殖场越来越多地采用饲料添加剂，例如鱼粉、复合氨基酸、维生素添加剂、乳清粉、油脂、骨粉等作为禽畜饲料补充剂，导致养殖成本不断升高。另一方面，随着人口增加和耕地减少，粮食越来越紧缺，而大量粮食的使用使得养殖成本进一步升高。因此，高效农产品饲料的研发和使用逐渐成为热门研究问题。显然的，更加科学和更高能量利用效率的饲料越来越受市场欢迎。

困扰养殖业的另一问题是抗生素的使用。众所周知，抗生素在动物中的滥用和抗药性已经成了世界范围内公共卫生领域的重大问题之一，并对人类健康构成潜在的威胁。具体地，在养殖业中，抗生素大量使用容易导致细菌产生耐药性，并且使得动物胃肠菌群失调和机体免疫力下降，易发生畜禽感染。这种饲料抗生素添加剂的大量使用不仅带来了严重的耐药性和药物残留的后患，作为食品时还进一步加剧了食品安全危机，甚至成为典型的不健康垃圾肉类食品。目前国际上逐渐开始限制或禁用饲用抗生素，越来越多的抗生素例如硫酸黏杆菌素等被禁止使用。遏制抗生素污染，探索可行的抗生素替代产品，为无抗养殖、绿色健康养殖提供可行的方法成为目前养殖行业急需解决的关键问题。可以预见的是，逐步减少甚至全面禁用抗生素将是现代养殖业的趋势所在。

针对上述饲料利用效率的问题，生物发酵饲料的应用越来越受到重视。确切地说，近年来生物发酵饲料在养殖行业已经得到大量应用。生物发酵饲料是以传统农副产品作为主要原料，通过接种酵母菌、乳酸菌等有益微生物，利用微生物自身的生长代谢活动，将传统饲料原料中的抗性营养组分或不能利用的大分子物质分解转化，代谢生成容易吸收利用的小分子物质，形成营养价值高、消化吸收率高同时又富含益生菌的生物发酵饲料。例如芽孢杆菌等能分泌大量蛋白酶降解大分子蛋白，有利于提高动物特别是幼龄动物对蛋白的需求；酵母菌生长代谢产生大量多糖和 B 族维生素，以及辅酶、核糖核酸等有益成分，并产生浓郁的醇香或酒香味，动物诱食效果明显；乳酸菌可以调节动物机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率，并抑制肠道内有害微生物生长繁殖，维护动物机体健康。粪肠球菌(Enterococcus facealis)是人和动物肠道内主要菌群之一，能产生天 然抗生素，有利于机体健康；同时还能产生细菌素等抑菌物质，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境，还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降。

在当前养殖条件下，为保证养殖动物的健康，提高机体免疫能力，已经开始研究饲料应用益生菌或中草药用以替代抗生素。通过改变肠道微生物区系，克服抗生素和化学药物的不良后果，有促生长、防病治病、保健等作用，能显著提高畜禽品质，提高饲料利用率等。

在现有技术中，公开了多种利用微生物发酵饲料的生物发酵饲料及其制备方法。CN106387336 A 公开了一种玉米浆发酵饲料及其生产方法，主要是给玉米浆(所述玉米浆发酵饲料按重量组份计主要包括：玉米浆 10-50 份、玉米皮 10-30 份、麸皮 5-10 份、玉米粉 10-20 份、豆粕 5-10 份、乳酸菌 2-10 份、甘露聚糖 110 份、混合菌液 1-6 份、酵母菌 0.5-1.5 份、复合抗氧化剂 0.1-0.5 份、螺旋藻粉 3-5 份、磷酸氢钙 2-4 份、纳豆激酶 0.1-0.2 份等)中加入玉米皮、麸皮、玉 米粉、豆粕，再加入混合菌液、乳酸菌、甘露聚糖、 酵母菌进行不同阶段的好氧、厌氧发酵，可以有效的降低玉米浆中的毒素指标，并充分利用玉米浆中的有益物质，再加入复合抗氧化剂、螺旋藻 粉、磷酸氢钙、纤维素酶、乙基麦芽酚、鱼骨粉、小 肽螯合铁、纳豆激酶多种饲料添加剂。

CN106858038 提供一种益生菌发酵饲料，其特点是：所述发酵饲料是由以下重量份的原料制成：纳豆芽胞杆菌 0.5-1.0 份，乳酸菌 0.7-1.2 份，酵母菌 0.3-0.8 份，发酵基质 30-60 份，提供一种发酵饲料的制造工艺，发酵基质分为 A、B 两部分，纳豆芽胞杆菌种和酵母菌种植入基质 A，把乳酸菌种植入基质 B，把基质 B 加入粘合剂制成密闭的球块，再把两种基质混合进行固体发酵。

CN107549494 公开了一种以构树叶为主料的发酵猪饲料，其特征在于，由以下原料各组分的重量份组成： 构树叶 64-66 份，玉米

粉 33-34 份，葡萄糖 0.3-0.4 份，磷酸氢二钾 0.05-0.15 份，硫酸镁 0.005-0.015 份，硫酸锰 0.005-0.015 份，淀粉酶 0.05-0.15 份，低聚糖酶 0.05-0.15 份，纤维素酶 0.04-0.06 份，复合菌 0.05-0.07 份，其中复合菌由枯草芽孢杆菌 0.005-0.015份，地衣芽孢杆菌 0.005-0.015

份，酿酒酵母 0.005-0.015 份，植物乳杆菌 0.005-0.015 份，布氏乳杆菌0.005-0.015 份和鼠李糖乳杆菌 0.005-0.015 份组成。发酵过程中产生大量的乳酸等天然抑菌物质，抑制腐败菌生长，延长构树叶的保鲜保质期，同时发酵过程中产生大量风味物质，对动物有极强的诱食作用，发酵后的饲料很好的保存了原有鲜绿饲料中的营养物质，大大提升饲料的品质。

此 外 还 有 其 他 利 用 秸 秆 类 发 酵 饲 料 的 技 术 ， 例 如CN105724760A 公开了一种农作物秸秆发酵饲料，所述农作物秸秆发酵饲料以农作 物秸秆为原料，利用包含纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、植物乳杆菌和布氏乳杆菌的酶 菌复合剂发酵而成。 CN105341325A 提供了一种用于秸秆青/黄贮饲料发酵的酶菌复合添加剂。所述酶菌复合添加剂中包含肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、布氏乳杆菌、纤维素酶、木聚糖酶以及β-葡聚糖酶。本发明提供的酶菌复合添加剂喷洒到秸秆中进行青/黄贮发酵后，能够 有效破除秸秆青/黄贮饲料中特殊的木质素-纤维素-半纤维素复合体结构，改善秸秆青/黄贮饲料的发酵品质。CN105211644A 一种秸秆发酵醇化饲料方法，包括：选料，按照要求选择秸秆；铡短、粉碎，将秸秆铡至 3cm 至 5cm 长短，用粉碎机粉碎至 4 至 10 目的碎粒；掺拌发酵剂， 将发酵菌剂与秸秆均匀混合；掺水，向所述秸秆内加入 40℃ 至 60℃的热水，所述秸秆与热水 的重量比为 100:85-100；装容器发酵，将所述秸秆装入发酵容器中密封，密封发酵 5 天以上。

生物发酵可以使得传统农产品类饲料原料中不易被动物分解吸收、利用的蛋白质、纤维素、果胶质、各类有机酸、淀粉等复杂大分子物质降解为易于被动物消化吸收的小分子物质，大幅度提高原料的营养价值和利用率，并通过发酵来改善和提高饲料的适口性，促进畜禽的采食欲；同时由于微生物本身及其所产生的各类生物活性物质可以促进动物体内有益微生物菌群的生长，抑制有害菌群的繁殖，从而减少动物疫病的发生。

