CN108752280A - 热休克蛋白结合化合物、组合物以及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及热休克蛋白结合化合物、组合物以及其制备和使用方法。本发明涉及由通式(I)或(I')表示的化合物或其医药学上可接受的盐；含有至少一种所述化合物的医药组合物；制备至少一种所述化合物的方法；使用至少一种所述化合物治疗和/或预防各种癌症和/或增生性病症的方法；使用至少一种所述化合物监测抗癌疗法针对各种癌症的有效性的方法。在一个实施例中，本发明涉及以一定特异性水平结合于热休克蛋白70 Hsp70的化合物。在另一实施例中，本发明涉及以一定特异性水平结合以抑制热休克蛋白70 Hsp70与热休克同源蛋白70 Hsc70的化合物。

Description

热休克蛋白结合化合物、组合物以及其制备和使用方法
本申请为申请日2010年08月17日，申请号201080036818.9，名称为“热休克蛋白结合化合物、组合物以及其制备和使用方法”的发明专利申请的分案申请。
本发明部分是在政府支持下依据NIH R01 CA119001进行。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及由本文揭示的通式表示的化合物或其药理学上可接受的盐；含有所述化合物的医药组合物；制备所述化合物的方法；使用所述化合物治疗和/或预防各种恶性肿瘤或增生性病症的方法；使用所述化合物鉴别治疗和/或预防各种恶性肿瘤或增生性病症的物质的方法；使用所述化合物鉴别用于临床研发治疗和/或预防各种恶性肿瘤或增生性病症的物质的生物标记物的方法；和使用所述化合物鉴别其在组合疗法中的合理使用的方法。具体地说，本发明涉及作为热休克蛋白70(Hsp70)的小分子调节剂的化合物。在另一实施例中，本发明涉及占据位于Hsp70核苷酸结合部位外部的Hsp70变构袋的小分子以及鉴别、表征和使用所述小分子的方法。
背景技术
癌细胞常常高水平表达若干热休克蛋白(HSP)，这些热休克蛋白加强这些肿瘤的攻击性，并且也允许所述细胞在致命条件(包括被疗法杀死)中存活下来。除了赋予治疗抗性以外，升高的HSP表达也通过抑制程序性细胞死亡以及促进自主性生长促进癌症。
主要的HSP为Hsp90和Hsp70，它们是以相互关联但又不同的方式起作用以调控恶性表型的蛋白质。Hsp90维持若干致癌蛋白的转化能力，其中HER2、AKT、RAF1、IGF-IR 和HIF-1的功能由Hsc70、组成性Hsp70、诱导性Hsp70同功异型物促进。在抑制Hsp90 时，Hsp90客户(client)致癌蛋白变得不稳定并通过蛋白酶体通路降解(图1a)。转录因子HSF-1(热休克反应的主调控子)是另一个Hsp90客户，并且不像致癌蛋白，其在Hsp90受到抑制时变得活化。HSF-1活化引起Hsp70含量升高，此为某些肿瘤中限制 Hsp90抑制剂效力的反馈反应。Hsp70本身是一种强大的抗细胞凋亡分子，表明通过增加Hsp70含量抑制内在与外在细胞凋亡通路可减弱Hsp90抑制的作用。除了抑制细胞凋亡以及帮助Hsp90以外，Hsp70和其高度同源的胞质同功异型物提供许多其它重叠的伴侣蛋白功能并在一些情况下可相互替代。
Hsp90多伴侣蛋白复合物(又称Hsp90超级伴侣蛋白(super-chaperone)机构)通过调控驱动和支持若干恶性肿瘤的客户蛋白而在致病性细胞转化的发生和发展中起重要作用。Hsp90多伴侣蛋白系统的活性通过伴侣蛋白的复杂系统维持和实现。Hsp70(组成性表达的Hsc70和热诱导性Hsp70-1和Hsp70-6)参与初始步骤，而Hsp90参与后期阶段(图1a)。它们的功能需要大量的辅助伴侣蛋白，例如Hsp70-调控子、Hsp40、Hsp110、 BAG和HIP；HSP组织蛋白(HOP)(参与使客户从Hsp70传到Hsp90的中间分子伴侣蛋白复合物的形成)，以及其它，例如p23、cdc37和免疫亲和素(在最终或成熟Hsp90 复合物上起作用)(图1a)。用通过直接结合于Hsp90的调控腺苷三磷酸酶袋起作用的药剂(例如格尔德霉素(geldanamycin，GM)以及PU衍生物PU24FC1和PU-H71(图1b)) 抑制Hsp90机构干扰成熟复合物的形成，将客户蛋白引向蛋白酶体降解(图1a)。有趣的是，据报导Hsp90的活性降低而非Hsp70或辅助伴侣蛋白HOP、HIP、p23和Hsp40 表达的降低显著活化HSF-1。此观测结果的一个值得关注的结果是不像Hsp90机构的致癌蛋白客户，HSF-1活化无需Hsp70。
虽然直接Hsp90抑制的重要性现已充分了解，并且目前已在多种癌症的临床评估中用于研发小分子抑制剂，但是关于干预Hsp90机构活性的替代方式所知甚少。以除直接Hsp90抑制以外的方式干扰伴侣蛋白机构可区分其若干功能，并赋予特定的生物活性。
发明内容
总之，考虑到癌症中HSP之间的复杂相互影响以及肿瘤细胞对这些蛋白质的内在依赖性，并不意外在抑制一种HSP时，细胞发展通过另一种HSP的作用来平衡此功能丧失的机制。因此，例如本文的本发明中所描述的同时靶向一种以上HSP的方法较可能进行成功治疗。
因此，本发明提供通过特异性调节Hsp70伴侣蛋白来区分Hsp90分子机构的两种功能(即调控致癌蛋白和抑制HSF-1)的化合物和方法。
本文描述新颖化合物以及其制备和使用方法。在本发明的一个实施例中，本文描述的化合物可用于调节细胞生长，例如抑制恶性细胞和/或增加针对癌细胞的细胞毒性。在另一实施例中，本文描述的化合物可充当热休克蛋白70(Hsp70)调节剂。因而，发现使用这些或其它化合物在药理学上调节Hsp70在癌细胞中具有重要且广泛有益的影响。在其它实施例中，本文描述的化合物可在不破坏或降解非致癌激酶的情况下破坏Hsp90 机构/致癌蛋白复合物的形成，引起若干致癌蛋白的蛋白酶体降解。在其它实施例中，本文所述化合物的抗癌作用可包含例如抑制增殖、转化特异性阻断细胞周期、诱导细胞凋亡或降低侵袭性。
在本发明的另一实施例中，描述如本文所述的重要活性可通过以不可逆或可逆结合模式相互作用的物质组合物实现。在一个具体实施例中，这些化合物与Hsp70相互作用。在另一实施例中，其与本文描述的在Hsp70上的变构部位相互作用。
在一个实施例中，提供人类Hsp70的同源模型。在本发明的另一实施例中，使用所述同源模型合理设计调节哺乳动物Hsp70活性的化合物。此同源模型将适用于通过包括(但不限于)合理药物设计和虚拟筛选在内的方法发现本发明的化合物。
在其它实施例中，提供位于Hsp70和Hsc70核苷酸结合部位外部的变构袋(allosteric pocket)。此袋的天然或合成小分子配体未知。在其它实施例中，提供用小分子配体占据此袋将会例如抑制增殖、转化特异性阻断细胞周期、诱导细胞凋亡或降低侵袭性。此袋将适用于发现本发明的化合物。候选化合物可通过若干方法用计算机提供。所述方法的实例包括将分子片段组装成候选化合物；重新设计候选化合物；修饰已知结合于此部位的化合物，包括本文描述的组合物，以形成候选化合物；以及(并非最后地)筛选候选化合物的数据库。
根据另一实施例，尚无已知天然存在或合成产生的配体的Hsp70蛋白中的空腔在被如本文所述的本发明化合物以对正常细胞无毒的剂量占据时抑制恶性细胞生长、抑制异常细胞周期进程、降解和抑制若干致癌蛋白、诱导细胞凋亡以及降低癌细胞的侵袭潜能。根据另一实施例，其它小分子配体以对正常细胞无毒的剂量占据此尚未探测到的袋将引起所有以下作用或其子集(但不限于)：抑制恶性细胞生长、抑制异常细胞周期进程、降解和抑制若干致癌蛋白、诱导细胞凋亡和降低癌细胞的侵袭潜能。
在其它实施例中，提供发现占据此袋的配体的方法。在其它实施例中，提供用小分子配体占据此袋将会导致Hsp90与Hsp70致癌通路的双重抑制。此处描述的Hsp70中的新颖结合空腔和相互作用模式也代表设计具有类似作用机制和治疗用途的抑制剂的一个有价值的出发点。虽然每次靶向一种HSP具有其明显的治疗意义，但是本文提供的实施例显示，通过同时抑制Hsp70与Hsc70，可获得抑制Hsp90的有益作用，即耗尽肿瘤中驱动例如增殖、存活和转移等恶性过程的致癌蛋白，并获得抑制Hsp70的细胞凋亡作用。最后，一个实施例描述一种抑制位于Hsp70和Hsc70核苷酸结合部位外部的变构袋的新颖癌症靶向策略。
在本发明的其它实施例中，提供包含以本文描述的本发明化合物在癌细胞中的重要且广泛有益的影响来评估候选化合物起作用能力的若干方法中的一者或一者以上的策略。所述策略包括在所选癌细胞中测试本文描述的表型结果，执行竞争性荧光偏振检验以测试如本文所述的Hsp90和Hsp70结合，以及用计算机评估候选化合物在本文提及的袋中的结构匹配。所述表型测试包括(但不限于)测试一大组癌细胞中的生长抑制、 HER2+SKBr3乳癌细胞中的HER2和Raf-1降解、MOLM-13AML细胞中的FLT3和 p-STAT5失活、MDA-MB-468三重阴性乳癌细胞中的p-STAT3和p-PDK1失活、LNCaP 前列腺癌细胞中突变的AR降解、一大组癌细胞中的PARP裂解、MOLM-13细胞中的卡斯蛋白酶(caspase)3,7活化、乳癌细胞中干扰素和TNF细胞凋亡作用的加强和一大组癌细胞中Hsp70诱导的缺乏。Hsp70和Hsp90竞争性检验测试候选化合物与癌细胞中表达的HSP的竞争性结合。
在其它实施例中，显示本文描述的化合物使与致癌客户蛋白货物(cargo)形成复合物的Hsp70分离。因此本文所述化合物的固体支撑物固定型式赋予研究内源细胞环境中癌症的Hsp70相互作用组的新颖可能性。
在其它实施例中，本文描述的本发明化合物也可衍生化以形成含有生物素的化合物，其可附接到抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白珠粒，或可直接连接到相应官能化的树脂，例如(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和基质胶树脂。
在另一实施例中，本文描述的化合物可用例如(但不限于)Cy3B、FITC和BODiPY 等荧光染料衍生化。当在本文描述的荧光偏振检验的背景下使用时，此化合物可用于筛选以类似于本文描述的本发明化合物的方式与Hsp70相互作用的候选化合物。
在其它实施例中，使用本文描述的固体支撑物固定的化合物来鉴别致癌活化的通路的不同肿瘤的组分与Hsp70形成复合物。将本文描述的组合物加入特定癌细胞中使这些复合物不稳定、致癌蛋白降解或抑制以及癌细胞生长抑制和死亡。肿瘤Hsp70抑制的这些下游事件可用于在功能上监测本文描述的本发明化合物的作用。因此本文描述的方法有效地分析与对所述本发明的化合物和通过占据本文描述的变构袋起作用或通过本文描述的检验鉴别的其它疗法的反应相关的功能分子生物标记物。提出这些生物标记物适用于临床研发本文描述的物质组合物、占据本文描述的袋的物质组合物或通过本文描述的检验鉴别的物质组合物。
有趣的是，只有Hsp90的活性降低，而非其Hsp90机构辅助伴侣蛋白(例如Hsp70 或HOP、HIP、p23或Hsp40)的活性降低可显著活化HSF-1，并且使用本发明的化合物，有可能通过特异性调控其辅助伴侣蛋白区分分子机构的两种功能。不像直接Hsp90抑制剂，本发明的化合物可能例如既不活化HSF-1，也不诱导保护性反馈热休克反应。在本发明的一个实施例中，化合物在不活化HSF-1和/或不诱导保护性反馈热休克反应的情况下破坏Hsp90机构/致癌蛋白复合物的形成。
当与直接Hsp90抑制相比时，在一些实施例中药理学投予所述化合物例如因细胞凋亡而增加针对癌细胞的细胞毒性，但具有选择性。药理学抑制Hsp70的生物学影响已经通过使用本发明的化合物在恶性细胞中得到表征。已发现Hsp70调节乳癌细胞中STAT1 肿瘤抑制子的脱磷酸化，此为使STAT1肿瘤抑制子失活的新颖机制。在本发明的另一实施例中，本文描述的化合物抑制乳癌细胞中STAT1脱磷酸化的Hsp70加速作用或使其失活，从而通过肿瘤抑制子STAT1的持续活性促进肿瘤抑制。
STAT1是干扰素-(IFN)γ信号传导的主要效应物。IFNγ是T细胞和自然杀手细胞所产生的具有防御肿瘤发生的必要免疫刺激功能的细胞因子。在另一实施例中，发现本文提供的目标组合物加强IFNγ和另一个细胞因子TNFα的作用并允许免疫反应更有效地除掉肿瘤。此对于疫苗疗法试验来说是令人兴奋的发现，表明共投予生物活性干扰素与本文描述的本发明化合物(即占据所述袋的本发明化合物或通过本文描述的检验鉴别的本发明化合物)，可提高疫苗功效并允许使用更小的接种剂量。
附图说明
图1.Hsp90机构伴侣循环(chaperoning cycle)的各个方面。a)Hsp90伴侣循环是一个动态过程，其中客户蛋白呈递到含有Hsp70、Hsp40、HIP和HOP的中间复合物中的Hsp90。在ATP结合和水解后，Hsp90形成含有p23、p50/cdc37和免疫亲和素(IP) 的成熟复合物，其催化Hsp90客户蛋白的构型成熟。例如格尔德霉素(GM)以及嘌呤骨架衍生物PU-H71和PU24FC1等Hsp90抑制剂药物结合于Hsp90的N端ATP结合袋并抑制ATP结合和水解，从而锁住中间复合物中的Hsp90。客户蛋白随后泛素化(可能通过例如CHIP等E3泛素连接酶)并成为蛋白酶体的靶而降解。此为基于一种当前对所述过程的了解的示意图。b)代表性Hsp90抑制剂的结构。
图2.YK类Hsp70相互作用子和YK5-Hsp70复合物的计算机模型的设计。a)Hsp70 的假定结合部位是通过美涛(Maestro)8.5的部位地图(SiteMap)2.2版程序(纽约薛定谔制药软件公司(Schrodinger L.L.C.,NY))预测。部位地图经配置以达到根据部位评分(Sitescore)和成药性评分(Druggability score)排列的5个可能部位。在此研究中，部位地图的所有其它参数都设为缺省值。所呈现的结构是使用人类Hsp70N端结构域 (PDB ID：1S3X)、大肠杆菌(E.coli)DnaK(PDB ID：2kho)和人类Hsp70蛋白质序列构筑的同源模型。若干基于2,5'-硫代二嘧啶骨架的化合物(右)经合理设计以与Hsp70 相互作用。2,5'-硫代二嘧啶骨架用粗体键呈现以便识别。b)半胱氨酸修饰的小分子蛋白质相互作用子的结构。丙烯酰胺官能被团圈出以便识别。c)如通过使用美涛8.5和格莱德(Glide)4.0(薛定谔)进行分子建模所揭露的所提出的YK5与人类 Hsp70同源模型的相互作用。
图3.发现YK5的测试策略。a、b)SKBr3细胞用所指示浓度的抑制剂处理24小时并溶解细胞以进行蛋白质印迹(western blot，WB)分析。β-肌动蛋白用作内部对照。数据与从多个重复实验(n≥3)获得的数据一致。c)所指示抑制剂在SKBr3细胞提取物中与GM-Cy3B竞争结合Hsp90的能力是通过荧光偏振检查。在加有抑制剂的孔中记录的值相对于在对照孔中读取的值标准化并相对于所测试抑制剂的浓度作图。药物一式三份进行检验。所有化合物都以DMSO储备液形式使用。点为平均值；棒为标准偏差。 d)生长抑制：SKBr3细胞一式三份与递增浓度的化合物一起培育，并评估经72小时的生长情况。低于0％的Y轴值表示起始群体细胞死亡。HER2降解如图a)中所分析，并通过光密度法定量凝胶。记录的值相对于对照(仅经媒剂处理的细胞)标准化并且数据相对于YK5浓度作图。误差棒代表平均值的标准偏差(n＝3)。
图4.YK5选择性地与Hsp70和Hsc70相互作用。a)生物素标记的YK5的结构。b) K562细胞用所指示浓度的YK55处理6小时，接着溶解，并在4℃下使蛋白质复合物在抗生蛋白链菌素珠粒(50μl)上沉淀，保持1小时。珠粒用高盐(1M NaCl)缓冲液洗涤，蛋白质通过在2％SDS中煮沸洗脱，在变性凝胶上分离并进行银染色。BB70Ab下拉(pull-down)用以指示Hsp70的位置(BB70IP；2μl)。此抗体识别若干Hsp70同功异型物，例如Hsp70、Hsc70、Grp75和Grp78。HC＝重链。c)SKBr3细胞用所指示浓度的YK5处理24小时并溶解细胞。利用化学沉淀，通过将细胞提取物(500μg)与YK55- 珠粒(50μl)一起培育，分离出蛋白质复合物，用2％SDS洗脱，在变性凝胶上分离并如所指示观察。YK55珠粒通过将YK55(50μM)与抗生蛋白链菌素珠粒(50μl)一起培育来制备。d)来自SKBr3细胞提取物(500μg)的蛋白质复合物通过用YK55-珠粒或惰性分子D-生物素化学沉淀来分离。珠粒是通过将所指示浓度的YK55或D-生物素与抗生蛋白链菌素珠粒(50μl)一起培育来制备。接着蛋白质在变性凝胶上分离并通过蛋白质印迹法分析。e)用YK55-珠粒(100μM YK55加入50μl抗生蛋白链菌素珠粒中) 或Hsp70Ab(5μl Ab加入30μl蛋白G珠粒中)从SKBr3提取物(500μg)沉淀的Hsp70 复合物通过WB来分析。HC＝重链(左)。探查Hsp/c70含量分别通过BB70Ab或IgG 免疫沉淀降低的SKBr3细胞提取物中蛋白质复合物与YK55珠粒的结合。蛋白质通过 WB分析(右)。f)SKBr3提取物与所指示浓度的YK5一起在4℃下培育3小时，接着 Hsp70复合物在YK55-珠粒(100μM YK55加入50μl抗生蛋白链菌素珠粒中)上沉淀。蛋白质通过WB分析。数据与从多个重复实验(n≥3)获得的数据一致。
图5.YK5在结合于Hsp70时与Cys267形成共价键。a)K562细胞用YK55(25μM) 处理所指示的时间，接着溶解，并在4℃下使蛋白复合物在抗生蛋白链菌素珠粒(50μl) 上沉淀，保持1小时。珠粒用高盐(1M NaCl)缓冲液洗涤，蛋白质通过在2％SDS中煮沸洗脱，在变性凝胶上分离并进行银染色。BB70Ab下拉用以指示Hsp70的位置(BB70 IP；2μl)。此抗体识别Hsp70、Hsc70、Grp75和Grp78。HC＝重链。b)实验设置类似于图a)，但蛋白质通过WB分析。c)K562细胞用YK55或D-生物素(50μM)处理6 小时并溶解。提取物(500μg)与抗生蛋白链菌素(ST)-珠粒一起在4℃下培育1小时并且下拉物用高盐缓冲液(1M NaCl)洗涤。蛋白质通过在如方法中所述的缓冲液A或 B中煮沸来洗脱。在变性凝胶上分离后，蛋白质通过WB进行观察。数据与从多个重复实验(n≥2)获得的数据一致。d)YK55结合于癌细胞中的Hsp70的MALDI-reTOF-MS/MS 分析。K562细胞用100μM YK55处理4小时并溶解。经YK55处理的细胞提取物(500 μg)与抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒一起在4℃下培育1小时。珠粒用高盐缓冲液(1M NaCl)洗涤，蛋白质通过在2％SDS中煮沸洗脱，在变性凝胶上分离并进行库马斯(Coomassie)染色。凝胶解析的蛋白质用胰蛋白酶消化并且肽如方法中所指示来鉴别。
图6.YK5抑制Hsp70的核心生物化学功能并破坏Hsp90/Hsp70相互作用。a)测量在YK5(100μM)或媒剂存在下所指示的时间内(左)或在所指示浓度的YK5存在下 60分钟时(右)在30℃下Hsc70和DJA2引起的变性荧光素酶的再折叠。b)测量在30℃下在媒剂(DMSO)或YK5(100μM)存在下与所指示的Hsc70和辅助伴侣蛋白的组合反应的Hsc70腺苷三磷酸酶速率。ADP的产生通过放射性标记的ADP从ATP的薄层色谱分离和磷屏成像分析(下)监测。数据与从多个重复实验(n≥2)获得的数据一致。 c、d)SKBr3细胞用媒剂或所指示浓度的YK5处理24小时(c)或用YK5(10μM)处理所指示的时间(d)。用抗Hsp90和Hsp70抗体(IP：Hsp90或Hsp70)分离或细胞提取物(溶解产物)中存在的蛋白质通过WB分析。结合特异性用对照IgG测试。HC＝重链；DJA1和Hdjl＝Hsp40同功异型物。e)不像Hsp90抑制剂，YK5无法活化HSF-1。SKBr3细胞在42℃下热休克45分钟或与媒剂、YK5或PU24FC1(5μM)一起培育3 小时。蛋白质被施加于非变性凝胶并通过免疫印迹分析。数据与从多个重复实验(n≥3) 获得的数据一致。f)YK5在针对359种激酶的斯坎麦斯(scanMAX)筛选(安比公司 (Ambit))中测试。呈现YK5的TREEspotTM相互作用地图。仅仅c-Met(激酶树上的红点)看似YK5的潜在低亲和力激酶碰撞(hit)。
图7.YK5破坏Hsp90/Hsp70/致癌客户蛋白复合物，导致致癌蛋白不稳定，随后被蛋白酶体降解。a)SKBr3细胞用YK5(10μM)处理所指示的时间。用抗Hsp90抗体 (IP：Hsp90)分离或细胞提取物(溶解产物)中存在的蛋白质通过WB分析。结合特异性用对照IgG测试。HC＝重链。b)SKBr3细胞在媒剂(DMSO)或YK5(10μM)存在下用蛋白质生物合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide)(100μg/ml)处理所指示的时间。WB分析后，蛋白质表达通过光密度法定量并相对于处理时间作图。点为平均值；棒为标准偏差。c)如方法中所述，在加入YK5(10μM)前，SKBr3细胞用所指示的蛋白质水解机构抑制剂预处理。处理24小时后，清洁剂可溶性与不溶性部分中的蛋白质表达通过蛋白质印迹法测定。单独抑制剂对蛋白质加工的作用呈现于右侧图中。
图8.YK系列中的结构-活性关系。a)SKBr3乳癌细胞用所指示浓度的YK衍生物处理24小时并通过蛋白质印迹法分析蛋白质。b)香澄-1(Kasumi-1)细胞与递增浓度的YK衍生物一起培育并用如方法中所指示的阿尔玛蓝(Alamar blue)检验来分析细胞生长的抑制。点为平均值；棒为标准偏差。低于0％的Y轴值表示起始群体细胞死亡。c) 抗生蛋白链菌素珠粒(50μl)与所指示浓度的YK55、YK56或D-生物素一起培育以将相应化合物固定于珠粒上。珠粒(50μl)用SKBr3细胞提取物(500μg)探查，并且沉淀的Hsp70通过蛋白质印迹法分析并通过剂量测定法定量。将来自三个独立实验的结果绘图以确定YK的相对结合亲和力。点为平均值；棒为标准偏差。d)代表性YK的结构。YK55和YK56分别是YK54和YK57的生物素标记衍生物。
图9.(a)本发明化合物的实例以剂量依赖性方式降低过度表达SKBr3HER2的乳癌细胞中HER2和Raf-1致癌激酶的稳态水平，并如PARP裂解所指示，诱导细胞凋亡。细胞用所指示浓度的YK149和YK5处理24小时。溶解细胞并通过蛋白质印迹法分析蛋白质。b)本发明化合物的实例抑制三重阴性乳癌细胞MDA-MB-468中致癌性STAT3 的活性。细胞用化合物或媒剂处理所指示的时间且蛋白质通过蛋白质印迹法分析。(c) 本发明化合物的实例以剂量依赖性方式诱导急性骨髓性白血病细胞MOLM13的细胞凋亡。细胞用所指示浓度的化合物处理24小时，并测量卡斯蛋白酶3,7活性的增加并且与仅经媒剂(DMSO)处理的细胞相比较。卡斯蛋白酶-3,7活性是化合物使卡斯蛋白酶底物Z-DEVD-R110裂解和释放若丹明(rhodamine)的效力的量度。通过比较从经化合物处理的细胞获得的荧光读数与从经媒剂(DMSO)处理的细胞获得的荧光读数，计算凋亡细胞的增加百分比。
图10.(a)本发明化合物的实例以剂量依赖性方式降低三重阴性乳癌细胞 MDA-MB-468中Raf-1致癌激酶的稳态水平，并如PARP裂解所指示，诱导细胞凋亡。本发明化合物的实例以剂量依赖性方式降低过度表达SKBr3HER2的乳癌细胞中HER2 和Raf-1致癌激酶的稳态水平，并如PARP和卡斯蛋白酶-3裂解所指示，诱导细胞凋亡。未观测到Hsp70的相关诱导。本发明化合物的实例以剂量依赖性方式降低表达MOLM-13 突变体FLT3的急性骨髓性白血病细胞中FLT3和p-STAT5的稳态水平。细胞用所指示浓度的化合物处理24小时或用所指示浓度的化合物处理所指示的时间。溶解细胞并通过蛋白质印迹法分析蛋白质。(b)本发明化合物的实例以剂量依赖性方式诱导急性骨髓性白血病细胞MOLM13的细胞凋亡。细胞用所指示浓度的化合物处理24小时，并测量卡斯蛋白酶3,7活性的增加并且与仅经媒剂(DMSO)处理的细胞相比较。卡斯蛋白酶 -3,7活性是化合物使卡斯蛋白酶底物Z-DEVD-R110裂解和释放若丹明的效力的量度。通过比较从经化合物处理的细胞获得的荧光读数与从经媒剂(DMSO)处理的细胞获得的荧光读数，计算凋亡细胞的增加百分比。
图11.(a)本发明化合物的实例以剂量依赖性方式降低过度表达SKBr3HER2的乳癌细胞中HER2和Raf-1致癌激酶的稳态水平，并如PARP裂解所指示，诱导细胞凋亡。细胞用所指示浓度的药剂处理24小时。溶解细胞并通过蛋白质印迹法分析蛋白质。(b) 在三重阴性乳癌细胞MDA-MB-468中，本发明化合物的实例抑制致癌性STAT3的活性，降低Raf-1的稳态水平并诱导细胞凋亡。细胞用所指示化合物处理24小时或用所指示浓度的化合物处理所指示的时间，且蛋白质通过蛋白质印迹法分析。
图12.YK5影响癌症的主要标志：抑制增殖和侵袭性以及使癌细胞的细胞周期停滞。 (a)所指示的癌细胞与递增浓度的抑制剂一起培育并评估经72小时的生长情况。低于0％的Y轴值表示起始群体细胞死亡。药物一式三份进行检验。(b)如方法中所述，向带有体积达约100-200mm3的MDA-MB-468皮下(s.c.)异种移植肿瘤的小鼠(n＝5) 的肿瘤内(i.t)投予YK5或媒剂。肿瘤体积(mm3)由测径规测量值估算。(c)细胞用所指示浓度的YK5处理24小时。DNA含量通过碘化丙啶染色和流式细胞术分析(左)，而蛋白质通过蛋白质印迹法分析(右)。(d)用YK55-珠粒从SKBr3和MDA-MB-468 提取物(500μg)分离的Hsp70客户蛋白通过蛋白质印迹法分析。对照珠粒含有附接的 D-生物素(100μM)。(e)MDA-MB-231乳癌细胞用YK5(1μM)处理24小时并且蛋白质提取物进行免疫印迹(上)或用媒剂或YK5预处理24小时，并定量能够在20小时时间内移动穿过基质胶的活细胞并将数据绘图(下)。点为平均值；棒为标准偏差。数据与从多个重复实验(n≥3)获得的数据一致。
图13.在所选肿瘤中YK5的细胞凋亡作用高于Hsp90抑制剂。(a-d)细胞用所指示浓度的抑制剂处理所提供的时间。(a、b)凋亡的细胞通过如方法中所述的吖啶橙/溴化乙啶双重染色定量。(c、d)细胞凋亡的分子标记物(PARP裂解)是通过蛋白质印迹法在用所指示浓度的抑制剂处理24小时的细胞中分析(c)或在用所指示浓度的抑制剂处理所指示的时间的细胞中分析(d)。(e)MDAMB-468细胞用媒剂、TNFα(20ng/ml)、 YK5(1μM)处理，在TNFα前用YK5预处理2小时或共同处理，并溶解细胞以进行蛋白质印迹分析(左)，或通过分析碘化丙啶染色后的亚二倍体群来定量细胞死亡(右)。数据与从多个重复实验(n≥3)获得的数据一致。点为平均值；棒为标准偏差。
图14.YK5对肿瘤Hsp70具有较高亲和力并选择性地杀死癌细胞。(a-c)细胞用所指示浓度的抑制剂处理所提供的时间，且代谢的活细胞通过如方法中所述的阿尔玛蓝吸收来确定(a)。细胞凋亡的分子标记物(PARP和卡斯蛋白酶-3裂解)是通过蛋白质印迹法在用所指示浓度的抑制剂处理24小时的细胞中分析(b、c)。用媒剂或所指示抑制剂处理24小时的细胞的形态通过光学显微术分析(c)。(d)提取物(500μg)与含有 D-生物素(75μM)的珠粒或加入50μl抗生蛋白链菌素珠粒中的所指示浓度的YK55一起培育过夜。HS＝热休克。(e)SKBr3(200μg)和MRC-5(400μg)提取物以及重组人类Hsp70(2μg)与所指示浓度的YK5一起培育3小时，接着Hsp70复合物在YK55- 珠粒(50μM YK55加入50μl抗生蛋白链菌素珠粒中)上沉淀。将从三个独立实验获得的数据绘图(右)。点为平均值；棒为标准偏差。
图15.附接固体支撑物的YK5、YK55-珠粒以肿瘤特异性方式分离与致癌蛋白形成复合物的Hsp70。(a左和b)用YK55-珠粒或D-生物素-珠粒(100μM YK55或D-生物素分别加入50μl抗生蛋白链菌素珠粒中)从所指示的细胞提取物(500μg)沉淀的Hsp70 复合物通过WB分析。(a右)蛋白质复合物与YK55珠粒的结合在Hsp/c70含量分别通过BB70Ab或IgG免疫沉淀降低的细胞提取物中探查。(c)细胞提取物与所指示浓度的 YK5一起在4℃下培育3小时，接着Hsp70复合物在YK55-珠粒(100μM YK55加入50 μl抗生蛋白链菌素珠粒中)上沉淀。(d)YK5降低Hsp70调控的致癌蛋白的稳态水平。癌细胞用所指示浓度的YK5处理24小时并溶解细胞以进行WB分析。β-肌动蛋白用作内部对照。
图16.Hsp70竞争性荧光偏振检验。将递增浓度的所指示抑制剂一式三份加入检验盘中，并如方法中所指示进行荧光偏振(FP)检验。竞争作用表示为对照物的百分比并通过用各盘中来自抑制剂孔的毫偏振(mP；减去游离cy3B-YK5)值除以来自对照物(cy3B-YK5和利用媒剂DMSO的细胞溶解产物)的平均mP(减去游离cy3B-YK5)计算。将配体结合相对于log10抑制剂浓度作图，并使用非线性最小二乘曲线拟合程序在普瑞姆(Prism)4.0中计算EC50值。点为平均值；棒为标准偏差。
图17.YK5鉴别STAT1和STAT3为乳癌细胞中新颖Hsp70相互作用致癌产物。(a)YK55-珠粒而非生物素-珠粒识别MDA-MB-468提取物中与STAT1和STAT3形成复合物的Hsp70(左)。为研究YK5对STAT稳态水平和活性的作用，细胞用媒剂(DMSO) 或YK5(10μM)处理24小时(右)。(b)目标实例组合物在三重阴性细胞MDA-MB-468 中有效抑制STAT3。活化的STAT3是三重阴性乳癌中重要致癌通路的一部分。
图18.YK5揭露一种抑制STAT1肿瘤抑制子促细胞凋亡作用的新颖机制。(a)YK55珠粒识别MDA-MB-468提取物(500μg)中与p-STAT1和STAT1形成复合物的Hsp70。 (b)蛋白质复合物与YK55珠粒的结合在由BB70Ab或IgG免疫沉淀引起Hsp/c70水平降低的MDA-MB-468细胞提取物中探查。(c)MDA-MB-468细胞用媒剂、IFNγ100 ng/ml)、YK5(10μM)处理7小时，在IFNγ刺激前用YK5预处理2小时或共同处理，并溶解细胞以进行蛋白质印迹分析。(d)细胞用IFNγ100ng/ml)刺激，并且提取物(500 μg)中Hsp70/STAT1复合物通过分别使用D-生物素、YK55-珠粒和Hsp70Ab的化学和免疫沉淀分析。(e、f)细胞在YK5(10μM)存在或缺乏下用IFNγ刺激所示时间，并且其中加入或未加入如方法中所述的十字孢碱(staurosporine)或正钒酸盐。p-STAT1 的含量通过蛋白质印迹法分析并通过剂量测定法定量。来自两个重复实验的数据相对于治疗时间作图。
图19.YK5提高IFNγ活化的STAT1的核含量并增强其与DNA的结合。MDAMB-468 细胞用IFNγ(100ng/ml)处理或用IFNγ(100ng/ml)和YK5(10μM)共同处理。(a) 活化的STAT1(pTyr701)通过免疫荧光显微术，使用与FITC结合的二级抗体测定。核染色用DAPI进行。(b)活化的STAT1结合于STAT共同结合部位(5'-TTCCCGGAA-3') 是通过基于ELISA的检验测定。含于未经处理(白色棒)、经YK5(淡灰色棒)、IFNγ (深灰色棒)或IFNγ与YK5的组合(黑色棒)处理的细胞的溶解产物中且结合于寡核苷酸的活化的STAT1是通过使用抗STAT1抗体检测。检验是在缺乏或存在20pmol含有野生型或突变型STAT共同结合部位的竞争性寡核苷酸下使用经IFNγ处理的细胞(深灰色棒)进行。实验是一式四份进行。结果表示为平均吸光度值(OD450nm)加SEM。
图20.用YK5处理原代AML细胞。YK5杀死母细胞与癌干细胞，但未杀死正常细胞。细胞用递增浓度的YK5处理24小时。(a-b)显示相对于未经处理的对照物的活力％。空心棒：“其它”代表同一患者中的正常细胞(非母细胞)，灰色棒：母细胞(CD45 dim)，红色棒：白血病干细胞(LSC)(CD34+CD38-CD123+)。(c)用YK5处理原代 AML细胞后CFU(集落形成单位)减少。**p<0.001。
图21：全长hHsp70(SEQ ID NO:1)(寄存编号：P08107)、N端hHsp70蛋白(SEQ IDNO:2)(PDB ID：1S3X)、大肠杆菌Hsp70(DNAK)结构(SEQ ID NO:3)(PDB ID： 2KHO)和秀丽隐杆线虫(C.elegans)(PDB ID：2P32)(SEQ ID NO:4)的蛋白质序列的比对。残基批注加有下划线并且保守残基以类似颜色展现。界定变构袋部位1的序列以盒显示。这些序列中的重要氨基酸与本文设计的配体相互作用。
具体实施方式
定义
本文中使用的术语“投予(administer、administering和administration)”是指在合理医学实践中将组合物按一定方式递送到个体以提供治疗作用的任何方法。
本文中使用的短语“衍生物”是指特定化合物或分子的任何水合物、溶剂化物、盐、外消旋物、异构体、对映异构体、前药、代谢物、酯或其它类似物或衍生物。术语“衍生物”也可指对所揭示化合物的改性，包括(但不限于)所揭示化合物的水解、还原或氧化产物。水解、还原和氧化反应是此项技术中已知的。
术语“调节”是指对生物体的生物活性、功能、健康或状况产生影响的方法，其中以符合生物体的一般健康状况和良好状态的方式维持、增强、降低或治疗所述生物活性、功能、健康或状况。术语“增强”生物体的生物活性、功能、健康或状况是指加强、强化、增强或改善的过程。
本文中使用的短语活性剂或成分或者医药活性剂或成分的“有效量”或“治疗有效量”在本文中同义，是指在投药后足以具有治疗作用的医药活性剂的量。医药活性剂的治疗有效量可以、将会或预期会引起症状的缓解。医药活性剂的有效量将随所治疗的一种或一种以上具体病况、病况的严重程度、治疗持续时间、所用组合物的具体组分等因素而变化。
本文在定义式(I)和(I')时使用的短语“任何取代基”意思指可替代氢的任何取代基。在一些实施例中，本文在定义式(I)和(I')时使用的术语“任何取代基”是任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；卤基；任选取代的C2-22酰基；羟基；硝基；氰基；芳氧基；烷氧基；卤代烷氧基；烯氧基；羟基烷基；氨基；烷基氨基；二烷基氨基；环烷基氨基；芳基氨基；二芳基氨基；酰基氨基；氨甲酰基；取代或未取代的酰胺基；烷基酰胺基；烷基磺酰胺基；磺酰胺基；-NHSO2烯基；-NHCO烯基；-NHCO炔基；-CO烯基；-CO炔基；三卤代烃；硫烷基；SO2-烷基；-COO-烷基；-CO烷基；和烷基-CN；或其医药学上可接受的盐或其水合物。在其它实施例中，短语“任何取代基”是指包含可用于鉴别、追踪和或分离化合物的标记或标记物基团的取代基。可用于本文中的标记基团和标记物基团的非限制性实例包括例如荧光基团、生物素基团、抗生物素蛋白基团和酶连接基团。
在命名取代基选择时，例如对于下文的Z和W1-W4，名称是指直接附接到中心结构的基团的类型，且不排除附接到基础取代基的额外官能团。
因此，术语“烷基”是指任选取代的直链、环状或分支状饱和烃基，其中附接到结构其余部分的原子是碳原子。烷基可具有1到24个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。优选本文中的“烷基”含有1到12个碳原子。“低级烷基”是指具有1到 6个，更优选具有1到4个碳原子的烷基。烷基可具有取代基，例如卤素、羟基、烷氧基、氨基、取代和未取代的取代和未取代的酰胺基、磺酰氨基、磺酰胺基、硫氧基、芳基、氰基、羧基、羧酰胺、酰基、硝基、硫基。
术语“烯基”是指任选取代的在一个或一个以上位置处具有碳-碳双键的直链、环状或分支状不饱和烃基，其中附接到结构其余部分的原子是碳原子。烯基可具有2到20 个碳，优选具有2到8个碳。线性烯基包括例如：1-烯基，例如乙烯基、1-丙烯基和1- 丁烯基；和2-烯基，例如2-丁烯基和2-戊烯基。烯基可具有与烷基相同的取代基。
术语“炔基”是指任选取代的在一个或一个以上位置处具有碳-碳三键的分支或未分支不饱和烃基，其中附接到结构其余部分的原子是碳原子。炔基可具有2到20个碳，优选具有2到8个碳。实例包括：1-炔基，例如乙炔基、1-丙炔基和3,3-二甲基-1-丁炔基；和2-炔基，例如2-丙炔基、2-丁炔基和3-苯基-2-丙炔基。炔基可具有与烷基相同的取代基。
术语“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘，通常认为卤基取代有机化合物中的氢原子。在这些卤基中，一般优选氯和氟，其中一般更优选氯。
术语“氨基”涵盖胺N直接键接到中心结构的分子，包括NH2、烷基氨基和烯基氨基。
术语“酰基”是指氢、烷基、部分饱和或完全饱和的环烷基、部分饱和或完全饱和的杂环和芳基取代的羰基。
术语“芳基”是指具有5到约30个碳原子且优选约6到约14个碳原子的取代或未取代的芳香族烃环基团。“芳基”可具有单一环或多个稠合环。当取代基确定为芳基取代基时，芳基环的原子直接键接到结构其余部分的原子。芳氧基取代基是芳基通过-O- 桥连接到结构的其余部分。芳基可具有与烷基相同的取代基以及烷基、烯基或炔基取代基。术语“芳基”包括(但不限于)苯基、α-萘基、β-萘基、联苯、蒽基、四氢萘基、芴基、茚满基、亚联苯基和苊基。“芳基”的定义内特别包括任选取代的芳香族基团。举例来说，在本发明的代表性实施例中，“芳基”任选经1到5个选自由以下组成的群组的取代基取代：酰氧基、羟基、酰基、具有1到6个碳原子的烷基、具有1到6个碳原子的烷氧基、具有2到6个碳原子的烯基、具有2到6个碳原子的炔基、氨基、经1 或2个具有1到6个碳原子的烷基取代的氨基、氨基酰基、酰基氨基、叠氮基、氰基、卤基、硝基、硫烷氧基、三卤代甲基和芳基。术语“芳烷基”包含芳基取代的烷基部分。优选芳烷基为芳基附接到具有1到6个碳原子的烷基的“低级芳烷基”。所述基团的实例包括苯甲基、二苯基甲基、三苯基甲基、苯乙基和二苯基乙基。
术语“碳环”是指含有一个或一个以上共价闭合环结构并且形成环主链的原子都为碳原子的任选取代的基团。因此，此术语使碳环与环主链含有至少一个非碳原子的杂环相区别。术语“环烷烃”或“环状烷烃”或“环烷基”是指环是任选取代的环状脂肪烃 (例如，优选具有3到12个环碳的环状烷基)的碳环基团。“环烷基”包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基等。
术语“杂环的或杂环”意思指具有4到约20个碳原子，优选具有约5到约6个碳原子的任选取代的饱和或不饱和、芳香族或非芳香族环状烃基，其中1到约4个碳原子经氮、氧或硫替代。优选的杂环选自由以下组成的群组：苯并咪唑、二氢噻吩、二氧杂环己烯、二噁烷、二氧杂环戊烷、二噻烷、二噻嗪、二噻唑、二硫杂环戊烷、呋喃、咪唑、吗啉、噁唑、噁二唑、氧杂噻唑、氧杂噻唑烷、噁嗪、噁二嗪、哌嗪、哌啶、吡喃、吡嗪、吡唑、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯烷、四氢呋喃、四嗪、噻二嗪、噻二唑、噻三唑、噻嗪、噻唑、硫代吗啉、噻吩、硫代吡喃、三嗪和三唑。一些杂环的结构如下：
杂环
本文中使用的术语“杂芳基”定义为取代或未取代的芳香族杂环系统(单环或双环)。杂芳基可具有例如约4到约20个碳原子(除非另作清楚说明)，且优选约4到约10个。在一些实施例中，杂芳基是具有约4到约14个环原子且含有碳原子和1、2、3或4个选自氧、氮或硫的杂原子的芳香族杂环系统。代表性杂芳基是呋喃、噻吩、吲哚、氮杂吲哚、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、咪唑、N-甲基咪唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、吡咯、 N-甲基吡咯、吡唑、N-甲基吡唑、1,3,4-噁二唑、1,2,4-三唑、1-甲基-1,2,4-三唑、1H-四唑、1-甲基四唑、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并呋喃、苯并异噁唑、苯并咪唑、N-甲基苯并咪唑、氮杂苯并咪唑、吲唑、喹唑啉、喹啉和异喹啉。
术语“桥环”是指形成包含一个或一个以上环(其中两个或两个以上不相邻环原子连接)的任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基的具有6到12个原子的基团。桥环结构的非限制性实例包括三环烷烃，例如金刚烷基。
“任选的”或“任选”是指随后描述的事件或情形可能发生或不发生，并且这一描述包括所述事件或情形发生的情况以及所述事件或情形不发生的情况。“任选”包括所述情形存在的实施例和所述情形不存在的实施例。举例来说，“任选取代的苯基”是指苯基可经取代或不经取代，且这一描述包括未取代的苯基和存在取代的苯基。“任选”包括所述情形存在的实施例和所述情形不存在的实施例。
本发明的化合物可以互变异构、几何异构或立体异构形式存在。本发明涵盖在本发明的范围内的所有所述化合物，包括顺式-和反式-几何异构体、E-和Z-几何异构体、R-和S-对映异构体、非对映异构体、d-异构体、l-异构体、其外消旋混合物和其其它混合物。
就这一点来说，所用短语“医药学上可接受的载剂”是指一种本文所述组合物中存在的有效增强所述组合物的稳定性、功效或其它方面的量的任何无活性成分。所述医药学上可接受的载剂的非限制性实例包括稀释剂、赋形剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、媒剂、递送系统、乳化剂、崩解剂、吸收剂、吸附剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、调味剂、软化剂、缓冲剂、pH调节剂、增稠剂、软水剂、保湿剂、香料、稳定剂、调节剂、螯合剂、甜味剂、推进剂、抗结块剂、增粘剂、增溶剂、增塑剂、渗透增强剂、助流剂、成膜剂、填充剂、涂覆剂、粘合剂、抗氧化剂、硬化剂、湿润剂或这些组分的任何混合物。
本文中使用的短语“医药学上可接受的盐”是指具有与未改性化合物相同的活性且并非生物学和其它方面不合需要的某些成分的盐。盐可用例如有机或无机酸形成。适合的酸的非限制性实例包括乙酸、乙酰水杨酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、重硫酸、硼酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、碳酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、十二烷基硫酸、乙烷磺酸、甲酸、反丁烯二酸、甘油酸、甘油磷酸、甘氨酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、戊二酸、乙醇酸、半硫酸、庚酸、己酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟基乙烷磺酸、乳酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、粘酸、萘磺酸、萘酸(naphthylicacid)、烟酸、亚硝酸、草酸、壬酸、磷酸、丙酸、糖精、水杨酸、山梨酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、硫氰酸、巯基乙酸、硫代硫酸、甲苯磺酸、十一碳烯酸以及天然和合成来源的氨基酸。
本文中使用的“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指诊断、预后或疗法都合乎需要的任何受试者，尤其哺乳动物受试者，例如人类。
本文中使用的“治疗(treatment或treating)”疾病、病症或病况涵盖减轻其至少一种症状、降低其严重程度，或延缓、预防或抑制其发展。治疗无需指完全治愈疾病、病症或病况。本文中的有用组合物只需降低疾病、病症或病况的严重程度；降低与其相关的症状的严重程度；改善患者或受试者的生活质量；或延缓、预防或抑制疾病、病症或病况的发作。
本文中使用的术语“调节”是指本发明的化合物可为Hsp70或Hsc70的活化剂或抑制剂。活化剂将促进HSP通路，活化剂将适用于增殖增加可具有有益治疗作用的疾病。抑制剂将抑制Hsp70或Hsc70，由此抑制HSP通路且抑制各种癌症和增生性病症的生长。因此，在需要HSP通路活性增加的情况下，则优选活化剂。在需要抑制HSP通路的情况下，则优选抑制剂。
在某些实施例中，本发明的化合物可用于治疗增生性病症。本文中使用的术语“增生性病症”是指癌症，包括乳房、前列腺、肺、结肠、胃、胰腺、卵巢、脑和造血系统的癌症、食道癌、肾细胞癌、膀胱癌、头和颈癌、白血病，和肉瘤，例如胆管肉瘤和食道肉瘤。具体说来，此包括乳癌和卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝细胞癌、非小细胞和小细胞肺癌(NSCLC和SCLC)、癌、白血病和淋巴瘤。包括转移性癌症，例如转移性乳癌。
本文中使用的“致癌蛋白”是指可潜在地诱导或促进细胞致瘤性转化的蛋白质。在一个实例中，所述蛋白质可由致癌基因编码。本文中使用的致癌基因是产生可潜在地诱导或促进细胞致瘤性转化的基因产物的基因。致癌基因可为病毒或细胞来源。致癌蛋白的非限制性实例包括生长因子受体、蛋白激酶、信号转导蛋白、核磷酸化蛋白、甲基转移酶和转录因子。当结构和/或调控改变后，这些蛋白质在细胞内异常表达、活化或移位时，可导致不受控制的细胞增殖和细胞死亡缺乏。本发明的致癌蛋白的非限制性实例包括单独和/或呈任何组合的ErbB2(Her2/Neu)、EGFR/ErbB1、ErbB3、ErbB4、ErbB5和任何其它erbB家族成员、PDGFR、PML-RAR AKT、BCR-abl、src、Raf家族成员(例如C-Raf、B-Raf)、显性阴性p53、HIF-1α、端粒酶、MTG8(骨髓性白血病蛋白)、热休克因子、B型肝炎病毒逆转录酶、c-src、v-src、突变的或不存在p53、雌激素受体、突变的K-ras蛋白、一氧化氮合成酶和嵌合蛋白p210BCR-ABL。本发明进一步包括现已知或以后鉴别为与Hsp70或Hsp70-Hsp90复合物有关的任何其它致癌蛋白。在一些实施例中，在疗法前、期间和之后测量患者体内存在的致癌蛋白。在其它实施例中，向有需要的患者投予本发明的化合物使患者体内的一种或一种以上致癌蛋白不稳定和降解。
除非另作指示，否则本文中所述的任何浓度范围、百分比范围或比率范围应理解为包括在所述范围内的任何整数和其分数浓度、百分比或比率，例如一个整数的十分之一和百分之一。
应了解，上文和本文别处使用的术语“一个(种)”是指“一个(种)或一个(种) 以上”所列举的组分。所属领域技术人员将了解，除非另作具体规定，否则使用单数包括复数。因此，术语“一个(种)”和“至少一个(种)”在本申请案中可互换使用。举例来说，“一种”聚合物是指一种聚合物或包含两种或两种以上聚合物的混合物两者。
在本申请案通篇，各种实施例的描述都使用了“包含”一词；然而所属领域技术人员应理解，在一些具体情形中，一个实施例可使用“基本上由……组成”或“由……组成”进行替代性描述。
出于更好地理解本发明教示的目的且决不是限制所述教示的范围，除非另作指示，否则本说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其它数字值应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非作相反指示，否则以下说明书和随附权利要求中陈述的数字参数都是近似值，其可视意图获得的所需特性而变化。在最低程度上，每一数字参数应至少依据所报导的有效数位的数字并通过应用常规舍入技术解释。
本文中使用的其它术语拟由其在此项技术中的众所周知的含义定义。
本发明的化合物
根据第一通用实施例，本发明涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9独立选自CH、经取代的C和经取代的N；
X10和X11独立选自CH、CH2、NH、NR、O和S，以维持芳香性；R是烷基或经取代的烷基链；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或 W1和W2可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或 W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(1a)和式(1b)的优选实施例中，X1到X4独立选自(但不限于)：
在式(1a)的优选实施例中，X5到X9独立选自(但不限于)：
在式(1b')的优选实施例中，X10是CH2、NH、NR'、O和S；其中R'是低级烷基链；
在式(I)和式(I')的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(1a)和式(1a')的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(1a)和式(1a')的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基；W1和W2可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
在式(1b)和式(1b')的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基；W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