但是，生物发酵饲料存在两个严重缺陷，第一个缺陷是营养结构的合理性没有得到根本解决，严重缺乏非植物性蛋白来源：生物发酵主要作用在于使得传统农产品类饲料营养组分变得更加容易吸收，提高营养物质利用率，没有从根本上解决营养配比的问题，因此鱼粉、骨粉类动物性蛋白资源仍然是必不可少的添加剂。然而，鱼粉、骨粉、虾粉类动物性蛋白资源价格昂贵，资源缺乏，严重压缩了养殖利润空间，带来了不利的经济效益。在这种形势下，新的动物性蛋白资源开发显得尤为重要。

第二个缺陷是生物发酵饲料本身不具备优良的抗菌作用，不能代替抗生素的作用，无法解决抗生素的使用问题。

面对抗生素的滥用难题，越来越多的现有技术中提供了中草药作为替代品。例如，粉碎中草药作为直接添加剂，或利用微生物发酵中草药，提高动物免疫力，来代替或减少使用抗生素。目前已有大量现有技术直接采用中草药制剂作为饲料添加剂或作为发酵原料(或发酵原料的一部分)直接进行发酵。

例如，CN107788237 公开了一种生物饲料关键功能性营养物及其发酵 与中药共制形成方法，该方法包括如下步骤：根据饲料所需的关键营养组分选取发酵底物，根据 待发酵特定微生物的需要，配制成液体发酵培养基；根据关键营养物所提供的功能选取中药成份 (例如益母草、甘草、当归、黄芪；丹参、樱桃树皮、红花、当归等等)，在发酵培养基中加入水和中药组分，搅拌后，高压蒸汽灭菌并同步熬制中药；灭菌后冷却，得 到含有熬制中药的发酵培养液；在发酵培养液中 接入备好的种子菌液，持续发酵，得到含有中药 熬制液的发酵液，形成生物饲料所需的关键功能性营养物。

CN106260639 公开了一种含有中药六神曲和益生菌的仔猪饲料添加剂，由六神曲、凝结芽孢杆菌菌粉、纳豆芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉、粪肠球菌菌粉、植物乳杆菌菌粉、鼠李糖乳杆菌菌粉、唾液乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉混合制成；同时，添加的 8 种益生菌具有维持肠道正常微生物菌群、提高免疫力、提高营养物质的消化吸收等功能。所述饲料添加剂包括：六神曲 88-96 份、凝结芽孢杆菌菌粉 0.5-1.5 份、纳豆芽孢杆菌菌粉0.5-1.5 份、酿酒酵 母菌粉 0.5-1.5 份、粪肠球菌菌粉 0.5-1.5 份、植物乳杆菌菌粉0.5-1.5 份、鼠李糖乳杆菌菌 粉 0.5-1.5 份、唾液乳杆菌菌粉 0.5-1.5 份、嗜热链球菌菌粉 0.5-1.5 份等。

CN106306463 公开了一种以小麦秸秆和酒糟为原料 生产猪发酵饲料的新工艺，其通过将中药( 包括虎杖 10-16 份、野菊花 15-25 份、金银花 8-12 份、薄荷 11-13 份、小蓟 5-7 份、黄芪 10-16 份、杜仲 7-11 份、厚朴 6-10 份、银杏叶 5-11 份、地榆 8-12份、石菖蒲 7-11 份、制何首乌 16-22 份、生地 11-15 份、十大功劳 6-8 份、紫花地丁12-14 份、仙鹤草 13-17 份、菟丝子 14-18 份、玄参 11-14 份、徐长卿 8-12 份、茯苓 4-7 份、柴胡 11-14 份)、小麦秸秆以及酒糟混合后采用菌种发酵制备得到。

CN107873981 公开了一种幼猪饲料，由以下组分按重量份进行配比，包括：发酵豆粕 30-40 份、豆粕 10-20 份、麦麸 510 份、玉米粉 5-10 份、米糠 8-12 份、木薯粉 5-10份、酒糟 5-10 份、虾壳粉 3-5 份、蚕蛹粉 2-3 份、混合果蔬粉 4-8 份、植物油 1-2 份、茶叶粉 2-3 份、复合酶制剂 2-3 份、益生菌制剂 1-2 份、中药提取物 2-3 份；所述中药提取物的制备方法如下： 分别将广藿香根茎、干茯苓、白术根茎、白芷根茎、厚朴皮、钩藤茎枝、白蒺藜果、苍术根 茎、木香根茎放入到清洗罐中，加入温度为 40-50℃的温水搅拌清洗2 次，每次清洗 20-30min，清洗的过程中在清洗罐中加入直径 1-2cm 的陶瓷块；将清洗后完成后的清洗液过滤除渣，得初料，将所得初料烘干，得次料、分别将广藿香、茯苓、白术、白芷、厚朴、钩藤、白蒺藜、苍术、木香次料碾碎，过 50 目筛，得中药粉，将所得中 药粉按重量份数比 2：（1-2）：（2-3）：（1-2）：（2-3）：（2-4）：3：（1-2）：2 的比例混合均匀，得混合粉，将所得混合粉与纤维素酶，营养液按重量份数比为 100:1:500 的比例混合，匀速搅拌30-45min，得混合液，将所述混合液高温沸煮一段时间后转小火直至熬煮呈粘稠状。

由此可见，越来越多的现有技术将各种各样的中药作为抗生素替代品，但是大多是通过提高动物免疫力来间接达到降低抗生素使用的目的。但是，其仍然存在各种弊端。即使不考虑成本性，其抗菌效果也值得商榷（尤其考虑到中药药效多依赖于组分配伍性和加工方法）。

另外，中草药制剂作用缓慢，且价格较高大幅增加了养殖成本，而且由于中草药生产工艺和使用方法的差异，导致不同的作用效果差异较大。

最后，相比将中草药粉碎成粉末添加方式，中草药发酵本身也并不能增强中药的疗效或增强草药原有性能，反而容易导致中药毒性成分的释放或削弱原有的药效功能。甚至，草药中的抗菌组分能够抑制或干扰正常发酵微生物的正常生长代谢。

更糟糕的是，中草药组分大量使用时，特有的各种强烈刺激气味严重削弱了饲料的适口性，降低了诱食效果。

因此，能够完全或部分替代抗生素的更有效的天然抗菌组分选择以及合理制剂方式成为现代养殖业迫切需要解决的技术问题之一。

发明内容

为克服现有技术饲料的上述缺点与不足，本发明提供一种含天然抗菌组分包埋物的微生物发酵复合无抗饲料及其制备方法。

具体地，本发明的技术方案如下。

本发明的第一个目的，本发明提供一种含天然抗菌组分的微生物发酵复合无抗饲料，其包括基于好氧-厌氧复合菌种联合分段发酵的发酵物料、包埋处理的复合天然抗菌组分、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及至少包含大豆蛋白基氨基酸/多肽复合螯合物的添加剂，所述好氧-厌氧复合菌种包括：乳酸菌、枯草芽孢杆菌、选自产朊假丝酵母或酿酒酵母的酵母菌，以及粪肠球菌。

本发明的第二个目的，本发明提供上述微生物发酵复合无抗饲料的制备方法，包括：(1)菌种培养、菌种混合；(2)联合分段发酵：包括发酵基础料配制、发酵基础料初次发酵，以及发酵混合料的配制、二次扩大发酵；(3)二次发酵料、天然抗菌组分包埋物以及添加剂的复配。

具体地，本发明所述方法包括菌种培养、菌种混合，发酵基础料配制，发酵基础料初次发酵，天然抗菌组分提取、淀粉包埋，配制包含药材滤渣、发酵助剂的发酵混合料，发酵混合料二次扩大发酵，含非植物源蛋白/多肽的添加剂制备，最终发酵料与天然抗菌组分、添加剂复配，产品封装等步骤。

本发明中，具体地，所述复合无抗饲料由复合菌种联合分段发酵的发酵物料与复合天然抗菌组分、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及添加剂按照一定的比例通过复配混匀，从而制备得到。

本发明中，所述基于好氧-厌氧复合菌种联合分段发酵的发酵物料由所述好氧-厌氧复合菌种通过对发酵原料进行二次发酵制备得到。

其中，所述发酵原料由发酵基础料、提取天然抗菌剂有效组分后的药材滤渣以及发酵助剂组成；进一步地，按重量份数计，所述发酵基础料、药材滤渣以及发酵助剂的用量比为：90-95 份，1-5 份，

0.5-2 份。

进一步地，所述发酵基础料包括脱脂豆粕、麸皮、玉米胚芽粕、玉米皮和脱酚棉粕；发酵助剂包括葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、氧化锌以及由蛋白酶、低聚糖酶、纤维素酶组成的复合酶。

进一步地，所述二次发酵工艺包括发酵基础料初次发酵和添加药材滤渣以及发酵助剂后的混合发酵原料的二次发酵。

进一步地，所述复合天然抗菌组分为能够遮蔽药物组分气味的具有核壳结构的抗菌组分-淀粉包埋颗粒物；其中，所述天然抗菌组分由至少包含牛至、百里香、肉桂的含有效抗菌组分的药材中提取得到。

进一步地，所述非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂为高纯微生物基蛋白/多肽组分，由微生物体中采用破碎法提取或酶解得到。

进一步地，所述非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂为微生物基蛋白或微生物基多肽，其由单一微生物体获取得到。

进一步地，所述非植物源蛋白由酵母菌经工业发酵制备得到，成本更低，菌体纯度更高。所述非植物源多肽多肽由所述非植物源蛋白酶解得到。

可选地，所述非植物源多肽也可以由市售酵母蛋白粉经过酶解得到。

进一步地，所述至少包含大豆蛋白基氨基酸/多肽复合螯合物的添加剂包括：大豆蛋白基多肽螯合锌、大豆蛋白基多肽螯合铁组成的复合螯合物，乙基麦芽酚，酸化剂甲酸钙，双乙酸钠，氯化钠，碳酸氢钠，谷氨酸钠，氯化胆碱以及微量元素等。

其中，所述添加剂组分除大豆蛋白基多肽螯合锌/铁的复合螯合物之外，还包括：乙基麦芽酚，酸化剂甲酸钙，双乙酸钠，氯化钠，碳酸氢钠，谷氨酸钠，氯化胆碱以及微量元素。按重量份计，所述添加剂各组分用量比例分别为：9-10 份，1-2 份，3-5 份，1-2 份，

10-15 份，4-5 份，1-2 份，0.5-1 份，0.1-0.5 份。进一步地，所述微量元素按重量比例包括：硫酸锰 40-60%、硫酸铜 30-50%、碘化钾

1-10%以及亚硒酸钠 0.5-1%。

本发明中，优选地，所述天然抗菌组分提取自由牛至、百里香、肉桂、金银花、鱼腥草、黄芪组成的药材组。

进一步地，上述药材按重量份数计，用量为：牛至 50-65 份、百里香 20-30 份、肉桂 20-25 份、 金银花 8-12 份、鱼腥草 15-20 份、黄芪 5-10 份。

可选地，天然抗菌组分可进一步添加人工合成的鱼腥草素亚硫酸氢钠盐。

本发明中，所述天然抗菌组分通过如下方法提取得到：

按重量份称取下列药材：牛至 50-65 份、百里香 20-30 份、肉桂 20-25 份、金银花 8-12 份、鱼腥草 15-20 份、黄芪 5-10 份，粉碎至长度小于 2cm 的碎料，除尘除杂，以5-8 倍重量的蒸馏水，以及 0.5-1 倍重量的无水乙醇作为溶剂，在闪式提取器中进行闪式提取 2-5min，重复提取 2-3 次，控制提取温度为 50-70℃，过滤，收集滤液；滤渣用 5 倍质量的 90%乙醇水溶液分散，在 50℃以及 300-400W 超声辅助下超声震荡提取 30-50min，过滤，将过滤后的药材滤渣烘干，粉碎，留待后用；将得到的滤液，与上述闪提滤液合并，减压蒸除或回收溶剂，浓缩提取物，从而得到饲料用复合抗菌提取物浓缩液，其中含有牛至油、肉桂醛、百里香酚等有效抗菌组分。

进一步地，本发明所述具有核壳结构的抗菌组分-淀粉包埋颗粒物制备步骤如下：

将 30-35wt%的淀粉乳液，磁力搅拌器上匀速搅拌至均匀，加入羧甲基纤维素钠、结冷胶以及上述步骤制得的复合抗菌提取物浓缩液(与水的密度比为 1.02-1.08)，按重量份数计，淀粉乳液、提取物浓缩液、结冷胶、羧甲基纤维素钠用量分别为 80-90 份、5-10份、1-2份、1-1.5 份；所得混合溶液在均质机中均质，将均质后的混合液静电喷雾干燥，制得能够减少药材刺激气味的具有核壳结构的抗菌组分-淀粉包埋颗粒物，从而达到延长有效组分保质期并提高饲料添加剂的适口性的效果。

本发明所述饲料中，按重量份计，所述最终发酵物料、复合天然抗菌组分包埋物、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及添加剂的用量分别为：90-100 份，1-3 份，2-5份，0.5-2 份。

具体地，本发明所述饲料的制备方法中：

本发明所述发酵菌种包括：乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌(选自产朊假丝酵母或酿酒酵母中的一种或两种)，以及粪肠球菌。

本发明中，发酵工艺采取发酵基础料初次发酵和混合料的混合二次发酵结合的分批发酵方式，从而达到充分发酵基础料并防止草药滤渣过度发酵带来的抗菌效应和代谢毒性问题。

具体地，基于好氧-厌氧复合菌种联合分段发酵的发酵方法具体

步骤如下：S1：培养菌株并将菌种按照比例复配成复合菌液

(1)发酵菌株的培养

首先将各个菌株接种至各自合适的斜面培养基上，在适当的条件下培养得到斜面种子，再将斜面种子接种到摇瓶液体培养基上，得到一级种子液；将得到的对数生长期一级种子液接种到液体发酵罐培养基上，扩大培养得二级种子。其中，所得的二级种子发酵液经复配得到混合后的复配菌液(含乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌)，用于转接到发酵车间的饲料原料罐中进一步生产发酵。

各个菌株的具体培养条件如下：

将乳酸菌、粪肠球菌菌种以 0.5%-1%的接种量接种至斜面培养基中，36-37℃厌氧条件下培养 24-36 小时，收集形成的斜面种子；按照 5%-10%的接种量将斜面种子接种到摇瓶液体培养基中，在30-35℃的厌氧条件下继续发酵培养 0.5-1 天，获得种子液；然后将种子液按照 10% 的接种量接种到液体发酵罐培养基中，然后在30-32℃的厌氧条件下发酵扩大培养 3-4 天至发酵液 pH＜5，得到乳酸菌、粪肠球菌二级种子发酵液。

将枯草芽孢杆菌、酵母菌菌种以 0.5%-1%的接种量接种至斜面培养基中，36-37℃培养 24-36 小时，收集形成的斜面种子；按照5%-10%的接种量将斜面种子接种到摇瓶液体培养基中，在 30-35℃ 的有氧条件下继续发酵培养 0.5-1 天，获得种子液；然后将种子液按照 10%的接种量接种到液体发酵罐培养基中，然后在 30-32℃的有氧条件下发酵扩大培养 3-4 天至发酵液 pH＜6，得到枯草芽孢杆菌、酵母菌二级种子发酵液。

其中，各菌株培养基按重量计的组成为：枯草芽孢杆菌(斜面培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 2%； 摇瓶液体培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 2%；发酵罐培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，葡萄糖 2.5%，硫酸镁0.2%；pH7.0 ，余量为水);酵母菌(斜面培养基：牛肉膏 0.5%，酵母提取物 1%，蛋白胨 2%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 1%； 摇瓶液体培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 2%； 发酵罐