在一个实施例中，式(I)或(I')的化合物如上文所定义，条件是：(1)Y选自由以下组成的群组：S、SO和SO2；(2)Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；(3)式1a或1a'的左侧芳基含有至少一个环氮；(4)W1和W2中至少一者选自由以下组成的群组：烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；以及(5)W3和W4中至少一者选自由以下组成的群组：氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代或未取代的酰胺基、 -NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基和磺酰胺基。
在另一实施例中，式(I)或(I')的化合物如上文所定义，条件是：(1)Z选自由以下组成的群组：芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；(2)W1和W2中至少一者选自由以下组成的群组：烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；以及(3)W3和(4)W4中至少一者选自由以下组成的群组：氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代或未取代的酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、 -CO烯基、-CO炔基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基和磺酰胺基。
在又一实施例中，式(I)或(I')的化合物如上文所定义，条件是：(1)Y选自由以下组成的群组：S、SO和SO2；(2)Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；(3)W1和W2中至少一者选自由以下组成的群组：烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；以及(4)W3和W4中至少一者选自由以下组成的群组：氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代或未取代的酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基和磺酰胺基。
在又一实施例中，式(I)或(I')的化合物如上文所定义，条件是：(1)Z选自由以下组成的群组：芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；(2)W1和W2都选自由以下组成的群组：烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；以及(3)W3和W4中至少一者选自由以下组成的群组：氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代或未取代的酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基和磺酰胺基。
在又一实施例中，式(I)或(I')的化合物如上文所定义，条件是：(1)W1和W2 都选自由以下组成的群组：芳基、杂环、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；以及(4)W3和W4中至少一者选自由以下组成的群组：氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代或未取代的酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基和磺酰胺基。
在一个实施例中，式(I)或(I')的化合物如上文所定义，条件是：(1)Y选自由以下组成的群组：S、SO和SO2；(2)Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；(3)式1a或1a'的左侧芳基或右侧芳基含有至少两个环氮；(4)W1和W2中至少一者选自由以下组成的群组：烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；以及(5)W3和W4中至少一者选自由以下组成的群组：氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代或未取代的酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基和磺酰胺基。
在一个实施例中，式(I)或(I')的化合物如上文所定义，条件是：(1)Y选自由以下组成的群组：S、SO和SO2；(2)Z选自由以下组成的群组：芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；(3)式1a或1a'的左侧芳基或右侧芳基或两个芳基含有至少两个环氮；(4)W1和W2中至少一者选自由以下组成的群组：烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基和二芳基氨基；以及(5)W3和W4中至少一者选自由以下组成的群组：烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代或未取代的酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基和磺酰胺基。
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X5到X9独立选自CH、经取代的C和经取代的N；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；且；
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(2a)的优选实施例中，X5到X9独立选自(但不限于)：
在式(2a)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(2a)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(2a)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(2a)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(2a)的特别优选的实施例中，X5到X9是
在式(2a)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(2a)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(2a)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(2a)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表1显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
所列某些所述化合物的IC50值说明主题化合物的抗增殖作用并且是使用本文所述的生长抑制检验获得。
表1
式2a化合物的一个实施例是式2a'化合物
或其立体异构体、互变异构体或医药学上可接受的盐，其中：X和Y各自独立选自由以下组成的群组：任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；卤基；任选取代的C2-22酰基；-NR4R5基团；-C(O)R6基团；-(乙氧基)n-R6基团，其中n是1-12；任选取代的烷氧基羰基；任选取代的烷氧基；任选取代的氨基；硝基；和羧基；R4和R5各自独立选自由以下组成的群组：H；任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；和-C(O)R6；且R6各自独立选自由以下组成的群组：任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；任选取代的烷氧基；和丙烯酸烷基酯基(例如丙烯酸乙酯)。
在另一实施例中，式2a'化合物如上文所述，条件是X不包含桥环结构。
在另一实施例中，式2a'化合物如上文所述，条件是X或Y取代基中至少一者包含至少一个可用于鉴别、追踪和或分离化合物的标记或标记物基团。可用于本文中的标记基团和标记物基团的非限制性实例包括例如荧光基团、生物素基团、抗生物素蛋白基团和酶连接基团。
本发明的另一实施例是式2a”化合物
或其立体异构体、互变异构体或医药学上可接受的盐，其中：R1各自独立选自由以下组成的群组：H；任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；卤基；任选取代的C2-22酰基；-C(O)R6基团；和-(乙氧基)n-R6基团，其中n是1-12；R2、R3、R4和R5各自独立选自由以下组成的群组：H；任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；任选取代的C2-22酰基；-C(O)R6基团；和任选取代的烷氧基羰基；且X选自由以下组成的群组：任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环(例如4-烷基哌嗪)、芳基或杂芳基；卤基；任选取代的C2-22酰基；-NR4R5；-C(O)R6基团；-(乙氧基)n-R6基团，其中n是1-12；任选取代的烷氧基羰基；任选取代的烷氧基；任选取代的氨基；硝基；和羧基；且R6各自独立选自由以下组成的群组：任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；任选取代的烷氧基；和丙烯酸烷基酯基 (例如丙烯酸乙酯)；条件是X不包含桥环结构。
在另一实施例中，式2a'化合物如上文所述，条件是所述化合物不为N-(6-氨基-2-(4,6- 二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-基)辛酰胺(YK20)。
在又一实施例中，式2a”化合物如上文所述，且其中：R1各自独立选自由以下组成的群组：H；和任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；R2、R3、R4和R5各自独立选自由以下组成的群组：H；任选取代的或直链或分支C1-C6烷基；和-C(O)R6，其中R6是任选取代的直链或分支C1-C6烷基、烯基或炔基；且X选自由以下组成的群组：任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；和卤基。在另一实施例中，X是在氮原子处连接的哌嗪环，其中所述哌嗪任选经至少一个选自由以下组成的群组的基团取代：卤基、卤烷基、直链或分支烷基、经取代的直链或分支烷基，和HO-(乙氧基)n-C1-C6烷基-，其中n＝1-8(例如HO-(乙氧基)3-C2H4-)。
在另一实施例中，式2a'化合物如上文所述，其中：R1各自独立选自由直链或分支C1-C6烷基和经取代的直链或分支C1-C6烷基组成的群组。举例来说，R1可选自由甲基、乙基、乙烯基、丙基和丁基组成的群组。
在另一实施例中，式2a'化合物如上文所述，其中：R1各自独立选自甲基和乙基；NR2R3是NH2；NR4R5是NHC(O)-C1-C6烷基或NHC(O)-C2-C6烯基；且X是在氮原子处连接的哌嗪环，且哌嗪环任选经卤基、卤烷基或者直链或分支C1-C6烷基取代。
在另一实施例中，式2a'化合物如上文所述，其中：R1各自相同或不同且为甲基或乙基；R2、R3和R4各自为H；R5是-C(O)-甲基、-C(O)-乙基或-C(O)-乙烯基；X是哌嗪、 4-甲基哌嗪-1-基或4-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基。
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X5到X9独立选自CH、经取代的C和经取代的N；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(3a)的优选实施例中，X5到X9独立选自(但不限于)：
在式(3a)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(3a)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(3a)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(3a)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(3a)的特别优选的实施例中，X5到X9是
在式(3a)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(3a)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(3a)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(3a)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表2显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表2
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X5到X9独立选自CH、经取代的C和经取代的N；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(4a)的优选实施例中，X5到X9独立选自(但不限于)：
在式(4a)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(4a)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(4a)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(4a)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(4a)的特别优选的实施例中，X5到X9是
在式(4a)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(4a)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(4a)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(4a)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表3显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表3
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X5到X9独立选自CH、经取代的C和经取代的N；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2独立地在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W1和W2可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(5a)的优选实施例中，X5到X9独立选自(但不限于)：
在式(5a)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(5a)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(5a)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(5a)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(5a)的特别优选的实施例中，X5到X9是
在式(5a)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(5a)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(5a)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(5a)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表4显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表4
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X5到X9独立选自CH、经取代的C和经取代的N；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W1和W2可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(6a)的优选实施例中，X5到X9独立选自(但不限于)：
在式(6a)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(6a)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(6a)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(6a)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(6a)的特别优选的实施例中，X5到X9是
在式(6a)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(6a)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(6a)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(6a)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表5显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表5
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X5到X9独立选自CH、经取代的C和经取代的N；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W1和W2可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(7a)的优选实施例中，X5到X9独立选自(但不限于)：
在式(7a)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(7a)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(7a)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(7a)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(7a)的特别优选的实施例中，X5到X9是
在式(7a)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(7a)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(7a)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(7a)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表6显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表6
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X10和X11独立选自CH、CH2、NH、NR'、O和S，以维持芳香性；其中R'是烷基或经取代的烷基链；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(2b)的优选实施例中，X10和X11独立选自(但不限于)：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(2b)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(2b)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(2b)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(2b)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(2b)的特别优选的实施例中，X10和X11独立选自：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(2b)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(2b)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(2b)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(2b)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表7显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表7
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X10和X11独立选自CH、CH2、NH、NR'、O和S，以维持芳香性；其中R'是烷基或经取代的烷基链；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(3b)的优选实施例中，X10和X11独立选自(但不限于)：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(3b)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(3b)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(3b)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(3b)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(3b)的特别优选的实施例中，X10和X11独立选自：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(3b)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(3b)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(3b)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(3b)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表8显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表8
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X10和X11独立选自CH、CH2、NH、NR'、O和S，以维持芳香性；其中R'是烷基或经取代的烷基链；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(4b)的优选实施例中，X10和X11独立选自(但不限于)：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(4b)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(4b)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(4b)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(4b)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(4b)的特别优选的实施例中，X10和X11独立选自：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(4b)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(4b)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(4b)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(4b)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表9显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表9
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X10和X11独立选自CH、CH2、NH、NR'、O和S，以维持芳香性；其中R'是烷基或经取代的烷基链；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W1和W2可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(5b)的优选实施例中，X10和X11独立选自(但不限于)：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(5b)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(5b)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(5b)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(5b)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(5b)的特别优选的实施例中，X10和X11独立选自：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(5b)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(5b)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(5b)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(5b)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表10显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表10
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X10和X11独立选自CH、CH2、NH、NR'、O和S，以维持芳香性；其中R'是烷基或经取代的烷基链；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W1和W2可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(6b)的优选实施例中，X10和X11独立选自(但不限于)：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(6b)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(6b)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(6b)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(6b)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(6b)的特别优选的实施例中，X10和X11独立选自：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(6b)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(6b)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(6b)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(6b)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表11显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表11
本发明的另一实施例涉及具有下式的化合物：
其立体异构体、互变异构体和医药学上可接受的盐，其中，
X10和X11独立选自CH、CH2、NH、NR'、O和S，以维持芳香性；其中R'是烷基或经取代的烷基链；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR、CO、O、NH或NR，其中R是低级烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2 烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W1和W2可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环；且
W3和W4在每次出现时可独立地选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO 炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；或W3和W4可经由连接基接合在一起形成稠合5元或6元环。
此外，W2可直接接合到右侧芳基环以形成5元环或经由连接基接合到右侧芳基环以形成6元或7元环。
在式(7b)的优选实施例中，X10和X11独立选自(但不限于)：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(7b)的优选实施例中，Y是S、SO、SO2、O或CH2。
在式(7b)的优选实施例中，Z是烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(7b)的优选实施例中，W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(7b)的优选实施例中，W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基和二烷基酰胺基。
在式(7b)的特别优选的实施例中，X10和X11独立选自：
其中R是烷基或经取代的烷基链。
在式(7b)的特别优选的实施例中，Y是S、SO或SO2。
在式(7b)的特别优选的实施例中，Z是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(7b)的特别优选的实施例中，W1和W2独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基。
在式(7b)的特别优选的实施例中，W3和W4独立地为氢、卤素、羟基、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO 烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN。
表12显示了例示说明本实施例的特定化合物的实例。
表12
在本发明的一个实施例中，本发明的化合物是选自由以下组成的群组的化合物：表 1化合物、表2化合物、表3化合物、表4化合物、表5化合物、表6化合物、表7化合物、表8化合物、表9化合物、表10化合物、表11化合物和表12化合物。
在另一实施例中，本发明涉及一种制备化合物或其中间物的方法，其包含进行本文实例中所述合成步骤中至少一者。
hHsp70上因被占据而赋予抗癌活性的未探测的变构部位(部位1)的描述
根据另一实施例，不具有已知天然存在或合成产生的配体的Hsp70蛋白的空腔当以对正常细胞无毒的剂量被本文所述的本发明化合物占据时，将抑制恶性细胞生长、抑制异常细胞周期进程、降解和抑制一种或一种以上致癌蛋白、诱导细胞凋亡、降低癌细胞的侵袭潜能或其组合。根据另一实施例，其它小分子配体以对正常细胞无毒的剂量占据此先前未探测的袋将导致以下所有或一部分作用(但不限于)：抑制恶性细胞生长、抑制异常细胞周期进程、降解和抑制数种致癌蛋白、诱导细胞凋亡、降低癌细胞的侵袭潜能或其组合。
所述袋(在本文中称为变构部位1)紧接着ATP/ADP结合袋，且包含按(但不限于)Thr13、Thr14、Tyr15、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264和Thr265极性氨基酸排列的亲水性子袋(sub-pocket)。在此子袋中嵌入半胱氨酸残基(Cys267)，其可共价连接到含有适宜Cys-反应性官能团(例如(但不限于)丙烯酰胺、乙烯基磺酰胺、丙酰胺或α-卤基羰基)的配体。邻近于所述亲水性子袋，存在包含非极性与极性氨基酸残基的较大子袋，所述氨基酸残基例如(但不限于)Leu237、Val238、Val260、Arg261、 Val59、Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68Arg 72和Tyr41，其提供与配体的疏水和静电(π-π)相互作用。提供与配体的相互作用的是例如(但不限于) Lys88、His89、Trp90、Pro91和Phe92等氨基酸。
由于不能得到人类Hsp70的全长晶体结构，故建立全长人类Hsp70的同源模型。在可得到的晶体结构中，Cys267未暴露，而在全长Hsp70的同源模型中，含有Cys267的袋暴露出来。已经鉴别出YK5与人类Hsp70的全长同源模型的相互作用。
在一个实施例中，提供治疗或预防动物的肿瘤或增生性病症的方法，其包含向有需要的动物投予治疗有效量的Hsp70抑制剂；使Hsp70抑制剂与位于Hsp70和Hsc70核苷酸结合部位外部的变构结合结构域接触；同时抑制Hsp70和Hsc70两者；诱导肿瘤细胞或出现增生性病症的细胞凋亡；以及不诱导正常细胞、基质或血管的细胞凋亡增加。在另一实施例中，上述方法中使用的Hsp70抑制剂是选自式(I)或(I')的化合物。
在另一实施例中，变构结合结构域位于SEQ ID NO:1上，且所述结构域是由一个或一个以上选自由以下组成的群组的氨基酸残基界定：Thr13、Thr14、Tyr15、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、 Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68、Tyr41、Lys88、His89、Trp90、 Pro91、Phe92和其组合。在另一实施例中，变构结合结构域是由三个或三个以上上文所述的氨基酸残基界定者。在另一实施例中，变构结合结构域是由四个或四个以上上文所述的氨基酸残基界定者。在另一实施例中，变构结合结构域是由五个或五个以上上文所述的氨基酸残基界定者。在另一实施例中，变构结合结构域是由3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15或更多个上文所述的氨基酸残基界定者。在一些实施例中，本发明的化合物结合于此变构结合结构域并引起对Hsp70、Hsc70或同时对两者的抑制。
在另一实施例中，变构结合结构域位于SEQ ID NO:1上，且所述结构域是由一个或一个以上选自由以下组成的群组的氨基酸残基界定：Cys267、Leu237、Arg264、Asp234、Arg261、Tyr41、Phe68、Trp90、His89和其组合。在另一实施例中，变构结合结构域位于SEQID NO:1上，且所述结构域是由一个或一个以上选自由以下组成的群组的氨基酸残基界定：Cys267、Arg264、Arg261、Phe68、His89和其组合。
另一实施例涉及一种活化Hsp70的方法，其中Hsp70包含在SEQ ID NO:1上的结合袋，其具有位于ATP/ADP结合结构域外部的裂缝区中且侧接亚区Ib和IIb的部位1，且所述方法包含使结合袋的位点1与结合于结合袋的配体接触以活化Hsp70活性。另一实施例涉及根据技术方案27所述的活化Hsp70的方法，其中位点1具有第一较大亲水性袋，其包含Tyr15、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264和Thr265极性氨基酸；嵌入此袋中的半胱氨酸残基(Cys267)；且邻近于此袋的是在Hsp70上的第二较大袋，其包含非极性和极性氨基酸残基，例如Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63、 Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68和Tyr41，其可形成疏水和静电(π-π) 相互作用。
在另一实施例中，提供Hsp70或其变体的结合部位1的三维结构，其用于筛选调节Hsp-70或Hsc-70活性的调节剂，其中所述结合部位包含在SEQ ID NO:1上由选自由以下组成的群组的氨基酸残基界定的配体结合结构域：Thr13、Thr14、Tyr15、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、Val238、Val260、Arg261、Val59、 Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、Phe68、Tyr41、Lys88、His89、Trp90、 Pro91、Phe92和其组合。
一个实施例涉及用于产生根据技术方案1所述的Hsp70或其变体的结合部位1的三维结构的计算机辅助系统，其中所述系统包含：(a)计算机可读数据存储媒体，其包含用计算机可读数据编码的数据存储材料，其中所述数据包含肽序列SEQ ID NO:1和图 21中的盒中所示序列的至少一部分；(b)工作存储器，其存储有用于处理所述计算机可读数据的指令；(c)用于将所述计算机可读数据处理成所述三维结构的中央处理单元，其耦接到所述计算机可读数据存储媒体和所述工作存储器；和(d)用于显示所述三维结构的显示器，其耦接到所述中央处理单元。在另一实施例中，在SEQ ID NO:1上的 Hsp70或其变体的结合部位1是由选自由以下组成的群组的氨基酸残基界定：Thr13、 Thr14、Tyr15、Lys56、Lys271、Arg269、Glu268、Arg264、Thr265、Cys267、Leu237、 Val238、Val260、Arg261、Val59、Pro63、Thr66、Asn235、Asp234、Glu231、Asp69、 Phe68、Tyr41、Lys88、His89、Trp90、Pro91、Phe92和其组合。
含有本发明化合物的医药组合物
在一个实施例中，本发明涉及包含本文所述化合物的组合物。在另一实施例中，本发明涉及包含本文所述化合物和医药学上可接受的载剂的医药组合物。可用于本文中的载剂可进一步包括一种或一种以上适于投予人类或动物的相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包封材料。
本文中使用的生物相容性载剂是不会引起实质上降低所述医药组合物在常规使用者环境中的功效的任何相互作用的组分。可能的医药载剂必须具有足够低的毒性以使其适于投予所治疗的受试者。
任何无毒、惰性且有效的载剂都可用于调配涵盖于本文中的组合物。就这一点来说，适合的医药学上可接受的载剂、赋形剂和稀释剂是所属领域技术人员众所周知的，例如默克索引(The Merck Index),第13版,布达瓦雷(Budavari)等人编辑,新泽西州拉威市默克集团(Merck&Co.,Inc.,Rahway,N.J.)(2001)；以及“非活性成分指南(InactiveIngredient Guide)”,美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)药品评价和研究中心(Center for Drug Evaluation and Research，CDER)管理办公室(Office of Management)中所述者，所有所述文献的内容都以全文引用的方式并入本文中。适用于本发明组合物中的优选的医药学上可接受的赋形剂、载剂和稀释剂的实例包括蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液、汉克氏溶液(Hank'ssolution)和DMSO。
这些其它非活性组分以及有效调配和投药程序都是此项技术中众所周知的，并且描述于标准教科书中，例如古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman and Gillman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics),第8版,吉尔曼(Gilman)等人编辑,珀盖蒙出版社(Pergamon Press)(1990)以及雷氏药学大全(Remington's PharmaceuticalSciences),第18版,宾夕法尼亚州伊斯顿市默克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.)(1990)，两篇文献都以全文引用的方式并入本文中。所述载剂可以重量计总计占本文提供的组合物约0.1％到约99.99999％。
治疗应用
在一些实施例中，已经发现式(I)和式(I')化合物具有抗增殖活性，因此相信其可用于治疗增生性病症，例如癌症，以及其它与不受控制的细胞增殖有关的病症。如本文所定义，在本发明范围内的抗增殖作用可例如通过在体外或体内抑制细胞增殖特异性激酶，或者在体外全细胞检验中、在体内动物模型中或在人类临床投药中抑制细胞增殖的能力来证实。
投药
本发明的医药组合物可适于经口、直肠、阴道、不经肠、肌肉内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻、口腔或舌下途径投予。
对于经口投药，特别使用压缩片剂、丸剂、片剂、胶囊剂(gellule)、滴液和胶囊。优选这些组合物每剂含有1到250mg且更优选10到100mg活性成分。
其它投药形式包含可经静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌肉内注射且由无菌或可灭菌溶液制备的溶液或乳液。本发明的医药组合物也可呈栓剂、子宫托、悬浮液、乳液、洗液、油膏、乳膏、凝胶、喷雾剂、溶液或撒粉剂的形式。
透皮投药的替代性方式是使用皮肤贴片。举例来说，可将活性成分并入由聚乙二醇或液体石蜡的水性乳液组成的乳膏中。活性成分也可以介于1与10重量％之间的浓度并入由白蜡或白软石蜡基质连同可能需要的稳定剂和防腐剂组成的油膏中。
可注射形式可每剂含有介于10到1000mg之间，优选介于10到250mg之间的活性成分。
组合物可调配成单位剂型，即含有单位剂量的个别部分或者具有单位剂量的多个单元或子单元。
剂量
每公斤体重约0.001mg到约5,000mg化合物活性剂的适宜剂量可用于治疗涵盖于本文中的疾病、病症和病况。通常，此活性剂有效量一般将包含每天每公斤患者体重约0.001mg到约100mg。此外，应了解，所述活性剂的剂量可按单一或多个剂量单元投予以提供所需的治疗作用。
在一个实施例中，优选治疗有效剂量将为获得浓度等于在本文所述许多检验的任一者中达到表型效应的浓度的血清(但更优选肿瘤)所需的本发明化合物的量，所述表型效应例如(但不限于)AML香澄-1(Kasumi-1)细胞的生长抑制、在MOLM-13AML 细胞中如卡斯蛋白酶(caspase)3,7活化所指示的细胞凋亡的诱导、在SKBr3乳癌细胞中HER-2和Raf-1激酶降解、在MDA-MB-468乳癌细胞中p-STAT3失活，所述量选自由以下组成的群组：1nM到200μM；1nM到100μM；1nM到50μM；100nM到100 μM；100nM到50μM；100nM到20μM；1nM到1μM；和1nM到100nM。在一个实施例中，表型效应是所述检验的IC50值。在另一实施例中，优选治疗有效剂量将为获得浓度等于在本文所述许多检验的任一者中达到表型效应的浓度的血清(但更优选肿瘤)所需的量，所述表型效应例如(但不限于)AML香澄-1细胞的生长抑制、在MOLM-13AML细胞中如卡斯蛋白酶3,7活化所指示的细胞凋亡的诱导、在SKBr3乳癌细胞中 HER-2和Raf-1激酶降解、在MDA-MB-468乳癌细胞中p-STAT3失活，所述量选自由以下组成的群组：小于200μM；小于100μM；小于50μM；小于25μM；小于15μM；小于10μM；小于5μM；小于2μM；小于1μM；小于500nM；小于200nM；或小于 100nM。在又一实施例中，表型效应是所述检验的IC50值。
必要时，可采用其它治疗剂与上述组合物中提供者组合。可与载剂材料组合产生单一剂型的医药活性成分的量将视所治疗的宿主、疾病、病症或病况的性质以及活性成分的性质而变化。
优选医药组合物可按每日一剂或多剂给与。在一个实施例中，医药组合物每天给与一次到三次。必要时，以每日两次较低剂量开始并缓慢逐渐达到较高剂量是一种策略。可与载剂材料组合产生单一剂型的医药活性成分的量将视所治疗的宿主、疾病、病症或病况的性质以及活性成分的性质而变化。然而，应了解，用于任何特定患者的具体剂量将视多种因素而变化，包括特定医药活性剂的活性；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间；排泄速率；可能的药物组合；所治疗的特定病况的严重程度；以及投药形式。所属领域技术人员将理解所述因素的可变性，并且将能够仅仅使用常规实验就确定具体剂量。
此项技术中众所周知药物动力学参数，例如生物利用率、吸收速率常数、表观分布体积、未结合分率、总清除率、原型排泄分数、首过代谢、消除速率常数、半衰期和平均滞留时间。
最佳的医药调配物将由所属领域技术人员视例如特定医药活性剂组合和所需剂量等考虑决定。参看例如，“雷氏药学大全”,第18版(1990,宾夕法尼亚州伊斯顿默克出版公司18042),第1435-1712页，其揭示内容以引用的方式并入本文中。所述调配物可能影响必需脂质的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
在一个实施例中，根据本文所述本发明的医药组合物可为包装于例如多次使用或单次使用包装(包括例如容器或瓶子、泡壳包装)中的静脉内形式或口服剂型，例如胶囊、片剂、液体和/或散剂。
可制备出含有每天一次或每次治疗一次的量的医药组合物的单剂量试剂盒和包装。本发明医药组合物的单次剂量、单位剂量和每天一次的一次性容器都涵盖在本发明的范围内。
组合疗法
在另一实施例中，本发明医药组合物可与其它医药剂型组合使用以增强其治疗癌症、恶性肿瘤或增生性病症的有效性。就这一点来说，本发明的优选组合物可作为另外包括此项技术中已知对治疗癌症、恶性肿瘤或增生性病症有效的任何其它医药和/或医药剂型的方案的一部分投予。类似地，除本文具体说明者外的医药活性成分可加入本发明的优选组合物中以增强其治疗癌症、恶性肿瘤或增生性病症的有效性。因此，所述其它医药活性成分或其它医药剂型可与本文所述的优选组合物直接或间接且同时或依序投予患者。