培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，葡萄糖 1.5%，蔗糖 5%，硫酸钾 0.2%，甘油0.5%；pH 7.0，余量为水);粪肠球菌及乳酸菌(斜面培养基：牛肉膏 0.4%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 2%，磷酸二氢钾 0.2%；硫酸镁 0.25%、蔗糖 5%； 摇瓶液体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨 1.8%，酵母提取物 0.5%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 3%；发酵罐培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨 2.5%，酵母提取物 1%，乳糖

0.2%，葡萄糖 1%，蔗糖 2%，碳酸钙 0.3%，VB 0.05%，pH 值 6.5-6.6，

余量为水)。

(2)配制复合菌液(含乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌)：

培养后将各菌种二级种子发酵液调整浓度为 3-5×10⁹CFU/g，其中将乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌按比例配制成二级种子复合菌液；二级种子复合菌液中各菌液重量百分比为：乳酸菌 35-50％、枯草芽孢杆菌 15-30％、酵母菌 20-40％。

S2：发酵原料的选择与配制本发明中，发酵原料由发酵基础料、提取天然抗菌组分后的药

材滤渣料以及发酵助剂组成，按重量份数计其用量比例为：90-95 份，

1-5 份，0.5-2 份。

发酵基础料包括脱脂豆粕、麸皮、玉米胚芽粕、玉米皮和脱酚棉粕；各组分的重量份数为：脱脂豆粕 30-40 份，麸皮 20-25 份，玉米胚芽粕 15-30 份，脱酚棉粕 5-10 份。

药材滤渣料为经干燥粉碎后的颗粒。

按重量百分比计，发酵助剂包括：葡萄糖 60-70%，磷酸氢二钾

5-10%，硫酸镁 1-2%、氧化锌 0.5-1.5%、复合酶 20-30%(其中按重量

比计蛋白酶 40％、低聚糖酶 20%、纤维素酶40％)。S3：发酵基础料的初次发酵具体步骤如下：

(1)按比例称取作为发酵基础料的各组分，粉碎过筛控制粒度在 40-80 目，在均质混合机中进行充分混合；在 120-125℃ 灭菌 20 -30min，冷却至室温。

(2)向灭菌冷却后的发酵基础料均匀喷种上述步骤制备的二级发酵种子液混合菌种，混合菌液用量比例为发酵基础料重量的 5%，并

加入 4-5％的玉米糖浆溶液，混合均匀，蒸馏水控制水分含量 30-35%，在带有通气阀的呼吸膜固态发酵袋中进行初次发酵。发酵车间的发酵温度控制 32-37℃，发酵时间30-36h，开始发酵后每隔 7-8 小时通气 0.5-1 小时，通气两次后进行厌氧发酵，从而得到初次发酵料。

S4：混合料的二次发酵步骤如下：

(1)混合：合并各发酵袋中的初次发酵料，将按比例称取好的药材滤渣与发酵助剂与初次发酵料混合均匀，随后转移至带有通气阀的固体发酵罐中；基于全部发酵料重量，喷洒补充混合二级发酵种子液 3%，并喷洒接种粪肠球菌二级发酵种子液 1.5-2%；并向发酵罐中再添加 1-3%粗蔗糖、3-4%玉米浆(固形物质量分数 30-40%)和0.1-0.2%的磷酸二氢钙，并控制发酵料的最终水分含量在 35％-40%。

(2)联合发酵：控制发酵温度 32-35℃，前期发酵阶段(发酵罐未明显升温前)定时通风，间隔 4-6h 打开通气阀往发酵罐中通气 0.5-1h，维持有氧发酵 1.5-2 天；随后进入厌氧阶段后保持密封状态，厌氧发酵 2-3 天至 pH＜5 结束发酵，得到扩大发酵后的混合二次发酵料。

本发明中，所述复合无抗饲料的制备还包括复配步骤：将含有复合微生物的二次发酵工艺最终发酵物料、复合天然抗菌组分-淀粉包埋物、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及所述添加剂按合适比例用量进行复配，从而得到所述复合无抗饲料。

优选地，复配过程中，所述复合无抗饲料中最终发酵物料、复合天然抗菌组分包埋物、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及添加剂的重量份用量分别为：90-100 份，2-3份，3-5 份，0.5-1.5 份。

具体地，本发明所述非植物源蛋白为高纯微生物基蛋白，微生物的培养可采用现有技术的一般方法和常规培养基，具体流程可参考本领域的现有技术；亦可采用市售的工业生产干燥菌体为原料制备。

可通过如下步骤制得：

(1)首先将巴斯德毕赤酵母菌株接种至试管斜面培养基(蛋白胨2%，酵母膏 1%，葡萄糖 2%，琼脂粉 2%，余量为水)上培养得斜面种子；试管斜面种子接种到液体培养基(酵母膏 1%，葡萄糖 2%，蛋白胨 2%，余量为水)上，培养得一级种子，接种到 pH 值为 5.0 的二

级种子液体培养基（碳酸钙 0.2%，硫酸钾 0.8%，硫酸镁 0.6%，85%磷酸 1.5%，甘油 4%，硫酸铵 3%，玉米糖浆 2%，余量为水，调 PH 5.5）上，培养得二级种子；将二级种子移种到发酵罐内的添加有0.01%复合微量元素(按重量份计，复合微量元素包括：硫酸铜 10份，碘化钾 0.05-0.1 份，硫酸锰 4-5 份，钼酸钠 0.1-0.2 份，硼酸 0.1-0.2

份，氯化锌 20-35 份，硫酸亚铁 50-60 份)的 100 升发酵罐培养基(主成分同二级液体培养基)中进行甲醇为碳源的发酵生产。

(2)向发酵罐内加入甲醇(流量 5-10 克/（升.小时），通气保持罐内溶氧，并每隔12 小时补加微量元素溶液和硫酸铵，发酵 3 天，至发酵液湿重达到 300g/L 以上结束发酵。发酵结束后，灭活，静置沉降 2h，获得微生物沉降液。将沉降液洗涤并继续沉降 1-2次，随后将菌体溶液加入溶菌酶(终浓度 1g/L)，37℃维持溶酶作用 2-3h，然后送入高压匀浆器中破碎细胞，压滤，取滤液，弃菌体碎片，收集滤液，将滤液浓缩，喷雾干燥并紫外灭菌，得到高纯微生物基蛋白干粉。

具体地，所述非植物源多肽(微生物蛋白基多肽)通过如下步骤制得：

将上述获得的微生物蛋白粉用水溶解稀释，并控制最终稀释液的质量浓度 50-60%，在 45℃下加入复合蛋白酶粉，至蛋白酶浓度50-100U/g，进行酶解 10-16h，灭活，纳滤膜过滤，收集酶解液，超滤浓缩，向获得的浓缩液中添加 50%的淀粉乳液并在均质机中均匀，喷雾干燥，即得微生物蛋白基多肽。

本发明中所用的微生物蛋白或多肽是饲料中植物源蛋白或多肽的有益补充，相比脱脂豆类，蛋白含量更高，可利用氮源也更高，兼具有丰富的氨基酸、矿物质及维生素，甚至可作为人类食品添加剂。在饲料中，其不仅能够代替常规饲料中鱼骨、鱼粉等动物蛋白或复合氨基酸添加剂以及复合维生素的使用，还具有明显的酵香味，具有增鲜剂效果，能够显著提高饲料的适口性。

另外，破菌提取的酵母菌体内容物蛋白质含量高，必需氨基酸在内的各种氨基酸组分齐全，并富维生素和矿物质，而且工业乙醇为原料的发酵方式避免了杂菌或有害菌的生长，所得酵母蛋白纯度

高，是非常优良的饲料蛋白，能够大量减少豆粕类谷物蛋白的使用量。

本发明中，至少包含大豆蛋白基氨基酸/多肽复合螯合物的添加剂组分包括：大豆蛋白基多肽螯合锌/铁的复合螯合物，乙基麦芽酚，酸化剂甲酸钙，双乙酸钠，氯化钠，碳酸氢钠，谷氨酸钠，氯化胆碱以及微量元素；按重量份计，所述添加剂各组分用量比例为：9-10

份，1-2 份，3-5 份，1-2 份，10-15 份，4-5 份，1-2 份，0.5-1 份，

0.1-0.5 份。所述微量元素按重量比例包括：硫酸锰 40-60%、硫酸铜

30-50%、碘化钾 1-10%以及亚硒酸钠 0.5-1%。

本发明中，所述大豆蛋白基多肽螯合锌/铁组成的复合螯合物的制备步骤如下：

(1)将饲料级大豆分离蛋白配制成 60-70%水溶液，在 50-60℃均质搅拌机中搅拌混合均匀，使大豆分离蛋白充分溶解，随后加入复合蛋白酶(含酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶)；基于大豆分离蛋白溶液，各蛋白酶的添加标准为：酸性蛋白酶 100-150U/g，碱性蛋白酶和中性蛋白酶 200-250 U/g；42-45℃搅拌酶解 6-8 小时，得酶解蛋白液，加热灭酶；

(2)将酶解后的含大豆蛋白基多肽的溶液用蒸馏水进一步稀释至

30-40%，加入等体积的质量浓度为 25-30％的硫酸亚铁和等体积的

5-10％的醋酸锌溶液，调节 pH 值为 6.0-6.2，在 50-55℃下进行螯合

反应 4-5h，螯合反应结束减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，制得大豆蛋白基多肽螯合锌/铁复合螯合物。

本发明所使用的大豆蛋白基多肽是蛋白质水解产物，通常是小分子肽，即由 10个以内的氨基酸组成的小分子量肽混合物。大豆蛋白基多肽相比大豆蛋白，在动物体内的消化吸收明显更快。根据大豆蛋白活性肽的生物学功能相关研究，证明包含小分子肽的大豆多肽在动物胃肠道中不受抗营养因子的干扰而直接被吸收，并且这些小分子肽能刺激动物瘤胃内纤维分解菌的生长，故小分子大豆蛋白基多肽是优良的饲料添加剂。

同时，本发明中小分子肽与微量元素的螯合物属于第三代微量元素添加剂，是新型有机矿物元素添加剂，具备稳定性好、生物效价高、易消化吸收、抗干扰性强等特点，比直接添加常规微量元素具有更高的利用效率，并协同了大豆蛋白基多肽的优点，相比现有技术常规大豆蛋白或微量元素添加剂，具有明显的进步性。

本发明中，所述制备得到的复合无抗饲料新鲜湿料可直接饲喂动物；或将封装的新鲜饲料成品放入低温库储存；或采用低温烘干干燥，使其水分含量低于 3％，并封装待用。

进一步地，所述复合无抗饲料湿料也可在全价料中作为添加剂使用；按重量百分比计，添加用量比不低于 30%，优选地，不低于

50%。

本发明的有益效果:与现有技术相比，本发明的有益效果包括但不限于以下：

1.本发明的无抗饲料具备更加营养和合理的营养结构，并创造性引入了高纯的非植物性蛋白及更易消化吸收的微生物多肽(具有丰富的必须氨基酸、矿物质微量元素及多种维生素，以及增鲜剂增香剂的效果)、饲料级大豆蛋白基多肽来源，代替了鱼粉、骨粉类动物性蛋白以及微量元素、复合必须氨基酸和多种微量元素等常规的必需添加剂组分，降低了饲料成本，并提高了饲料适口性。

而且，本发明所使用的微生物基蛋白除了可利用甲醇等原料作为原料生产，还可利用制糖、造纸、淀粉、木材加工碎屑等废料废液发酵生产，来源广泛，价廉易得。

2.相比将贵重的中草药粉碎成粉末添加或直接微生物发酵的方式，本发明对天然抗菌药材的利用更加合理有效，药渣也加以利用，原料利用率达到 100%；而且分批发酵的方式避免了药材的过度或深度发酵带来的代谢毒性问题，并避免了药材中的抗菌组分对发酵微生物的抑制和干扰作用。

3、相比药材熬煮或直接浸提使用，本发明复合抗菌有效组分的提取更加充分，所需时间更短，关键的是有效组分包埋处理工艺不仅消除了中药有效组分特有的刺激气味，避免了饲料诱食性和适口性的降低，而且避免了有效组分被氧化/抗菌效果下降、延长保质期，并使得微量药物组分的添加量更加可控、饲料中的分散性更加均匀；而包埋物淀粉可以在胃中快速崩解，从而达到快速释放有效抗菌组分的目的，不影响抗菌效能的发挥。

4.本发明所使用的复合抗菌有效组分包括百里香酚、肉桂醛、牛至油等多种抗菌化合物，不仅对枯草杆菌、金黄色葡萄菌、白色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、伤寒甲杆菌、肺炎球菌、肠炎沙门氏菌和霍乱弧菌等有害菌具有明显抑制作用，起着消毒杀菌的作用，还具有治消化不良、健脾消食以及治疗多种因细菌感染引起的疾病的功能，安全、高效、广谱，是优良的天然抗生素和促动物生长的饲料添加剂；加之饲料中富含大量有益活菌产生多种抗菌物质，如乳酸菌素、嗜酸菌素、杆菌肽以及有机酸、过氧化氢等，抑制病原菌的生长繁殖，调节动物肠道，增强免疫力，抗病性强，可大大缓解养殖业对抗生素的依赖。

4.本发明的大豆蛋白基多肽及其螯合物是小分子肽形成的优异添加剂，在动物胃肠道中吸收速度快，在补充氨基酸、微量元素的基础上，还具备刺激瘤胃内纤维分解菌的生长等功能。

5.相比本领域普通的微生物直接发酵方式，本发明在单向排气的呼吸袋和发酵装置中采取分段联合发酵工艺，即好氧发酵-兼性厌氧发酵(初次发酵阶段)-厌氧发酵为主(二次发酵阶段)的发酵工艺；发酵初期的通气和初次发酵后转移过程，为中底层物料中好氧微生物提供了额外的氧气，有利于好氧微生物的生长繁殖和更彻底的发酵。

同时，药材提取滤渣的后期加入避免了药渣的深度发酵，而且发酵基础料经过二次发酵过程发酵更充分，发酵助剂例如酶制剂的存在使得发酵料抗营养因子降解更彻底，积累的有益代谢产物更加丰富，相比单一发酵，显著提高饲料营养成分合理性和饲料品质。

6.本发明通过微生物发酵饲料和天然抗菌组分的组合，有益于动物肠道菌群平衡，可防止畜禽消化道菌群失调，提高动物机体免疫功能，减少抗生素的使用，使畜禽肉制品无抗生素药物残留，动物体内不产生耐药性，显著提高动物肉质品质。

综上所述，本发明无抗饲料制备方法简单，适合大规模生产，具有良好的应用前景和市场价值。

具体实施方式

下面通过具体的制备例和实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

实施例 1

天然抗菌组分包埋物的制备

(1)有效成分提取

按下列重量份比例称取下列药材：牛至 60 份、百里香 30 份、肉桂 25 份、金银花 10 份、鱼腥草 15 份、黄芪 10 份，除尘除杂，并粉碎至长度小于 2cm，共得碎料3300g，以 20L 蒸馏水以及 2L 无水乙醇组成溶剂，在闪式提取器中进行闪式提取 2min，重复提取 3 次，控制提取温度为 60℃，过滤，收集滤液；滤渣用 5 倍质量的 90%乙醇水溶液分散，在 50℃以及 300W 超声辅助下超声震荡提取 45min，过滤，将过滤后的药材滤渣烘干，粉碎，留待后用(作为发酵原料之一)；将超声震荡提取得到的滤液，与上述闪提滤液合并，减压蒸除回收溶剂，浓缩提取物，从而得到浓稠液体状的饲料用复合抗菌提取物浓缩液约 360ml，其中含有牛至油、肉桂醛、百里香酚等有效抗菌组分。