就这一点来说，另外涵盖除上文论述的化合物外的抗癌、抗恶性肿瘤或抗增生性病症药剂以用于本文论述的组合疗法中。本文中涵盖前述药剂或其医药学上可接受的盐或衍生物中任一者的组合。
就这一点来说，在一个实施例中，本发明组合物和所述其它医药剂型可同时投予患者。在替代性实施例中，本发明优选组合物和所述其它医药剂型中的一者可在早晨投予，且另一者可在晚间投予。
在另一实施例中，当前描述的化合物可以多种医药剂型投予有需要的患者。此组合疗法可使本发明组合物治疗癌症、恶性肿瘤或增生性病症的有效性最大。
实例
以下实例是对本发明医药组合物的说明，而不打算对其作限制。化合物是使用查博昂(ChemBioDraw Ultra)11.0.1版(马萨诸塞州剑桥市剑桥软件公司(Cambridge Soft；Cambridge,MA))中的“结构转化成名称(Convert Structure to Name)”功能命名。
实例1：化学合成和纯化
综述.NMR光谱记录在布鲁克(Bruker)AV-III-500MHz NMR光谱仪上。化学位移是由作为内标物的TMS到低磁场的δ个值以ppm为单位报导。1H数据报导如下：化学位移、多重性(s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，br＝宽峰，m＝多重峰)、偶合常数(Hz)、积分。13C化学位移是由作为内标物的TMS到低磁场的δ个值以ppm为单位报导。高分辨质谱记录在沃特世LCT普雷默(Waters LCT Premier)系统上。低分辨质谱是在具有电喷雾电离和SQ检测器的沃特世艾奎提(Waters Acquity)高效LC上获得。分析型HPLC是在具有PDA、麦克麦斯ZQ(MicroMass ZQ)和ELSD检测器的沃特世自动纯化系统(Waters Autopurificationsystem)上进行。分析型薄层色谱法是在250 μM硅胶F254板上进行。制备型薄层色谱法是在1000μM硅胶F254板上进行。快速柱色谱法是采用F230-400目硅胶进行。溶剂是HPLC级。所有试剂都购自奥德里奇公司 (Aldrich)或艾可有机品公司(Acros Organics)且不经纯化即使用。所有反应都在氩气保护下进行。
(2)-PU24FC1
2是根据先前公开的程序合成。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.46(s,1H),6.17(br s,2H),4.31(s,2H),4.12(t,J＝7.3Hz,2H),3.91(s,3H),3.86(s,3H),3.72(s,3H),2.19(dd,J＝6.6,2.5Hz,2H),1.97(t,J＝2.5Hz,1H),1.94-1.87(m,2H)；13C NMR(166MHz, CDCl3)δ159.8,157.7,156.2,152.8,152.4,150.5,150.2,142.6,128.7,119.7,116.8,108.5,82.2,69.8,61.1,56.2,42.1,31.5,28.1,15.7；MS(m/z):[M+H]+434.1。
(3)-PU-H71
3是根据先前公开的程序合成。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.33(s,1H),7.31(s,1H),6.89(s,1H),5.99(s,2H),5.58(br s,2H),4.30(t,J＝7.0Hz,2H),2.74-2.69(m,1H),2.58(t,J＝7.0Hz,2H),2.01-1.96(m,2H),1.03(d,J＝6.2Hz,6H)；13C NMR(166MHz, CDCl3)δ154.6,152.9,151.6,149.2,148.9,146.2,127.9,120.1,119.2,112.2,102.2,91.1,48.7,43.9,41.7,30.3,22.9；MS(m/z):[M+H]+513.0。
(5)-GM-Cy3B
5是根据先前公开的程序合成。MS(m/z):[M+Na]+1181.3。
合成方案1
合成方案1提供合成化合物18-26、YK5(4)和YK20(6)的实例。
试剂和条件：(a)PMBCl，NaH，DMF，0℃到室温，12小时，95％；(b)NIS， MeCN，室温，1小时，98％；(c)4,6-二氨基-2-巯基嘧啶，新亚铜试剂，CuI，K2CO3， DMSO，120℃，16小时，65％；(d)Ac2O，DMAP，110℃，2小时，91％；(e)TFA， CHCl3，62℃，24小时，95％；(f)HF/吡啶，NaNO2，0℃，1小时，54％；(g)1-甲基哌嗪，DMF，90℃，1小时，90％；(h)NaOH，H2O，MeOH，60℃，1小时，95％；(i) 丙烯酰氯，Et3N，二噁烷，室温，24小时，50％或辛酰氯，Et3N，二噁烷，室温，12小时，71％。
(19)-4,6-二甲氧基-N,N-双(4-甲氧基苯甲基)嘧啶-2-胺
在0℃下向2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶(2.0g，12.9mmol)于20mL DMF中的溶液中加入NaH(1.24g，51.5mmol)，并在室温下搅拌混合物10分钟。加入4-甲氧基苯甲基氯(4.03g，25.7mmol)并在室温下搅拌混合物过夜。用甲醇淬灭反应并减压去除溶剂。将残余物溶解于EtOAc中，用盐水洗涤并用MgSO4干燥。减压蒸发溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，4:1)纯化残余物，得到4.8g(95％)19。1H NMR(500MHz,CDCl3): δ7.26(d,J＝8.4Hz,4H),6.89(d,J＝8.4Hz,4H),5.47(s,1H),4.78(s,4H),3.85(s,6H), 3.80(s,6H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ171.9,161.5,158.7,130.9,129.1,113.8,78.7, 55.2,53.4,48.3；MS(m/z):[M+H]+396.3。
(20)-5-碘-4,6-二甲氧基-N,N-双(4-甲氧基苯甲基)嘧啶-2-胺
向19(4.8g，12.3mmol)于50mL乙腈中的溶液中加入N-碘代琥珀酰亚胺(4.13g，18.4mmol)并在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，4:1)纯化残余物，得到6.3g(98％)20。1H NMR(500MHz,CDCCl3):δ7.18(d,J＝8.6Hz,4H), 6.83(d,J＝8.6Hz,4H),4.71(s,4H),3.89(s,6H),3.79(s,6H)；13C NMR(166MHz, CDCl3):δ169.1,160.9,158.8,130.5,129.0,113.9,55.3,54.7,48.6,43.9；MS(m/z):[M+H]+ 522.4。
(21)2-(2-(双(4-甲氧基苯甲基)氨基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二胺
在120℃下，搅拌20(6.2g，11.9mmol)、4,6-二氨基-2-巯基嘧啶(1.7g，11.9mmol)、新亚铜试剂(0.538g，2.38mmol)、碘化亚铜(0.452g，2.38mmol)和碳酸钾(3.3g， 33.8mmol)于100mL DMSO中的混合物16小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到4.2g(65％)21。1H NMR(500MHz, DMSO-d6):δ7.18(d,J＝8.6Hz,4H),6.80(d,J＝8.6Hz,4H),5.09(s,1H),4.68(s,4H), 4.40(s,4H),3.79(s,6H),3.74(s,6H)；MS(m/z):[M+H]+536.5。
(22)N,N'-(2-(2-(双(4-甲氧基苯甲基)氨基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
在110℃下，搅拌21(3.2g，6.0mmol)和DMAP(0.037g，0.3mmol)于20mL 乙酸酐中的溶液2小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc,1:1)纯化残余物，得到3.4g(91％)22。1H NMR(500MHz,CDCl3/DMSO-d6):δ8.25(br s,1H),7.70(br s, 2H),7.18(d,J＝10.0Hz,4H),6.81(d,J＝10.0Hz,4H),4.70(s,4H),3.78(s,6H),3.74(s, 6H),2.10(s,6H)；MS(m/z):[M+H]+620.4。
(23)N,N'-(2-(2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
在62℃下，加热22(0.950g，1.5mmol)于20mL TFA:CHCl3(1:1)中的溶液24 小时。减压去除过量TFA和溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH，20:1)纯化残余物，得到0.550g(95％)23。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ10.51(br s,2H),8.37(br s,1H), 6.98(s,2H),3.78(s,6H),2.06(s,6H)；13C NMR(166MHz,DMSO-d6):δ170.9,170.1, 169.2,162.5,158.9,92.8,78.5,53.9,24.1；MS(m/z):[M+H]+380.2。
(24)N,N'-(2-(2-氟-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
将23(2.0g，5.3mmol)加入装备有搅拌棒的塑料管中并冷却到0℃。随后加入HF/吡啶溶液(3.6mL，144mmol)。搅拌下，经20分钟时间分数份加入NaNO2(0.545g， 7.9mmol)。在0℃下再用力搅拌50分钟并在室温下搅拌2小时。加入CaCO3(14.4g， 144mmol)以驱除过量的HF。用CH2Cl2萃取混合物并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N)，20:1)纯化，得到1.1g(54％)24。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.45(s,1H),7.61 (s,2H),4.00(s,6H),2.18(s,6H)；MS(m/z):[M+H]+383.2。
(25)N,N'-(2-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
向24(30mg，0.078mmol)于2mL DMF中的溶液中加入1-甲基哌嗪(31mg，0.31mmol)，并在90℃下加热1小时。减压去除溶剂和过量的试剂并通过柱色谱法 (CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到32mg(90％)25。1H NMR(500MHz, CDCl3):δ8.36(br s,1H),8.13(br s,2H),3.88(s,6H),3.87(m,4H),2.46(m,4H),2.35(s, 3H),1.99(s,6H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ172.2,169.4,168.9,160.4,158.9,96.1, 95.9,54.7,54.3,46.1,43.8,24.7；MS(m/z):[M+H]+463.2。
(26)2-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二胺
在60℃下搅拌25(50mg，0.108mmol)、1N NaOH(水溶液)(2mL)于4mL甲醇中的混合物1小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC纯化残余物，得到39mg(95％) 26。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.19(s,1H),4.48(s,4H),3.88(s,6H),3.87(m,4H),2.48 (m,4H),2.35(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+378.9。
YK5(4)-N-(6-氨基-2-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-基) 丙烯酰胺
在水浴下，向26(0.370g，0.977mmol)和Et3N(0.988g，9.77mmol)于10mL 无水二噁烷中的溶液中逐滴加入丙烯酰氯(0.855g，9.77mmol)。所得混合物在室温下搅拌24小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到0.211g(50％)4。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.96(br s,1H),7.04(s,1H), 6.41(d,J＝16.8Hz,1H),6.17(dd,J＝16.8,10.3Hz,1H),5.78(d,J＝10.3Hz,1H),4.83 (br s,2H),3.88(s,6H),3.87(m,4H),2.47(m,4H),2.35(s,3H)；13C NMR(166MHz, CDCl3):δ169.3,168.8,162.6,162.5,158.3,154.9,128.9,127.1,86.7,78.2,53.1,52.4,44.5, 41.9；HRMS(m/z):C18H25N8O3S的[M+H]+计算值433.1770；实验值433.1750；HPLC:(a) H2O+0.1％TFA(b)ACN+0.1％TFA(5到95％ACN，持续10分钟)Rt＝6.28分钟。
YK20(6)-N-(6-氨基-2-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4- 基)辛酰胺
向26(20mg，0.049mmol)和Et3N(49mg，0.49mmol)于1mL无水二噁烷中的溶液中逐滴加入辛酰氯(80mg，0.49mmol)。所得混合物在室温下搅拌12小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到17mg (71％)6。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.01(br s,1H),6.97(s,1H),4.86(br s,2H),3.89(s, 6H),3.86(m,4H),2.46(m,4H),2.35(s,3H),2.30(t,J＝7.4Hz,2H),1.62(m,2H), 1.20-1.30(m,8H),0.87(t,J＝6.9Hz,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ172.7,171.1, 170.4,164.3,160.0,156.7,87.9,80.1,54.9,54.2,46.3,43.7,37.7,31.6,29.1,29.0,25.2, 22.6,14.1；HRMS(m/z):C23H37N8O3S的[M+H]+计算值505.2709；实验值505.2701；HPLC: (a)H2O+0.1％TFA(b)ACN+0.1％TFA(5到95％ACN，持续10分钟)Rt＝7.98分钟。
合成方案2
合成方案2提供合成化合物28-36、YK30(15)和YK31(16)的实例。
试剂和条件：(a)NaH，EtOH，回流，12小时，89％；(b)PMBCl，NaH，DMF， 0℃到室温，12小时，97％；(c)NIS，MeCN，室温，1小时，96％；(d)4,6-二氨基-2- 巯基嘧啶，新亚铜试剂，CuI，K2CO3，DMSO，120℃，16小时，80％；(e)Ac2O，DMAP， 110℃，2小时，89％；(f)TFA，CHCl3，62℃，24小时，92％；(g)HF/吡啶，NaNO2， 0℃，1小时，46％；(h)1-甲基哌嗪，DMF，90℃，1小时，91％；(i)NaOH，H2O， MeOH，60℃，1小时，93％；(j)丙烯酰氯，Et3N，二噁烷，室温，12小时，40％，或丙酰氯，Et3N，二噁烷，室温，12小时，66％。
(28)-2-氨基-4,6-二乙氧基嘧啶
室温下，向2-氨基-4,6-二氯嘧啶(1.0g，6.09mmol)于20mL无水乙醇中的溶液中加入NaH(0.585g，24.39mmol)。回流下搅拌混合物12小时。减压去除溶剂并将残余物溶解于二氯甲烷中，并用盐水洗涤。蒸发溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，4:1) 纯化所得固体，得到1.0g(89％)28。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.42(s,1H),4.78(br s,2H),4.24(q,J＝7.1Hz,4H),1.34(t,J＝7.1Hz,6H)；MS(m/z):[M+H]+183.9。
(29)-4,6-二乙氧基-N,N-双(4-甲氧基苯甲基)嘧啶-2-胺
在0℃下，向28(1.00g，5.46mmol)于20mL DMF中的溶液中加入NaH(0.524g，21.83mmol)并在室温下搅拌10分钟。加入4-甲氧基苯甲基氯(1.88g，12.0mmol)并在室温下搅拌混合物过夜。用乙醇淬灭反应并减压去除溶剂。将残余物溶解于EtOAc 中，用盐水洗涤，用MgSO4干燥并浓缩，得到残余物，通过柱色谱法(己烷:EtOAc， 4:1)纯化，得到2.25g(97％)29。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.18(d,J＝8.1,4H),6.84 (d,J＝8.1,4H),5.38(s,1H),4.70(s,4H),4.27(q,J＝7.1Hz,4H),3.79(s,6H),1.29(t,J＝ 7.1Hz,6H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ171.5,161.4,158.6,130.9,129.0,113.7,78.6, 61.8,55.2,48.1,14.6；MS(m/z):[M+H]+424.2。
(30)-5-碘-4,6-二乙氧基-N,N-双(4-甲氧基苯甲基)嘧啶-2-胺
向29(2.2g，5.2mmol)于50mL乙腈中的溶液中加入N-碘代琥珀酰亚胺(1.7g，8mmol)，并在室温下搅拌1小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，4:1) 纯化残余物，得到2.75g(96％)30。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.17(m,4H),6.84(m, 4H),4.68(s,4H),4.34(q,J＝7.1Hz,4H),3.80(s,6H),1.32(t,J＝7.1Hz,6H)；13C NMR (166MHz,CDCl3/DMSO-d6):δ168.3,160.4,158.2,130.1,128.4,113.2,62.6,54.8,48.1, 44.2,14.1；MS(m/z):[M+H]+550.1。
(31)2-(2-(双(4-甲氧基苯甲基)氨基)-4,6-二乙氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二胺
在120℃下，搅拌30(2.75g，5.0mmol)、4,6-二氨基-2-巯基嘧啶(0.71g，5.0mmol)、新亚铜试剂(0.226g，1.0mmol)、碘化亚铜(0.190g，1.0mmol)和碳酸钾(1.38g， 10.0mmol)于60mL DMSO中的混合物16小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)部分纯化残余物，得到2.2g(80％)不纯的31[MS(m/z): [M+H]+564.2]，不经进一步纯化即用于下一步骤中。
(32)N,N'-(2-(2-(双(4-甲氧基苯甲基)氨基)-4,6-二乙氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
在110℃下，搅拌31(1.2g，2.19mmol)和DMAP(0.013g，0.11mmol)于20mL 乙酸酐中的溶液2小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，1:1)纯化残余物，得到1.2g(89％)32。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.22(s,2H),7.21(d,J＝8.5Hz,4H), 6.86(d,J＝8.5Hz,4H),4.70(s,4H)4.32(q,J＝7.1Hz,4H),3.80(s,6H),2.16(s,6H), 1.20(t,J＝7.1Hz,6H)；MS(m/z):[M+H]+648.1。
(33)N,N'-(2-(2-氨基-4,6-二乙氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
在62℃下，加热32(2.00g，3.09mmol)于20mL TFA:CHCl3(1:1)中的溶液24 小时。减压去除过量TFA和溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH，20:1)纯化残余物，得到1.15g(92％)33[MS(m/z):[M+H]+407.8]。
(34)N,N'-(2-(2-氟-4,6-二乙氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
将33(1.5g，3.68mmol)加入装备有搅拌棒的塑料管中并冷却到0℃。随后加入 HF/吡啶溶液(3.0mL，120mmol)。数分钟后，搅拌下，经20分钟时间分数份加入NaNO2 (0.380g，5.52mmol)。在0℃下再用力搅拌50分钟。加入CaCO3(12.0g，120mmol) 以驱除过量的HF。用CH2Cl2萃取混合物并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 20:1)纯化，得到0.76g(46％)34。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.47(br s,1H),7.85(br s,2H),4.44(q,J＝7.1Hz,4H),2.17(s,6H),1.31(t,J＝7.1Hz,6H)；MS(m/z):[M+H]+ 411.3。
(35)N,N'-(2-(4,6-二乙氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
向34(0.165g，0.402mmol)于3mL DMF中的溶液中加入1-甲基哌嗪(400mg，4.4mmol)并加热到90℃，保持1小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到0.180g(91％)35。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.35(br s,1H),8.06(br s,2H),4.35(q,J＝7.1Hz,4H),3.82(m,4H),2.43(m,4H),2.36(s,3H), 2.15(s,6H),1.26(t,J＝7.1Hz,6H)；MS(m/z):[M+H]+491.2。
(36)-2-(4,6-二乙氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二胺
在60℃下，搅拌35(0.130g，0.265mmol)、1N NaOH(水溶液)(2mL)于7mL 甲醇中的混合物1小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH，10:1)纯化残余物，得到0.100g(93％)36。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.17(br s,1H),4.48(s,4H), 4.34(q,J＝7.1Hz,4H),3.83(m,4H),2.47(m,4H),2.35(s,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,6H)； MS(m/z):[M+H]+407.1。
YK30(15)-N-(6-氨基-2-(4,6-二乙氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4- 基)丙烯酰胺
向36(20mg，0.049mmol)和Et3N(49mg，0.49mmol)于1mL无水二噁烷中的溶液中逐滴加入丙烯酰氯(44mg，0.49mmol)。所得混合物在室温下搅拌12小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到9mg (40％)15。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.14(br s,1H),7.04(s,1H),6.40(d,J＝16.9Hz, 1H),6.19(dd,J＝16.9,10.4Hz,1H),5.77(d,J＝10.4Hz,1H),4.83(br s,2H),4.35(q,J＝ 7.0Hz,4H),3.83(m,4H),2.46(m,4H),2.35(s,3H),1.28(t,J＝7.0Hz,6H)；13C NMR (166MHz,DMSO-d6):δ170.1,169.2,164.8,164.2,159.4,156.4,131.3,128.1,87.5,79.9, 62.0,54.3,46.6,43.2,14.4；HRMS(m/z):C20H29N8O3S的[M+H]+计算值461.2083；实验值461.2096；HPLC:(a)H2O+0.1％TFA(b)ACN+0.1％TFA(5到95％ACN，持续10 分钟)Rt＝5.57分钟。
YK31(16)-N-(6-氨基-2-(4,6-二乙氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4- 基)丙酰胺
向36(20mg，0.049mmol)和Et3N(49mg，0.49mmol)于1mL无水二噁烷中的溶液中逐滴加入丙酰氯(45mg，0.49mmol)。所得混合物在室温下搅拌12小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到15mg (66％)16。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.17(br s,1H),6.95(s,1H),4.84(br s,2H),4.35 (q,J＝7.5,4H),3.82(m,4H),2.44(m,4H),2.34(s,3H),2.34(q,J＝7.5Hz,2H),1.28(t,J ＝7.5Hz,6H),1.15(t,J＝7.5Hz,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ173.3,170.6,170.5, 164.2,160.0,156.7,87.7,80.3,62.4,54.9,46.3,43.7,30.6,14.5,9.1；HRMS(m/z): C20H31N8O3S的[M+H]+计算值463.2240；实验值463.2253；HPLC:(a)H2O+0.1％TFA(b) ACN+0.1％TFA(5到95％ACN，持续10分钟)Rt＝6.22分钟。
[本页其余部分有意留白]
合成方案3
合成方案3提供合成化合物38-43、YK57(11)和YK56(10)的实例。
试剂和条件：(a)H(OCH2CH2)4OH，DMF，80℃，3小时，83％；(b)HF/吡啶， NaNO2，0℃，42％；(c)1-甲基哌嗪，DMF，90℃，1小时，91％；(d)NIS，CH3CN，室温，1.5小时，85％；(e)4,6-二氨基-2-巯基嘧啶，新亚铜试剂，CuI，K3PO4，DMSO， 150℃，2.5小时，73％；(f)丙烯酰氯，Et3N，CH2Cl2，0℃到室温，8小时，38％；(g) NaOH，H2O，THF，室温，6小时，52％；(h)D-生物素，DCC，DMAP，CH2Cl2，声波处理，8小时，72％。
(38)-2-(2-(2-(2-(2-氨基-6-甲氧基嘧啶-4-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇
向溶解于20mL DMF中的7.28g(37.5mmol)四乙二醇中加入0.900g(37.5mmol)NaH，并在室温下搅拌所得悬浮液10分钟。随后加入2.0g(12.5mmol)2-氨基-4-氯-6- 甲氧基嘧啶并在80℃下加热反应混合物3小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (EtOAc:MeOH，100:0到95:5)纯化油状残余物，得到3.30g(83％)油状物38。TLC (EtOAc:MeOH,95:5v/v):Rf＝0.24；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.48(s,1H),5.08(br s, 2H),4.39(t,J＝4.8Hz,2H),3.83(s,3H),3.79(t,J＝4.8Hz,2H),3.60-3.73(m,12H),3.21 (br s,1H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ172.6,172.0,162.4,80.2,72.8,70.86,70.80, 70.77,70.57,69.7,65.6,61.8,53.9；MS(m/z):[M+H]+318.1。
(39)-2-(2-(2-(2-(2-氟-6-甲氧基嘧啶-4-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇
将1.55g(4.88mmol)38加入装备有搅拌棒的塑料管中并冷却到0℃。随后加入 HF/吡啶溶液(1.22ml，48.8mmol)。数分钟后，搅拌下，经20分钟时间分数份加入0.505 g(7.32mmol)NaNO2。在0℃下再用力搅拌70分钟并在室温下搅拌3小时。接着加入 15mlCH2Cl2和4.88g CaCO3(48.8mmol)，并在室温下搅拌混合物5小时。随后其经由烧结盘式漏斗过滤并用EtOAc(4×25ml)洗涤固体。合并的滤液经硅藻土过滤，减压浓缩并通过柱色谱法(EtOAc:MeOH，100:0到95:5)纯化油状残余物，得到0.65g (42％)油状物39。TLC(EtOAc):Rf＝0.19；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.99(s,1H), 4.48-4.50(m,2H),3.95(s,3H),3.80-3.84(m,2H),3.58-3.75(m,12H),2.56(br s,1H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ173.7(d,J＝15.7Hz),173.0(d,J＝15.7Hz),161.6(d,J＝ 215.9Hz),88.0(d,J＝6.8Hz),72.5,70.70,70.68,70.57,70.37,69.2,66.6,61.8,54.7；MS (m/z):[M+H]+321.2。
(40)2-(2-(2-(2-(6-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基) 乙醇
将0.55g(1.72mmol)39溶解于40ml DMF中，并加入1.72g(17.2mmol)1-甲基哌嗪且在90℃下加热1小时。减压去除溶剂和过量的试剂并通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化油状残余物，得到0.63g(91％)油状物40。TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1v/v):Rf＝0.24；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.40(s,1H), 4.42(t,J＝5.0Hz,2H),3.85(s,3H),3.80(t,J＝5.1Hz,4H),3.65-3.73(m,12H),3.60(t,J ＝4.5Hz,2H),2.44(t,J＝5.1Hz,4H),2.33(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ172.0, 171.3,160.7,78.5,72.6,71.8,70.64,70.55,70.33,69.5,65.1,61.7,54.9,53.5,46.2,43.7；MS(m/z):[M+H]+401.3。
(41)2-(2-(2-(2-(5-碘-6-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基氧基)乙氧基)乙氧基) 乙氧基)乙醇
向溶解于20ml CH3CN中的0.600g(1.50mmol)40中加入0.581g(2.58mmol) N-碘代琥珀酰亚胺，并在室温下搅拌溶液1.5小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (CHCl3:MeOH:Et3N，90:10:2)纯化油状残余物，得到0.670g(85％)油状物41。TLC (CHCl3:MeOH:Et3N，90:10:2v/v/v):Rf＝0.29；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ4.46(t,J＝ 4.7Hz,2H),3.92(s,3H),3.86(m,4H),3.57-3.83(m,14H),2.46(m,4H),2.33(s,3H)；MS (m/z):[M+H]+527.2。
(42)-2-(2-(2-(2-(5-(4,6-二氨基嘧啶-2-基硫基)-6-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶 -4-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇
在150℃下，将含0.620g(1.18mmol)41、0.501g(2.36mmol)K3PO4、0.053g(0.236mmol)新亚铜试剂、0.045g(0.236mmol)碘化亚铜和0.184g(1.30mmol)4,6- 二氨基-2-巯基嘧啶的14ml DMSO加热2.5小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (CHCl3:MeOH:Et3N，99:1:2到95:5:2)纯化残余物，得到0.465g(73％)42。TLC (CHCl3:MeOH:Et3N，85:15:2v/v/v):Rf＝0.35；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.18(s,1H), 4.94(br s,4H),4.45(t,J＝4.2Hz,2H),3.87(s,3H),3.80-3.86(br s,4H),3.74(t,J＝4.2Hz, 2H),3.69(t,J＝4.7Hz,2H),3.51-3.63(m,10H),2.46(t,J＝4.6Hz,4H),2.35(s,3H)；MS (m/z):[M+H]+541.4。
(43)-丙烯酸2-(2-(2-(2-(5-(4-丙烯酰胺基-6-氨基嘧啶-2-基硫基)-6-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯
在0℃下向含0.100g(0.185mmol)42的2ml CH2Cl2中加入0.037g(51μl，0.370mmol)Et3N。随后在0℃下加入0.117g(105μl，1.30mmol)丙烯酰氯。5分钟后，去除冰浴并在室温下持续搅拌。2小时后，再加入0.037g(51μl，0.370mmol)Et3N和0.050g(45μl，0.555mmol)丙烯酰氯并且再持续搅拌6小时。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，12:1)纯化残余物，得到0.049g(38％) 43。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.16(br s,1H),7.06(s,1H),6.39-6.42(m,2H),6.10-6.27 (m,2H),5.76-5.83(m,2H),4.92(s,2H),4.49(br s,2H),4.29(br s,2H),3.89(s,3H),3.86 (s,4H),3.51-3.74(m,12H),2.48(s,4H),2.37(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+649.4。
YK57(11)-N-(6-氨基-2-(4-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-6-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-基)丙烯酰胺
在室温下，向溶解于0.8ml THF中的0.042g(0.0647mmol)43中加入0.2mL 0.5NNaOH，并搅拌6小时。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CHCl3:MeOH-NH3(7N)， 10:1)纯化残余物，得到0.020g(52％)11。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.38(s,1H),7.07 (s,1H),6.42(d,J＝16.7Hz,1H),6.24(dd,J＝16.7,10.3Hz,1H),5.77(d,J＝10.3Hz, 1H),4.95(br s,2H),4.49(br s,2H),3.90(s,3H),3.86(br s,4H),3.51-3.74(m,14H),2.47 (br s,4H),2.36(s,3H)；HRMS(m/z):C25H39N8O7S的[M+H]+计算值595.2662；实验值 595.2658；HPLC:(a)H2O+0.1％TFA(b)ACN+0.1％TFA(5到95％ACN，持续10分钟) Rt＝5.05分钟。
YK56(10)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸 2-(2-(2-(2-(5-(4-丙烯酰胺基-6-氨基嘧啶-2-基硫基)-6-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4- 基氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯
在密封管中，将含5.0mg(0.0084mmol)11、7.0mg(0.0287mmol)D-(+)-生物素、1.0mg(0.0084mmol)DMAP、14.0mg(0.0679mmol)DCC的2ml CH2Cl2用声波处理 8小时。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到5.0mg(72％)10。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.58(s,1H),7.15(s,1H), 6.41-6.43(m,2H),6.19(br s,1H),5.77(br s,1H),5.73(dd,J＝7.3,4.3Hz,1H),5.31(br s, 2H),4.5-4.6(m,2H),4.41-4.47(m,1H),4.35-4.4(m,1H),4.15-4.25(m,2H),3.85-3.93(br s, 7H),3.5-3.75(m,12H),3.14-3.19(m,1H),2.93(dd,J＝12.9,4.9Hz,1H),2.84(d,J＝12.7 Hz,1H),2.56(br s,4H),2.41(s,2H),2.28(t,J＝7.5Hz,3H),1.37-1.78(m,6H)；13C NMR (166MHz,CDCl3):δ＝173.2,170.7,170.2,169.4,164.6,164.3,163.7,159.5,156.6,130.6, 128.3,88.3,77.2,70.5,70.2,70.1,69.3,68.8,65.8,63.1,61.8,59.9,55.2,54.2,53.8,45.4, 42.9,40.1,33.4,29.3,27.9,27.8,24.4；HRMS(m/z):C35H53N10O9S2的[M+H]+计算值 821.3438；实验值821.3439；HPLC:(a)H2O+0.1％TFA(b)ACN+0.1％TFA(5到95％ ACN，持续10分钟)Rt＝7.10分钟。
合成方案4
合成方案4提供合成化合物45-50、YK54(12)和YK55(9)的实例。
试剂和条件：(a)TsCl，NaOH，THF，H2O，0℃，2小时，78％；(b)哌嗪，CH3CN， 75℃，12小时，66％；(c)24，DMF，90℃，2小时，79％；(d)NaOH，MeOH，H2O， 60℃，2小时，98％；(e)丙烯酰氯，Et3N，CH2Cl2，0℃，7小时，36％；(f)NaOH， THF，H2O，3小时，75％；(g)D-生物素，DCC，DMAP，CH2Cl2，声波处理，13小时， 85％；(h)丙烯酰氯，Et3N，CH2Cl2，0℃，6小时，41％
(45)-4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯
将含2.0g(10.3mmol)四乙二醇的10ml THF冷却到0℃。加入含0.200g(5mmol)NaOH的2ml蒸馏水并将其搅拌30分钟。随后缓慢加入0.491g(2.58mmol)对甲苯磺酰氯并在0℃下持续搅拌2小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，50:50 到10:90)纯化残余物，得到0.705g(78％)油状物45。TLC(己烷:EtOAc，10:90v/v):Rf＝0.26；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.80(d,J＝8.1Hz,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,2H), 4.16(t,J＝4.9Hz,2H),3.59-3.74(m,14H),2.45(s,3H)；MS(m/z):[M+Na]+371.3。
(46)-2-(2-(2-(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇
在75℃下将含0.705g(2.02mmol)45和0.697g(8.09mmol)哌嗪的45ml CH3CN 加热12小时。减压去除溶剂和过量试剂并通过柱色谱法纯化油状残余物 (CH2Cl2:MeOH:MeOH-NH3(7N)，90:5:5到90:0:10)，得到0.350g(66％)油状物46。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ3.72(m,2H),3.58-3.70(m,12H),2.91(m,4H),2.59(br m, 2H),2.49(m,4H)；MS(m/z):[M+H]+263.3。
(47)-N,N'-(2-(2-(4-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
向含0.430g(1.12mmol)24的27ml DMF中加入0.310g(1.18mmol)46并在90 ℃下加热2小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH，10:1)纯化残余物，得到0.552g(79％)47。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.38(br s,2H),8.13(s,1H),3.88(br s,10H),3.57-3.74(m,14H),2.66(br s,2H),2.58(br s,4H),2.15(s,6H)；MS(m/z):[M+H]+ 625.5。
(48)-2-(2-(2-(2-(4-(5-(4,6-二氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基) 乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇
向0.520g(0.832mmol)47中加入25ml MeOH和7ml 10％NaOH(水溶液)并在60℃下搅拌悬浮液2小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH，15:1)纯化残余物，得到0.440g(98％)48。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.17(s,1H),4.60(br s,4H), 3.88(br s,10H),3.37-3.77(m,14H),2.67(br s,2H),2.59(br s,4H)；MS(m/z):[M+H]+ 541.4。
(49)丙烯酸2-(2-(2-(2-(4-(5-(4-丙烯酰胺基-6-氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶 -2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯
在0℃下向含22.6mg(0.042mmol)48的3ml CH2Cl2中加入83.6mg(116μl，0.836mmol)Et3N。在0℃下加入11.4mg(10.2μl，0.126mmol)丙烯酰氯。1小时后，再加入11.4mg(10.2μl，0.126mmol)丙烯酰氯。再重复此操作5次，总反应时间为7小时 (总丙烯酰氯，79.8mg，71.7μl，0.882mmol)。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH，10:1)纯化残余物，得到9.8mg(36％)49。1H NMR(500MHz,CDCl3): δ8.10(br s,1H),7.05(s,1H),6.35-6.45(m,2H),6.10-6.20(m,2H),5.73-5.85(m,2H),4.90 (br s,2H),4.32(br s,2H),3.89(br s,10H),3.60-3.70(m,12H),2.69(br s,2H),2.61(br s, 4H)；MS(m/z):[M+H]+649.5。
YK54(12)N-(6-氨基-2-(2-(4-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1- 基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-基)丙烯酰胺
室温下，向溶解于1.6ml THF中的8.0mg(0.012mmol)49中加入0.4mL 0.5N NaOH并搅拌3小时。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH，10:1)纯化残余物，得到5.5mg(75％)12。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.65(s,1H),7.03(s,1H),6.36 (d,J＝16.2Hz,1H),6.11(m,1H),5.70(d,J＝10.1Hz,1H),5.14(br s,2H),3.88(br s,4H), 3.85(s,6H),3.57-3.75(m,15H),2.70(br s,2H),2.62(br s,4H)；HRMS(m/z):C25H39N8O7S 的[M+H]+计算值595.2662；实验值595.2684。HPLC:(a)H2O+0.1％TFA(b)ACN+0.1％ TFA(5到95％ACN，持续10分钟)Rt＝6.05分钟。
(50)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸 2-(2-(2-(2-(4-(5-(4,6-二氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯
在密封管中，将含50.0mg(0.0925mmol)48、90.0mg(0.37mmol)D-(+)-生物素、11.3mg(0.0925mmol)DMAP、153.0mg(0.74mmol)DCC的15ml CH2Cl2用声波处理13小时。反应混合物蒸发至干并对残余物进行柱色谱分离(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 20:1到10:1)，得到不纯的50，通过制备型TLC(CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到60.0mg(85％)50。1H NMR(500MHZ),CDCl3):δ5.27(br s,1H),5.18(s,1H),4.82 (br s,1H),4.59(br s,4H),4.49(m,1H),4.32(m,1H),4.22(m,2H),3.88(br s,10H), 3.60-3.75(m,12H),3.15(m,1H),2.92(m,1H),2.90(m,1H),2.69(m,2H),2.60(m,4H), 2.34(t,J＝5.9Hz,2H),1.37-1.78(m,6H)；HRMS(m/z):C32H51N10O8S2的[M+H]+计算值 767.3333；实验值767.3361。
YK55(9)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸 2-(2-(2-(2-(4-(5-(4-丙烯酰胺基-6-氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基) 乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯
在0℃下向含50.0mg(0.065mmol)50的10ml CH2Cl2中加入195.4mg(271μl，1.953mmol)Et3N。随后在0℃下加入17.7mg(15.9μl，0.196mmol)丙烯酰氯。1小时后，再加入17.7mg(15.9μl，0.196mmol)丙烯酰氯。再重复此操作4次，总反应时间为6小时(总丙烯酰氯，106.2mg，95.4μl，1.17mmol)。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CHCl3:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到22.0mg(41％)9。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.99(s,1H),7.09(s,1H),6.40(d,J＝16.8Hz,1H),6.31(dd, J＝16.7,9.9Hz,1H),5.79(br s,1H),5.74(d,J＝10.8Hz,1H),5.09(s,2H),5.08(s,1H), 4.50(m,1H),4.36(m,1H),4.21(t,J＝6.8Hz,2H),3.87(s,10H),3.6-3.75(m,12H),3.16 (m,1H),2.91(dd,J＝12.8,5.0Hz,1H),2.74(d,J＝12.8Hz,1H),2.70(t,J＝5.4Hz,2H), 2.61(t,J＝4.8Hz,4H),2.31(t,J＝7.6Hz,2H),1.37-1.8(m,6H)；13C NMR(166MHz, CDCl3):δ172.9,170.4,169.5,164.1,164.0,163.2,159.3,156.3,130.3,127.9,88.1,78.9, 69.9,69.8,69.7,68.5,68.0,62.8,61.4,59.6,57.7,57.1,54.9,53.5,52.5,42.9,39.9,33.1, 27.8,27.6,24.0；HRMS(m/z):C35H53N10O9S2的[M+H]+计算值821.3438；实验值821.3455； HPLC:(a)H2O+0.1％TFA(b)ACN+0.1％TFA(5到95％ACN，持续10分钟)Rt＝6.98 分钟。
方案5.制备Cy3B-YK5(57)。
试剂和条件：a.哌嗪，DMF，90℃，1小时；b.N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺，DMF， 80℃，1小时；c.肼，THF，室温，16小时；d.NaOH，甲醇，60℃，1小时；e.二碳酸二-叔丁酯，Et3N，CH2Cl2，室温，2小时；f.丙烯酰氯，Et3N，CH2Cl2；g.TFA:CH2Cl2 (1:4)，室温，1小时；h.Cy3B-OSu，DMF，室温，12小时。
(51)N,N'-(2-((4,6-二甲氧基-2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
将24(100mg，0.26mmol)和哌嗪(45mg，0.52mmol)于5mL DMF中的溶液加热到90℃，保持1小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 10:1)纯化残余物，得到84mg(72％)51。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.20(s,1H),8.03 (s,2H),3.87(s,6H),3.80(m,4H),3.45(m,4H),2.08(s,6H)；MS(m/z):[M+H]+449.1。
(52)N,N'-(2-((2-(4-(4-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)丁基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶 -5-基)硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
将51(50mg，0.111mmol)和N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺(125mg，0.446mmol) 于5mL DMF中的溶液加热到80℃，保持1小时。减压去除溶剂。通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到61mg(86％)52。MS(m/z):[M+H]+ 650.1。
(53)2-((2-(4-(4-氨基丁基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基)硫基)嘧啶-4,6-二胺 [YK91]
向52(61mg，0.095mmol)于3mL THF中的溶液中加入肼(100μL)。在室温下搅拌所得混合物16小时，随后减压蒸发溶剂。向残余物中加入甲醇(10ml)、氢氧化钠 (500mg)并将混合物加热到60℃，保持1小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2: MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到25mg(60％)53。1H NMR(500MHz,CDCl3) δ5.16(s,1H),4.58(s,4H),3.87(s,6H),3.71(m,4H),2.75(m,2H),2.50(m,4H),2.36(m, 2H),1.68(m,2H),1.60(m,2H)；MS(m/z):[M+H]+436.1。
(54)4-(4-(5-(4,6-二氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)丁基氨基甲酸叔丁酯
向53(80mg，0.18mmol)和Et3N(100μL)于3mL CH2Cl2中的溶液中加入二碳酸二-叔丁酯(39mg，0.18mmol)。在室温下搅拌混合物2小时。减压蒸发溶剂，通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到95mg(95％)54，使其进行下一反应。
(55)(4-(4-(5-((4,6-二氨基嘧啶-2-基)硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)丁基) 氨基甲酸叔丁酯
向54(95mg，0.18mmol)和Et3N(94μl)于5mL CH2Cl2中的溶液中分数份加入丙烯酰氯。通过TLC监测反应，当起始物质消失时，通过在冷却条件下加入甲醇来淬灭反应。产物通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到48mg(46％) 55。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.21(s,1H),7.05(s,1H),6.42(m,1H),6.32(m,1H), 5.79(m,1H),3.88(s,6H),3.87(m,4H),3.15(m,2H),2.49(m,4H),2.39(m,4H),1.59(m, 4H),1.44(s,9H)；MS(m/z):[M+H]+590.4。
(56)N-(6-氨基-2-((2-(4-(4-氨基丁基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基)硫基)嘧啶 -4-基)丙烯酰胺
室温下，将55(48mg，17mmol)于20％TFA-CH2Cl2中的溶液搅拌1小时。减压去除溶剂并在高真空下干燥残余物，得到31mg(80％)56，不经进一步纯化即使用。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.01(s,1H),6.40(m,1H),6.29(m,1H),5.80(m,1H),3.88(s, 6H),3.86(m,4H),2.75(t,J＝7.5,2H),2.54(m,4H),2.45(m,2H),1.59(m,4H)；MS(m/z): [M+H]+490.2。
(57)Cy3B-YK5
在室温下将Cy3B-OSu(1mg，0.00178mmol)和56(1.74mg，0.0035mmol)于 100μLDMF中的溶液搅拌12小时。通过HPLC纯化产物，得到57(0.54mg，产率30％)。 MS(m/z):[M+H]+1312.4。
方案6.制备YK5珠粒(59)。
试剂和条件：a.1-Boc-哌嗪，NaI，K2CO3，丙酮，回流，22小时；b.CH2Cl2:TFA (4:1)，室温，1小时；c.24，K2CO3，90℃，1.5小时；d.水合肼，MeOH，室温，2小时，随后1M NaOH，55℃，2小时；e.二碳酸二-叔丁酯，Et3N，CH2Cl2，室温，20小时；f.丙烯酰氯，Et3N，CH2Cl2，0℃，2小时；g.CH2Cl2:TFA(4:1)，室温，45分钟； h.10珠粒，DIEA，DMAP，DMF，3小时。
(58)4-(4-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)丁基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将N-(4-溴丁基)邻苯二甲酰亚胺(1.95g，6.89mmol)和碘化钠(81mg，0.537mmol)加入K2CO3(1.64g，11.88mmol)和1-Boc-哌嗪(1.00g，5.37mmol)于丙酮(25mL) 中的悬浮液中并回流22小时。过滤反应混合物并用丙酮(3×50mL)洗涤固体。浓缩滤液并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，7:3到0:1)纯化残余物，得到2.08g(100％)58。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.84(dd,J＝3.0,5.4Hz,2H),7.71(dd,J＝3.0,5.4Hz,2H), 3.71(t,J＝7.1Hz,2H),3.38-3.43(m,4H),2.32-2.40(m,6H),1.70(m,2H),1.53(m,2H), 1.45(s,9H)；MS(m/z):[M+H]+388.4。
(52)N,N'-(2-(2-(4-(4-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)丁基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶 -5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
向含58(429.7mg，1.11mmol)的CH2Cl2(12mL)中逐滴加入TFA(3mL)并在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物并通过与MeOH共蒸发数次且在高真空下干燥过夜来去除TFA。向其中加入K2CO3(384mg，2.78mmol)和DMF(21mL)，并在室温下搅拌所得悬浮液10分钟。随后加入24(424mg，1.11mmol)并在90℃下加热悬浮液90分钟。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH，100:1到40:1)纯化残余物，得到0.355g(49％)52。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.35(br s,1H),7.82-7.88(m,4H), 7.72(dd,J＝3.1,5.5Hz,2H),3.88(s,6H),3.84(m,4H),3.74(t,J＝7.2Hz,2H),2.48(m, 4H),2.43(t,J＝7.4Hz,2H),2.16(s,6H),1.74(m,2H),1.59(m,2H)；MS(m/z):[M+H]+ 650.5。
YK91(53)2-(2-(4-(4-氨基丁基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6- 二胺
向含52(0.355g，0.546mmol)的MeOH(10mL)中加入水合肼(797μL，0.820 g，16.4mmol)并在室温下搅拌2小时。随后加入5mL 1M NaOH并在55℃下加热反应混合物2小时。减压浓缩反应混合物并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1 到5:1)纯化残余物，得到0.228g(96％)53。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ5.22 (s,1H),3.88(s,10H),2.72(t,J＝7.1Hz,2H),2.53(m,4H),2.42(t,J＝7.2Hz,2H), 1.46-1.62(m,4H)；MS(m/z):[M+H]+436.4。
(54)4-(4-(5-(4,6-二氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)丁基氨基甲酸叔丁酯
向含53(0.221g，0.507mmol)的CH2Cl2(6mL)中加入Et3N(107μL，77mg， 0.761mmol)和二碳酸二-叔丁酯(0.133g，0.611mmol)并在室温下搅拌20小时。减压浓缩反应混合物并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，100:1到30:1)纯化残余物，得到0.254g(93％)54。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ5.19(s,1H),4.41(s,4H),3.89 (m,10H),3.14(m,2H),2.50(m,4H),2.40(t,J＝6.8Hz,2H),1.54-1.63(m,4H),1.44(s, 9H)；MS(m/z):[M+H]+536.5。
(55)4-(4-(5-(4-丙烯酰胺基-6-氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1- 基)丁基氨基甲酸叔丁酯
在0℃下向含80mg(0.149mmol)54的8ml CH2Cl2中加入414μl(298mg，2.98 mmol)Et3N。随后加入14.5μl(16.2mg，0.179mmol)丙烯酰氯。30分钟后，再在0 ℃下加入14.5μl丙烯酰氯。再重复此操作2次，总反应时间为2小时(总丙烯酰氯，58 μl，64.8mg，0.716mmol)。通过加入1mL MeOH淬灭反应，随后减压浓缩。通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化残余物，得到42.5mg(48％)55。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ7.78(s,1H),7.05(s,1H),6.42(d,J＝16.9Hz,1H),6.18(dd,J＝10.4, 16.9Hz,1H),5.80(d,J＝10.2,1H),5.15(brs,1H),4.80(br s,2H),3.89(s,10H),3.14(m, 2H),2.54(m,6H),1.58(m,4H),1.44(s,9H)；MS(m/z):[M+H]+590.5。
(59)YK5珠粒
室温下，将55(45mg，0.076mmol)于3ml CH2Cl2中的溶液逐滴加入0.75mL TFA 中。搅拌45分钟后，减压浓缩反应混合物。通过与MeOH共蒸发数次并在高真空下干燥过夜来去除TFA，得到残余物，将其溶解于DMF(2mL)中并加入固相肽合成容器中的4.2mL(0.0636mmol)10珠粒(预先洗涤，3×6mL DMF)中。加入100 μL N,N-二异丙基乙胺和一些DMAP晶体并将其在室温下震荡3小时。随后去除溶剂并洗涤珠粒10分钟，每次用CH2Cl2(4×10mL)、DMF(4×10mL)和i-PrOH(3×10mL) 洗涤。YK5珠粒(59)储存于-80℃的i-PrOH中。
方案7.制备YK71珠粒(65)。
试剂和条件：a.CH2Cl2:TFA(4:1)，室温，1小时；b.N-(2-(2-氟-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-基)乙酰胺，K2CO3，90℃，1.5小时；c.水合肼，MeOH，室温，20 小时，随后在50℃下3小时；d.二碳酸二-叔丁酯，Et3N，CH2Cl2，室温，20小时；e.丙烯酰氯，Et3N，CH2Cl2，0℃，1.5小时；f.CH2Cl2:TFA(4:1)，室温，45分钟；g. 10珠粒，DIEA，DMAP，DMF，3小时。
(60)N-(2-(2-(4-(4-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)丁基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5- 基硫基)嘧啶-4-基)乙酰胺
向含58(402.4mg，1.04mmol)的CH2Cl2(12mL)中逐滴加入TFA(3mL)并在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物并通过与MeOH共蒸发数次且在高真空下干燥过夜来去除TFA。向其中加入K2CO3(359mg，2.6mmol)和DMF(20mL)并在室温下搅拌所得悬浮液10分钟。随后加入N-(2-(2-氟-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4- 基)乙酰胺(338mg，1.04mmol)并在90℃下加热悬浮液90分钟。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH，100:1到40:1)纯化残余物，得到0.60g(97％)60。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ8.34(d,J＝5.7Hz,1H),7.85(dd,J＝3.0,5.4Hz,2H),7.81(br s,1H), 7.59-7.71(m,3H),3.88(s,6H),3.85(m,4H),3.74(t,J＝7.1Hz,2H),2.49(m,4H),2.43(t, J＝7.5Hz,2H),2.18(s,3H),1.75(m,2H),1.60(m,2H)；MS(m/z):[M+H]+593.4。
YK93(61)2-(2-(4-(4-氨基丁基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-胺
向含60(0.600g，1.01mmol)的MeOH(28mL)中加入水合肼(813μL，0.836g，16.7mmol)并在室温下搅拌20小时。随后再加入水合肼(813μL，0.836g，16.7mmol) 并在50℃下加热反应混合物3小时。减压浓缩反应混合物并通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，80:1到10:1)纯化残余物，得到0.370g(87％)61。1H NMR (500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ7.85(d,J＝5.9Hz,1H),6.11(d,J＝5.9Hz,1H),3.88(s, 10H),2.71(t,J＝7.1Hz,2H),2.53(m,4H),2.42(t,J＝7.4Hz,2H),1.47-1.63(m,4H)；MS (m/z):[M+H]+421.3。
(62)4-(4-(5-(4-氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)丁基氨基甲酸叔丁酯
向含61(0.370g，0.880mmol)的CH2Cl2(10mL)中加入Et3N(186μL，134mg，1.32mmol)和二碳酸二-叔丁酯(0.230g，1.06mmol)并在室温下搅拌20小时。减压浓缩反应混合物并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH:MeOH-NH3(7N)，100:1:0到50:0:1) 纯化残余物，得到0.44g(96％)62。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.97(d,J＝5.8Hz,1H), 6.05(d,J＝5.8Hz,1H),5.21(br s,1H),4.76(br s,2H),3.89(s,6H),3.87(m,4H),3.15(m, 2H),2.49(m,4H),2.40(t,J＝6.8Hz,2H),1.54-1.63(m,4H),1.44(s,9H)；MS(m/z): [M+H]+521.3。
(63)4-(4-(5-(4-丙烯酰胺基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)丁基氨基甲酸叔丁酯
在0℃下向含100mg(0.192mmol)62的10ml CH2Cl2中加入533μl(384mg，3.84 mmol)Et3N。随后加入19μl(21mg，0.23mmol)丙烯酰氯。30分钟后，再在0℃下加入19μl丙烯酰氯。再重复此操作1次，总反应时间为1.5小时(总丙烯酰氯，57μl， 63mg，0.69mmol)。通过加入2mL MeOH淬灭反应，随后减压浓缩。通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到72mg(65％)63。1H NMR(500MHz, CDCl3):δ8.83(br s,1H),8.36(d,J＝5.2Hz,1H),7.85(d,J＝5.2Hz,1H),6.46(d,J＝ 16.9Hz,1H),6.28(dd,J＝10.2,16.9Hz,1H),5.81(d,J＝10.2Hz,1H),5.23(br s,1H), 3.87(s,6H),3.85(m,4H),3.16(m,2H),2.48(m,4H),2.40(m,2H),1.57(m,4H),1.44(s, 9H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ171.4,171.0,164.4,160.1,158.9,157.4,156.1,130.4, 129.7,106.0,79.1,78.9,58.2,53.4,52.9,43.6,40.5,28.5,28.0,24.3；MS(m/z):[M+H]+ 575.3。
YK94(64)N-(2-(2-(4-(4-氨基丁基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4- 基)丙烯酰胺
室温下，向含70mg(0.122mmol)63的4ml CH2Cl2中逐滴加入1mL TFA。搅拌 45分钟后，减压浓缩反应混合物。通过与MeOH共蒸发数次并在高真空下干燥过夜来去除TFA，得到64的TFA盐，且不经进一步纯化即使用。1H NMR(500MHz, CDCl3/MeOH-d4):δ8.33(d,J＝5.9Hz,1H),8.19(br s,1H),8.03(d,J＝6.1Hz,1H),6.51 (d,J＝16.9Hz,1H),6.40(dd,J＝10.6,16.9Hz,1H),5.88(d,J＝10.6Hz,1H),3.90(s, 6H),3.55-3.72(m,2H),3.38-3.54(m,2H),3.19(t,J＝7.7.Hz,2H),2.94-3.13(m,4H), 1.86-1.95(m,2H),1.73-1.82(m,2H)；13CNMR(166MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ171.4, 170.2,165.4,159.9,158.9,155.7,130.5,129.9,106.2,79.2,56.2,54.4,51.5,40.7,38.6,24.1, 20.6；MS(m/z):[M+H]+475.4。
(65)YK71珠粒
在固相肽合成容器中，将64(约0.122mmol)于DMF(4mL)中的溶液加入6.8mL(0.102mmol)10珠粒(预先洗涤，3×10mL DMF)中。加入100μL N,N-二异丙基乙胺和一些DMAP晶体并将其在室温下震荡3小时。随后去除溶剂并洗涤珠粒10 分钟，每次用CH2Cl2(4×10mL)、DMF(4×10mL)和i-PrOH(3×10mL)洗涤。YK71 珠粒(65)储存于-80℃的i-PrOH中。
方案8.合成TT-6(72)。
试剂和条件：a.邻苯二甲酰亚胺钾，DMF，110℃，18小时；b.对甲苯磺酰氯， Et3N，DMAP，CH2Cl2，5℃到室温，24小时；c.1-Boc-哌嗪，K2CO3，二噁烷，80℃，22小时；d.CH2Cl2:TFA(4:1)，室温，1小时；e.24，K2CO3，DMF，90℃，1.5小时； f.NH2NH2，MeOH，室温，2小时，随后1MNaOH(水溶液)，50℃，1.5小时；g.D- 生物素，EDCl，DMAP，CH2Cl2，声波处理，2小时；h.丙烯酰氯，Et3N，CH2Cl2，0 ℃。
(66)2-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)异吲哚啉-1,3-二酮
将45(1.22g，3.5mmol)和邻苯二甲酰亚胺钾(0.713g，3.85mmol)悬浮于无水 DMF(10mL)中并在110℃下加热18小时。减压浓缩反应混合物并将残余物溶解于CH2Cl2(50mL)中且用1M HCl(2×20mL)、盐水(2×20mL)洗涤，用MgSO4干燥并过滤。减压去除溶剂，得到油状物，将其通过柱色谱法(EtOAc)纯化，得到0.95g (84％)66。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.85(dd,J＝3.1,5.4Hz,2H),7.72(dd,J＝3.0, 5.5Hz,2H),3.91(t,J＝5.9Hz,2H),3.75(t,J＝5.8Hz,2H),3.55-3.73(m,12H)；MS(m/z): [M+Na]+346.1。
(67)4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯
用冰浴将66(0.95g，2.7mmol)、Et3N(395μL，0.287g，2.8mmol)和DMAP(33 mg，0.27mmol)于CH2Cl2(30mL)中的溶液冷却到5℃。在5℃下分数份加入甲苯磺酰氯(0.515g，2.7mmol)且在30分钟后，移开冰浴并在室温下持续搅拌24小时。将反应混合物加入分液漏斗中并用1N HCl(2×25mL)、水(25mL)和盐水(2×25mL) 洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到油状物，将其通过柱色谱法(己烷:EtOAc， 6:4到4:6)纯化，得到1.12g(87％)67。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.84(dd,J＝3.1, 5.4Hz,2H),7.79(d,J＝8.3Hz,2H),7.72(dd,J＝3.0,5.5Hz,2H),7.34(d,J＝8.4Hz, 2H),4.14(t,J＝4.8Hz,2H),3.89(t,J＝5.9Hz,2H),3.73(t,J＝5.8Hz,2H),3.48-3.68(m, 10H),2.44(s,3H)；MS(m/z):[M+Na]+500.0。
(68)4-(2-(2-(2-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1- 甲酸叔丁酯
向含67(1.10g，0.0023mol)的二噁烷(25mL)中加入1-Boc-哌嗪(1.07g，0.0058mol)和K2CO3(1.37g，0.0099mol)并在80℃下加热22小时。减压去除溶剂并将残余物溶解于CH2Cl2(100mL)中，且用水(2×50mL)和盐水(2×50mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩成油状物，将其通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 1:0到30:1)纯化，得到0.819(72％)68。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.84(dd,J＝3.1, 5.4Hz,2H),7.71(dd,J＝3.0,5.5Hz,2H),3.90(t,J＝5.9Hz,2H),3.74(t,J＝5.9Hz,2H), 3.52-3.67(m,10H),3.43(m,4H),2.57(t,J＝6.0Hz,2H),2.43(m,4H),1.45(m,9H)；MS (m/z):[M+H]+492.1。
(69)N,N'-(2-(2-(4-(2-(2-(2-(2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二基)二乙酰胺
向含68(542mg，1.10mmol)的CH2Cl2(28mL)中逐滴加入TFA(7mL)并在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物并通过与MeOH共蒸发数次且在高真空下干燥过夜来去除TFA。向其中加入K2CO3(381mg，2.76mmol)和DMF(20mL)并将所得悬浮液在室温下搅拌10分钟。随后加入24(421mg，1.1mmol)并在90℃下加热悬浮液90分钟。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH，100:1到25:1)纯化残余物，得到0.537g(65％)69。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.35(s,1H),7.84(dd,J＝3.1, 5.5Hz,2H),7.81(bs,2H),7.71(dd,J＝3.1,5.5Hz,2H),3.83-3.92(m,12H),3.74(t,J＝ 5.8Hz,2H),3.55-3.67(m,10H),2.64(t,J＝5.7Hz,2H),2.56(m,4H),2.15(s,6H)；MS (m/z):[M+H]+754.2。
(70)2-(2-(4-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4,6-二胺
向含69(300mg，0.398mmol)的MeOH(9mL)中加入水合肼(580μL，598mg， 11.9mmol)并在室温下搅拌2小时。随后加入1M NaOH(4.5mL)并在50℃下加热反应混合物1.5小时。反应混合物浓缩至干并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH，60:1到10:1) 纯化残余物，得到0.214g(93％)70。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.16(s,1H),4.56(s, 4H),3.84-3.91(m,10H),3.61-3.69(m,10H),3.51(t,J＝5.2Hz,2H),2.86(t,J＝5.2Hz, 2H),2.66(t,J＝5.7Hz,2H),2.57(m,4H)；MS(m/z):[M+H]+540.1。
(71)N-(2-(2-(2-(2-(4-(5-(4,6-二氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1- 基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺
在密封管中，将含20.0mg(0.0371mmol)70、18.1mg(0.0741mmol)D-(+)-生物素、DMAP(催化量)、14.2mg(0.0741mmol)EDCl的1ml CH2Cl2用声波处理2小时。将反应混合物蒸发至干并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到15.6mg(55％)71。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ5.23(s,1H),4.49(m, 1H),4.30(m,1H),3.86-3.91(m,10H),3.60-3.72(m,12H),3.40(m,2H),3.12-3.18(m,1H), 2.91(dd,J＝5.0,12.9Hz,1H),2.72(d,J＝12.9Hz,1H),2.68(t,J＝5.6Hz,2H),2.60(m, 4H),2.19(dd,J＝2.1,7.7Hz,2H),1.38-1.76(m,6H)；MS(m/z):[M+H]+766.25。
TT-6(72)N-(2-(2-(2-(2-(4-(5-(4-丙烯酰胺基-6-氨基嘧啶-2-基硫基)-4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4- 基)戊酰胺
在0℃下向含15mg(0.020mmol)71的2ml CH2Cl2中加入83μl(60mg，0.6mmol) Et3N。随后在0℃下逐滴加入含3.3μl(3.6mg，0.04mmol)丙烯酰氯的CH2Cl2(0.5mL)。 1小时后，再逐滴加入含3.3μl丙烯酰氯的CH2Cl2(0.5mL)。以30分钟间隔再重复此操作4次，总反应时间为3.5小时(总丙烯酰氯，19.8μl，21.6mg，0.24mmol)。通过加入1mL MeOH淬灭反应，随后减压浓缩。通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到6.0mg(37％)72。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ9.57(s,1H),7.13 (s,1H),6.94(br s,1H),6.53(br s,1H),6.32-6.45(m,2H),5.72(dd,J＝2.4,9.0Hz,1H), 5.58(br s,2H),5.19(br s,1H),4.48(m,1H),4.34(m,1H),3.82-3.93(m,10H),3.55-3.77 (m,12H),3.39(m,2H),3.08-3.15(m,1H),2.89(dd,J＝5.1,12.9Hz,1H),2.81(m,2H), 2.72(d,J＝12.9Hz,1H),2.70(m,4H),2.19(m,2H),1.38-1.76(m,6H)；13C NMR(166 MHz,CDCl3):δ173.6,171.0,170.3,165.1,164.8,163.8,159.8,157.1,130.9,128.8,88.7, 79.5,71.0,70.4,70.3,70.2,69.5,62.3,59.9,57.3,56.0,54.2,53.4,52.5,43.6,40.7,39.2, 35.4,28.5,28.0,25.7；MS(m/z):[M+H]+820.3。
方案9.合成YK140(75)、YK141(77)、YK142(78)。
试剂和条件：a.3-氨基苯硫醇，新亚铜试剂，CuI，K2CO3，DMF，125℃，20小时； b.丙酰氯，Et3N，CH2Cl2，0℃到室温；c.CHCl3:TFA(1:1)，62℃，22小时；d.HF/ 吡啶，NaNO2，0℃到室温；e.46，DMF，90℃，75分钟；f.D-生物素，DCC，DMAP，CH2Cl2，声波处理，6小时。
(73)5-(3-氨基苯基硫基)-4,6-二甲氧基-N,N-双(4-甲氧基苯甲基)嘧啶-2-胺
在125℃下将20(0.521g，1.0mmol)、3-氨基苯硫醇(106μl，0.125g，1.0mmol)、新亚铜试剂(42mg，0.2mmol)、碘化亚铜(38mg，0.2mmol)和碳酸钾(0.415g，3.0 mmol)于DMF(10mL)中的混合物搅拌20小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，75:25)纯化残余物，得到0.183g(35％)73。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ 7.23(d,J＝8.6Hz,4H),7.00(t,J＝7.8Hz,1H),6.87(d,J＝8.6Hz,4H),6.54(d,J＝8.5 Hz,1H),6.44(s,1H),6.41(d,J＝7.8Hz,1H),4.76(s,4H),3.89(s,6H),3.81(s,6H),3.59 (br s,2H)；MS(m/z):[M+H]+519.0。
(74)N-(3-(2-(双(4-甲氧基苯甲基)氨基)-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)苯基)丙酰胺
向含183mg(0.353mmol)73的10mL CH2Cl2中加入Et3N(492μL，357mg，3.53 mmol)并用冰浴冷却到0℃。逐滴加入丙酰氯(168μL，179mg，1.765mg)于CH2Cl2 (5mL)中的溶液并搅拌反应混合物。20分钟后，去除冰浴且再持续搅拌40分钟。加入2mL MeOH以淬灭反应并减压去除溶剂，且通过柱色谱法(己烷:EtOAc，70:30到60:40) 纯化残余物，得到0.188g(93％)74。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.47(d,J＝7.7Hz,1H), 7.24(d,J＝8.5Hz,4H),7.17(t,J＝7.9Hz,1H),7.08(s,1H),7.01(s,1H),6.87(d,J＝8.6 Hz,4H),6.83(d,J＝7.6Hz,1H),4.77(s,4H),3.89(s,6H),3.81(s,6H),2.36(q,J＝7.5Hz, 2H),1.26(t,J＝7.5Hz,3H)；MS(m/z):[M+Na]+597.1。
YK140(75)N-(3-(2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)苯基)丙酰胺
在62℃下将含188mg(0.327mmol)74的5mL CHCl3:TFA(1:1)加热22小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(己烷:EtOAc，1:1到4:6)纯化残余物，得到90mg(83％) 75。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.43(d,J＝1.1Hz,1H),7.15(t,J＝8.0Hz,1H), 6.95-7.06(m,3H),6.74-6.85(m,2H),3.90(s,6H),2.36(q,J＝7.6Hz,2H),1.26(t,J＝7.6 Hz,3H)；HRMS(m/z):C15H19N4O3S的[M+H]+计算值335.1178；实验值335.1183。
(76)N-(3-(2-氟-4,6-二甲氧基嘧啶-5-基硫基)苯基)丙酰胺
将60mg(0.178mmol)75和吡啶(250μL)加入装备有搅拌棒的塑料管中并冷却到0℃。随后加入HF/吡啶溶液(300μL，12mmol)。数分钟后，加入20mg(0.290mmol) NaNO2并在0℃下再用力搅拌90分钟且在室温下搅拌3小时。随后加入5ml CH2Cl2和 100mg CaCO3并在室温下搅拌混合物5小时。随后使其经由烧结盘式漏斗过滤并用 EtOAc洗涤固体。滤液经硅藻土过滤，减压浓缩并通过制备型TLC(己烷:EtOAc，60:40) 纯化残余物，得到35mg(58％)76。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.35(d,J＝7.7Hz,1H), 7.17(t,J＝7.9Hz,1H),6.96-7.05(m,1H),6.75-6.90(m,2H),4.01(s,6H),2.36(q,J＝7.5 Hz,2H),1.23(t,J＝7.5Hz,3H)；MS(m/z):[M+H]+338.2。
YK141(77)N-(3-(2-(4-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)-4,6- 二甲氧基嘧啶-5-基硫基)苯基)丙酰胺
向含35mg(0.104mmol)76的2ml DMF中加入30mg(0.114mmol)46并在90 ℃下加热75分钟。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1) 纯化残余物，得到44.2mg(74％)77。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.51(d,J＝7.2Hz, 1H),7.22(s,1H),7.14(t,J＝7.8Hz,1H),6.95(s,1H),6.80(d,J＝7.5Hz,1H),3.94(s, 4H),3.89(s,6H),3.60-3.80(m,15H),2.60-2.82(m,6H),2.35(q,J＝7.2Hz,2H),1.21(t,J ＝7.4Hz,3H)；HRMS(m/z):C27H42N5O7S的[M+H]+计算值580.2805；实验值580.2806。
YK142(78)5-(2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸2-(2-(2-(2-(4-(4,6-二甲氧基-5-(3-丙酰胺基苯基硫基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯
在密封管中，将含29mg(0.050mmol)77、36mg(0.147mmol)D-(+)-生物素、 DMAP(4.5mg，0.037mmol)、61mg(0.296mmol)DCC的5ml CH2Cl2用声波处理6 小时。将反应混合物蒸发至干并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化残余物，得到36mg(90％)78。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.45-7.53(m,2H),7.13 (t,J＝6.6Hz,1H),7.05(s,1H),6.77(d,J＝6.5Hz,1H),5.90(s,1H),5.35(s,1H), 4.46-4.53(m,1H),4.27-4.33(m,1H),4.18-4.26(m,2H),3.85-4.00(m,10H),3.63-3.74(m, 12H),3.10-3.18(m,1H),2.90(dd,J＝4.5,10.7Hz,1H),2.74(d,J＝10.7Hz,1H),2.61(m, 4H),2.42(t,J＝7.2Hz,2H),2.36(m,4H),1.10-1.82(m,9H)；HRMS(m/z):C37H56N7O9S2的[M+H]+计算值806.3581；实验值806.3566。
方案10.合成YK129(83)、YK130(84)、YK139(85)、YK149(86)、TT-2(87)、 TT-3(88)、TT-4(89)。
试剂和条件：a.N-甲基哌嗪，DMF，90℃，2.5小时；b.NIS，TFA，CH3CN，室温，1.5小时；c.3-氨基苯硫醇，新亚铜试剂，CuI，K3PO4，DMF，125℃，17小时；d.RCOCl， Et3N；e.RCOOH，DCC，THF，室温；f.CH2Cl2:TFA(4:1)，室温。
(80)4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶
在90℃下将含5g(0.0286mol)2-氯-4,6-二甲氧基嘧啶(79)和7.93mL(7.16g，0.0715mol)N-甲基哌嗪的22mL DMF加热2.5小时。减压浓缩反应混合物并将残余物溶解于200mL CH2Cl2中。将其用盐水(3×50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到6.51g(95％)80。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ5.37(s,1H),3.85(s,6H),3.82(m,4H), 2.44(m,4H),2.33(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ172.0,160.8,77.8,55.0,53.4, 46.3,43.7；MS(m/z):[M+H]+239.2。
(81)5-碘-4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶
向含1.59g(6.67mmol)80的40mL乙腈中加入1.80g(8.01mmol)N-碘代琥珀酰亚胺、0.771mL(1.14g，10.0mmol)TFA并在室温下搅拌1.5小时。将反应混合物浓缩至干并将残余物溶解于100mL CH2Cl2中，且用5％NaHCO3(3×50mL)洗涤，用 MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到残余物，将其通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 1:0到20:1)纯化，得到2.06g(86％)81。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ3.93(s,6H),3.82 (m,4H),2.47(m,4H),2.36(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+365.1。
YK133(82)3-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯胺
在125℃下将81(0.500g，1.37mmol)、3-氨基苯硫醇(146μl，0.172g，1.37mmol)、新亚铜试剂(86mg，0.411mmol)、碘化亚铜(78mg，0.411mmol)和磷酸钾(0.582g，2.74mmol)于DMF(15mL)中的混合物搅拌17小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，100:1到30:1)纯化残余物，得到0.253g(51％)82。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ6.97(t,J＝8.0Hz,1H),6.46-6.51(m,1H),6.36-6.40(m,2H), 3.88-4.03(m,10H),2.52(m,4H),2.38(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ171.8,160.1, 146.9,139.5,129.6,116.2,112.2,112.1,81.1,55.0,54.6,46.3,43.8；HRMS(m/z): C17H24N5O2S的[M+H]+计算值362.1651；实验值362.1649。
YK129(83)N-(3-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)丙烯酰胺
向82(10mg，0.027mmol)和Et3N(50μL，36mg，0.36mmol)于1mL CH2Cl2中的溶液中加入丙烯酰氯(22μL，24.4mg，0.27mmol)。在室温下搅拌反应12小时，随后通过加入冷MeOH淬灭。减压蒸发溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 20:1)纯化残余物，得到6.0mg(54％)83。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.49(m,1H),7.36 (m,1H),7.14(m,2H),6.84(d,J＝7.5Hz,1H),6.36(m,1H),6.22(m,1H),5.73(m,1H), 4.02(m,4H),3.90(s,6H),2.70(m,4H),2.50(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+416.4。
YK130(84)N-(3-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)丙酰胺
向82(10mg，0.027mmol)和Et3N(50μL，36mg，0.36mmol)于1mL CH2Cl2中的溶液中加入丙酰氯(22μL，24.4mg，0.27mmol)。在室温下搅拌反应12小时，随后通过加入冷MeOH淬灭。减压蒸发溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 20:1)纯化残余物，得到7.3mg(65％)84。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.44(d,J＝7.5 Hz,1H),7.13(m,2H),7.04(s,1H),6.78(d,J＝7.5Hz,1H),3.93(m,4H),3.90(s,6H), 2.55(m,4H),2.36(s,3H),2.33(q,J＝7.2Hz,2H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H)；HRMS(m/z): C20H28N5O3S的[M+H]+计算值418.1913；实验值418.1910。
YK139(85)N-(3-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)环丙烷甲酰胺
向82(10.9mg，0.0302mmol)和Et3N(21μl，15.3mg，0.151mmol)于CH2Cl2 (1mL)中的溶液中加入环丙烷羰基氯(14μl，15.8mg，0.1508mmol)并在室温下搅拌 2小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到7.9mg(61％)85。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.49(m,1H),7.29(s,1H),7.13 (t,J＝7.8Hz,1H),6.97(s,1H),6.78(d,J＝7.6Hz,1H),3.88-3.95(m,10H),2.48(m,4H), 2.36(s,3H),1.05-1.13(m,1H),0.74-0.96(m,4H)；HRMS(m/z):C21H28N5O3S的[M+H]+计算值430.1913；实验值430.1897。
YK149(86)2-氨基-N-(3-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基) 乙酰胺
向82(20mg，0.0552mmol)于THF(1mL)中的溶液中加入Boc-甘氨酸(9.7mg，0.0552mmol)和DCC(12mg，0.058mmol)并在室温下搅拌5小时。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(EtOAc:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到固体，将其溶解于2mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并在室温下搅拌1小时。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化残余物，得到13.9mg(60％)86。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ7.38(d,J＝8.2Hz,1H),7.26(s,1H),7.15(t,J＝ 7.9Hz,1H),6.79(d,J＝7.6Hz,1H),3.86-3.97(m,10H),3.52(s,2H),2.58(m,4H),2.41(s, 3H)；MS(m/z):[M+H]+419.1。
TT-2(87)N-(3-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)环丁烷甲酰胺
在室温下将含82(10mg，0.028mmol)、Et3N(19.5μl，14.2mg，0.14mmol)和环丁烷羰基氯(9.6μl，10.0mg，0.084mmol)的CH2Cl2(1mL)搅拌2小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(EtOAc:MeOH-NH3)(7N)，20:1)纯化残余物，得到4.1mg (33％)87。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.50(d,J＝7.8Hz,1H),7.14(t,J＝7.9Hz,1H), 7.00(s,1H),6.94(br s,1H),6.77(d,J＝7.9Hz,1H),3.90(br s,10H),3.07(m,1H),2.50 (m,14H),2.14-2.42(m,7H),1.82-2.02(m,2H)；MS(m/z):[M+H]+444.1。
TT-3(88)N-(3-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)环己烷甲酰胺
在室温下将含82(10mg，0.028mmol)、Et3N(19.5μl，14.2mg，0.14mmol)和环己烷羰基氯(11.4μl，12.3mg，0.084mmol)的CH2Cl2(1mL)搅拌3小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(EtOAc:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到12mg (91％)88。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.50(d,J＝7.9Hz,1H),7.18(s,1H),7.13(t,J＝ 7.9Hz,1H),7.02(s,1H),6.76(d,J＝7.7Hz,1H),3.90(br s,10H),2.51(m,4H),2.38(s, 3H),2.11-2.22(m,1H),1.19-1.96(m,10H)；MS(m/z):[M+H]+472.0。
TT-4(89)N-(3-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)苯甲酰胺
在室温下将含82(10mg，0.028mmol)、Et3N(19.5μl，14.2mg，0.14mmol)和苯甲酰氯(9.8μl，11.8mg，0.084mmol)的CH2Cl2(1mL)搅拌3小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(EtOAc:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到8.6mg(66％) 89。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.83(d,J＝7.7Hz,2H),7.74(br s,1H),7.59(d,J＝7.8 Hz,1H),7.54(t,J＝6.4Hz,1H),7.47(t,J＝7.8Hz,2H),7.20(t,J＝8.0Hz,1H),7.13(s, 1H),6.86(d,J＝7.9Hz,1H),3.87-3.93(m,10H),2.50(m,4H),2.37(s,3H)；MS(m/z): [M+H]+466.1。
方案11.合成TT-5(95)。
试剂和条件：a.PhB(OH)2，Na2CO3，Pd(OAc)2，PPh3，DME，95℃，15-20小时； b.N-甲基哌嗪，DMF，90℃，1.5小时；c.NIS，TFA，CH3CN；d.3-氨基苯硫醇，新亚铜试剂，CuI，K3PO4，DMF，120℃，12小时；e.Boc-甘氨酸，DCC，THF，室温，12 小时；f.CH2Cl2:TFA(4:1)，室温。
(91)2-氯-4-苯基嘧啶
向2,4-二氯嘧啶(90)(50mg，0.336mmol)、苯基硼酸(41mg，0.336mmol)、碳酸钠(110mg于0.5mL水中)和DME(2.5mL)的混合物中加入乙酸钯(3.8mg，0.0168 mmol)和三苯基膦(8.8mg，0.0336mmol)。在95℃下加热反应混合物20小时。减压去除溶剂并将残余物溶解于二氯甲烷(20mL)中，用水(3×5mL)洗涤，用MgSO4干燥并浓缩，得到残余物，将其通过制备型TLC(己烷:EtOAc，8:2)纯化，得到41mg (64％)91。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.63(d,J＝5.2Hz,1H),8.06-8.11(m,2H),7.64 (d,J＝5.3Hz,1H),7.47-7.57(m,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ167.2,161.9,159.8, 135.1,131.9,129.1,127.4,115.2。
(92)2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-苯基嘧啶
向91(38mg，0.201mmol)于0.5mL DMF中的溶液中加入1-甲基哌嗪(56μl， 50mg，0.31mmol)并在90℃下加热1.5小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到49mg(95％)92。1H NMR(500MHz, CDCl3):δ8.36(d,J＝5.2Hz,1H),8.01-8.09(m,2H),7.43-7.50(m,3H),6.92(d,J＝5.2 Hz,1H),3.96(m,4H),2.50(m,4H),2.34(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ164.4, 162.1,158.4,137.8,130.6,128.8,127.1,105.8,55.2,46.4,43.9；MS(m/z):[M+H]+255.1。
(93)5-碘-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-苯基嘧啶
向含92(49mg，0.193mmol)的乙腈(1.4mL)中加入TFA(59μl，88mg，0.772 mmol)、N-碘代琥珀酰亚胺(43mg，0.193mmol)并在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂并将残余物溶解于二氯甲烷(15mL)中，用10％Na2CO3(2×5mL)、水(5mL)洗涤，用MgSO4干燥并浓缩，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH，10:1)纯化，得到67mg(92％)93。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.60(s,1H),7.65-7.73(m,2H), 7.42-7.49(m,3H),3.86(m,4H),2.45(m,4H),2.33(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ167.5,165.8,160.9,140.3,129.7,129.3,128.1,76.2,55.0,46.4,43.9；MS(m/z):[M+H]+ 380.9。
(94)3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-苯基嘧啶-5-基硫基)苯胺
在110℃下，将93(37.6mg，0.099mmol)、3-氨基苯硫醇(12μl，13.6mg，0.109mmol)、新亚铜试剂(6.2mg，0.0297mmol)、碘化亚铜(5.7mg，0.0297mmol)和碳酸钾(42mg，0.198mmol)于DMF(1.4mL)中的混合物搅拌12小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到10mg(27％) 94。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.45(s,1H),7.71(d,J＝6.6Hz,2H),7.32-7.42(m,3H), 6.99(t,J＝7.9Hz,1H),6.47(d,J＝7.8Hz,1H),6.43(dd,J＝2.0,6.4Hz,1H),6.36(d,J＝ 1.8Hz,1H),3.97(m,4H),3.60(br s,2H),2.52(m,4H),2.37(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+ 378.1。
TT-5(95)2-氨基-N-(3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-苯基嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向94(5mg，0.0133mmol)于THF(0.5mL)中的溶液中加入Boc-甘氨酸(2.3mg，0.0133mmol)和DCC(3mg，0.0146mmol)。在室温下搅拌2小时后，蒸发THF并加入0.5mLCH2Cl2:TFA(4:1)。搅拌溶液45分钟，随后减压浓缩至干，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化，得到2mg(35％)95。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ8.45(s,1H),7.69(d,J＝8.2Hz,2H),7.35-7.45(m, 4H),7.31(m,1H),7.17(t,J＝8.0Hz,1H),6.76(d,J＝7.8Hz,1H),3.96(m,4H),3.36(s, 2H),2.56(m,4H),2.38(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+435.0。
方案12.合成TT-7(100)、TT-8(101)、TT-9(102)、TT-18(103)、TT-19(104)、 TT-20(105)。
试剂和条件：a.苯甲醇，KOH，18-冠醚-6，甲苯，室温，1小时；b.N-甲基哌嗪， DMF，80℃，1.75小时；c.NIS，TFA，CH3CN，室温，1小时；d.3-氨基苯硫醇，新亚铜试剂，CuI，K2CO3，DMF，120℃，18小时；e.Ac2O，CH2Cl2或PhCOCl，Et3N，CH2Cl2； f.RCOOH，DCC，THF，室温，12小时；g.CH2Cl2:TFA(4:1)，室温。
(96)4-(苯甲氧基)-2-氯嘧啶
向2,4-二氯嘧啶(90)(2.0g，0.0134mmol)于甲苯(20mL)中的溶液中加入苯甲醇(1.53ml，1.59g，0.0147mol)、KOH(0.82g，0.0147mol)和18-冠醚-6(0.177g， 0.00067mol)并在室温下搅拌1小时。用EtOAc(400mL)稀释反应混合物并用水(3×50 mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到白色固体，对其进行色谱分离(己烷:CH2Cl2， 1:1到3:7)，得到2.09g(71％)96与区域异构体2-(苯甲氧基)-4-氯嘧啶(分别借助1H-NMR 得到相对比率为75:25)的混合物；MS(m/z):[M+Na]+243.1。
(97)4-(苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶
向96(2.09，0.00947mol；含有区域异构体)于DMF(34mL)中的溶液中加入1- 甲基哌嗪(3.15mL，2.85g，0.0284mol)并在80℃下加热1.75小时。减压去除溶剂并将残余物溶解于EtOAc(350mL)中且用盐水(3×50mL)洗涤。用EtOAc(2×50mL) 萃取水层且合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到油状物，将其通过柱色谱法(EtOAc:MeOH-NH3(7N)，1:0到25:1)纯化，得到1.88g(70％)97。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ8.06(d,J＝5.6Hz,1H),7.41(d,J＝7.0Hz,2H),7.35(t,J＝7.0Hz,2H), 7.32(d,J＝7.0Hz,1H),6.03(d,J＝5.6Hz,1H),5.35(s,2H),3.83(m,4H),2.45(m,4H), 2.33(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+284.9。
(98)4-(苯甲氧基)-5-碘-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶
向含97(0.937g，0.0033mol)的乙腈(16mL)中加入TFA(1.02mL，1.51g，0.0132mol)和N-碘代琥珀酰亚胺(0.965g，0.0043mol)并在室温下搅拌1小时。随后加入7mL10％Na2CO3(0.70g，0.066mol)并搅拌2分钟。反应混合物浓缩至干并将残余物溶解于CH2Cl2(200ml)中且用10％Na2CO3(2×50mL)、10％硫代硫酸钠(50 mL)和盐水(50mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到油状物，将其通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，50:1)纯化，得到1.31g(97％)98。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ8.27(s,1H),7.44(d,J＝7.4Hz,2H),7.37(t,J＝7.2Hz,2H),7.32(d, J＝7.3Hz,1H),5.40(s,2H),3.79(m,4H),2.42(m,4H),2.32(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+ 411.0。
(99)3-(4-(苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯胺
在120℃下，将98(0.985g，2.40mmol)、3-氨基苯硫醇(255μl，300.5mg，2.40mmol)、新亚铜试剂(150mg，0.72mmol)、碘化亚铜(137mg，0.72mmol)和碳酸钾(0.663g， 4.80mmol)于DMF(25mL)中的混合物搅拌18小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，50:1到20:1)纯化残余物，得到0.75g(77％)99。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ8.24(s,1H),7.16-7.30(m,5H),6.99(t,J＝7.3Hz,1H),6.56(d,J＝ 7.6Hz,1H),6.38-6.46(m,2H),5.38(s,2H),3.84(m,4H),3.56(br s,2H),2.45(br s,4H), 2.33(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ169.3,164.5,161.4,158.1,146.9,138.5,136.8, 129.6,128.3,127.7,127.4,117.6,113.6,112.6,67.6,54.8,46.2,43.9；MS(m/z):[M+H]+ 408.1。
TT-7(100)N-(3-(4-(苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向含99(5.2mg，0.013mmol)的CH2Cl2(0.2mL)中加入乙酸酐(1.5μL，1.6mg，0.0156mmol)并在室温下搅拌4小时。随后将其减压浓缩至干，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化，得到4.5mg(79％)100。1H NMR (500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ8.24(s,1H),7.54(d,J＝7.7Hz,1H),7.22-7.27(m,3H), 7.13-7.20(m,3H),7.09(s,1H),6.87(d,J＝7.7Hz,1H),5.36(s,2H),3.85(m,4H),2.49(m, 4H),2.35(s,3H),2.10(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+450.1。
TT-8(101)N-(3-(4-(苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)苯甲酰胺
在室温下将99(14mg，0.034mmol)、Et3N(24μl，17.2mg，0.17mmol)和苯甲酰氯(12μl，14.3mg，0.102mmol)于CH2Cl2(1mL)中搅拌2小时。减压去除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，25:1)纯化残余物，得到13.6mg(78％) 101。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ8.26(s,1H),7.84(d,J＝7.4Hz,2H),7.69(dd, J＝1.4,8.2Hz,1H),7.54(t,J＝7.3Hz,1H),7.47(t,J＝7.9Hz,2H),7.14-7.27(m,7H), 6.93(dd,J＝0.9,7.9Hz,1H),5.37(s,2H),3.85(m,4H),2.48(m,4H),2.35(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ168.6,166.3,164.2,161.3,138.6,138.3,136.4,134.8, 131.8,129.3,128.6,128.3,127.7,127.5,127.2,123.4,118.8,117.9,100.1,67.8,54.6,45.9, 43.6；MS(m/z):[M+H]+512.1。
TT-9(102)2-氨基-N-(3-(4-(苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向含99(30mg，0.0736mmol)的THF(3mL)中加入Boc-甘氨酸(14.2mg，0.081 mmol)、DCC(16.7mg，0.081mmol)并在室温下搅拌过夜。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，25:1)纯化残余物，得到油状物，将其溶解于2.5mL CH2Cl2:TFA(4:1)中并在室温下搅拌45分钟。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化残余物，得到24.6mg(72％)102。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ8.24(s,1H),7.50(dd,J＝1.2,8.1Hz,1H),7.31 (m,1H),7.22-7.27(m,3H),7.13-7.20(m,3H),6.86(d,J＝7.9Hz,1H),5.37(s,2H),3.85 (m,4H),3.39(s,2H),2.49(m,4H),2.35(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ 171.4,168.5,164.1,161.2,138.2,138.1,136.4,129.2,128.2,127.6,127.2,123.0,118.2, 117.0,67.7,54.3,45.8,44.6,43.5；MS(m/z):[M+H]+465.3。
TT-20(105)N-(3-(4-(苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)吡咯烷-2- 甲酰胺
向含99(8.6mg，0.0211mmol)的THF(0.5mL)中加入Boc-1-脯氨酸(5mg，0.0232mmol)、DCC(5mg，0.0232mmol)并在室温下搅拌过夜。减压浓缩反应混合物并将残余物溶解于0.35mL GH2Cl2:TFA(4:1)中，且在室温下搅拌45分钟。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化残余物，得到6.0 mg(57％)105。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.63(s,1H),8.26(s,1H),7.58(dd,J＝1.2, 8.1Hz,1H),7.31(t,J＝1.9Hz,1H),7.12-7.17(m,3H),7.22-7.26(m,3H),6.83(d,J＝7.9 Hz,1H),5.36(s,2H),3.80-3.91(m,5H),3.04-3.11(m,1H),2.94-3.00(m,1H),2.47(m,4H), 2.35(s,3H),2.15-2.25(m,1H),1.98-2.06(m,1H),1.70-1.81(m,1H)；MS(m/z):[M+H]+ 505.2。
方案13.合成TT-12(115)、TT-13(116)、TT-14(117)、TT-15(118)、TT-16(119)、TT-17(120)。
试剂和条件：a.对甲氧基苯甲醇，KOH，18-冠醚-6，甲苯，室温，1小时；b.N- 甲基哌嗪，DMF，80℃，1.5小时；c.NIS，TFA，CH3CN，室温，1小时；d.3-氨基苯硫醇，噻吩-2-甲酸铜(I)，K2CO3，DMF，120℃，25小时；e.Ac2O，CH2Cl2，室温，3 小时；f.CH2Cl2:TFA(1:1)，室温，4小时；g.POCl3，60℃，2小时；h.ROH，NaH， DMF，80℃，1.5小时；i.BF3-MeOH，回流，5小时；j.RCOOH，DCC，THF，室温， 12小时；k.CH2Cl2:TFA(4:1)，室温或CH2Cl2:哌啶(9:1)，室温。
(106)2-氯-4-(4-甲氧基苯甲氧基)嘧啶
向含2,4-二氯嘧啶(90)(2.0g，0.0134mmol)的甲苯(20mL)中加入对甲氧基苯甲醇(1.84ml，2.04g，0.0147mol)、KOH(0.825g，0.0147mol)和18-冠醚-6(0.177 g，0.00067mol)并在室温下搅拌1小时。反应混合物用EtOAc(350mL)稀释，用水 (2×50mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到油状物，将其通过柱色谱法(己烷:CH2Cl2，1:1到3:7)纯化，得到2.39g(71％)106与区域异构体4-氯-2-(4-甲氧基苯甲氧基)嘧啶(分别借助1H-NMR得到相对比率为78:22)的混合物。
(107)4-(4-甲氧基苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶
向106(2.39，0.0095mol；含有区域异构体)于DMF(34mL)中的溶液中加入1- 甲基哌嗪(3.16mL，2.85g，0.0285mol)并在80℃下加热1.5小时。减压去除溶剂并将残余物溶解于EtOAc(350mL)中且用盐水(3×50mL)洗涤。水层用EtOAc(2×50 mL)萃取且合并的有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到油状物，将其通过柱色谱法(EtOAc:i-PrOH:Et3N，40:1:1％到20:1:1％)纯化，得到2.10g(70％)107。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ8.05(d,J＝5.6Hz,1H),7.35(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.5Hz, 2H),6.00(d,J＝5.6Hz,1H),5.27(s,2H),3.84(m,4H),3.81(s,3H),2.46(m,4H),2.34(s, 3H)；MS(m/z):[M+H]+315.2。
(108)5-碘-4-(4-甲氧基苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶
向含107(1.16g，3.69mmol)的乙腈(18mL)中加入N-碘代琥珀酰亚胺(1.08g，4.80mmol)、TFA(1.14mL，1.68g，14.76mmol)，并在室温下搅拌1小时。随后加入 15.6mL10％Na2CO3(1.56g，14.76mmol)并搅拌2分钟。将反应混合物浓缩至干并将残余物溶解于CH2Cl2(200ml)中且用10％Na2CO3(2×50mL)、10％硫代硫酸钠(50mL) 和盐水(50mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到油状物，将其通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，50:1)纯化，得到1.44g(85％)108。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ8.26(s,1H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.5Hz,2H),5.33(s,2H), 3.81(s,3H),3.80(m,4H),2.44(m,4H),2.33(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+441.0。
(109)3-(4-(4-甲氧基苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯胺
将108(1.14g，2.59mmol)和碳酸钾(0.716g，5.18mmol)于DMF(37mL)中的混合物抽空并回填氩气三次。加入噻吩-2-甲酸铜(I)(0.198g，1.04mmol)并抽空，且回填氩气2次。加入3-氨基苯硫酚(330μl，0.389g，3.11mmol)且在120℃下加热反应混合物25小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，200:1 到40:1)纯化残余物，得到0.933g(82％)109。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.23(s,1H), 7.14(d,J＝8.7Hz,2H),6.98(t,J＝7.8Hz,1H),6.80(d,J＝8.7Hz,2H),6.54(d,J＝7.8 Hz,1H),6.44(d,J＝7.9Hz,1H),6.40(t,J＝1.9Hz,1H),5.30(s,2H),3.86(m,4H),3.79 (s,3H),3.55(br s,2H),2.47(m,4H),2.35(s,3H)；13C NMR(166MHz,CDCl3):δ168.6, 164.4,161.4,159.2,146.8,138.6,129.5,129.3,128.8,117.6,113.7,113.6,112.5,100.1,67.4, 55.3,54.8,46.2,43.9；MS(m/z):[M+H]+438.3。
TT-11(110)N-(3-(4-(4-甲氧基苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基) 乙酰胺
向109(0.933g，2.13mmol)于CH2Cl2(6mL)中的溶液中加入乙酸酐(242μL， 261mg，2.56mmol)并在室温下搅拌3小时。反应混合物用CH2Cl2(90mL)稀释并用 10％Na2CO3(2×25mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物，将其通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，200:1到50:1)纯化，得到0.895g(88％)110。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.24(s,1H),7.55(d,J＝7.8Hz,1H),7.16(t,J＝7.9Hz, 1H),7.11(d,J＝8.6Hz,2H),6.85-6.93(m,3H),6.78(d,J＝8.6Hz,2H),5.31(s,2H),3.88 (m,4H),3.78(s,3H),2.48(m,4H),2.35(s,3H),2.12(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+480.1。
(111)N-(3-(4-羟基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
经5分钟向110(0.872g，1.82mmol)于CH2Cl2(4mL)中的溶液中逐滴加入TFA (4mL)并在室温下搅拌4小时。减压浓缩反应混合物并在高真空下干燥过夜，得到111，不经进一步纯化即使用。MS(m/z):[M+H]+360.2。
(112)N-(3-(4-氯-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
在65℃下将111(约1.82mmol)和POCl3(5mL)加热2小时。冷却到室温后，将反应混合物加入含有碎冰的烧杯中。POCl3完全淬灭后，小心地加入固体Na2CO3直到约pH 9。将其转移到分液漏斗中并用CH2Cl2(4×60mL)萃取，用MgSO4干燥，过滤并浓缩成固体，将其通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，200:1到50:1纯化)，得到0.215g(31％)112。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.37(s,1H),7.40(d,J＝8.0Hz,1H), 7.16-7.25(m,2H),6.89(d,J＝7.7Hz,1H),3.88(m,4H),2.47(m,4H),2.34(s,3H),2.14(s, 3H)；MS(m/z):[M+H]+378.2。
(113A)N-(3-(4-(环戊基甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向溶解于DMF(250μL)中的环戊烷甲醇(21.3μL，19.9mg，0.198mmol)中加入NaH(4.3mg，0.179mmol)并在室温下搅拌所得悬浮液10分钟。随后加入112(15 mg，0.0397mmol)并在80℃下加热反应混合物1.5小时。加入MeOH(1mL)并搅拌 5分钟，随后减压浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3 (7N)，20:1)纯化，得到13.9mg(79％)113A。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.23(s,1H), 7.42(d,J＝8.0Hz,1H),7.10-7.22(m,3H),6.86(d,J＝7.7Hz,1H),4.16(d,J＝6.7Hz, 2H),3.86(m,4H),2.48(m,4H),2.35(s,3H),2.19(m,1H),2.09(s,3H),1.56-1.67(m,2H), 1.40-1.55(m,4H),1.10-1.20(m,2H)；MS(m/z):[M+H]+442.1。
(114A)3-(4-(环戊基甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯胺
向含113A(13.9mg，0.0315mmol)的甲醇(1mL)中加入BF3-MeOH(47μL， 53.6mg，0.378mmol)并回流5小时。加入Et3N，随后浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化，得到11mg(87％)114A。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.22(s,1H),6.98(t,J＝7.8Hz,1H),6.55(d,J＝7.7Hz, 1H),6.45(s,1H),6.43(d,J＝7.9Hz,1H),4.17(d,J＝6.7Hz,2H),3.86(m,4H),3.58(br s, 2H),2.48(m,4H),2.35(s,3H),2.23(m,1H),1.59-1.68(m,2H),1.43-1.58(m,4H), 1.13-1.23(m,2H)；MS(m/z):[M+H]+400.3。
TT-12(115)2-氨基-N-(3-(4-(环戊基甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向含114A(11mg，0.0275mmol)的THF(1mL)中加入Boc-甘氨酸(5.3mg，0.030mmol)、DCC(6.2mg，0.030mmol)并在室温下搅拌过夜。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1)纯化残余物，得到残余物，将其溶解于1.25mL CH2Cl2:TFA(4:1)中，且在室温下搅拌45分钟。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，10:1)纯化残余物，得到10.3mg(82％) 115。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ8.21(s,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),7.34(s, 1H),7.17(t,J＝8.0Hz,1H),6.86(d,J＝7.1Hz,1H),4.17(d,J＝6.8Hz,2H),3.84(m, 4H),3.41(s,2H),2.51(m,4H),2.36(s,3H),2.21(m,1H),1.57-1.67(m,2H),1.42-1.57(m, 4H),1.10-1.22(m,2H)；MS(m/z):[M+H]+457.4。
(113B)N-(3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-苯氧基嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向溶解于DMF(250μL)中的苯酚(19mg，0.198mmol)中加入NaH(4.3mg， 0.179mmol)并在室温下搅拌所得溶液10分钟。随后加入112(15mg，0.0397mmol) 并在80℃下加热反应混合物1.5小时。加入MeOH(1mL)并搅拌5分钟，随后减压浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，20:1) 纯化，得到16.2mg(94％)113B。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.35(s,1H),7.40(d,J＝ 7.7Hz,1H),7.30-7.36(m,3H),7.28(br s,1H),7.15-7.23(m,2H),7.02(d,J＝8.0Hz,2H), 6.96(d,J＝7.6Hz,1H),3.65(m,4H),2.36(m,4H),2.28(s,3H),2.13(s,3H)；MS(m/z): [M+H]+436.2。
(114B)3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-苯氧基嘧啶-5-基硫基)苯胺
向含113B(16.2mg，0.037mmol)的甲醇(1mL)中加入BF3-MeOH(55μL，63.3 mg，0.446mmol)并回流5小时。加入Et3N，随后浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(己烷:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3(7N)，2:2:1:0.5)纯化，得到6.5mg (45％)114B。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.34(s,1H),7.33(t,J＝7.7Hz,2H),7.18(t,J ＝7.4Hz,1H),7.01-7.07(m,3H),6.63(d,J＝7.8Hz,1H),6.56(t,J＝2.0Hz,1H),6.47(dd, J＝2.2,8.0Hz,1H),3.63(m,6H),2.37(m,4H),2.30(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+394.3。
TT-13(116)2-氨基-N-(3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-苯氧基嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向含114B(6.5mg，0.0165mmol)的THF(0.65mL)中加入Fmoc-甘氨酸(5.4mg，0.018mmol)、DCC(3.8mg，0.018mmol)并在室温下搅拌过夜。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(己烷:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3(7N)，2:2:1:0.5)纯化残余物，得到残余物，将其溶解于CH2Cl2(0.9mL)和哌啶(0.1mL)中，并在室温下搅拌5小时。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化残余物，得到3.5mg(47％)116。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.34(br s,1H),8.36(s,1H),7.50(d, J＝8.0Hz,1H),7.47(s,1H),7.33(t,J＝8.2Hz,2H),7.22(t,J＝8.0Hz,1H),7.18(t,J＝ 7.4Hz,1H),7.03(d,J＝7.7Hz,2H),6.96(d,J＝7.9Hz,1H),3.68(m,4H),3.46(s,2H), 2.40(m,4H),2.31(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+451.1。
(113C)N-(3-(4-(环戊基氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向溶解于DMF(200μL)中的环戊醇(11.8μL，11.2mg，0.13mmol)中加入NaH (2.8mg，0.117mmol)并在室温下搅拌所得悬浮液10分钟。随后加入112(10mg，0.026 mmol)并在80℃下加热反应混合物2小时。加入MeOH(1mL)并搅拌5分钟，随后减压浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)， 15:1)纯化，得到8.5mg(77％)113C。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ8.21(s,1H),7.41(d, J＝7.9Hz,1H),7.10-7.19(m,3H),6.86(d,J＝7.8Hz,1H),5.39(m,1H),3.86(m,4H), 2.48(m,4H),2.35(s,3H),2.14(s,3H),1.63-1.86(m,4H),1.45-1.56(m,4H)；MS(m/z): [M+H]+428.2。
(114C)3-(4-(环戊基氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯胺
向含113C(8.5mg，0.020mmol)的甲醇(0.75mL)中加入BF3-MeOH(30μL， 34.1mg，0.24mmol)并回流5小时。加入Et3N，随后浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化，得到7.2mg(94％)114C。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.20(s,1H),6.98(t,J＝7.8Hz,1H),6.55(d,J＝7.0Hz, 1H),6.46(t,J＝2.0Hz,1H),6.43(dd,J＝2.0,7.9Hz,1H),5.40(m,1H),3.86(m,4H), 3.58(br s,2H),2.48(m,4H),2.35(s,3H),1.67-1.87(m,4H),1.51-1.62(m,4H)；MS(m/z): [M+H]+386.2。
TT-14(117)2-氨基-N-(3-(4-(环戊基氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基) 乙酰胺
向114C(7.2mg，0.0187mmol)于THF(0.5mL)中的溶液中加入Boc-甘氨酸(3.6 mg，0.0206mmol)和DCC(4.3mg，0.0206mmol)。在室温下搅拌过夜后，蒸发THF 并加入0.5mLCH2Cl2:TFA(4:1)。搅拌溶液45分钟，随后减压浓缩至干，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化，得到7.4mg(89％)117。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.29(brs,1H),8.22(s,1H),7.52(d,J＝7.7Hz,1H),7.30(s, 1H),7.16(t,J＝8.0Hz,1H),6.86(d,J＝7.9Hz,1H),5.40(m,1H),3.86(m,4H),3.45(s, 2H),2.48(m,4H),2.35(s,3H),1.61-1.86(m,4H),1.44-1.57(m,4H)；MS(m/z):[M+H]+ 443.2。