(2) 包埋处理以制备具有核壳结构的抗菌组分-淀粉包埋颗粒物将 35wt%的玉米淀粉乳液 900ml，在磁力搅拌器上匀速搅拌至均

匀，加入羧甲基纤维素钠、结冷胶以及上述步骤制得的复合抗菌提取物浓缩液(按重量份数计，淀粉乳液、提取物浓缩液、结冷胶、羧甲基纤维素钠用量比分别为 90 份:10份: 2 份:1 份)；所得混合溶液在均质机中均质，将均质后的混合液静电喷雾干燥，制得能够减少药材刺激气味的具有核壳结构的抗菌组分-淀粉包埋颗粒物约 350g。

实施例 2

菌种培养及复合菌液的配制

(1) 菌种培养

本发明所适合的菌种为常规的可饲用菌种或可食用菌种。

本实施例所选菌种包括：选自植物乳杆菌(Lactobacillus platarum)

的乳酸菌、枯草芽孢杆菌、复合酵母菌(产朊假丝酵母与酿酒酵母的任意组合)，以及粪肠球菌。所述菌种均依据《饲料添加剂品种目录》(农业部颁布)中的可饲用菌种选择；具体地，优选例如枯草芽孢杆菌

CCTCC NO:M 2011328、植物乳杆菌 CICC NO:21790 及产朊假丝酵母 CICC NO:31430 等。

S1:菌株的培养

乳酸菌、粪肠球菌培养：将乳酸菌、粪肠球菌菌种以 0.5%的接种量接种至斜面培养基(斜面培养基：牛肉膏 0.4%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 2%，磷酸二氢钾 0.2%；硫酸镁 0.25%、蔗糖 5%，余量为水)中，36-37℃厌氧条件下培养 24 小时，收集形成的斜面种子；按照 5%的接种量将斜面种子接种到摇瓶液体培养基(牛肉膏0.5%，蛋白胨 1.8%，酵母提取物 0.5%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 3%；余量为水)中，在 35℃的厌氧条件下继续发酵培养 1 天，获得种子液；然后将种子液按照 10%的接种量接种到液体发酵罐培养基（牛肉膏0.3%，蛋白胨 2.5%，酵母提取物 1%，乳糖 0.2%，葡萄糖 1%，蔗糖

2%，碳酸钙 0.3%，VB 0.05%，pH 值 6.5-6.6，余量为水）中，然后

在 30-32℃的厌氧条件下发酵扩大培养 3 天，得到乳酸菌、粪肠球菌二级种子发酵液。

枯草芽孢杆菌、复合酵母菌培养：将枯草芽孢杆菌、等量组合的酵母菌菌种以0.5%-1%的接种量接种至斜面培养基中，36-37℃培养 24-36 小时，收集形成的斜面种子；按照 5%-10%的接种量将斜面种子接种到摇瓶液体培养基中，在 30-35℃的有氧条件下继续发酵培养 0.5-1 天，获得种子液；然后将种子液按照 10%的接种量接种到液体发酵罐培养基中，然后在 30-32℃的有氧条件下发酵扩大培养 4 天至发酵液 pH＜6，得到枯草芽孢杆菌、复合酵母菌二级种子发酵液。

其中，枯草芽孢杆菌、酵母菌培养基的组成为：

枯草芽孢杆菌(斜面培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，氯化钠0.5%，葡萄糖 2%；摇瓶液体培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 2%；发酵罐培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨 1%，葡萄糖 2.5%，硫酸镁 0.2%；pH7.0，余量为水);酵母菌(斜面培养基：牛肉膏 0.5%，酵母提取物 1%，蛋白胨 2%，氯化钠 0.5%，葡萄糖 1%；摇瓶液体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，葡萄糖2%； 发酵罐培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，葡萄糖 1.5%，蔗

糖 5%，硫酸钾 0.2%，甘油 0.5%；pH 7.0，余量为水)。

培养结束后将各菌种二级种子发酵液用蒸馏水调整浓度为

5×109CFU/g。

(2)配制乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌组成的复合菌液：

将乳酸菌、枯草芽孢杆菌、复合酵母菌二级种子发酵液按比例配制成二级种子复合菌液；二级种子复合菌液中各菌液重量百分比为：乳酸菌液 40％、枯草芽孢杆菌液20％、复合酵母菌液 40％。

实施例 3A

混合二次发酵物料 A 的制备包括发酵基础料初次发酵和混合料的混合二次发酵，具体步骤如

下：S1：选择上述实施例制备的复合菌液以及粪肠球菌菌液；S2：发酵原料的选择与配制

发酵原料由发酵基础料、提取天然抗菌组分后的药材滤渣料以及发酵助剂组成，发酵基础料由脱脂豆粕、麸皮、玉米胚芽粕、玉米皮和脱酚棉粕组成。发酵原料的具体组成为：脱脂豆粕 40 份，麦麸皮 20 份，玉米胚芽粕 25 份，脱酚棉粕 5 份；天然抗菌剂提取滤渣料 3 份；助剂：葡萄糖 0.6 份，磷酸氢二钾 0.05 份，硫酸镁 0.01 份、氧化锌 0.01份、复合酶 0.3 份(蛋白酶 40％、低聚糖酶 20%、纤维素酶

40％)，共计 95kg。

S3：发酵基础料的初次发酵

(1)将按上述比例称取的发酵基础料各组分混合，粉碎过筛控制粒度在 60-80目，并在均质混合机中进行充分混合；在 120℃灭菌 20min，冷却至室温。

(2)向灭菌冷却后的发酵基础料均匀喷种上述实施例 2 制备的乳酸菌、枯草芽孢杆菌、复合酵母菌组成的混合菌液，混合菌液用量比例为发酵基础料重量的 5%，并喷洒入4％重量比的工业玉米糖浆溶液(总糖质量分数约 50%)，混合均匀，用蒸馏水调整水分含量35%，在带有单向通气阀的呼吸膜固态发酵袋中进行初次发酵。发酵车间的发酵温度控制35℃，发酵时间 30h，开始发酵后每隔 8 小时通气 0.5 小时，通气两次后进行厌氧发酵，从而得到初次发酵料。

S4：混合料的二次发酵

(1)混合：快速合并各发酵袋中的初次发酵料至带有通气阀的固体发酵罐中，将按比例称取好的药材滤渣与发酵助剂与初次发酵料混合均匀；基于全部发酵料重量，补充喷洒混合二级发酵种子菌液 3%，并喷洒接种粪肠球菌二级发酵种子液 2%；并向发酵罐中再添加重量比例为 3%的粗蔗糖、3%重量的玉米浆(超微玉米粉溶解于水制得，固形物质量分数 40%)和 0.2%的磷酸二氢钙，并控制发酵料的最终水分含量在 35％。

(2)联合发酵：控制发酵温度 32-34℃，前期发酵阶段(发酵罐未明显升温前)定时通风，间隔 6h 打开通气阀往发酵罐中通气 0.5h，维持有氧发酵 2 天；随后进入厌氧阶段后保持密封状态，厌氧发酵 3 天结束发酵，测得 pH4.7，得到扩大发酵后的混合二次发酵料 A。

所得发酵料充分发酵，湿润松软，具备微酸的醇香气味；于 3 处不同位置分别取1g 发酵料置于 50mL 无菌生理盐水中震荡，粗纤过滤取滤液 1-2 微升，蒸馏水稀释并涂布平板进行活菌计数，测得生物有益菌数均达到 10⁹cfu/g 级别，其中乳酸菌、酵母菌高达3.8×10⁹cfu/g 级别，基本不含大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌。