(113D)N-(3-(4-(环己基氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向溶解于DMF(200μL)中的环己醇(14μL，13.0mg，0.13mmol)中加入NaH (2.8mg，0.117mmol)并在室温下搅拌所得悬浮液10分钟。随后加入112(10mg，0.026 mmol)并在80℃下加热反应混合物2小时。加入MeOH(1mL)并搅拌5分钟，随后减压浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(己烷:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3(7N)，2:2:1:0.5)纯化，得到2.9mg(25％)113D。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ8.23(s,1H),7.43(d,J＝7.9Hz,1H),7.12-7.19(m,2H),7.06(br s, 1H),6.88(d,J＝7.6Hz,1H),5.05(m,1H),3.85(m,4H),2.50(m,4H),2.36(m,3H),2.14 (s,3H),1.22-1.80(m,10H)；MS(m/z):[M+H]+442.2。
(114D)3-(4-(环己基氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯胺
向含113D(2.9mg，0.0066mmol)的甲醇(0.5mL)中加入BF3-MeOH(10μL， 11.2mg，0.079mmol)并回流5小时。加入Et3N，随后浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化，得到2.4mg(92％)114D。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.22(s,1H),6.98(t,J＝7.9Hz,1H),6.57(d,J＝7.8Hz, 1H),6.48(t,J＝2.0Hz,1H),6.43(dd,J＝2.0,8.0Hz,1H),5.05(m,1H),3.86(m,4H), 3.58(br s,2H),2.51(m,4H),2.37(s,3H),1.22-1.80(m,10H)；MS(m/z):[M+H]+400.2。
TT-15(118)2-氨基-N-(3-(4-(环己基氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)苯基) 乙酰胺
向114D(2.4mg，0.006mmol)于THF(0.25mL)中的溶液中加入Boc-甘氨酸(1.2 mg，0.0066mmol)和DCC(1.4mg，0.0066mmol)。在室温下搅拌过夜后，蒸发THF 并加入0.25mLCH2Cl2:TFA(4:1)。搅拌溶液45分钟，随后减压浓缩至干，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化，得到2.5mg(93％)118。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.28(brs,1H),8.24(s,1H),7.54(d,J＝7.9Hz,1H),7.30(s, 1H),7.17(t,J＝7.9Hz,1H),6.88(d,J＝7.8Hz,1H),5.06(m,1H),3.84(m,4H),3.45(s, 2H),2.48(m,4H),2.35(s,3H),1.22-1.80(m,10H)；MS(m/z):[M+H]+457.1。
(113E)N-(3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(吡啶-3-基甲氧基)嘧啶-5-基硫基)苯基)乙酰胺
向溶解于DMF(200μL)中的3-吡啶基甲醇(15.5μL，17.4mg，0.159mmol)中加入NaH(3.4mg，0.143mmol)并在室温下搅拌所得悬浮液10分钟。随后加入112(12 mg，0.0318mmol)并在80℃下加热反应混合物1.5小时。加入MeOH(1mL)并搅拌 5分钟，随后减压浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(己烷:CH2Cl2:EtOAc:MeOH-NH3(7N)，2:2:1:0.5)纯化，得到11.8mg(83％)113E。MS (m/z):[M+H]+451.3。
(114E)3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(吡啶-3-基甲氧基)嘧啶-5-基硫基)苯胺
向含113E(11.8mg，0.026mmol)的甲醇(1mL)中加入BF3-MeOH(39μL，44.3 mg，0.312mmol)并回流5小时。加入Et3N，随后浓缩反应混合物，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化，得到7mg(66％)114E。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ8.45(d,J＝4.9Hz,1H),8.43(s,1H),8.25(s,1H), 7.50(d,J＝7.9Hz,1H),7.27(dd,J＝5.0,7.8Hz,1H),7.01(t,J＝7.8Hz,1H),6.47-6.55 (m,3H),5.39(s,2H),3.88(m,4H),2.52(m,4H),2.37(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+409.3。
TT-16(119)2-氨基-N-(3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(吡啶-3-基甲氧基)嘧啶-5-基硫基) 苯基)乙酰胺
向114E(6mg，0.015mmol)于THF(0.5mL)中的溶液中加入Boc-甘氨酸(3mg，0.016mmol)和DCC(3.3mg，0.016mmol)。在室温下搅拌过夜后，蒸发THF并加入 0.35mLCH2Cl2:TFA(4:1)。搅拌溶液45分钟，随后减压浓缩至干，得到残余物，将其通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化，得到6.1mg(88％)119。1H NMR(500MHz,CDCl3/MeOH-d4):δ9.31(br s,1H),8.50(m,2H),8.28(s,1H),7.50(d,J ＝7.8Hz,1H),7.42(m,1H),7.33(s,1H),7.11-7.25(m,2H),6.86(d,J＝7.9Hz,1H),5.40 (s,2H),3.87(m,4H),3.46(s,2H),2.48(m,4H),2.36(s,3H)；MS(m/z):[M+H]+466.2。
方案14.合成TT-10(121)。
试剂和条件：a.Fmoc-甘氨酸，DCC，THF，室温，12小时；b.CH2CI2:哌啶(9:1)，室温，2小时。
TT-10(121)2-氨基-N-(3-(4-(4-甲氧基苯甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基) 苯基)乙酰胺
向含109(10mg，0.0228mmol)的THF(1mL)中加入Fmoc-甘氨酸(7.5mg，0.0251mmol)、DCC(5.2mg，0.0251mmol)并在室温下搅拌过夜。减压浓缩反应混合物并将残余物溶解于CH2Cl2(0.9mL)和哌啶(0.1mL)中并在室温下搅拌2小时。减压浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，15:1)纯化残余物，得到8.2mg(73％)121。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.20(br s,1H),8.25(s,1H),7.60(d, J＝7.8Hz,1H),7.17-7.20(m,2H),7.09(d,J＝8.5Hz,2H),6.85(d,J＝7.1Hz,1H),6.77 (d,J＝8.6Hz,2H),5.30(s,2H),3.88(m,4H),3.78(s,3H),3.44(s,2H),2.48(m,4H),2.35 (s,3H)；MS(m/z):[M+H]+495.2。
方案15.合成YK171(126)、YK172(127)、YK173(129)、YK174(130)、YK175 (131)。
试剂和条件：a.N-甲基哌嗪，K2CO3，DMF，130℃，16小时；b.NIS，CH3CN，室温，2小时；c.3-氨基苯硫醇，新亚铜试剂，CuI，K2CO3，DMF，130℃，16小时；d.RCOCl， Et3N；e.RCOOH，EDCl，THF，室温；f.CH2CI2:TFA(4:1)，室温。
(123)1-(6-甲氧基吡啶-2-基)-4-甲基哌嗪
向2-溴-6-甲氧基吡啶(122)(150mg，0.8mmol)和1-甲基哌嗪(240mg，2.4mmol) 于2ml DMF中的溶液中加入K2CO3(220mg，1.6mmol)并将所得混合物加热到130 ℃，保持16小时。减压蒸发溶剂并通过用(含5-10％MeOH的CH2Cl2)进行的柱色谱法纯化残余物，得到145mg(88％)123。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.41(t,J＝8.0Hz, 1H),6.16(d,J＝8.0Hz,1H),6.08(d,J＝8.0Hz,1H),3,87(s,3H),3.54(m,4H),2.51(m, 4H),2.54(s,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ163.1,158.3,140.1,98.2,98.1,54.8,52.9, 46.2,45.1；MS(m/z):[M+H]+208.4。
(124)1-(5-碘-6-甲氧基吡啶-2-基)-4-甲基哌嗪
向123(124mg，0.6mmol)于5mL乙腈中的溶液中加入N-碘代琥珀酰亚胺(203 mg，0.9mmol)并在室温下搅拌所得混合物2小时。减压蒸发溶剂并通过用 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，1:0到85:15)进行的柱色谱法纯化残余物，得到190mg(95％) 124。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.70(d,J＝8.0Hz,1H),6.02(d,J＝8.0Hz,1H),3.90 (s,3H),3.60(m,4H),2.62(m,4H),2.39(s,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ177.7, 160.5,157.8,148.6,100.7,61.7,54.2,45.5,44.5；MS(m/z):[M+H]+334.1。
(125)2-((2-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)硫基)嘧啶-4-胺
将124(100mg，0.3mmol)、4-氨基嘧啶-2-硫醇(39mg，0.3mmol)、K2CO3(83mg，0.6mmol)、新亚铜试剂(11mg，0.05mmol)和CuI(10mg，0.05mmol)于DMF(3ml) 中的混合物加热到130℃，保持16小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，1:0到85:15)纯化残余物，得到60mg(60％)125。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ7.95(d,J＝8.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.5Hz,1H),6.20(d,J＝8.5Hz, 1H),6.05(d,J＝8.0Hz,1H),5.01(s,2H),3.87(s,3H),3.62(m,4H),2.54(m,4H),2.36(s, 3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ171.9,162.9,162.5,158.6,156.2,147.8,101.1,98.6, 97.6,54.6,53.6,46.0,44.6；MS(m/z):[M+H]+333.5。
YK171(126)N-(2-((2-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)硫基)嘧啶-4-基)丙酰胺
向125(20mg，0.06mmol)于1.5mL CH2C12和Et3N(100μL)中的溶液中逐滴加入含丙酰氯的CH2Cl2。完成(借助TLC确定)后，通过加入冷MeOH淬灭反应。减压去除溶剂并通过用(含MeOH-NH3(7N)2-10％的CH2Cl2进行的柱色谱法纯化残余物，得到18mg(80％)126。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.53(bs,1H),8.34(d,J＝8.0Hz,1H), 7.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(d,J＝8.0Hz,1H),6.21(d,J＝8.0Hz,1H),3.86(s,3H), 3.63(m,4H),2.52(m,4H),2.41(q,J＝7.2Hz,2H),2.36(s,3H),1.08(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ173.4,172.2,171.7,162.9,158.8,157.3,147.6,105.6,98.7, 96.7,54.6,53.7,46.0,44.6,30.6,8.96；MS(m/z):[M+H]+389.3。
YK172(127)N-(2-((2-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)硫基)嘧啶-4-基)环丙烷甲酰胺
向125(20mg，0.06mmol)于1.5mL CH2Cl2和Et3N(100μL)中的溶液中逐滴加入含环丙烷羰基氯的CH2Cl2。完成(借助TLC确定)后，通过加入冷MeOH淬灭反应。减压去除溶剂并通过用(含MeOH-NH3(7N)2-10％的CH2Cl2)进行的柱色谱法纯化残余物，得到21mg(90％)127。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.87(br s,1H),8.31(d,J＝ 8.0Hz,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.0Hz,1H),6.20(d,J＝8.0Hz,1H), 3.87(s,3H),3.62(m,4H),2.52(m,4H),2.36(s,3H),1.61(m,1H),1.08(m,2H),0.88(m, 2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ176.4,173.5,171.7,162.9,158.8,157.2,147.6,105.7, 98.6,96.7,54.7,53.6,46.1,44.6,14.0,7.7；MS(m/z):[M+H]+401.3。
(128)3-((2-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)硫基)苯胺
将124(100mg，0.3mmol)、3-氨基苯硫醇(37mg，0.3mmol)、K2CO3(83mg， 0.6mmol)、新亚铜试剂(11mg，0.05mmol)和CuI(10mg，0.05mmol)于DMF(3ml) 中的混合物加热到130℃，保持16小时。减压去除溶剂并通过柱色谱法 (CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，1:0到85:15)纯化残余物，得到60mg(60％)128。1H NMR (500MHz,CDCl3):δ7.54(d,J＝8.0Hz,1H),6.96(m,1H),6.51(d,J＝8.0Hz,1H),6.41 (m,2H),6.19(d,J＝8.0Hz,1H),3.88(s,3H),3.62(m,4H),2.54(m,4H),2.36(s,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ162.7,158.4,147.5,146.8,139.5,129.5,117.1,113.0,112.2, 99.8,98.9,54.6,53.7,46.1,44.8；MS(m/z):[M+H]+331.2。
YK173(129)N-(3-((2-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)硫基)苯基)丙酰胺
向128(20mg，0.06mmol)和Et3N(100μL)于1.5mL CH2Cl2中的溶液中逐滴加入含丙酰氯的CH2Cl2。完成(借助TLC确定)后，通过加入冷MeOH淬灭反应。减压去除溶剂并通过用(含MeOH-NH3(7N)2-10％的CH2Cl2)进行的柱色谱法纯化残余物，得到15mg(70％)129。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ7.55(d,J＝8.0Hz,1H),7.45(d,J ＝8.0Hz,1H),7.22(br s,1H),7.14(t,J＝8.0Hz,1H),7.08(s,1H),6.81(d,J＝8.0Hz, 1H),6.20(d,J＝8.0Hz,1H),3.88(s,3H),3.47(m,4H),2.57(m,4H),2.36(s,3H),2.33(q, J＝7.2Hz,2H),1.19(t,J＝7.2Hz,3H)；MS(m/z):[M+H]+387.2。
YK174N-(3-((2-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)硫基)苯基)环丙烷甲酰胺
向128(20mg，0.06mmol)和Et3N(100μL)于1.5mL CH2Cl2中的溶液中逐滴加入含环丙烷羰基氯的CH2Cl2。完成(借助TLC确定)后，通过加入冷MeOH淬灭反应。减压去除溶剂并通过用(含MeOH-NH3(7N)2-10％的CH2Cl2)进行的柱色谱法纯化残余物，得到16mg(70％)130。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.61(s,1H),7.31(d,J＝8.0 Hz,1H),7.20(br s,1H),6.88(m,2H),6.55(m,1H),5.95(d,J＝8.0Hz,1H),3.63(s,3H), 3.37(m,4H),2.29(m,4H),2.09(s,3H),1.25(m,1H),0.78(m,2H),0.57(m,2H)；13C NMR (125MHz,CDCl3)δ176.4,172.1,162.7,158.4,147.5,139.3,138.7,129.2,122.2,117.5, 116.8,99.0,54.6,53.6,46.1,44.7,13.9,7.9；MS(m/z):[M+H]+398.3。
YK175(131)2-氨基-N-(3-((2-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)硫基)苯基)乙酰胺
向128(20mg，0.06mmol)于CH2Cl2(1ml)中的溶液中加入Boc-甘氨酸(10.6mg，0.06mmol)、DMAP(1.0mg)、Et3N(10μL)和EDCl(11mg，0.06mmol)。在室温下搅拌所得溶液2小时。减压蒸发溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，1:0 到85:15)纯化残余物，得到26mg(90％)残余物。向其中加入5ml 10％TFA-CH2Cl2并在室温下搅拌1小时。减压蒸发溶剂并通过柱色谱法(CH2Cl2:MeOH-NH3(7N)，1:0 到85:15)纯化残余物，得到16mg(85％)131。1HNMR(500MHz,CDCl3):δ9.26(br s, 1H),7.55(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(d,J＝8.0Hz,1H),7.28(s,1H),7.15(t,J＝8.0Hz,1H), 6.82(d,J＝8.0,1H),6.21(d,J＝8.0Hz,1H),3.89(s,3H),3.62(m,4H),3.42(s,2H),2.54 (m,4H),2.36(s,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ170.6,162.7,158.4,147.5,139.4, 138.0,129.3,122.5,117.5,116.5,99.4,98.9,54.6,53.6,46.0,45.1,44.7；MS(m/z):[M+H]+ 388.3。
实例2：人类Hsp70(hHsp70)同源模型的构筑和YK5的设计
为设计Hsp70的抑制剂/调节剂，采用例如同源模型建立、部位地图和对接(docking) 等不同的计算机方法分别确定人类Hsp70(hHsp70)的3D模型，鉴别可能的结合部位并评估蛋白质/配体相互作用。未获得关于hHsp70蛋白全长晶体结构的信息，并且计划构筑hHsp70的理论3D结构(同源模型)。如华尔纳(Wallner)等人所述，同源模型构筑中最重要的因素是比对的正确性和最佳模板结构的选择。选择三个与相关受体共有高度序列一致性(超过50％)的模板晶体结构用于构建hHsp70蛋白的同源模型。hHsp70 蛋白的N端晶体结构(PDB ID：1S3X)是最佳的可用于N端氨基酸的模板(Met1-Gly382， hHsp70)。没有hHsp70的SBD的晶体结构，因此选择与hHsp70共有62％相似性的大肠杆菌Hsp70(DNAK)结构(PDBID：2KHO)作为建立SBD区段模型的模板 (Asp385-Gln538，大肠杆菌；Asp383-Ala541，hHsp70)。最后，秀丽隐杆线虫Hsp70的晶体结构(PDB ID：2P32)用作C端氨基酸的模板(Leu543-Ser614，秀丽隐杆线虫； Leu542-Gly613，hHsp70)。hHsp70的C端氨基酸(614-641)没有模板结构，因此不建立模型。如乔西亚(Chothia)和雷斯克(Lesk)所建议，选择模板后，模板比对和基于氨基酸序列检测结构相似性的能力决定模型的整体质量。比对hHsp70残基。据华尔纳等人报导，对于具有高度相似性的紧密相关的蛋白质序列，比对在大多数情况下通常最佳。在本研究中，613个残基中有606个与三个执行的模板(PDB ID：1S3X，PDB ID：2KHO，PDB ID：2P32)一致，表明最佳比对。在比对残基侧链后，使用普瑞姆(Prime) 中的自动或半自动程序成功插入模板结构(PDB ID：2KHO)中缺乏的氨基酸，例如 Lys384、Ser385、Glu386、Asn387和Arg509(hHsp70)。由此获得的同源模型含有基于模板结构的细胞内和细胞外环(不包括末端)。所有环区域(33个环)都使用普瑞姆中的环精修工具最佳化，以产生稳固的环构型。最后，所得蛋白质模型经受蛋白质制备向导(wizard)应用，接着进行严格的能量最小化，以放松不适宜的接触。
先前华尔纳等人已显示，模板与建立模型的蛋白质之间的均方根差(rmsdeviation) 是一种优良的验证方法。同源模型和模板结构(PDB ED：1S3X)的NBD中主链原子的叠加得出的均方根差和0.05的优良比对评分，验证了所述模型。
由此建立的同源模型含有613个氨基酸残基并具有两个主要结构域NBD和SBD，两者通过柔性连接子接合在一起(图2a)。N端腺苷三磷酸酶结构域展现肌动蛋白样己糖激酶折叠并具有两个球形突出物I(子结构域IA和IB)和II(子结构域IIA和IIB)。十二个α螺旋和十六个β折叠汇编成NBD，其经NBD的晶体结构证实。C端SBD可进一步分成两个功能相关的子结构域；含有两个四股β折叠的肽结合子结构域(SBD-β) 和一个四α-螺旋子结构域(SBD-α)(又称顶盖结构域(lid domain))的夹层结构。在缺乏此治疗上重要的伴侣蛋白的全长晶体结构下，此同源模型适用于确定部位以通过例如 (但不限于)基于结构的设计和虚拟筛选等方法设计Hsp70抑制剂。
部位预测：对于基于结构的设计策略，通过部位地图鉴别hHsp70上小分子抑制剂可靶向的可能结合部位。部位地图考虑若干物理变量，例如尺寸、封闭/暴露程度、紧密性、范德华力(van der Waals force)、疏水性/亲水性特征和氢键接可能性，以确定可能的部位。此通过将最可能促成蛋白质/配体或蛋白质/蛋白质相互作用的位点连在一起来进行。
部位地图检查整个结构并排列这些部位。排列主要由部位尺寸(通过所发现位点的数目测量)、部位的相对开放度(通过暴露和封闭特性测量)和部位紧密性(通过部位的接触项和疏水性与亲水性特征测量)决定。为广泛地探测Hsp70上可用的结合部位，部位地图经配置以达到十个部位。注意到例如部位6-10等评分低的部位在表面上(图2 中未显示)。这些是找到对应于外表面的部位的计算机模型的人为结果并具有较低S评分。因此，部位地图经配置以达到同源模型建立的hHsp70蛋白中排列在前五个的可能结合部位。这五个部位的S评分为0.80或更高，此评分由哈尔格林(T.A Halgreen)推荐来确定貌似合理的结合部位。
确定结合部位的另一个重要准则是部位的成药性，如部位地图中D评分所述。此包括促进配体结合的项，例如足够的尺寸和与溶剂的分离，但使亲水性增加不利的项会抵消前述项。根据哈尔格林，部位分为不可成药、难以成药和可成药的。不可成药部位亲水性强，尺寸相对较小，几乎没有疏水性特征，并且特征为D评分值低于0.83。难以成药部位的亲水性足够高以致需要以前药形式投予，但其疏水性低于典型结合部位，并以 D评分值在0.83与0.98之间来确定。可成药部位的尺寸、封闭性和疏水性合理，亲水性一般并且D评分值高于0.98。
在通过部位地图预测的五个部位(部位1-5)(图2)中，部位3、4和5具有极少位点，空腔小并且部位浅。因此，这些部位难以产生足够的结合亲和力。包括被内源性配体ATP和ADP占据的凹槽的部位2具有合理的尺寸(位点：178)和合理的高S评分。根据目视检查，部位2具有相对较小的凹槽，并且其主要由亲水性氨基酸组成。在缺乏适于疏水性相互作用的区域下，如相对较低的D评分(0.91)所描绘，可能比较难以靶向。位于在ATP/ADP结合结构域外部的裂缝区中并且侧接亚区Ib和IIb的部位1的尺寸较大(位点：385)，凹槽较大并由亲水性和疏水性氨基酸组成，这使其成为较可成药的部位(D评分：1.00)。将S评分和D评分、其尺寸、其平衡的疏水性和亲水性特征、暴露和封闭特性结合在一起，预测部位1是最可成药的空腔，因此焦点放在此新颖的变构部位1上以进一步设计Hsp70抑制剂。
为认识整个部位的性质，产生部位1和2上的疏水性/亲水性地图。这些地图将所述部位视为一个整体，与仅仅考虑最靠近的受体原子的表面模型相对。这些地图明确显示出部位的形状，并表明疏水性和亲水性区域的范围。部位2主要具有亲水性特征，具有极少疏水性特征。相比之下，部位1具有均衡的特征，其中疏水性与亲水性区域都存在。这些结果进一步支持部位1具有较高的可成药性。
蛋白质/配体相互作用和抑制剂的设计：
迄今，已知很少分子调节Hsp70的活性。已经鉴别大量靶向SBD的分子，包括15- 去氧精胍啉和脂肪酸酰基苯甲酰胺。设计结合于细菌Hsp70的SBD的小分子量肽，刺激其腺苷三磷酸酶活性。靶向NBD的药剂包括二氢嘧啶和核苷酸模拟物。二氢嘧啶是在测量酵母Hsp70的腺苷三磷酸酶活性的筛选中发现的。已经证明难以鉴别ATP竞争性抑制剂。威廉姆逊(Williamson)等人描述设计成结合于腺苷三磷酸酶袋内的基于腺苷的类似物。Hsp70属于腺苷三磷酸酶的肌动蛋白样家族，并且这些蛋白质之间存在高结构同源性，尤其在其腺苷三磷酸酶结构域内。因此，结合如上所确定的此部位的较差类药特征，不清楚研发直接ATP竞争剂对Hsp70来说是否是最适宜的方法。因此选择部位 1来靶向。
图21：全长hHsp70(寄存编号：P08107)、N端hHsp70蛋白(PDB ID：1S3X)、大肠杆菌Hsp70(DNAK)结构(PDB ID：2KHO)和秀丽隐杆线虫(PDB ID：2P32) 的蛋白质序列的比对。残基批注加有下划线并且保守残基以类似颜色展现。界定变构袋部位1的序列以盒显示。这些序列中的重要氨基酸与本文设计的配体相互作用。
为鉴别特异性靶向部位1的Hsp70抑制剂，设计和合成适于与其结构凹槽相互作用的未探测化学空间的若干化学库。部位1也含有潜在反应性半胱氨酸Cys267，并且为利用可能的共价相互作用，将丙烯酰胺官能团(NH-C(＝O)-CH＝CH2)并入设计的化学库内。如图3中所例示，成功的反馈设计和测试鉴别出YK5(图2)。为证实YK5与部位1的结合并研究可能的配体/蛋白质相互作用，将化合物YK5对接到通过部位地图预测的五个部位中每一者上。由结合相互作用、化合物定向和格莱德评分(Glidescore)值的研究得出结论，YK5最适宜结合于部位1。通过YK5对接到部位1上所获得的最佳结合模式显示于图2c中。
表13：部位地图预测hHsp70蛋白上抑制剂/调节剂的结合部位
为进一步验证所提出的结合相互作用，将经预测对Hsp70亲和力较低的YK20对接到变构结合部位1上。不像YK5，YK20的所有对接姿势都定向在结合袋外并具有较差 G评分。为确定引起此定向的可能原因，将YK20用结合于同源模型建立的hHsp70的 YK5覆盖，由此显示YK20具有造成其不良抑制活性的可能空间碰撞。
实例3：新颖调节剂的表征
为鉴别Hsp70抑制剂，合成经设计以与N端区域的结构凹槽相互作用的未探测化学空间的若干化学库(图2，图a)。此结构域容纳两个潜在的可成药区域。一个是核苷酸结合部位(图2的图a中描述为部位2)，其具有主要亲水性特征，因此，可能较难以靶向。第二个是较大并可能更类药的结合凹槽，其位于在核苷酸结合结构域外部的裂缝区中并侧接亚区Ib和IIb(图2的图a中描述为部位1)。Hsp70也含有若干潜在反应性半胱氨酸，其中两个位于两个潜在可成药部位附近(图2，图a)。为利用这些残基，将丙烯酰胺官能团并入一些设计的衍生物中，探查在蛋白质结合时抑制剂与半胱氨酸残基之间可能的共价键形成(图2，图a)。在研发例如CI-1033(卡奈替尼(Canertinib))(图 2，图b)和EKB-569(培利替尼(Pelitinib))(处于癌症临床试验中的化合物)等不可逆EGFR和HER2抑制剂的过程中惯常使用丙烯酰胺“弹头(warhead)”。EGFR和HER2 如Hsp70一般在其调控部位中含有反应性半胱氨酸。
根据一种可行假设：在癌细胞中，Hsp70抑制剂将具有Hsp90抑制剂的表型结果，同时缺乏反馈Hsp70诱导，在先前由乔欧斯实验室(Chiosis lab)针对肿瘤Hsp90研发的表型检验中筛选这些药剂。这些检验经设计以读取Hsp90抑制的细胞特征，例如在相关遗传背景下Hsp90致癌客户的降解以及肿瘤细胞生长的相关抑制。分析Hsp70的诱导以排除那些活化HSF-1的药剂。为确保药理学相关浓度化合物可能通过Hsp70介导的机制选择性地起作用，仅选择那些在所有检验中在相似浓度下具有活性的药剂。进一步探查与Hsp90的结合以排除直接Hsp90抑制剂。
通过这些准则，具有新颖骨架2,5'-硫代二嘧啶(作为本文中称为YK的较大类别的一部分)的若干实体具有活性(图2，图a)。组装YK-骨架的合成方法提供于实例1方案中。
由设计和筛选策略鉴别出的一种衍生物为YK5(图2，图b)，其合成描述于本文中。
如在SKBr3乳癌细胞中所证明，YK5，而非以较低亲和力结合于标靶的对照衍生物YK20(20μM)，诱导HER2、Raf-1和Akt激酶降解，已知在此细胞背景下这三者全部都为Hsp90致癌客户蛋白(图3，图a)。此外，非致癌酪氨酸蛋白激酶CSK(一种c-Src 相关性酪氨酸激酶)保持不受YK药剂和直接Hsp90抑制剂PU-H71影响(图3，图a)。如PARP裂解所证明，YK5也诱导这些细胞凋亡(图3，图a)。与先前关于直接Hsp90 抑制剂的报导一致且如此处利用PU-H71所观测(图3，图a)，β-肌动蛋白和Hsp90辅助伴侣蛋白p23(含量对Hsp90抑制不敏感的蛋白质)在细胞加入YK后保持不变(图 3，图a)。
在YK5处于使Hsp90机构致癌客户降解的浓度下未检测到Hsp70的反馈诱导(图3，图a和b)。同时，在这些细胞中，如Hsp70诱导所证明，直接Hsp90抑制剂有效活化热休克反应(图3，图a中的PU-H71和图b中的PU24FC1)。不像直接Hsp90抑制剂 PU-H71和PU24FC1，YK衍生物无法与荧光标记的格尔德霉素衍生物GM-Cy3B竞争结合Hsp90(图3，图c)。
在SKBr3乳癌细胞中，在递增的低微摩尔浓度下YK5使Hsp90-致癌客户蛋白降解(图3，图a)，也导致抑制细胞增殖(图3，图d)，表明在此浓度范围内，YK5的生物活性可能通过可能以Hsp70结合机制抑制功能Hsp90机构来引导。
YK5是癌细胞中的选择性Hsp70结合剂。为证实Hsp70负责YK5的活性，设计生物素标记的YK5衍生物YK55(图4，图a)。YK55的合成描述于本文中。在另一实施例中，本发明的其它化合物可经生物素标记并根据本文描述的方法使用。
YK55而非D-生物素加入细胞中，接着在抗生蛋白链菌素珠粒上分离，鉴别出约70kDa的主要谱带(图4，图b)，其被可溶性YK5以剂量依赖性方式竞争去除(图4，图 c)。从此谱带获得的肽消化物的串联液相色谱-质谱(LC/MS/MS)分析证实存在两种诱导性Hsp70同功异型物(Hsp70-1和Hsp70-6)以及Hsc70(组成性Hsp70成员)。其身份通过蛋白质印迹法进一步研究，以证明在YK55-下拉物中为Hsp70而非Hsp90(图4，图d)。
为研究对YK5最敏感的Hsp70循环阶段，分析通过YK55-珠粒分离的辅助伴侣蛋白复合物并与通过抗Hsp70抗体鉴别的复合物相比较(图4，图e，左)。YK55-珠粒优先捕获与活化辅助伴侣蛋白Hsp40和Hsp110形成复合物的Hsp70，而Ab分离物缺乏核苷酸交换因子Hsp110。因为抗Hsp70Ab BB70可降低Hsp70和Hsc70的细胞含量，但在捕获呈辅助伴侣蛋白(即Hsp110)结合的构型的Hsp70方面较弱，所以有可能进一步探查YK55-珠粒对Hsp70的特异性(图4，图e，右)。也就是说，当与BB70而非不相关的IgG Hsp70耗尽的提取物一起培育时，YK55-珠粒无法与Hsp110显著相互作用，证实YK55与Hsp110的相互作用通过Hsp70介导的复合物发生。可溶性YK5以剂量依赖性方式与YK55-珠粒竞争与Hsp70复合物结合(图4，图f)。
细胞与YK55一起培育时，在药剂与Hsp70之间形成强烈而有选择性的相互作用，不会被高盐洗涤液(1M NaCl)破坏(图4，图b)。YK5含有丙烯酰胺官能团，其在蛋白质结合时可建立共价键。对于不可逆结合起作用的化合物，针对结合的半数结合抑制 (IC50)值由两个分量组成，一个反映可逆结合，而另一个反映随后共价结合，并取决于共价相互作用进行的程度。实际上，细胞与YK55一起培育1到4小时使固定的70kDa 谱带的量逐渐增加(图5，图a)，通过抗生物素和Hsp70免疫印迹，表明其为含有 YK55-Hsp70的物质(图5，图b)。在这些条件下检测到YK55与Grp75和Grp78(分别是线粒体和内质网Hsp70家族成员)的相互作用较弱或者没有相互作用(图5，图b)。
在苛刻到足以破坏已知最紧密的非共价结合抗生蛋白链菌素-生物素复合物的条件下从YK55-抗生蛋白链菌素珠粒洗脱蛋白质复合物证实，当细胞与YK55一起培育时实际上形成共价结合的YK55-Hsp70物质(图5，图c)。YK55结合的Hsp70物质而非BB70 下拉物(抗Hsp70抗体)的胰蛋白酶消化鉴别出在1867.915和1372.649原子质量单位处的两个m/z峰(图5，图d)。这些峰分别对应于附接到LRTAC267ERAK的YK55(820.34 Da)和附接到TAC267ERAK的缺乏生物素的YK55(YK55-生物素)(594.26Da)。当YK55Hsp70分离物分别使用β-巯基乙醇和丙烯酰胺还原和烷基化时，未观测到这些肽标记。进行LRTAC267(YK55)ERAK的质谱测序以进一步证实序列一致性(未图示)。
TACERAK序列在人类胞质Hsp70中保持不变，但在Grp75和Grp78中有分歧，此与其在类似条件下缺乏与YK55的相互作用一致(图5，图b)。总之，这些数据表明YK55 特异性地衍生化胞质Hsp70。
YK5抑制主要生物化学Hsp70功能。接着，研究YK5与Hsp70的结合以了解此结合是否干扰其主要生物化学活性、变性客户蛋白的特定再折叠和其腺苷三磷酸酶活性。 Hsp70活性受Hsp40蛋白和核苷酸交换因子(例如Hsp110)刺激。人类具有若干胞质 Hsp40，包括Hdj1、DJA1、DJA2和DJA4，并且近来报导DJA1提供对Hsc70腺苷三磷酸酶活性的最强刺激，而DJA2最有效地促进Hsc70多肽底物萤火虫荧光素酶的再折叠。 YK5通过纯化的Hsc70和DJA2以剂量依赖性方式抑制荧光素酶的再折叠(图6，图a) 并部分抑制所刺激的Hsc70腺苷三磷酸酶速率(图6，图b)。因为YK5与Hsp70N端结构域的结合未堵塞腺苷三磷酸酶部位，所以其作用最可能由N端和C端结构域的基本配合的破坏引起。在不利于共价键形成的检验条件下Hsp70的核心生物化学功能受到 YK5抑制，表明除了共价反应性以外，YK5还适当地配合标靶的活性部位。
YK5抑制活性Hsp70/Hsp90/致癌蛋白复合物的形成。提出Hsp70促进Hsp90多伴侣蛋白复合物的功能并在复合物形成的初始步骤通过利用中间蛋白HOP将客户蛋白装载到Hsp90复合物上来起作用。Hsp90的客户是在致病细胞转化的发生和进展中具有重要作用的驱动和支持若干恶性肿瘤的客户蛋白。除了致癌蛋白以外，Hsp90还调控转录因子热休克因子-1(HSF-1)，其为对细胞损害起反应的热休克反应的主调控子。Hsp90 结合于HSF-1并维持转录因子处于单体状态。在细胞暴露于Hsp90抑制剂或诱导细胞应激的元件时，伴侣蛋白自HSF-1分离，允许其三聚化，进入核，并结合于在热休克蛋白的启动子中发现的热休克反应元件，包括Hsp70和其活化子Hsp40。
YK5以剂量依赖性方式干扰Hsp90-复合物的形成(图6，图c，左和中间)，同时不影响复合物-组分伴侣蛋白的细胞表达(图6，图c，右)。YK5抑制Hsp90复合物的形成导致致癌蛋白释放和不稳定(图6，图d)，但对HSF-1活化没有影响(图6，图e)。与缺乏YK5引起的Hsp90/HSF-1复合物不稳定一致，仅热休克和直接Hsp90抑制剂而非YK5导致HSF-1三聚体的形成(图6，图e)。这些结果支持如下假设：HSF-1的转录能力通过与含有Hsp90而非Hsp70的复合物的缔合而受到抑制。其也显示通过上游 Hsp70抑制，Hsp90机构的致癌蛋白调控作用可不同于其对HSF-1的作用。在此方面， YK5成为研究Hsp90机构抑制在化学-HSF-1阻断(knock-down)环境下的生物作用的化学工具。此干预明显优于HSF-1的基因操作，允许在时间和空间上分析细胞环境。YK5 改变Hsp90复合物发生在递增的低微摩尔浓度下(图6c，中间)，在这些浓度下也发生Hsp90-致癌客户蛋白质的降解(图3a)。总之，YK5抑制SKBr3细胞的生长并在其破坏 Hsp70/Hsp90复合物形成的浓度下降解Hsp70/Hsp90致癌蛋白客户HER2，表明在此浓度范围内，YK5的生物活性部分通过破坏功能性Hsp90机构引导。如蛋白质半衰期降低 (图7b)和随之引起的致癌蛋白的细胞稳态水平降低(图7a)所证明，YK5破坏Hsp90 机构/致癌蛋白复合物与致癌蛋白不稳定和其细胞清除加速相关。进一步证实的Hsp90 机构介导的作用，并与Hsp90机构客户蛋白在抑制伴侣蛋白时通过蛋白酶体通路降解一致，蛋白酶体抑制剂而非其它蛋白水解酶的抑制剂有效拯救致癌蛋白免于被YK5降解(图7c)。
总之，这些实施例证明YK5和本发明的其它相关化合物在调控致癌客户蛋白方面的生物活性至少部分是其能够干扰活性中间Hsp90机构复合物的形成，引起Hsp90致癌客户蛋白不适当的细胞加工并导致其随后主要通过蛋白酶体降解的结果。
实例4：YK系列的结构-活性关系
为进一步证实IC50值与YK5-抑制剂反应性的绝对相关性无法由反映可逆(非共价) 结合的IC50分量解释，进行相关的结构-活性关系研究。实际上，丙烯酰胺(如YK30 中)还原成乙酰胺(如YK31中)(图8a)保留了Hsp70驱动的作用机制，并降低生物活性仅30倍(图8a且未图示)。此外，保持丙烯酰胺但乙二醇链从位置R1(如在YK54 和其生物素标记的型式YK55中)转移到R2(如在YK57和其生物素标记的型式YK56 中)降低生物活性约20-25倍(图8b和c)。在一些实施例中，与本发明的其它化合物相比生物活性降低的本发明化合物仍可具有足够的活性以在适用的IC50浓度或结合常数下抑制或结合所选酶或蛋白质。
总之，这些数据指示YK5和本发明的其它相关化合物与Hsp70的相互作用由两个要素组成，一个反映可逆结合，而另一个反映随后的共价半胱氨酸修饰。
虽然关注到丙烯酰胺实体可无差别地与非标靶相关蛋白质反应，产生多效作用，但细胞与YK55一起培育选择性地形成YK55-Hsp70加合物(图4和5)。此外，已知引起半胱氨酸非特异性氧化的药剂会增加细胞蛋白质错误折叠并引起后续热休克反应的保护性活化，此为用YK5所未观测到的现象。当针对359种激酶进行测试时，YK5在10μM 的生理学相关浓度下也为惰性(图6f)。这些发现证实在所测试浓度下，YK5是特异性 Hsp70调节剂，因此是适于在体外生物系统中仔细研究药理学Hsp70抑制的重要性的工具。
药物发现尝试往往会避免显示非竞争性动力学的分子，考虑到与不可逆抑制相关的潜在毒物学事件，可以理解这种谨慎。然而，在临床使用中作为抗癌剂和抗微生物剂的至少25种药剂是共价蛋白质修饰剂。可推断，对于不可逆的结合剂，在体循环中保持高药物浓度的需求较低，因此一旦实现标靶抑制，此作用就将保持，直到合成新的标靶蛋白。此外，对于对ATP具有相对高亲和力的蛋白质(例如Hsp70)，可认为在存在高细胞ATP含量下，不可逆的标靶抑制提供治疗优势。总之，这些观测结果表明，如果以有限的毒性为代价，在首过代谢与足够标靶递送和抑制之间达成平衡，那么不可逆抑制剂可在抗癌疗法中具有重要作用。
对于YK5，数据证明可逆抑制剂保持Hsp70介导的机制，表明丙烯酰胺基可完全消除，并且有效的可逆抑制剂可通过改良结合焓来鉴别。实际上，本文中的其它实施例显示具有可逆Hsp70相互作用模式的本发明化合物(图9、图10和图11)。本发明的这些化合物加入若干癌细胞中以类似于YK5的方式使相关致癌客户蛋白降解并诱导细胞凋亡。因此这些实施例证明如本文所述的重要活性可通过以不可逆或可逆结合模式与 Hsp70相互作用的本发明化合物实现。在一个具体实施例中，这些化合物与上述部位1 相互作用。
也已经报导研究小分子抑制Hsp70的生物关联性的尝试。这些尝试表明Hsp70不如Hsp90那么容易靶向。虽然近来揭示了若干Hsp70调节剂，但这些化合物的效力低并且完全不清楚其对细胞生理学的可能的多效作用。也不大了解其与Hsp70同功异型物相互作用的模式。此外，这些化合物是基于具有有限类药特征的骨架。另外，在癌细胞中用若干所述Hsp70抑制剂观测到的细胞凋亡反应出奇地低，甚至没有，考虑到所报导的 Hsp70的有效抗细胞凋亡功能，明显自相矛盾。
此外，Hsp70的基因操作导致矛盾的发现。哈维克(Havik)等人报导在两种乳癌细胞SKBr3和MCF-7中Hsp70和Hsc70的表达单一或混合降低，同时细胞活力降低，未显示降低Hsp90/Hsp70伴侣蛋白复合物活性的能力。另一方面，在HCT116结肠癌细胞中hsc70与hsp70同时转染靶向会抑制Hsp90的功能。尼兰斯德(Nylansted)等人发现单单耗尽Hsp70导致根除成胶质细胞瘤以及乳癌和结肠癌异种移植物，而在前列腺癌细胞中，他人报导仅仅对抗癌剂敏感。
与以上提及的策略形成对比，我们的工作鉴别出YK5，其为基于可用于广泛医药化学的潜在可成药性骨架设计的Hsp70和Hsc70的双重和选择性调节剂。此外，与以上策略相对，通过本文描述的许多量度，YK5和本发明的相关化合物显示具有有效的抗增殖性，且对正常细胞无毒性。
实例5：药理学Hsp70调节干扰恶性肿瘤的主要标志。
正常细胞转化成恶性细胞是一个多步骤的过程，需要在细胞中积累大量影响关键调控过程的基因变化。哈纳汉(Hanahan)和温伯格(Weinberg)描述完全恶性表型发生所需的六种基本表型性状，称为癌症的“六个标志”。对于每个标志特性，已经鉴别出能够调控此过程的至少一种Hsp90机构客户蛋白，并且直接Hsp90抑制剂能够影响所有六种这些特征。已研发出药理学Hsp70调控剂，接着研究在Hsp90机构中Hsp70对癌症标志的作用。
癌细胞的特征是异常增殖。某些Hsp90机构客户(例如Akt和Raf-1)是肿瘤生长和存活必需的通路中的主要参与者，并且在大多数肿瘤中由Hsp90调控。与Hsp70参与这些Hsp90功能一致，在YK5和本发明的相关化合物加入包括乳癌细胞SKBr3和 MDA-MB-468、小细胞肺癌NCI-H526和急性骨髓性白血病MOLM-13在内的一系列癌细胞中后，观测到这些普遍存在的驱动肿瘤的分子以剂量依赖性方式降解和失活(图3、 7-10和表1)。对特定恶性表型具特异性的其它Hsp90致癌客户也对YK5敏感。在乳癌细胞系SKBr3的情况下，通过活化促进细胞生长和存活的信号传导通路的HER2酪氨酸激酶的过度表达来驱动转化。此细胞中的HER2稳定性通过Hsp90调控，并且直接Hsp90 抑制剂对伴侣蛋白的抑制导致HER2降解(图3)。在LNCaP前列腺癌细胞中表达的突变雄激素受体(AR)和急性骨髓性白血病特有并在MOLM-13细胞中表达的突变FLT-3 激酶(都是Hsp90机构客户)也对本文描述的YK5和本发明的相关化合物敏感(图10a 和15d)。在三重阴性乳癌中活化的STAT3和PDK1以及在白血病中活化的STAT5也对本文描述的YK5和本发明的相关化合物敏感(图9-11、15d)。
与通过致病性Hsp70/Hsp90复合物抑制的常见作用机制一致，直接Hsp90抑制剂PU-H71和PU24FC1以及YK5抑制所有测试癌细胞的生长，无论其起源和遗传背景如何(图12a和表1)。测试MDA-MB-468三重阴性乳癌细胞SKBr3HER2+乳癌细胞、LNCaP mAR+前列腺癌细胞、MOLM-13和香澄-1急性骨髓性白血病细胞、OCI-Ly7弥漫性大B 细胞淋巴瘤细胞和HuH7肝细胞癌细胞。YK5也抑制MDA-MB-468异种移植肿瘤的生长(图12b)。在癌细胞中，记录的针对YK5的半数生长抑制浓度(GI50)与其降解Hsp90 致癌客户的效力高度一致。总之，这些结果进一步表明，在药理学相关剂量下，YK5的生物活性反映其标靶Hsp70的抑制情况。
癌细胞异常增殖与细胞周期失调相关，并且在整个细胞周期中转变的若干分子组分受Hsp90机构控制。直接Hsp90抑制剂引起细胞依赖性周期停滞-例如SKBr3等某些细胞被阻挡在G0/G1期，而例如MDA-MB-468等其它细胞被阻挡在G2/M。与其Hsp90机构靶向机制一致，YK5对这些细胞中的细胞周期具有类似作用(图12c，左)。其作用与 Hsp90机构依赖性细胞周期蛋白(例如MDA-MB-468中的G2/M调控蛋白CDK1和SKBr3 中的G1调控蛋白周期素D1)耗尽相关(图12c，右)。此外，发现这些蛋白质与YK5 分离的Hsp70形成复合物(图12d)。
侵入邻近组织并转移到远处部位是恶性癌细胞的主要特征并为90％人类癌症死亡的原因。侵袭和转移是复杂的过程并需要许多基因(包括许多激酶)的协调作用。与增加癌细胞转移潜能有关的若干蛋白质受Hsp90，包括PI3K/Akt通路(驱动肿瘤细胞侵袭的关键信号传导通路)调控。在高转移性MDA-MB-231乳癌细胞中，抑制此通路足以降低其侵袭潜能。一致地，如在Ser473磷酸化的Akt降低所证明(图12e，上)，降低活化的Akt的细胞含量的YK5抑制MDA-MB-231细胞侵袭穿过基质胶侵袭的能力(图 12e，下)。总之，这些发现证明通过YK5介导的机制进行的药理学Hsp70调节部分模拟直接Hsp90抑制剂对致癌蛋白降解、抑制异常细胞增殖和循环以及降低侵袭潜能的作用。类似地，也可预期本发明的其它化合物也具有这些相同的活性。
逃避细胞凋亡是癌症的另一个重要标志。癌细胞在用YK5激发时会经历大量细胞死亡，并且对于某些癌细胞系来说，此作用始终高于直接Hsp90抑制的情形(图3a和 13)。虽然在例如MDA-MB-468、OCI-Ly7和MOLM-13等某些细胞中，在PU24FC1抑制Hsp90和YK5抑制Hsp70时观测到相对多且均等的杀死作用，但例如LNCaP、SKBr3 和HuH7等其它细胞似乎对Hsp70抑制更敏感(图12a)。据报导不同化学型的其它Hsp90 抑制剂对这些细胞的细胞杀死作用降低，表明其为特异性标靶相关的结果，而不是非特异性的事件，例如潜在的Hsp90抑制剂代谢。
为确定YK5造成的细胞死亡是否归因于细胞凋亡，细胞用YK5处理并分析对形态以及对细胞凋亡的若干效应物和介体的作用(图13)。为定量经历细胞凋亡的细胞数目，细胞用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色并在荧光显微镜下分析活细胞、凋亡细胞(早期和晚期)和坏死细胞的百分比。经YK5处理的细胞培养物证明显示细胞凋亡形态特征 (例如核皱缩和碎裂)的细胞显著且优先以剂量依赖性方式增加(图13a左和图13b)。 24小时处理后这些实验的定量显示在经媒剂处理的急性骨髓性白血病(AML)香澄-1 细胞中约5％的细胞经历细胞凋亡，并且当用10μM YK5激发时其数目升到70％(图13a，右)。在相同条件下用PU24FC1仅观测到9％凋亡细胞死亡(图13a，右)。在其它癌细胞中，例如在乳癌和前列腺癌细胞中，观测到与直接Hsp90抑制剂相比YK5升高的细胞凋亡作用(未图示)。对YK5最敏感的是胰腺癌细胞。当在由Mia-PaCa2、AsPC-1、 BxPC3和PL45细胞组成的一组细胞中测试时，YK5(10μM)在仅仅处理24-48小时后就诱导显著的细胞凋亡(图13且未图示)，考虑到胰腺癌的高抗细胞凋亡阈值和其对疗法的抗性，此为卓越的发现。
在分子水平上，YK5和本发明的相关化合物在癌细胞中造成的细胞凋亡通过PARP增加(图13c)以及卡斯蛋白酶-3裂解和活化(图9、10、14)证明。这些对细胞凋亡标记物的作用发生在YK5与其抗增殖活性和其使Hsp90机构依赖性致癌蛋白降解的能力一致的浓度下，表明常见的Hsp70介导的YK5对癌症标志的作用机制。
实例6.YK5通过Hsp70和Hsp90介导的通路诱导细胞凋亡。已经证明Hsp70与Hsp90都抑制细胞凋亡。Hsp70保护细胞免受广泛的细胞凋亡和坏死刺激影响，并相信 Hsp70含量升高加强肿瘤细胞存活性。简单地说，已报导Hsp70抑制线粒体膜潜能的损失，其先于细胞色素c与AIF从线粒体的释放。也已经注意到Hsp70直接作用于细胞色素c、Apaf-1和AIF。此外，通过抑制应激活化的JNK激酶，证明Hsp70在早期步骤参与细胞凋亡信号转导。另外，发现Hsp70介导保护免受TNF细胞毒性影响，结合并调节例如Bcl2等抗细胞凋亡因子的活性和定位，并促进例如p53和c-myc等促细胞凋亡因子的降解和失活。因此，Hsp70通过调控内在和外在细胞凋亡通路的大量关键元件来抑制细胞凋亡。相比之下，Hsp90对细胞凋亡的调控更有限，并且Hsp90调控的主要抗细胞凋亡分子是Akt和Bcl-xL。虽然调控若干抗细胞凋亡分子，但两种伴侣蛋白Hsp90 和Hsp70并非癌症中普遍存在的细胞凋亡抑制剂。其作用以取决于细胞接线(wiring) 和细胞凋亡通路功能性的转化特异性方式显现。
按照这些方法，近来报导在SKBr3细胞中Hsp90失活使其生长停滞并引起Akt降解，但无法诱导明显的细胞凋亡。相比之下，这些药剂在小细胞肺癌细胞NCI-H526中诱导大规模的细胞凋亡。正好相反，细胞经MAL3-101(一种干扰J-蛋白活化Hsp70的药剂) 或经槲皮素和KNK437(都是诱导性Hsp70表达抑制剂)处理引起SKBr3中而非 NCI-H526中由细胞凋亡引起的大量细胞死亡。通过反义序列降低Hsp70表达也诱导 SKBr3细胞大量死亡。总之，这些研究提出Hsp70是SKBr3中而非NCI-H526细胞凋亡通路的重要调控剂，且相反，指示Hsp90是NCI-H526中而非SKBr3细胞凋亡的主要调控剂。同时作用于Hsp90和Hsp70通路，YK5和本发明的相关化合物诱导SKBr3(图 13c)与NCI-H526细胞(图14且未图示)的显著细胞凋亡。
除了抑制自主性细胞存活以外，据报导诱导Hsp70表达可使细胞高度抵抗肿瘤坏死因子(TNF)、氧化应激、紫外线(UV)辐射、卡斯蛋白酶-3过度表达和若干化学治疗药物所诱导的细胞死亡。与对Hsp70的作用一致，YK5在三重阴性乳癌细胞 MDA-MB-468中增强TNFα的细胞凋亡作用(图13e)。
总之，这些发现表明Hsp70和Hsc70的双重抑制在一系列肿瘤中的细胞凋亡诱导作用强于单独Hsp90或Hsp70抑制，指示这些抑制剂在癌症中的可能增加的治疗效力。其也显示本文描述的本发明化合物可增强其它干预的治疗作用。
与直接Hsp90抑制剂相比用YK5观测到的增加的细胞凋亡也可部分通过其无法诱发反馈热休克反应来解释。虽然已经显示某些肿瘤在直接Hsp90抑制后易于发生细胞凋亡，但直接Hsp90抑制时Hsp70的反馈诱导限制这些药剂在许多肿瘤类型中的细胞毒性。在蛋白质水平上，已经证明所有已知的Hsp90抑制剂都诱导Hsp70蛋白合成，并在临床前和临床上都已经观测到。直接Hsp90抑制剂优先对HSF-1基因敲除的细胞具有细胞毒性，并且甚至在某些癌细胞中通过siRNA和反义方法短期下调Hsp70使这些细胞对 Hsp90抑制剂更敏感。按照这些方法，削弱HSF-1活化的小分子也使细胞对Hsp90抑制敏感。此外，无法上调Hsp70含量的某些肿瘤细胞似乎对Hsp90抑制尤其敏感。通过其它干预诱导Hsp70经证明会引起细胞保护，并且实验证据表明Hsp70的细胞含量是对细胞凋亡易感性的关键参数。考虑到这些主要抗细胞凋能力，YK5不能诱导Hsp70和活化 HSF-1(图3)至少部分地解释当与直接Hsp90抑制剂相比时其具有较高细胞毒性(图 12a)和细胞凋亡反应(图13)的原因。进一步根据此观测结果，Hsp90抑制剂对经YK5 预处理的癌细胞或在Hsp90和Hsp70抑制剂一起加入时更具毒性。
总之，这些发现表明Hsp70和Hsc70的双重药理学抑制能够影响大量致癌标志，导致全面攻击恶性表型并引起癌细胞死亡。
此外，数据证明与Hsp90失活相比，抑制Hsp70对细胞凋亡具有更深远的作用，表明这些抑制剂在癌症中的治疗效力可能增强。
实例7：药理学Hsp70抑制选择性地对癌细胞具有毒性。
因为Hsp70帮助管理正常细胞的功能，例如新合成多肽的折叠、错误折叠蛋白质的再折叠和蛋白质移位通过生物膜，所以仍然不清楚靶向Hsp70与Hsc70同功异型物的药理学干预(例如YK5)对这些细胞是否无毒。为解决此问题，评估在一组正常细胞，即从健康供血者获得的外周血白细胞(PBL)和培养的正常纤维母细胞(例如结肠细胞CCD18Co和肺MRC-5)中YK5的细胞毒性作用(图14a-c)。通过测量代谢活性(图 14a，上)、细胞凋亡活化(图14b、c)和目视检查细胞形态(图14c，下)，发现在YK5 使Hsp70药理学失活后，正常细胞中的细胞死亡最少。同时，在类似条件下，癌细胞在用YK5激发时大量死亡(图14a-c)。在原代AML试样中，YK5诱导母细胞群体的有效细胞死亡，而在相同患者样品中发现的非肿瘤细胞受处理影响小得多。此外，当在手术时从患有ER,PR,HER2-状态的分化不良浸润性导管癌的患者获得的新鲜组织用YK5(5 μM)离体处理时，在基质和正常血管中未观测到处理相关的改变，但在肿瘤细胞中出现大规模的细胞凋亡(60％肿瘤细胞在YK5加入后24小时死亡或濒死)(未图示)。总之，这些发现指示YK5和本发明的相关化合物选择性地对癌细胞具有毒性。
结合由基因Hsp70操作得到的发现，即Hsp70同功异型物沉默在非致瘤细胞系中的毒性低于在癌细胞中的毒性，癌细胞对Hsp70表达和功能失活的较高敏感性可通过类似于温斯坦(Weinstein)提出的“致癌基因成瘾(oncogene addiction)”模型的模型证明。在此模型中，YK5对在适当遗传背景下的特定Hsp70客户(例如在酪氨酸激酶过度表达的细胞中的HER2)的降解将引起细胞凋亡和/或分化，而其在正常细胞中的降解几乎没有影响。此模型已被用以证明临床研发直接Hsp90抑制剂用于广泛肿瘤类型中的合理性。
然而，不能排除在癌细胞中Hsp70的更复杂应用，YK5小分子可通过某些Hsp90 抑制剂选择肿瘤Hsp90物质的方式选择性地靶向Hsp70。为研究此可能性，测量YK55- 珠粒与正常细胞和癌细胞提取物的相互作用。在第一个实验中，使用递增浓度的YK55- 珠粒，进行正常细胞MRC-5和癌细胞SKBr3的化学沉淀实验(图14d，顶图)。在SKBr3 中YK55-珠粒与Hsp40结合的Hsc/p70物质强烈相互作用。在MRC-5中，相互作用较弱，并在YK55-下拉中未检测到Hsp40物质。为增大MRC-5细胞中的Hsp含量，使这些细胞在化学沉淀步骤前暴露于热休克处理。热休克提高Hsp70和Hsp40的表达，但 YK55的选择性和亲和力未改变(图14d，中间图)。在脑提取物中确定类似发现。虽然此组织具有高Hsc70表达，与癌细胞相当，但脑提取物中的Hsp70物质与YK55的相互作用较弱(图14d，下图)。
在第二个实验中，测试可溶性YK5与YK55竞争结合于正常细胞和癌细胞Hsp70 物质的能力(图14e)。有趣的是，低微摩尔浓度的YK5与YK55-珠粒竞争结合于来自 SKBr3癌细胞提取物的Hsp70物质，而要观测到MRC-5细胞中表达的Hsp70的替代，需要超过200μM浓度的YK5(图14e)。YK5与重组人类Hsp70的相互作用甚至更弱(图 14e)。
癌细胞中Hsp70以异源复合物形式存在，其中致癌客户蛋白和辅助伴侣蛋白结合的 Hsp70物质可能在任何时候都与游离Hsp70和辅助伴侣蛋白结合的Hsp70共同存在。在此背景下分析图15的发现指示致癌蛋白结合的Hsp70物质对用可溶性YK5的竞争最敏感，表明YK5对这些Hsp70物质亲和力较高。
总之，这些结果表明例如YK5等本发明化合物对在恶性细胞中表达的Hsp70物质可具有较高亲和力，此外，其可能优选那些结合致癌蛋白和辅助伴侣蛋白的Hsp70物质，由此可能解释观测到的癌细胞对例如YK5等本发明化合物的选择性敏感性，以及提高的致癌蛋白对本发明化合物所诱导的抑制的敏感性。
实例8.Hsp70 Cy3B-K5竞争荧光偏振检验
因为YK5和本发明的相关化合物结合于在癌细胞中发现的Hsp/c70复合物的亲和力高于重组蛋白(图14d、e)，所以设计荧光偏振(FP)检验，测量cy3B标记的YK5或本发明的相关化合物与癌溶解产物Hsp/c70复合物的竞争性结合。原则上，细胞溶解产物与本文描述的本发明化合物一起预先培育，并在加入YK5-cy3B且平衡后，在安利吉 (Analyst GT)盘式读取器中读取信号。此检验是针对96孔格式研发并允许快速地评估化合物(图16)。
人类癌细胞溶解产物的制备：人类乳癌细胞系MDA-MB-468是从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(弗吉尼亚州马纳萨斯市(Manassas,VA))获得并如供应商所指示来培养。收集细胞并冷冻以使膜破裂，接着溶解于加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的结合缓冲液中，以形成溶解产物。溶解产物储存在-80℃下待用。使用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)检验试剂盒(伊利诺斯州罗克福德市的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Rockford,IL))，根据制造商的说明测定总蛋白质含量。
Hsp70 Cy3B-K5竞争FP检验：FP测量是使用黑色96孔微量滴定盘(康宁公司(Corning)#3650)进行，其中激发与发射都从孔的顶部进行。Hsp70FP结合缓冲液含有以下各物：25mM HEPES-K(pH＝7.2)、20mM NaCl、200μM CaCl2、110mM KOAc、 2mM Mg(OAc)2、0.01％NP40。每个检验孔都含有含20μg细胞溶解产物和YK抑制剂的75μL缓冲液。混合物在震荡器上保持10分钟，接着在37℃下培育2小时。将示踪剂加入每个孔中，使得Cy3B-YK5的最终浓度为3nM且最终体积为100μL。接着在安利吉盘式读取器(加利福尼亚州桑尼维尔市的分子仪器公司(Molecular Devices, Sunnyvale,CA))上进行测量。使用100ms的积分时间，并且Z高度设定在3mm(中间)。激发偏振设为静态，而发射偏振设为动态。对于cy3B-YK5，使用在530nm下的激发滤光片和在580nm下的发射滤光片，以及561nm的分色镜。所有FP值都以毫偏振(mP)为单位表示。mP值是使用方程式mP＝1000×[(IS-ISB)-(IP-IPB)]/[(IS-ISB) +(IP-IPB)]计算，其中IS是平行发射强度测量值，IP是垂直发射强度样品测量值，以及ISB和ISP是相应背景测量值(缓冲液)。总荧光度以2×IP+IS确定。
如图16中可见，递增浓度的所指示抑制剂一式三份加入检验盘中并如上所指示进行FP检验。竞争性作用表示为对照物的百分比并通过用各盘中来自抑制剂孔的毫偏振(mP；减去游离cy3B-YK5)值除以来自对照物(cy3B-YK5和利用媒剂DMSO的细胞溶解产物)的平均mP(减去游离cy3B-YK5)计算。将配体结合相对于log10抑制剂浓度作图，并使用非线性最小二乘曲线拟合程序在普瑞姆4.0中计算EC50值。点为平均值；棒为标准偏差。图16指示加入本发明的所指示化合物以剂量依赖性方式竞争细胞溶解产物中YK5-cy3B与Hsp70的结合。
实例9.YK5捕获呈客户蛋白结合构型的Hsp70。使用固体支撑物固定的YK5鉴别癌症特异性致癌蛋白：乳癌中的STAT1
YK55-珠粒优先分离与若干肿瘤特异性致癌蛋白形成复合物的Hsp70(图15a-d)。细胞溶解产物与YK5一起预先培育以剂量依赖性方式降低YK55-珠粒与Hsp70相互作用的能力，并替代结合的致癌蛋白(图15c)。因为抗Hsp70Ab BB70可降低Hsp70和 Hsc70的细胞含量，但在捕获呈辅助伴侣蛋白(即Hsp110)和致癌蛋白客户结合构型的 Hsp70方面较弱，所以探查YK55-珠粒对Hsp70的特异性。也就是说，当与BB70而非不相关IgG Hsp70耗尽的提取物一起培育时，YK55-珠粒无法与Hsp110和Raf-1显著相互作用，证实YK55与Hsp110和Raf-1的相互作用通过Hsp70介导的复合物发生(图 15a，右)。
总之，这些发现指示YK5分离呈致癌客户构型的Hsp70，表明在肿瘤类型依赖性Hsp70客户的发现中使用YK55-珠粒或本发明的相关化合物赋予研究内源细胞环境中癌症Hsp70的相互作用组的新颖可能性。这些尝试对于发现与肿瘤对Hsp70抑制的敏感性相关的机制、设计包括本文描述的本发明化合物和YK-珠粒分离的活化致癌蛋白和通路的抑制剂在内的合理组合疗法以及本文描述的本发明化合物和其它Hsp70抑制剂合理转化为癌症治疗来说至关重要。
为验证YK55-珠粒的实用性，通过YK55而非生物素分离的Hsp70池首先经显示含有已确定的Hsp70客户，例如丝氨酸/苏氨酸激酶Raf-1(图15a，左)。在Hsp70耗尽的细胞中YK55-珠粒无法与致癌Raf-1激酶显著相互作用，证实YK55与致癌基因产物的相互作用通过Hsp70介导的复合物发生(图15a，右)。
接着，探查Hsp70是否如Hsp90一般具有与遗传背景特异性致癌蛋白相互作用的能力。发现若干与通过致病通路的信号传导增加有关或与异常细胞周期有关的与Hsp70形成复合物的致癌蛋白。这些致癌蛋白也称为Hsp90相互作用子，包括在过度表达HER2 的SKBr3乳癌细胞中的周期素D1和HER2激酶、在MDA-MB-468乳癌细胞中的周期素依赖性激酶1(CDK1)和磷酸肌醇依赖性激酶-1(PDK1)以及在LNCaP前列腺癌细胞中的突变雄激素受体(AR)(图15b、c)。细胞溶解产物与YK5一起预先培育以剂量依赖性方式降低YK55-珠粒与Hsp70相互作用的能力，并替代结合的致癌蛋白(图15c)。
总之，这些数据证明YK5-珠粒分离若干参与实现细胞特异性异常信号传导的Hsp70 调控致癌基因产物。在正确的遗传背景下这些致癌基因产物的抑制引起肿瘤抑制和细胞凋亡，因此其降解可用作临床评估对本文描述的本发明化合物的反应的功能检验(即反应的生物标记物)。这些致癌基因产物的抑制剂也可与本文描述的本发明化合物组合使用以设计令结果改善的个体化疗法。为鉴别对本文描述且相关的物质组合物抑制Hsp70 敏感的相关致癌基因产物，此处描述使用YK55-珠粒。
研究乳房肿瘤中的Hsp70相互作用组
HSP是普遍表达的蛋白质，其在多种蛋白质的折叠和细胞移位中具有广泛功能。这些管家功能已经充分得到认识并成为深入研究的主题，而现在更清楚在致病细胞中指派伴侣蛋白实现不同且专门的疾病特异性作用。
对于Hsp90伴侣蛋白，在恶性肿瘤中的这些功能已经主要通过小分子抑制剂格尔德霉素的发现而得到解释。相比之下，在此背景下缺乏选择性调节Hsp70的小分子以及借助Hsp70和Hsc70基因操作获得的有点矛盾的发现使我们无法充分了解Hsp70和Hsc70 在恶性转化中的相关性。因为YK5和本发明的相关化合物是具有新颖作用机制，锁住与致癌客户蛋白和细胞凋亡调控分子形成复合物的Hsp70的Hsp70调节剂，所以此提供独特的机会使我们无偏见地研究癌细胞中Hsp70的相互作用组。
表14.固体支撑物固定的YK5鉴别出STAT1为乳癌细胞中的Hsp70相互作用子。人类MDA-MB-468和人类SKBr3乳癌溶解产物中通过附接有D-生物素的对照珠粒分离的蛋白质复合物以及通过YK55-珠粒分离的蛋白质复合物在SDA-PAGE上分离，割下 90kDa谱带，并且消化所提取的蛋白质并通过如方法中所述的LC/MS/MS分析。括号中的氨基酸在提取期间从序列的其余部分裂解下来。序列分析鉴别出此谱带为STAT1。
为进行癌症Hsp70相互作用组的无偏见分析，对来自SKBr3和MDA-MB-468乳癌细胞的对照物-珠粒-下拉物和YK55-珠粒-下拉物进行蛋白质组分析。所鉴别(表14)和验证(图17、图18)的货物蛋白质是信号转导子和转录活化子1和3(STAT1和STAT3)。在Hsp70免疫缺陷型细胞中YK55无法与STAT相互作用(图18b)，指示YK55与STAT 的结合是Hsp70介导的并具有Hsp70特异性。值得关注的是，与Raf-1和其它致癌蛋白相反，YK5加入细胞中无法降低STAT1的稳态水平(图17a，右)。另一方面，在YK5 处理时，观测到活性STAT3而非STAT1降低，如p-STAT3的水平大幅度降低所证明(图 17a，右)。
STAT是在多种细胞外刺激的整合中具有关键作用的转录因子家族。大部分STAT家族成员(例如STAT3和STAT5)显示促进癌形成，而STAT1抑制癌形成，表明癌细胞为了存活，需要发展伴随保持p-STAT3和p-STAT5的表达增加同时抑制p-STAT1含量的对立机制。实际上，在乳癌细胞中发现丰富的p-STAT3(图8-11、图17)，但几乎没有可检测含量的活化的STAT1(图17、18，参看内源性细胞与IFNγ刺激的细胞中 p-STAT1水平的比较)。因此需要了解在癌细胞中，p-STAT1和p-STAT3物质含量的微调是否可以通过Hsp70调控。已知STAT1活化可促进细胞死亡，并且因为乳癌细胞表达STAT1，故假设这些细胞中Hsp70与STAT1的结合可在抑制其促细胞凋亡功能中起作用，表明癌细胞抵御IFNγ和免疫系统的可能机制。
按照这些方法，发现IFNγ既增加p-STAT1的细胞含量(图18c、d)，也诱导 MDA-MB-468细胞的细胞凋亡(图18c)。YK5加强IFNγ对p-STAT1的作用(图18c)。这些细胞中STAT1和p-STAT1含量与被YK55-珠粒分离的STAT1和p-STAT1含量的比较指示大部分活化的STAT1与YK5/Hsp70形成复合物，表明Hsp70对p-STAT1的捕捉与IFNγ-STAT1通路的抑制有关。
STAT1是干扰素-(IFN)γ信号传导的主要效应物。IFNγ是T细胞和自然杀手细胞所产生的具有防御病原体和肿瘤发生的必要免疫刺激功能的细胞因子。IFNγ可对包括乳房肿瘤细胞在内的各种肿瘤细胞发挥抗增殖作用，并且这些作用通过STAT1引导。在免疫活性小鼠中IFNγ具有外在肿瘤监视作用，并且这些作用需要完整的JAK(济纳斯激酶(JanusKinase))-STAT信号传导通路。具体地说，IFNγ引起酪氨酸残基701和丝氨酸残基727上STAT1磷酸化，导致同源二聚合、DNA结合和其标靶基因的转录活化，一些还有细胞凋亡作用。在缺乏功能性STAT1的细胞中回应于IFNγ的细胞凋亡和卡斯蛋白酶活化消失。类似地，与表达功能性STAT1的紧密匹配的细胞相比，STAT1阴性细胞显示减少的卡斯蛋白酶表达和肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的细胞凋亡。这些发现指示STAT1活化在回应于调控细胞因子(例如IFNγ或TNFα)的诱导细胞凋亡中起关键作用。此外，近来的一项研究显示STAT1与RAG2(对V(D)J重组来说很关键的蛋白质) 都缺乏的小鼠易患上自发性乳腺癌。也已经提供STAT1是肿瘤血管生成、生长和转移的负调控子的证据。
这些结果指示使用并入如本文所述的本发明化合物的组合疗法能够刺激干扰素的作用并允许免疫反应通过阻断肿瘤相关的抑制机制(dampening mechanism)更有效地去除肿瘤。此对疫苗疗法试验来说是令人兴奋的发现，表明共投予生物活性干扰素与本文描述的本发明化合物可提高疫苗效率并允许使用更小的接种剂量。因为其它致病转化依赖于细胞因子/STAT1信号传导，例如微生物和病毒感染以及II型糖尿病的晚期并发症，所以提出，除了癌症以外，并入Hsp70抑制剂的疗法对这些疾病的治疗也可具有增强的作用。
Hsp70结合是抑制肿瘤抑制子活性的新颖机制。
为详述Hsp70抑制STAT1的机制，在YK5以及蛋白质磷酸化和脱磷酸化抑制剂存在和缺乏下，在不同时间点，分析经IFNγ处理的MDA-MB-468细胞，目标是测量STAT1 在残基Tyr701处随时间进行的酪氨酸磷酸化(图18e、f)。在YK5存在下，STAT1-磷酸化快速达到最大水平，但在Hsp70抑制剂缺乏下，其活化推迟并且无法达到类似程度。
因为p-STAT1的整体含量是通过磷酸化和脱磷酸事件的平衡来确定，所以Hsp70受抑制的细胞中STAT1的酪氨酸磷酸化延迟可能由针对STAT1的JAK激酶活性增加或蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)活性降低引起。
为监测STAT1脱磷酸化的速率，采用脉冲追踪策略，其中十字孢碱(一种蛋白激酶抑制剂)加入经IFNγ预处理30分钟的细胞中，意外地阻断JAK引起的STAT1连续磷酸化(图18f，上)。接着在若干后续时间点测定酪氨酸磷酸化的STAT1的剩余含量。在 YK5缺乏下，STAT1的酪氨酸磷酸化立即下降，而在其存在下，细胞p-STAT1含量延长。这些结果指示Hsp70可削弱乳癌细胞中IFNγ诱导的STAT1磷酸化，并且Hsp70抑制剂因可能延迟脱磷酸化而促进p-STAT1的积累。因此，在正钒酸盐(Na3VO4)(一种非特异性PTPase抑制剂)存在下，STAT1磷酸化几乎如未经YK5处理和经YK5处理的细胞中一般有效地发生(图18f，下)。正钒酸盐阻断STAT1脱磷酸化导致酪氨酸磷酸化的 STAT1在核中积累并随后一直持续。一致地，在IFNγ刺激前用YK5预处理MDA-MB-468 细胞增强活化的STAT1在核中的移位(图19a)并提高其DNA结合功效(图19b)。这些结果与Hsp70保持p-STAT1处于通过PTPase改变脱磷酸化速率的构型的机制一致。
实例10：使用固体支撑物固定的YK5鉴别癌症特异性致癌蛋白：乳癌中的STAT3
如实例9中所指示，也在YK55-珠粒分离物中鉴别STAT3(图17c)。与STAT1相反，常常发现STAT3在乳癌中具有组成性活性，并且肿瘤可变得沉溺于STAT3。已经发现在大量乳癌肿瘤和细胞系中STAT3酪氨酸磷酸化和DNA结合增加。有证据表明STAT3 可活化与细胞周期进程、细胞存活和转化相关的若干基因的转录。相反，STAT3活性的药理学和显性阴性抑制阻止乳癌细胞增殖和存活，总之表明STAT3活性为乳癌中转化的表型所需。
使用针对STAT1设计的实验策略，Hsp70对STAT3的作用与对STAT1的作用相反。结果指示Hsp70通过用激酶促进磷酸化和/或用PTPse延迟STAT3脱磷酸化来帮助细胞 p-STAT3积累。STAT3活化视上游激酶(例如济纳斯激酶2(JAK2))对保守酪氨酸残基(Y705)的磷酸化而定。总之，推断出结合于Hsp70保持p-STAT3处于PTPase不能进入但利于JAK磷酸化的构型，并为维持细胞中升高的p-STAT3含量储备的主要机制。结合Hsp70调控STAT3活性的机制，本文描述的本发明化合物有效使STAT3失活，如在所述化合物存在下酪氨酸残基(Y705)磷酸化减少所指示(图9b、10a、11b)。因此， YK5和本发明的相关化合物使Hsp70促进p-STAT3的作用恢复。STAT3信号传导通路的持续活化已经在广泛的人类实体和血液癌症中得到证明并通常与较差的预后相联系。归因于持续STAT3信号传导的促癌活性包括与细胞增殖、转移、血管生成、宿主免疫逃避和细胞凋亡抗性有关的活性。本文显示用本文描述的本发明化合物干扰STAT信号传导通路是一种抑制癌细胞中异常活化的STAT信号传导的新策略。
最后，本文所包括的实施例显示使用YK5和其生物素标记的衍生物YK55研究胞质Hsp70的相互作用组。在广泛癌症类型中活化的若干致癌基因产物通过这些珠粒鉴别。这些致癌基因产物包括(但不限于)在过度表达HER2的乳癌中的HER2、周期素D1、 Raf-1、STAT1和STAT3；在三重阴性乳癌中的PDK1、STAT1、STAT3和CDK1，以及在前列腺癌中的突变AR。这些证明本文描述的本发明化合物组合作用于若干活化的致癌通路并在众多癌症中具有活性。需要Hsp70结合这些蛋白质以维持其功能稳定性，并且YK5和本发明的相关化合物对Hsp70的抑制引起致癌蛋白不稳定以及随后通过蛋白酶体通路消除，或者使其失活。
需要更好地了解产生转化的表型的分子异常。此了解可基于促肿瘤分子的抑制剂，使毒性较低的抗癌治疗得到发展。因为大部分癌症的特征是若干分子改变，所以在临床环境下难以确定将实现最佳结果的分子靶向剂的确切组合。可想象使用YK-珠粒“捞出(fish out)”在每个癌细胞类型/患者肿瘤组织中异常的蛋白质子集。从这些“捞出”实验获得的信息可经汇编，以产生细胞和癌症特异性转化通路的分子地图。“肿瘤特异性分子异常”地图的产生最终将允许医师针对患者设计个体化疗法。此蛋白质组地图明显优于更常见的遗传特征地图，因为大部分抗癌剂都是靶向蛋白质而非基因的小分子，并且靶向特定分子改变的许多小分子目前正在研发中。这些尝试可为设计在治疗癌症患者中功效更佳且毒性更低的组合疗法奠定基础，此外，还确定特定肿瘤中的特定分子改变，促进了新颖分子靶向疗法的发展。
本发明的一个实施例提供一种监测正治疗肿瘤或增生性病症的患者的治疗状态的方法，其包含将根据技术方案1到20所述的化合物共价连接到固体基质以形成基质-化合物复合物；在治疗期前或期间某一时间从患者获得第一生物样品；使样品与基质-化合物复合物接触，以允许基质-化合物复合物接触HSP70复合物；测量和记录从Hsp70复合物替代的致癌蛋白的类型和量；在治疗期期间稍迟的某一时间从患者获得第二生物样品并重复测量t和记录从Hsp70复合物替代的致癌蛋白的类型和量的步骤；比较此结果与先前测量结果并鉴别致癌蛋白代谢通路是否受抑制或转到其它致癌蛋白通路；和鉴别患者疗法是否具有有益作用。
这些实施例也显示使用YK5和本发明的相关化合物鉴别调控细胞中蛋白磷酸化的新颖机制。具体地说，其显示Hsp70充当乳癌细胞中STAT1和STAT3活性的细胞缓冲剂。数据指示Hsp70结合于STAT1和STAT3并保持这些蛋白质处于促进和加速(对于 STAT1)或减速(对于STAT3)磷酸酶对其的脱磷酸作用的构型的机制。通过此机制， Hsp70减少内源性p-STAT1并降低其促细胞凋亡的能力，且相反，增加内源性p-STAT3 并加强其诱导增殖的能力。
并非最后，我们的发现表明通过YK5机制药理学抑制Hsp70在广泛癌细胞中具有多模式作用并引起对主要癌症标志的全面攻击。此作用与本文描述的本发明化合物能够削弱多种致癌蛋白的稳定性和功能并恢复肿瘤抑制子活性高度关联。结合其缺乏反馈热休克反应、对正常细胞的细胞毒性作用很小以及在不同遗传背景的广泛癌细胞中具有有效活性，我们的结果将Hsp70和Hsc70双重药理学抑制定位为潜在的新颖抗癌干预。
实例11.使用本发明的化合物除去干细胞
YK5有效杀死癌症干细胞。越来越多的证据表明急性骨髓性白血病(AML)是由称为白血病干细胞(LSC)的相对稀少且具有化学疗法抗性的细胞亚群产生和维持，这些细胞可自我更新，增殖并分化成白血病母细胞。呈现较高比例表型确定的LSC的患者显示的无复发存活率明显不如具有低比例LSC的患者。而且，诊断时较高比例的LSC高度预示微小残留病(MRD)，表明LSC是MRD的重要促成因素。最后，已经证明虽然许多药物可杀死白血病母细胞，但很少能除去LSC。
在原代AML试样中，YK5诱导母细胞、干细胞和祖细胞群体的有效细胞死亡(图20)。引人注意的是，观测到表型描述的白血病干细胞和全部白血病母细胞具有高度敏感性(图20b；红色棒对灰色棒)。最后，在相同患者样品中发现的非肿瘤细胞受YK5 处理的影响小得多(图20，白色棒)。因此，例如YK等具有癌症干细胞毒性的化合物对改善癌症疗法来说具有重大价值。
实例12：分析方法
试剂。PU24FC1和PU-H71如先前所述合成和表征。基于安沙霉素(ansamycin)Hsp90抑制剂的荧光探针GM-cy3B如所报导合成。本文描述本发明化合物的合成和表征。亮抑酶肽(Leupeptin)、MG 132、MG 101、PMSF、碘化丙啶和肿瘤坏死因子-α是从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)获得；AEBSF来自A.G.科技公司(A.G. Scientific)；Z-VAD-FMK、BOC-D-FMK、组织蛋白酶(cathepsin)抑制剂1、钙酶抑肽(calpeptin)和IFNγ来自卡尔生物化学公司(Calbiochem)。重组人类Hsp70蛋白购自史曲根公司(Stressgen)。
细胞系。人类癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231、LNCaP和正常人类肺纤维母细胞MRC5和正常人类结肠细胞CCD18Co购自美国菌种保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯市)。SKBr-3细胞为尼尔罗森博士(Dr.Neal Rosen)(MSKCC)赠予，HuH7细胞为马萨基博士(Dr.Massague)(MSKCC)赠予，OCI-Ly7、MOLM-13和香澄-1来自尼蒙博士(Dr.S.Nimer)(MSKCC)且Mia-PaCa2、AsPC-1、BxPC3和PL45为纽约大学的巴沙基博士(Dr.D.Bar-Sagi,NYU)赠予。细胞在补充有10％胎牛血清、1％L- 谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素的DME/F12(MDA-MB-468、MDA-MB-231和SKBr3) 或RPMI(LNCaP、MOLM-13、BxPC3和AsPC-1和香澄-1)或MEM(MRC5和CCD18Co) 或IMDM(OCI-Ly7)或DMEM(HuH7、Mia-Paca2和PL45)中常规培养。PBL(人类外周血白细胞)是从购自纽约血液中心(New York Blood Center)的患者血液分离。35ml 细胞悬浮液铺在15ml法柯帕克分离液(Ficoll-Paque plus)(通用医疗集团(GEHealthcare))上。样品在4℃下在2,000rpm下离心40分钟，并收集白细胞界面。细胞涂在具有10％FBS的RPMI培养基中并在第二天用适当浓度的YK5处理所指示的时间。
原代细胞分离和培养。在知情同意下获得原代人类AML细胞。试样的所有操作和分析都经威尔康奈尔医学院伦理审查委员会(the Weill Cornell Medical CollegeInstitutional Review Board)批准。单核细胞使用法柯帕克分离液(Ficoll-Plaque)(纽约州皮斯卡塔韦市的法莫生物技术公司(Pharmacia Biotech,Piscataway,NY))密度梯度分离来分离。在一些情况下，细胞冷冻保存于由伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove'smodified Dulbecco medium，IMDM)、40％胎牛血清(FBS)和10％二甲亚砜(DMSO) 组成的冷冻培养基中或CryoStorTM CS-10(培利公司(Biolife))中。
缓冲液：为洗涤在YK55-珠粒或BB70-Ab上分离的蛋白复合物，如所指示使用高盐缓冲液(20mM Tris pH 7.4、1M NaCl、0.1％NP-40)或低盐缓冲液(20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、0.1％NP-40缓冲液)。为从YK55-珠粒洗脱蛋白质复合物，如所指示，使用洗脱缓冲液A(62.5mM TrisHCl pH 6.8、2％SDS、10％甘油、15.5mg/ml DTT、0.02 mg/ml溴酚蓝)并在100℃下煮沸样品3分钟，或使用洗脱缓冲液B(2％SDS、50mM 磷酸盐、100mM NaCl、6M尿素和2mM硫脲)并在室温下培育样品15分钟，接着在 100℃下培养15分钟。
计算方法：蛋白质序列和晶体结构分别从NCBI和RCSB数据库下载。同源模型由普瑞姆2.0版构筑，并且粗同源模型通过使用宏模型(Macromodel)9.6版最小化进一步精修。对所产生的同源模型进行部位地图2.2版分析，接着设计YK5并将其对接到预测的变构部位上。所有计算都使用美涛8.5版在使用乌班图(Ubuntu)8.10操作系统的惠普工作站(HPworkstation)xw8200上进行。
残基编号方案：除非另外说明，否则Hsp70蛋白中每个氨基酸残基的位置都根据米乐(Milner)等人提出的hHsp70(寄存编号：P08107)序列编号。
同源模型构建：使用普瑞姆2.0版产生同源模型。使用与ATP形成复合物的hHsp70N端结构域(PDB ID：1S3X)、与ADP和底物(肽-NRLLLTG)形成复合物的大肠杆菌Hsp70(DnaK)(PDB ID：2KHO)、秀丽隐杆线虫Hsp70的C端结构域(PDB ID： 2P32)的蛋白质结构和全长hHsp70蛋白的氨基酸序列(寄存编号：P08107)进行模型构建。为建立模型，hHsp70的蛋白质序列(寄存编号：P08107)作为输入序列输入普瑞姆的结构制备向导中。进行序列同源性搜索以鉴别显示超过50％序列同源性的模板。此搜索鉴别出三个模板晶体结构(PDB ID：1S3X、2KHO和2P32)。全长hHsp70序列和模板使用普瑞姆的缺省参数比对。在普瑞姆的构建结构选项中，氨基酸Met1-Gly382 (hHsp70)选自PDB ID：1S3X，氨基酸Asp385-Gln538(大肠杆菌)，即Asp383-Ala541 (hHsp70)选自PDB ID：2KHO，且最后氨基酸Leu543-Ser614(秀丽隐杆线虫)，即 Leu542-Gly613(hHsp70)选自PDB ID：2P32。氨基酸残基(614-641，hHsp70)未建立模型，因为没有这些C端氨基酸的模板结构。接着使用来自模板比对部分的原子位置，考虑溶剂、配体(ADP)、力场和其它因素，通过在普瑞姆中执行的一系列演算法构建结构。通过插入模板间隙超过20个残基，使结构不连续性最佳化。所有环都在普瑞姆的缺省参数设定下精修。
结构制备：使用美涛8.5中可用的蛋白质制备向导精修同源模型建立的hHsp70蛋白结构用于部位地图和对接计算。部分原子电荷根据OLPS-AA力场指定。为获得hHsp70 的更可靠的3D结构，同源模型进一步进行由5000次最陡下降(steepest descent，SD) 和共轭梯度(conjugate gradient，CG)迭代组成的一系列能量最小化步骤，直到均方根 (rms)梯度能量低于
结合部位预测：使用在美涛8.5版的部位地图2.2版中执行的缺省参数，对精修的hHsp70同源模型进行计算机研究，旨在确定可能的可成药部位。如哈尔根(T.Halgren) 所述，部位地图计算分成三个阶段。在第一阶段，基于几何和能量性质选择相关位点，并且将这些点归合成数组以界定这些部位。接着，以网格点计算疏水性、亲水性和其它关键性质并制备等高线图。最后，计算部位性质，如部位评分(S评分)、可成药性评分(D评分)、尺寸、封闭性、亲水性和疏水性。基于S评分和D评分排列潜在的受体结合部位。
为确定适当的药物结合部位，部位地图识别可强烈地结合配体的部位(较高S评分)，但是如果具有最高活性的活性配体含有带电结构，例如天然磷酸盐底物的结构，因此不太可能具有类药特征，那么不将此部位列为可成药的(较低D评分)。
配体结构制备：hHsp70调节剂(YK5)和新设计的调节剂是使用美涛8.5版的片段字典(fragment dictionary)构筑。调节剂的几何形状通过宏模型程序9.6版，使用OLPS-AA力场最佳化。
配体对接。对接计算是以格莱德4.0版的标准精度(SP)模式进行。使用格莱德中的受体网格生成(Receptor Grid Generation)工具，通过选择用部位地图获得的个别输入部位(部位1-5)作为输入配体，制备网格。计算和存储多个能量网格的结合部位是根据两个同心立方体来界定：边界盒，其必须含有任何可接受的配体姿势的中心；和封闭盒，其必须含有可接受姿势的所有配体原子。边界盒和封闭盒通过棱长分别为和以配体的最长原子-原子距离的中点为中心的立方体界定。除去均方根差小于和最大原子位移小于的姿势以排除冗余。将范德华半径的比例因子应用于针对配体和蛋白质的绝对部分电荷分别小于或等于0.15(比例因子为0.8)和0.25(比例因子为1.0)个电子的原子。设定在对接计算初始阶段期间产生的姿势的最大数目的最大保持变量(maxkeep variable)设为5000，并且设定每个进入能量最小化的配体的姿势的数目的保持最佳变量(keep bestvariable)设为1000。能量最小化方案包括介电常数 4.0和1000级的共轭梯度。在完成每个对接计算后，每个配体允许产生最多100种姿势。考虑定向和格莱德评分(G评分)，选择最佳对接构型。
蛋白质印迹法。细胞生长到60-70％汇合并用抑制剂或DMSO媒剂处理所指示的时间。在50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl和1％NP-40溶解缓冲液中制备蛋白质溶解产物。使用BCA试剂盒(皮尔斯公司(Pierce))，根据制造商的说明，测量蛋白质浓度。蛋白质溶解产物(10-50μg)通过SDS-PAGE解析，转移到硝基纤维素膜上并与所指示的初级抗体一起培育：来自兔的抗erbB2(1:250，28-0004，兹姆德公司(Zymed))、来自小鼠的抗-Hsp90(1:500，SPA-830，史曲根公司)、来自兔的抗Hsp40(1:1000， SPA-400，史曲根公司)、来自小鼠的抗HOP(1:1000，SRA-1500，史曲根公司)、来自兔的抗Hsc70(1:500，SPA-816，史曲根公司)、来自小鼠抗雄激素受体(1:500，554225，百思公司(Biosciences))、来自兔的抗Flt-3(1:500，sc-480，圣克鲁兹公司(Santa Cruz))、来自小鼠的抗生物素(1:250，B7653，西格玛-奥德里奇公司)、来自小鼠的抗Hsp90 (1:1000，SMC-107，斯曲玛公司(Stressmarq))、来自兔的抗HSF1(1:500，SPA-901，史曲根公司)、来自小鼠的抗CDK1(1:1000，905-777-100，检验设计公司(Assay Designs))、来自小鼠的抗周期素D1(1:125，2926，赛信通公司(CellSignaling))、来自兔的抗卡斯蛋白酶3(1:500，9665，赛信通公司)、来自兔的抗磷酸化STAT1(Tyr 701)(1:250，9171，赛信通公司)、来自小鼠的抗STAT1(1:1000，610186，BD生物科技公司(BD Biosciences))、来自小鼠的抗Hsp70(1:500，SPA-810，史曲根公司)、来自兔的抗Akt(1:500，9272，赛信通公司)、来自兔的抗磷酸化Akt(Ser 473)(1:500， 9271，赛信通公司)、来自兔的抗Raf-1(1:500，sc-133，圣克鲁兹公司)、来自兔的抗PARP(p85片段)(1:500，G7341，普洛麦格公司(Promega))、来自兔的抗CSK (1:1000，sc-13074，圣克鲁兹公司)、来自小鼠的抗β-肌动蛋白(1:2500，A1978，西格玛-奥德里奇公司)和来自兔的抗PI3K(p85)(1:4000，06-195，阿普代特公司 (Upstate))。接着膜与相应过氧化物酶结合的二级抗体(1:3,000稀释)一起培育。抗 p23(JJ3)为托夫特博士(Dr.D.Toft)赠予。抗HIP、抗Hsp90(H9010)和抗Hsp/c70 (BB70)抗体如先前所述产生。
Hsp90结合检验。如先前所述在黑色96孔微量滴定盘(康宁公司#3650)中进行测量7。简单地说，每个96孔盘都含有3nM Cy3B-GM、10nM Hsp90(史曲根公司#SPP-770) 和所测试的抑制剂(于DMSO中的储备液)，最终体积为100μl。盘留在震荡器上于4 ℃下保持24小时，并且记录荧光偏振(FP)值(mP)。EC50值测定为替代50％Cy3B-GM 的竞争剂浓度。FP测量是在安利吉仪器(分子仪器公司)上进行。
Hsc70腺苷三磷酸酶活性和荧光素酶再折叠。纯化并分析人类Hsc70、 DJA1/DNAJA1、DJA2/DNAJA2和Hsp110/Hsp105/HSPH1。为测量Hsc70腺苷三磷酸酶活性，4μM Hsc70在检验缓冲液(100mM KOAc、20mM Hepes-KOH pH 7.5、5mM MgOAc2)中与不同浓度的YK5或作为媒剂对照物的1％DMSO于37℃下预先培育2小时。加入4μM DJA1或DJA2、1μM Hsp110、2mM ATP和5μCi/mlμ[32P]-ATP(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))并在30℃下培育反应物。在时间点用37.5mM EDTA终止样品并通过在0.5M LiCl和0.5M甲酸中显影的聚乙烯亚胺纤维素(玛利贝克公司 (Mallinckrodt Baker))上进行薄层色谱加以分析。产生的ADP通过磷屏成像定量并且线性酶速率(Vmax)由回归分析计算。为分析荧光素酶再折叠，使萤火虫荧光素酶(西格玛公司(Sigma))在6M盐酸胍和1mM二硫苏糖醇中变性10分钟。4μM Hsc70 如上与药物或媒剂对照物一起预先培育。加入4μM DJA2和2mM ATP，并用在30℃下培育的反应物将荧光素酶以1:100快速稀释到5.4nM。在60分钟或所指示的时间点时，样品用荧光素酶检验试剂(普洛麦格公司)以2:25稀释并在柏斯露特(Berthold Lumat) LB9507光度计中测量活性。
使用YK55珠粒的Hsp70竞争检验。蛋白质溶解产物使用20mM Tris pH 7.4、25mMNaCl、0.1％NP-40溶解缓冲液制备。细胞提取物在4℃下与所指示浓度的可溶性竞争剂在20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、0.1％NP-40缓冲液中一起培育3小时。同时，通过将抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒(50μl)(赛默科技公司(Thermo Scientific))与YK55 (50或100μM，如所指示)在4℃下一起培育1小时来制备YK55-珠粒。在用缓冲液洗涤珠粒三次后，将含有以上可溶性竞争剂的溶解产物与YK55-珠粒一起培育。样品在 4℃下培育过夜，用溶解缓冲液洗涤5次并施加于SDS-PAGE。
Hsp70 Cy3B-K5竞争荧光偏振检验：FP测量使用黑色96孔微量滴定盘(康宁公司 #3650)进行，其中激发与发射都从孔的顶部进行。Hsp70FP结合缓冲液含有以下各物： 25mMHEPES-K(pH＝7.2)、20mM NaCl、200μM CaCl2、110mM KOAc、2mM Mg(OAc)2、0.01％NP40。每个检验孔都含有含20μg细胞溶解产物和YK抑制剂的75μL 缓冲液。混合物在震荡器上保持10分钟，接着在37℃下培育2小时。将示踪剂加入每个孔中，使得Cy3B-YK5的最终浓度为3nM且最终体积为100μL。接着在安利吉盘式读取器(加利福尼亚州桑尼维尔市的分子仪器公司)上进行测量。使用100ms的积分时间，并且Z高度设定在3mm(中间)。激发偏振设为静态，而发射偏振设为动态。对于cy3B-GA，使用在530nm下的激发滤光片和在580nm下的发射滤光片，使用561 nm的分色镜。所有FP值都以毫偏振(mP)为单位表示。mP值是使用方程式mP＝1000×[(IS-ISB)-(IP-IPB)]/[(IS-ISB)+(IP-IPB)]计算，其中IS是平行发射强度测量值， IP是垂直发射强度样品测量值，以及ISB和ISP是相应背景测量值(缓冲液)。总荧光度以2×IP+IS确定。
非变性凝胶电泳。细胞在42℃下热休克45分钟或用所指示的抑制剂或媒剂处理3小时，随后在20mM Hepes pH 7.9、0.42M NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、25％甘油缓冲液中溶解。75μg蛋白质样品装载到预先跑胶的非变性梯度聚丙烯酰胺凝胶(4％积层凝胶、5到20％分离凝胶)上并在50mM Tris pH 8.0、0.38M甘氨酸电泳缓冲液中在4℃下分离过夜。在室温下凝胶在SDS-PAGE电泳缓冲液中预先平衡15分钟。接着蛋白质在50mM Tris、380mM甘氨酸、0.1％SDS、20％甲醇缓冲液中在4℃下电泳转移到硝基纤维素膜上并针对HSF-1印迹。
免疫沉淀。收集细胞并溶解于20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、0.1％NP-40缓冲液中。每个样品都含有500μg总蛋白质。适当抗体(对于Hsp70为BB70以及对于Hsp90 为H9010)(5μl)或正常IgG(5μl)(作为阴性对照)与蛋白G琼脂糖珠粒(30μl) (阿普代特公司)一起加入每个样品中并在4℃下培育过夜。样品用溶解缓冲液洗涤5 次并施加于SDS-PAGE上，接着进行标准蛋白质印迹程序。
化学沉淀。蛋白质溶解产物使用20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、0.1％NP-40溶解缓冲液制备。抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒(50μl)(赛默科技公司)用溶解缓冲液洗涤3次，加入所指示浓度的YK55并在4℃下培育复合物1小时。在用缓冲液洗涤3次后，将珠粒加入含所指示的总细胞蛋白质的缓冲液中。样品在4℃下培育过夜，用溶解缓冲液洗涤5次并施加于SDS-PAGE。
Hsp70耗尽。将4μl BB70抗Hsp70抗体或正常小鼠IgG和30μl蛋白G琼脂糖悬浮液加入含200μg MDA-MB-468蛋白细胞溶解产物的20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、 0.1％NP-40缓冲液中。在4℃下培育3小时后，样品离心，收集上清液并弃去珠粒离心块。重复此程序两次。YK55-珠粒(100μM YK55加入50μl抗生蛋白链菌素珠粒中) 如上所述制备，加入上清液中并在4℃下培育过夜。珠粒用20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、0.1％NP-40缓冲液洗涤5次并施加于SDS-PAGE。
共价结合。K562细胞用所指示量的YK55处理所指示的时间。收集细胞并溶解于20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、0.1％NP-40缓冲液中。于100μl溶解缓冲液中的细胞提取物(500μg)与抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒一起在4℃下培育1小时。样品用溶解缓冲液或高盐(20mM Tris pH 7.4、1M NaCl、0.1％NP-40)缓冲液洗涤5次并进行 SDS-PAGE。凝胶根据制造商的程序(英杰公司(Invitrogen))进行银染色或蛋白质转移到硝基纤维素膜上，接着进行免疫印迹。
不可逆性测试方案。MDA-MB-468细胞在6孔盘中生长到约80％汇合。细胞组用 YK5(10μM)或媒剂(DMSO)处理2小时。接着一组经YK5处理的细胞用100ng/mL IFNγ刺激30分钟并且制备提取物用于蛋白质印迹法。另一组细胞用温培养基洗涤以除去化合物，培育2小时，再次洗涤，再培育2小时，再次洗涤，接着再培育4小时。接着此组细胞用IFNγ刺激并类似于第一组细胞制备提取物。
放线菌酮处理。细胞用加有媒剂或本发明化合物的放线菌酮(最终浓度为100μg/ml) 处理所指示的时间。细胞如上所指示溶解并通过蛋白质印迹法分析所得样品。