实施例 3B

混合二次发酵物料 B 的制备发酵原料的具体组成为：

按重量比计，脱脂豆粕 30 份，麦麸皮 25 份，玉米胚芽粕 30 份，脱酚棉粕 8份；天然抗菌剂提取滤渣料 2 份；葡萄糖 0.7 份，磷酸氢二钾 0.1 份，硫酸镁 0.02 份、氧化锌 0.01 份、复合酶 0.2 份(蛋白酶40％、低聚糖酶 20%、纤维素酶 40％)；原料共计约 96kg。

发酵步骤和流程与实施例 3A 基本相同，制得得到扩大发酵后的混合二次发酵料B，性状特点基本与发酵料 A 相同。

实施例 4

(1)非植物源蛋白(微生物基蛋白)的制备本实施例采用毕赤酵母，以甲醇为碳源进行培养制得，具体通过

如下步骤制备：

发酵培养：首先将巴斯德毕赤酵母菌株 ( 已知酵母，保藏号 CCTCC NO:M2012342，中国典型培养物保藏中心)接种至试管斜面培养基(蛋白胨 2%，酵母膏 1%，葡萄糖 2%，琼脂粉 2%，余量为水)上培养得斜面种子；试管斜面种子接种到液体培养基(酵母膏1%，葡萄糖 2%，蛋白胨 2%，余量为水)上，培养得一级种子，接种到 pH 值为 5.0 的二级种子液体培养基（碳酸钙 0.2%，硫酸钾 0.8%，硫酸镁 0.6%，85%磷酸 1.5%， 甘油 4%，硫酸铵3%，玉米糖浆 2%，余量为水，调 PH 5.5）上，培养得二级种子；将二级种子移种到发酵罐内的添加有 0.01%复合微量元素(按重量份计，复合微量元素包括：硫酸铜 10 份，碘化钾0.05-0.1 份，硫酸锰 4-5 份，钼酸钠 0.1-0.2 份，硼酸 0.1-0.2 份，氯化锌 20-35 份，硫酸亚铁 50-60 份)的 100 升发酵罐培养基(主成分同二级液体培养基)中进行甲醇为碳源的发酵生产。向发酵罐内加入甲醇(流量 5 克/（升.小时），通气保持罐内溶氧，并每隔12 小时补加微量元素溶液和硫酸铵，发酵 3 天，至发酵液湿重达到 300g/L 以上结束发酵。

(2)高纯微生物基蛋白干粉制备发酵结束后，微生物高温灭活，静置沉降 2h，获得微生物沉降液。

将沉降液洗涤并继续沉降 1-2 次，随后将浓缩的菌体溶液加入溶菌酶(终浓度1g/L)，37℃维持溶酶作用 2-3h，然后送入高压匀浆器中破碎细胞，压滤，取滤液，弃菌体碎片，收集含菌体蛋白内容物的滤液，将滤液浓缩，喷雾干燥并紫外灭菌，得到高纯微生物基蛋白干粉。

实施例 5

非植物源多肽(微生物多肽)的制备将上述实施例 4 获得的微生物蛋白粉用蒸馏水溶解稀释，并控制

最终稀释液的质量浓度 50%，在 45℃下加入复合蛋白酶粉，至蛋白酶浓度 50U/g，进行酶解 16h，灭活，纳滤膜过滤，收集酶解液，超滤浓缩，向获得的浓缩液中添加 50%的淀粉乳液至适当浓度，并在均质机中均匀，喷雾干燥，紫外灭菌，即得微生物蛋白基多肽。

实施例 6

大豆蛋白基多肽螯合锌/铁组成的复合螯合物的制备

(1)将饲料级大豆分离蛋白配制成 60%水溶液，在 60℃均质搅拌机中搅拌混合均匀，使大豆分离蛋白充分溶解，随后加入复合蛋白酶(含酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶)；基于大豆分离蛋白溶液，各蛋白酶的添加标准为：酸性蛋白酶 100U/g，碱性蛋白酶和中性蛋白酶各 200 U/g；42℃搅拌酶解 8 小时，得酶解蛋白液，加热灭酶；

(2)将酶解后的含大豆蛋白基多肽的溶液用蒸馏水进一步稀释至

30%，加入等体积的质量浓度为 30％的硫酸亚铁和等体积的 10％的醋酸锌溶液，调节 pH 值为 6.2，在 55℃下进行螯合反应 4h，螯合反应结束减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，制得大豆蛋白基多肽螯合锌/铁复合螯合物。

实施例 7

添加剂的配制

本实施例中，所用的添加剂为：上述实施例制备的大豆蛋白基多肽螯合锌/铁的复合螯合物，乙基麦芽酚，酸化剂甲酸钙，双乙酸钠，氯化钠，碳酸氢钠，谷氨酸钠，氯化胆碱以及微量元素；按重量份计，所述添加剂各组分用量比例为： 10 份， 2 份，3 份，1 份，15份， 5 份， 2 份， 1 份，0.1 份。所述微量元素具体组分及按重量比例包括：硫酸锰 60%、硫酸铜 30%、碘化钾 9%以及亚硒酸钠 1%。

实施例 8A

复合无抗饲料 A 制备

将上述实施例 3A 制备的含有复合微生物的二次发酵物料以及上述相应实施例1 制备的复合天然抗菌组分-淀粉包埋物、实施例 4-5 制备的非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及实施例 7 制备的所述

含有大豆蛋白基多肽螯合锌/铁的复合螯合物添加剂，按重量比例为： 100 份、3份、3 份、1 份的用量进行复配，从而得到所述复合无抗饲料约 98kg。

实施例 8B

复合无抗饲料 B 制备

将上述实施例 3B 制备的二次发酵物料以及上述相应实施例制备的复合天然抗菌组分-淀粉包埋物、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及所述含有大豆蛋白基多肽螯合锌/铁的复合螯合物添加剂，按重量比例为：95 份、2.5 份、4 份、1.5 份的用量进行复配，从而得到所述复合无抗饲料 B 约 96kg。

所述制备得到的复合无抗饲料新鲜湿料可直接饲喂动物；或将封装后放入低温库储存；或采用低温烘干干燥，使其水分含量低于 3％，并封装待用。

对比实施例 1

不含非植物源蛋白/多肽复合补充剂的实施例 8A 的无抗饲料(即，去除非植物源蛋白/多肽复合补充剂的实施例 8A 饲料)。

对比实施例 2

仅含有实施例 3A 中所述混合二次发酵料 A 的饲料。

对比实施例 3

仅含有实施例 3A 中所述发酵基础料的初次发酵物的饲料。

效果实施例 1抑菌效果测试

以大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）作为测试菌种。

(1)取低温冻存的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌解冻后接种到常规培养基中，在 37℃培养箱中震荡培养 12-16h 至对数期；(2)将本发明的复合天然抗菌组分浓缩液喷雾干燥制备成粉末状，并按梯度浓度与相应菌种培养基混合均匀，梯度浓度差为 0.5-1mg( 抗菌组分粉末)/mL(培养基)；高温灭菌，冷却培养基并置于琼脂平皿中，得到含梯度浓度抗菌组分的抗菌平皿培养基；(3)移取 1μL 菌液点种于抗菌平皿中，多点点种(优选 8-10 点)，每点菌量级约 10⁵CFU；(4)将接种后的抗菌平皿于 37℃恒温培养箱中培养 24h；24h 后，生长的菌落形成直径鲜明的菌落圈(约为 5mm)；若菌落被抑制生长，则无菌落圈出现。

阳性对照组：琼脂平皿不含抗菌组分，点种菌种。空白对照组：琼脂平皿不含抗菌组分，不点种菌种。

实验结果表明：提取的复合天然抗菌组分对大肠杆菌(最小抑菌浓度平均为1.5mg/mL)和金黄色葡萄球菌(最小抑菌浓度为 2mg/mL)均有显著的抑制作用，能够作为饲料中有效的抗菌组分，可以代替或适当减少饲用抗生素的使用。

效果实施例 2饲料饲喂效果

实验方法：选取品种相同、体重 25 公斤左右的 60 日龄健康仔猪 120 头，分为实验组 1A、实验组 1B、对比组 1、对比组 2、对比组 3 以及空白对照组，每组包括 20 头。饲喂方式：自由采食，自由饮水，连续饲喂 35 天，不添加抗生素；取第 6-35 天的平均日增重、平均料肉比(消耗饲料重量与体增重比值)、期间患病个体数目(含腹泻、感染、流感等异常病症)进行记录。

实验组的仔猪分别饲喂本发明实施例 8A、实施例 8B 的饲料，对照组的仔猪分别饲喂本发明对比实施例 1-3 的饲料，空白对照组饲喂实施例 3 中未发酵的发酵基础料。

结果如下表所示：

表 1

由上表可知，含有抗菌组分的本发明饲料实验组没有仔猪患病情形出现，不含抗菌组分的对照组有患病个体出现；试验组比空白对照组和对比组平均日增重增加明显，料肉比显著降低，差异具有显著性。

这说明本发明无抗饲料有益于动物肠道菌群平衡，提高动物机体免疫力，降低发病率，显著促进体重生长，达到提高日增重、降低料肉比的效果，证明本发明饲料与普通的饲料相比营养结构合理，消化率高，易吸收。

同样地，类似上述类似的评价体系，将上述组别的饲料作为全日饲料对 100 只体重相近的健康产蛋鸡进行饲喂，观察并记录两周的料蛋比(消耗饲料与产蛋重量之比)平均数据。结果表明，饲喂蛋鸡两周的实验组 1A、实验组 1B 、对比组 3 以及空白对照组的饲料的料蛋比均值分别为 1.89、1.87、2.31、2.45；在产品品质上，实验组蛋黄颜色更黄，空白对照组蛋黄颜色相对较淡。

由此可以看出，本发明饲料可明显降低蛋鸡的料蛋比，提升鸡蛋营养质量，其经济效益非常显著。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (4)

1.一种含天然抗菌组分的微生物发酵复合无抗饲料，包括：基于好氧-厌氧复合菌种联合分段发酵的发酵物、复合天然抗菌组分包埋物、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及至少包含大豆蛋白基多肽锌/铁复合螯合物的添加剂，其中所述好氧-厌氧复合菌种包括乳酸菌、枯草芽孢杆菌、选自产朊假丝酵母或酿酒酵母的酵母菌，以及粪肠球菌；其中，按重量份计，所述发酵物、复合天然抗菌组分包埋物、非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂以及至少包含大豆蛋白基多肽锌/铁复合螯合物的添加剂的用量分别为：90-100份，1-3份，2-5份，0.5-2份；

其特征在于，所述基于好氧-厌氧复合菌种联合分段发酵的发酵物由所述好氧-厌氧复合菌种通过对发酵原料进行二次发酵制备得到；其中，所述发酵原料由发酵基础料、提取天然抗菌剂有效组分后的药材滤渣以及发酵助剂组成，按重量份数计，发酵基础料、药材滤渣以及发酵助剂的用量比为：90-95份，1-5份，0.5-2份；所述发酵基础料包括脱脂豆粕、麸皮、玉米胚芽粕、玉米皮和脱酚棉粕；发酵助剂包括葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、氧化锌以及由蛋白酶、低聚糖酶、纤维素酶组成的复合酶；

所述二次发酵工艺包括发酵基础料初次发酵和添加药材滤渣以及发酵助剂后的混合发酵原料的二次发酵；

所述复合天然抗菌组分为能够遮蔽气味的具有核壳结构的抗菌组分-淀粉包埋颗粒物，所述天然抗菌组分由至少包含牛至、百里香、肉桂的含有效抗菌组分的药材中提取得到；

所述非植物源蛋白/多肽复合营养补充剂为高纯微生物基蛋白/多肽组分，由微生物体采用破碎法提取或酶解得到；

所述至少包含大豆蛋白基多肽锌/铁复合螯合物的添加剂包括：大豆 蛋白基多肽螯合锌、大豆蛋白基多肽螯合铁组成的复合螯合物，乙基麦芽酚，酸化剂甲酸钙，双乙酸钠，氯化钠，碳酸氢钠，谷氨酸钠，氯化胆碱以及微量元素；

其中，所述天然抗菌组分包埋物中的抗菌组分提取自由牛至、百里香、肉桂、金银花、鱼腥草、黄芪组成的药材组；所述复合天然抗菌组分包埋物通过如下步骤制备得到：

(1)按重量份称取下列药材：牛至50-65份、百里香20-30份、肉桂20-25份、金银花8-12份、鱼腥草15-20份、黄芪5-10份，粉碎至长度小于2cm的碎料，除尘除杂，以蒸馏水和无水乙醇为溶剂，在闪式提取器中进行闪式提取2-5min，重复提取2-3次，控制提取温度为50-70℃，过滤，收集滤液；滤渣用5倍质量的90％乙醇水溶液分散，在50℃以及300-400W超声辅助下超声震荡提取30-50min，过滤，将过滤后的药材滤渣烘干，粉碎，留待后用；将得到的滤液，与上述闪提滤液合并，减压蒸除或回收溶剂，浓缩提取物，从而得到饲料用复合抗菌提取物浓缩液，其中含有牛至油、肉桂醛、百里香酚有效抗菌组分；

(2)将30-35wt％的淀粉乳液于磁力搅拌器上匀速搅拌至均匀，加入羧 甲基纤维素钠、结冷胶以及上述步骤制得的复合抗菌提取物浓缩液，按重量份数计，淀粉乳液、提取物浓缩液、结冷胶、羧甲基纤维素钠用量分别为80-90份、5-10份、1-2份、1-1.5份；所得混合溶液在均质机中均质，将均质后的混合液静电喷雾干燥，制得天然抗菌组分淀粉包埋颗粒物。

2.如权利要求1所述的微生物发酵复合无抗饲料，其特征在于，所述大豆蛋白基多肽锌/铁复合螯合物的制备步骤如下：

(1)将饲料级大豆分离蛋白配制成60-70％水溶液，在50-60℃均质搅拌机中搅拌混合均匀，使大豆分离蛋白充分溶解，随后加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶组成的复合蛋白酶；基于大豆分离蛋白溶液，各蛋白酶的添加标准为：酸性蛋白酶100-150U/g，碱性蛋白酶和中性蛋白酶200-250U/g；42-45℃搅拌酶解6-8小时，得酶解蛋白液，加热灭酶；

(2)将酶解后的含大豆蛋白基多肽的溶液用蒸馏水进一步稀释至30-40％，加入等体积的质量浓度为25-30％的硫酸亚铁和等体积的5-10％的醋酸锌溶液，调节pH值为6.0-6.2，在50-55℃下进行螯合反应4-5h，螯合反应结束减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，制得大豆蛋白基多肽锌/铁复合螯合物。

3.如权利要求1所述的微生物发酵复合无抗饲料，其特征在于，所述至少包含大豆蛋白基多肽锌/铁复合螯合物的添加剂包括：大豆蛋白基多肽锌/铁复合螯合物，乙基麦芽酚，酸化剂甲酸钙，双乙酸钠，氯化钠，碳酸氢钠，谷氨酸钠，氯化胆碱以及微量元素；按重量份计，所述添加剂各组分相应用量比例为：9-10份， 1-2份，3-5份，1-2份，10-15份，4-5份，1-2份，0.5-1份，0.1-0.5份；所述微量元素按百分重量比包括：硫酸锰40-60％、硫酸铜30-50％、碘化钾1-10％以及亚硒酸钠0.5-1％。

4.权利要求1所述的无抗饲料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌种培养、菌种混合；

(2)联合分段发酵：包括发酵基础料配制、发酵基础料初次发酵，以及发酵混合料的配制、二次扩大发酵；

(3)二次发酵料、天然抗菌组分包埋物以及添加剂的复配。