细胞溶解于50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl和1％NP-40溶解缓冲液中。NP-40 不可溶部分溶解于50mM Tris pH 7.4和2％SDS中并煮沸15分钟。蛋白质通过 SDS-PAGE分离，接着进行标准蛋白质印迹程序。使用增强型化学发光检测系统(通用医疗集团)，通过自动射线摄影术，观察印迹。
光密度法。凝胶在阿道比公司(Adobe)福托肖普(Photoshop)7.0.1中扫描并使用昂斯伊(Un-Scan-It)5.1软件(犹他州奥勒姆市的斯尔克科技公司(Silk Scientific,Orem, UT))进行定量光密度分析。
激酶筛选。对于大部分检验，激酶标记的T7噬菌体菌株平行生长于24孔深孔板中来源于BL21品系的大肠杆菌宿主中。大肠杆菌生长到对数期并用来自冷冻储备液的T7 噬菌体感染(感染复数＝0.4)并在32℃下震荡培育，直到溶解(90-150分钟)。溶解产物离心(6,000×g)并过滤(0.2μm)以去除细胞碎片。剩余的激酶在HEK-293细胞中产生，随后用DNA标记以进行qPCR检测。涂有抗生蛋白链菌素的磁性珠粒用生物素标记的小分子配体在室温下处理30分钟以产生亲和树脂以进行激酶检验。经配体结合的珠粒用过量生物素阻断并用阻断缓冲液(西贝克阻断缓冲液(SeaBlock)(皮尔斯公司)、1％BSA、0.05％吐温20(Tween20)、1mM DTT)洗涤以去除未结合的配体并减少非特异性噬菌体结合。通过将激酶、经配体结合的亲和珠粒和测试化合物组合在 1×结合缓冲液(20％西贝克阻断缓冲液、0.17×PBS、0.05％吐温20、6mM DTT)中来组装结合反应。测试化合物制备为于100％DMSO中的40×储备液制备并直接在检验中稀释。所有反应都在聚丙烯384孔盘中进行，最终体积为0.04ml。检验盘在室温下震荡培育1小时并用洗涤缓冲液(1×PBS、0.05％吐温20)洗涤亲和珠粒。接着珠粒再悬浮于洗脱缓冲液(1×PBS、0.05％吐温20、0.5μm非生物素标记的亲和配体)中并在室温下震荡培育30分钟。洗脱液中的激酶浓度通过qPCR测量。金姆扫描(KINOMEscan)的选择性评分(S)是化合物选择性的定量量度。其通过排除掉突变变体，用结合于化合物的激酶数目除以所测试的不同激酶的总数目来计算。TREEspotTM是金姆扫描研发的一种有专利权的数据可视化软件工具。发现结合的激酶用红圈标记，其中较大圆圈指示较高亲和力结合。修改激酶树状图并在科技与细胞信号传导技术公司 (Science andcell signaling Technology.Inc)许可下再现。
生长抑制检验。抑制剂的抗增殖作用是使用染料阿尔玛蓝评估。此试剂迅速客观地测量细胞培养物中的细胞活力，并且其使用指示剂染料刃天青(resazurin)测量细胞代谢能力(细胞活力的指示剂)。简单地说，将细胞涂在柯斯塔(Costar)96孔盘上。对于附着细胞(例如SKBr3、MDA-MB-468、LNCaP、MRC5)，每孔使用8,000个细胞。对于悬浮细胞(例如MOLM-13、香澄-1、OCI-Ly7、PBL)，每孔涂20,000个细胞。在药物处理前，细胞在37℃下培育24小时。药物一式三份以所指示浓度添加，并将盘培育72小时。加入阿尔玛蓝(440μM)，并在6小时后使用安利吉(荧光强度模式，激发530nm，发射580nm，使用560nm分色镜)读盘。结果使用索普软件(Softmax Pro software)分析。细胞生长抑制百分比通过根据初始细胞群体(零时)，将从经处理细胞获得的荧光读数与从对照细胞获得的荧光读数比较来计算。IC50以抑制50％细胞生长的药物浓度计算。
细胞凋亡-吖啶橙/溴化乙啶。细胞凋亡是使用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)复染色法测定。吖啶橙被活细胞与非活细胞吸收，并且如果嵌入双股核酸(DNA)中，那么发射绿色荧光，或者如果结合于单股核酸(RNA)，那么发射红色荧光。溴化乙啶仅仅被非活细胞吸收并通过嵌入DNA中发射红色荧光。(1)活细胞具有含有组织的结构的均匀绿色细胞核。(2)早期凋亡细胞(其仍然具有完整的膜，但已经开始进行DNA裂解) 具有绿色细胞核，但可见核周染色质凝缩成可见的鲜绿色小块或片段。(3)晚期凋亡细胞具有含凝缩或碎裂的染色质的橙色到红色细胞核。(4)坏死细胞具有含有组织的结构的均匀橙色到红色细胞核。简单地说，细胞涂在20mm法科尔盘(Falcon plate)上并再培育24小时。加入所指示浓度的药物，保持24或48小时，细胞用PBS洗涤并经受胰蛋白酶作用。在用吖啶橙和溴化乙啶染色后，用荧光显微镜(蔡司阿西福特(Zeiss Axiovert)40 CFL)观察细胞并计数。凋亡细胞百分比由每组中计数的200-300个细胞来确定。
碘化丙啶细胞染色和流式细胞术分析。具有碎裂DNA(指示细胞凋亡)的细胞的存在也可通过具有小于2N DNA含量(亚G1)的细胞来检测。为分析DNA含量，将细胞用冰冷的PBS洗涤，并在4℃下在70％乙醇中固定1小时。固定的细胞在1,200rpm 下离心5分钟并通过在室温下在含有50μg/mL碘化丙啶(西格玛-奥德里奇公司)和50 μg/mL不含脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶A(西格玛-奥德里奇公司)的PBS中培育1 小时来染色。DNA含量通过FACScan(BD生物科技公司)中的流式细胞术分析。数据用西奎普软件(Cell Quest Prosoftware)(贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson))从不少于10,000个细胞收集，并用福乔(Flow Jo)(奥勒冈州阿什兰市(Ashland,OR)) 分析。
脉冲追踪。MDA-MB-468细胞用100ng/ml IFNγ预处理30分钟，接着加入10μM YK5，保持30分钟，接着用500nM十字孢碱或1mM Na3VO4处理。在所指示的时间收集细胞，并溶解于50mM Tris pH 7.4、130mM NaCl和1％NP-40溶解缓冲液中并进行蛋白质印迹程序。
活化STAT1DNA结合检验。STAT1的DNA结合能力是通过基于ELISA的检验(曲斯姆(TransAM)，加利福尼亚州卡尔斯巴德市的阿莫公司(Active Motif,Carlsbad,CA))，根据制造商的说明检验。简单地说，5×106个MDA-MB-468细胞用IFNγ(100ng/ml)、 YK5(10μM)或IFNγ(100ng/ml)加YK5(1、5和10μM)的组合处理。10微克细胞溶解产物加入含有预吸附的STAT共同寡核苷酸(5'-TTCCCGGAA-3')的孔中。对于经IFNγ处理的细胞，在20pmol含有野生型或者突变STAT共同结合部位的竞争剂寡核苷酸缺乏或存在下进行检验。经干扰素处理的海拉细胞(HeLa cell)(每孔5μg)用作检验的阳性对照物。培育和洗涤后，兔多克隆抗STAT1α抗体(1:1000，阿莫公司) 加入每个孔中，接着加入HPR-抗兔二级抗体(1:1000，阿莫公司)。加入HRP底物后，在450nm下读取吸光度，其中参考波长为655nm(斯勒4(Synergy4)，佛蒙特州威努斯基市的博特克公司(Biotek,Winooski,VT))。在此检验中，吸光度与样品中存在的DNA结合转录因子的数量成正比。实验按一式四份进行。结果表示为平均吸光度值加SEM。P值通过双尾T测验获得。
免疫荧光显微术。MDA-MB-468细胞用100ng/ml IFNγ处理30分钟，接着加入本发明的化合物，又保持30分钟。细胞在室温下在三聚甲醛(4％)中固定15分钟，接着用1×TBS(3-5分钟)洗涤。接着细胞用含0.1％硼氢化钠的1×TBS淬灭5分钟，如先前所述冲洗，接着在室温下与含有5.5％正常小牛血清和0.1％曲拉通X-100(Triton X-100)的阻断溶液一起培育以减少非特异性结合。接着细胞与初级抗体(抗磷酸化 STAT1(Y701)；赛信通公司)一起在室温下培育1小时，接着冲洗，并再与FITC标记的山羊抗兔二级抗体(加利福尼亚州卡玛利洛市的英杰公司(Invitrogen,Camarillo, CA))一起培育。载玻片在具有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的维克德封片剂 (Vectashield)中封片以进行核染色(加利福尼亚州伯林盖姆市的维克实验室公司 (Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA))。荧光用蔡司阿西福特200M倒置显微镜，使用DAPI和异硫氰酸荧光素(FITC)滤光片组和40x的物镜设置监测。
细胞侵袭检验。使用博伊登小室基质胶侵袭检验(Boyden chamber Matrigelinvasion assay)检查MDA-MB-231细胞的侵袭能力。MDA-MB-231细胞以5×105个细胞/孔涂在6孔盘(新泽西州富兰克林湖的贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ))中，用DMSO和YK5(1μM)预处理24小时。通过锥虫蓝排除法估计细胞活力。概括地说，细胞用锥虫蓝染色并用血球计手工计数。活细胞(排除锥虫蓝的细胞)用无血清DMEM洗涤三次并再悬浮于0.3ml无血清DMEM中。将相等数目的活细胞(2× 105个)加入博伊登小室的上部隔室中并且将含有含10％FBS的DMEM的处理培养基加入下部隔室中。博伊登小室含有8μmPET径迹蚀刻膜，其涂有基质胶曲斯维尔 (transwell)(加利福尼亚州圣胡塞市的BD生物科技公司)。细胞在37℃下培育20 小时后，固定侵入膜下侧的细胞，固定在100％甲醇中2分钟，在0.5％结晶紫中染色2 分钟，在水中冲洗，并在明视场显微镜下检查。在×100物镜下对每个膜10个场中的细胞计数。
卡斯蛋白酶3/7活化细胞凋亡检验。将细胞涂在黑色96孔盘(康宁公司3603)上，除了具有50μl培养基的背景柱(无细胞)，并留在恒温箱(37℃，5％CO2)中以允许细胞附着和平衡。加入50μl培养基中所指示浓度范围的化合物，保持所指示的时间。将含有Z-DEVD-R110(分子探针公司(Molecular Probes)R22120)的100μL检验缓冲液(10mM HEPES(pH.7.5)、2mM EDTA、0.1％CHAPS、0.1mg/ml PMSF、完全蛋白酶抑制剂混合物(CompleteProtease Inhibitor Mix)(罗氏公司(Roche)1 697 498)) 加入每个孔中。培育后，用安利(Analyst)(在485下发射，在530下激发)读取荧光强度。
化学沉淀和蛋白质组研究。使用20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、0.1％NP-40溶解缓冲液制备蛋白质溶解产物。抗生蛋白链菌素琼脂糖(赛默科技公司)用溶解缓冲液洗涤3次，加入YK55(100μM)并在4℃下培育复合物1小时。用缓冲液洗涤3次后，将珠粒加入含500μg细胞蛋白质的缓冲液中。样品在4℃下培育过夜，用溶解缓冲液洗涤5次并施加于SDS-PAGE。根据制造商的说明，用斯奎银染色试剂盒(SilverQuest Silver Staining kit)(英杰公司)对凝胶染色。切下蛋白质谱带，并在用水洗涤后，将凝胶切片切成1mm3的小片，在56℃下用10mM DTT在100mM NH4HCO3中还原30分钟，在室温下在黑暗中用55mM碘乙酰胺溶液在100mM NH4HCO3中烷基化20分钟，接着在37℃下用胰蛋白酶(13ng/μl)消化过夜。肽用100-200μl 66.6％乙腈/5％甲酸提取，并在MS分析前在斯伐离心浓缩仪(SpeedVac)中将合并的肽提取物的体积减少到约10 μl。在威尔康奈尔医学院(Weill Cornell Medical College，WCMC)的蛋白质组研究实验室，使用耦接到XCT plus离子阱质谱计(加利福尼亚州帕洛阿尔托市的安捷伦技术公司(Agilent Technologies,Palo Alto,CA))的1100系列LC，进行液相色谱-串联质谱分析(LC-MS/MS)。此系统装有安捷伦芯片立方(Chip Cube)界面以及整合C18富集柱、C18解析柱和毫微喷雾发射器(nanospray emitter)的硅晶片“芯片-柱”。凝胶内 (In-gel)蛋白消化物以4μL/min的流动速率装载在富集柱上并脱盐，接着在40mm× 75μM ZORBAX 300 C18柱(安捷伦公司)上以0.35μL/min的流动速率解析。LC梯度为3到45％溶剂B，持续25分钟，接着45到90％溶剂B，持续5分钟。流动相溶剂A 为含0.1％甲酸的3％ACN，且溶剂B为含0.1％甲酸的90％ACN。在来自前体MS扫描的4个最强烈离子上用自动数据相关的MS/MS以阳离子模式获得质谱。使用斯派米尔 (SPECTRUM MILL)软件(安捷伦公司)处理LC-MS/MS原始数据并搜索蛋白质数据库以鉴别蛋白质。
化学沉淀和MS分析：1：毫微-LC-MS/MS。K562细胞用100μM YK55或D-生物素处理4小时。收集细胞并溶解于20mM Tris pH 7.4、25mM NaCl、0.1％NP-40缓冲液中。含经YK55处理的细胞提取物(500μg)的100μl溶解缓冲液与抗生蛋白链菌素琼脂糖珠粒一起在4℃下培育1小时。经D-生物素处理的细胞提取物(500μg)在4℃下与附着在蛋白G琼脂糖珠粒(30μl)(阿普代特公司)上的BB70抗体(4μl)一起培育1小时。珠粒用高盐缓冲液(1M NaCl)洗涤，蛋白质通过在2％SDS中煮沸洗脱，在变性凝胶上分离并根据制造商的程序(伯乐公司(Biorad))进行库马斯染色。经凝胶从经YK55-药物处理和BB70下拉物解析的蛋白质用胰蛋白酶消化，如所述(10)，使用β-巯基乙醇和丙烯酰胺将含有半胱氨酸的肽还原并烷基化。凝胶内胰蛋白酶消化物在2μl床体积的普罗斯(Poros)50R2(应用生命系统公司(AppliedBiosystems)-“AB”) 逆相珠粒上进行微清除程序，填充在艾本德(Eppendorf)凝胶上样头中，并用0.1％甲酸稀释洗脱液。使用装有毫微喷雾离子源的奥毕曲(OrbiTrap)(赛默科技公司LTQ XL 线性离子阱)质谱仪分析成批纯化的池。使用艾斯吉(Eksigent)毫微MDLC系统(艾斯吉技术公司(Eksigent Technologies,Inc))，以20μL/min的流动速率将肽混合物(20mL)装载到捕获保护柱(trapping guard column)(来自LC帕克公司(LC Packings) 的0.3×5mm普玛(PepMap)C18 100滤筒)上。洗涤后，液流逆向流过保护柱，并且以5-45％MeCN梯度(0.1％FA中)以200nL/min的流动速率经85分钟洗脱的肽装载到75μm×15cm熔融二氧化硅毛细管普玛C18柱(LC帕克公司)上并经此柱；洗脱液导向75微米(具有10微米孔)熔融二氧化硅毫微电喷雾针(钮奥本公司(New Objective))。电喷雾电离(ESI)的喷针电压设定在约1800V。质量分析器以数据相关的自动MS/MS截获模式操作；碰撞能量根据针对MS/MS选择的前体离子的m/z值自动调整。使用玛斯柯特搜索引擎(Mascot search engine)(玛曲克斯科技公司(Matrix Science)，2.2.04版；www.matrixscience.com)和NCBI(国家卫生研究所的国家医学图书馆(National Library of Medicine,NIH))和IPI(英国黑星顿市欧洲生物信息学中心的国际蛋白质索引(International Protein Index,EBI,Hinxton,UK)数据库，由 LC-MS/MS数据进行初始蛋白质鉴别。允许两个遗漏的胰蛋白酶裂解位点，前体离子质量公差＝10ppm，碎片离子质量公差＝0.8Da，允许Met-氧化物、Cys-丙烯酰胺和N端乙酰化的蛋白质修饰。通常应用慕皮评分(MudPit scoring)，且激活“需要红色粗体”并使用显著性阈值评分p<0.01。所有鉴别的蛋白质的独特肽数(或“光谱数(spectral count)”)和序列覆盖百分比输出到Excel以进行进一步分析。
MALDI-reTOF-MS/MS：从凝胶内消化物获得的肽池通过基质辅助激光解吸/电离反射飞行时间(MALDI-reTOF)MS，使用布鲁克昂福(BRUKER UltraFlex)TOF/TOF 仪器(德国不来梅市的布鲁克道尔顿公司(Bruker Daltonics；Bremen,Germany))分析。获取所选的实验质量(m/z)，利用玛针对Windows的2.2.04版的斯柯特肽质量指纹 (Mascot Peptide MassFingerprint，PMF)程序(www.matrixscience.com)，搜索无冗余蛋白质数据库(“NR”；约223,695个条目；马里兰州贝塞斯达市的美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information；Bethesda,MD))的人类区段，其中质量精度限制优于35ppm，并且每个肽允许最多两个遗漏裂解位点。此用以证实蛋白质的身份并找出经修饰(半胱氨酸丙烯酰胺衍生化)肽的胰蛋白酶肽图之间的差异。差别峰m/z值与鉴别的蛋白质相配，允许存在820.34道尔顿(Dalton)(加上YK55-药物)和594.26道尔顿(加上无生物素基团的YK55-药物)的药物衍生化基团。为证实具有与实验值相配的经计算单一同位素片段的观测肽，通过在相同制备的样品上，使用昂福仪器，以“LIFT”模式进行MALDI-TOF/TOF(MS/MS)分析，对所选肽进行质谱测序。获取碎片离子光谱，使用玛斯柯特MS/MS离子搜索程序(玛曲克斯科技公司)和在http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/FragIonServlet.html可获得的在线蛋白质组研究工具箱搜索NR。结果通过手动证实。由此获得的任何暂定结果通过比较所预测胰蛋白酶肽由计算机产生的碎片离子系列与实验MS/MS数据来验证。
肿瘤异种移植物。从塔可尼克(Taconic)(法姆公司(Farms INC))获得4到6 周龄的nu/nu无胸腺雌性小鼠。实验根据机构动物管理与使用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)批准的方案进行，并遵循在研究中动物的适当和人道使用的机构准则。使用20号规格的针将MDA-MB-468(1×107个细胞)皮下移植到小鼠右侧腹部中并使其生长。投予前，在无菌水中调配YK5·HCl溶液。隔日向小鼠肿瘤内(i.t.) 注射20μl YK5溶液。针对肿瘤体积，估计所注射YK5的浓度，并在整个实验期内保持在10μM。在治疗进行的同时，所有小鼠都接收其饮用水中的沃格孟汀(Augmentin) (阿莫西林(Amoxicillin)/棒酸钾(Clavulanate potassium)；史克必成公司(SmithKline Beecham))。小鼠通过CO2安乐死处死。隔日对带有体积达100-150mm3的MDA-MB-468 肿瘤的小鼠(n＝5)进行肿瘤内(i.t.)治疗。肿瘤体积通过用游标测径规(Vernier caliper) 测量来确定，并且肿瘤体积以其长度×宽度2×0.4的乘积计算。所指示日的肿瘤体积表示为所指示的小鼠组的中值肿瘤体积±标准偏差。在研究最后1天，经药物处理的小鼠与经媒剂处理的小鼠相比，测量肿瘤生长抑制百分比(％)值，并以100×{1-[(经处理最后1天-经处理第1天)/(对照最后1天-对照第1天)]}计算。
统计学。如在格瑞帕德普瑞姆(GraphPad Prism)(第4版；格瑞帕德软件(GraphPadSoftware))中所执行，通过未配对的双尾t测验，分析W数据。认为P值小于0.05为显著的。除非另作说明，否则呈现的数据为双重或三重复实验数据的平均值±标准偏差。误差棒表示平均值的标准偏差。如果呈现单个图，那么数据代表2个独立实验。
实例13：患者的治疗
患者患有乳癌。向此患者投予包含医药学有效量的化合物YK5或本发明的相关化合物的医药组合物。预期患者的乳癌将从乳癌好转或恢复，和/或乳癌的增殖将减缓和/ 或得到抑制。
实例14：患者的治疗
患者患有白血病。向此患者投予包含医药学有效量的本发明化合物的医药组合物。预期患者的白血病将从白血病好转或恢复，和/或白血病的增殖将减缓和/或得到抑制。
应了解，为清楚起见描述于个别实施例上下文中的目前所述本发明的某些特征也可以组合提供于单一实施例中。反之，为简要起见描述于单一实施例上下文中的目前所述本发明的各种特征也可以单独或以任何适合子组合形式提供。
由此描述的本发明显然可以许多方式进行修改或变化。认为这些修改和变化并不偏离本发明的精神和范围，并且所有这些修改和变化都打算包括在上述本发明的范围内。
序列表
<110> 纪念斯隆-凯特琳癌症中心
<120> 热休克蛋白结合化合物、组合物以及其制备和使用方法
<130> 30002-PCT
<150> 61/272,101
<151> 2009-08-17
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 641
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Lys Ala Ala Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser
1 5 10 15
Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp
20 25 30
Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu
35 40 45
Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Leu Asn Pro Gln
50 55 60
Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Gly Asp
65 70 75 80
Pro Val Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Gln Val Ile Asn
85 90 95
Asp Gly Asp Lys Pro Lys Val Gln Val Ser Tyr Lys Gly Glu Thr Lys
100 105 110
Ala Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys
115 120 125
Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Tyr Pro Val Thr Asn Ala Val Ile
130 135 140
Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp
145 150 155 160
Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro
165 170 175
Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Arg Thr Gly Lys Gly Glu
180 185 190
Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser
195 200 205
Ile Leu Thr Ile Asp Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr Ala Gly
210 215 220
Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val Asn His
225 230 235 240
Phe Val Glu Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser Gln Asn
245 250 255
Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg
260 265 270
Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Ile Asp Ser Leu Phe
275 280 285
Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu
290 295 300
Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg Ser Thr Leu Glu Pro Val Glu Lys Ala
305 310 315 320
Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Ala Gln Ile His Asp Leu Val Leu
325 330 335
Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Lys Leu Leu Gln Asp
340 345 350
Phe Phe Asn Gly Arg Asp Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala
355 360 365
Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Met Gly Asp Lys
370 375 380
Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Ala Pro Leu Ser
385 390 395 400
Leu Gly Leu Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Ala Leu Ile Lys Arg
405 410 415
Asn Ser Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Ile Phe Thr Thr Tyr Ser
420 425 430
Asp Asn Gln Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Ala
435 440 445
Met Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu Leu Ser Gly Ile
450 455 460
Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile
465 470 475 480
Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Thr Asp Lys Ser Thr Gly
485 490 495
Lys Ala Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys
500 505 510
Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Ala Glu
515 520 525
Asp Glu Val Gln Arg Glu Arg Val Ser Ala Lys Asn Ala Leu Glu Ser
530 535 540
Tyr Ala Phe Asn Met Lys Ser Ala Val Glu Asp Glu Gly Leu Lys Gly
545 550 555 560
Lys Ile Ser Glu Ala Asp Lys Lys Lys Val Leu Asp Lys Cys Gln Glu
565 570 575
Val Ile Ser Trp Leu Asp Ala Asn Thr Leu Ala Glu Lys Asp Glu Phe
580 585 590
Glu His Lys Arg Lys Glu Leu Glu Gln Val Cys Asn Pro Ile Ile Ser
595 600 605
Gly Leu Tyr Gln Gly Ala Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Phe Gly Ala
610 615 620
Gln Gly Pro Lys Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val
625 630 635 640
Asp
<210> 2
<211> 382
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Lys Ala Ala Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser
1 5 10 15
Cys Ile Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp
20 25 30
Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Thr Glu
35 40 45
Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Leu Asn Pro Gln
50 55 60
Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Gly Asp
65 70 75 80
Pro Val Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Gln Val Ile Asn
85 90 95
Asp Gly Asp Lys Pro Lys Val Gln Val Ser Tyr Lys Gly Glu Thr Lys
100 105 110
Ala Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys
115 120 125
Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Tyr Pro Val Thr Asn Ala Val Ile
130 135 140
Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp
145 150 155 160
Ala Gly Val Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro
165 170 175
Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Arg Thr Gly Lys Gly Glu
180 185 190
Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser
195 200 205
Ile Leu Thr Ile Asp Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr Ala Gly
210 215 220
Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val Asn His
225 230 235 240
Phe Val Glu Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser Gln Asn
245 250 255
Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg
260 265 270
Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Ile Asp Ser Leu Phe
275 280 285
Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu
290 295 300
Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg Ser Thr Leu Glu Pro Val Glu Lys Ala
305 310 315 320
Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Ala Gln Ile His Asp Leu Val Leu
325 330 335
Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Lys Leu Leu Gln Asp
340 345 350
Phe Phe Asn Gly Arg Asp Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala
355 360 365
Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Met Gly
370 375 380
<210> 3
<211> 605
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 3
Met Gly Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val
1 5 10 15
Ala Ile Met Asp Gly Thr Thr Pro Arg Val Leu Glu Asn Ala Glu Gly
20 25 30
Asp Arg Thr Thr Pro Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Gln Asp Gly Glu Thr
35 40 45
Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Gln Asn
50 55 60
Thr Leu Phe Ala Ile Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Gln Asp Glu
65 70 75 80
Glu Val Gln Arg Asp Val Ser Ile Met Pro Phe Lys Ile Ile Ala Ala
85 90 95
Asp Asn Gly Asp Ala Trp Val Glu Val Lys Gly Gln Lys Met Ala Pro
100 105 110
Pro Gln Ile Ser Ala Glu Val Leu Lys Lys Met Lys Lys Thr Ala Glu
115 120 125
Asp Tyr Leu Gly Glu Pro Val Thr Glu Ala Val Ile Thr Val Pro Ala
130 135 140
Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Arg Ile
145 150 155 160
Ala Gly Leu Glu Val Lys Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala
165 170 175
Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Arg Thr Ile Ala Val
180 185 190
Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Ser Ile Ile Glu Ile Asp
195 200 205
Glu Val Asp Gly Glu Lys Thr Phe Glu Val Leu Ala Thr Asn Gly Asp
210 215 220
Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Ser Arg Leu Ile Asn Tyr Leu
225 230 235 240
Val Glu Glu Phe Lys Lys Asp Gln Gly Ile Asp Leu Arg Asn Asp Pro
245 250 255
Leu Ala Met Gln Arg Leu Lys Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu
260 265 270
Leu Ser Ser Ala Gln Gln Thr Asp Val Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Ala
275 280 285
Asp Ala Thr Gly Pro Lys His Met Asn Ile Lys Val Thr Arg Ala Lys
290 295 300
Leu Glu Ser Leu Val Glu Asp Leu Val Asn Arg Ser Ile Glu Pro Leu
305 310 315 320
Lys Val Ala Leu Gln Asp Ala Gly Leu Ser Val Ser Asp Ile Asp Asp
325 330 335
Val Ile Leu Val Gly Gly Gln Thr Arg Met Pro Met Val Gln Lys Lys
340 345 350
Val Ala Glu Phe Phe Gly Lys Glu Pro Arg Lys Asp Val Asn Pro Asp
355 360 365
Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Val Gln Gly Gly Val Leu Thr Gly
370 375 380
Asp Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly
385 390 395 400
Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Thr
405 410 415
Thr Ile Pro Thr Lys His Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Glu Asp Asn
420 425 430
Gln Ser Ala Val Thr Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Lys Arg Ala
435 440 445
Ala Asp Asn Lys Ser Leu Gly Gln Phe Asn Leu Asp Gly Ile Asn Pro
450 455 460
Ala Pro Arg Gly Met Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala
465 470 475 480
Asp Gly Ile Leu His Val Ser Ala Lys Asp Lys Asn Ser Gly Lys Glu
485 490 495
Gln Lys Ile Thr Ile Lys Ala Ser Ser Gly Leu Asn Glu Asp Glu Ile
500 505 510
Gln Lys Met Val Arg Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp Arg Lys
515 520 525
Phe Asp Glu Leu Val Gln Thr Arg Asn Gln Gly Asp His Leu Leu His
530 535 540
Ser Thr Arg Lys Gln Val Glu Glu Ala Gly Asp Lys Leu Pro Ala Asp
545 550 555 560
Asp Lys Thr Ala Ile Glu Ser Ala Leu Thr Ala Leu Glu Thr Ala Leu
565 570 575
Lys Gly Glu Asp Lys Ala Ala Ile Glu Ala Lys Met Gln Glu Leu Ala
580 585 590
Gln Val Ser Gln Lys Leu Met Glu Ile Ala Gln Gln Gln
595 600 605
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 秀丽隐杆线虫
<400> 4
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gly Leu Glu Ser Tyr Ala Phe Asn Leu Lys Gln
20 25 30
Thr Ile Glu Asp Glu Lys Leu Lys Asp Lys Ile Ser Pro Glu Asp Lys
35 40 45
Lys Lys Ile Glu Asp Lys Cys Asp Glu Ile Leu Lys Trp Leu Asp Ser
50 55 60
Asn Gln Thr Ala Glu Lys Glu Glu Phe Glu His Gln Gln Lys Asp Leu
65 70 75 80
Glu Gly Leu Ala Asn Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gln Ser Ala Gly
85 90 95
Gly Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly
100 105 110
Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val Asp
115 120
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Arg Phe His Asp Leu Leu Ser Gln Leu Asp Asp Gln Tyr Ser Arg Phe
1 5 10 15
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Arg Phe Asn Gln Ala Gln Ser Gly Asn Ile Gln Ser Thr Val Met Leu
1 5 10 15
Asp Lys Gln
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Arg Phe Asn Gln Ala Gln Ser Gly Asn Ile Gln Ser Thr Val Met Leu
1 5 10 15
Asp Lys Gln
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Arg Gly Leu Asn Val Asp Gln Leu Asn Met Leu Gly Glu Lys Leu
1 5 10 15
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Lys Leu Leu Gly Pro Asn Ala Ser Pro Asp Gly Leu Ile Pro Trp Thr
1 5 10 15
Arg Phe
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Lys Ser Leu Glu Asp Leu Gln Asp Glu Tyr Asp Phe Lys Cys
1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Lys Thr Glu Leu Ile Ser Val Ser Glu Val His Pro Ser Arg Leu
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Lys Val Met Ala Ala Glu Asn Ile Pro Glu Asn Pro Leu Lys Tyr
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种式2a化合物:
或其立体异构体、互变异构体或医药学上可接受的盐，其中：
X5到X9独立选自：CH、经W3或W4取代的C、和N；
Y是S、SO、SO2、CH2、CHR、CRR或CO，其中R是C1-C6烷基或烷氧基链；
Z选自由以下组成的群组：烯基、炔基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、硝基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；
W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、不饱和杂环、卤素、硝基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；且
W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基和烷基-CN；且
其中所述化合物在针对AML香澄-1(Kasumi-1)细胞中生长抑制的测试中或在针对乳癌SKBr3细胞中生长抑制的测试中或在两者中的IC50值小于100μM。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中：
Y是S、SO或SO2；
Z为烯基、炔基、饱和或不饱和环烷基、饱和或不饱和杂环、卤素、羟基、烷氧基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基；
W1和W2独立为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基或二芳基氨基；且
W3和W4独立为氢、卤素、羟基、氰基、芳氧基、烷氧基、卤代烷氧基、烯氧基、羟基烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、氨甲酰基、取代和未取代的酰胺基、烷基酰胺基、烷基磺酰胺基、磺酰胺基、-NHSO2烯基、-NHCO烯基、-NHCO炔基、-CO烯基、-CO炔基、三卤代烃、硫烷基、SO2-烷基、-COO-烷基、-CO烷基或烷基-CN。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中：
X5到X9选自：
Y是S；
Z选自由饱和杂环、卤素、烷氧基和二烷基氨基组成的群组；
W1和W2在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、烷基、芳基和烷氧基；且
W3和W4在每次出现时独立选自由以下组成的群组：氢、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰基氨基和-NHCO烯基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中当W1或W2为烷氧基时，所述烷氧基是取代的烷氧基。
5.一种式2a”化合物
或其立体异构体、互变异构体或医药学上可接受的盐，其中：
R1各自独立选自由以下组成的群组：H；任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；卤基；任选取代的C2-22酰基；-C(O)R6基团和-(乙氧基)n-R6基团，其中n是1-12；
R2、R3、R4和R5各自独立选自由以下组成的群组：H；任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；任选取代的C2-22酰基；-C(O)R6基团；和任选取代的烷氧基羰基；且
X选自由以下组成的群组：任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环(例如4-烷基哌嗪)、芳基或杂芳基；卤基；任选取代的C2-22酰基；-NR4R5；-C(O)R6基团；-(乙氧基)n-R6基团，其中n是1-12；任选取代的烷氧基羰基；任选取代的烷氧基；任选取代的氨基；硝基和羧基；且
R6各自独立选自由以下组成的群组：任选取代的直链或分支烷基、烯基或炔基；任选取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基；任选取代的烷氧基；和丙烯酸烷基酯基；
条件是X不包含桥环结构；
其中所述化合物在针对AML香澄-1(Kasumi-1)细胞中生长抑制的测试中或在针对乳癌SKBr3细胞中生长抑制的测试中或在两者中的IC50值小于100μM。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中：
R1各自独立选自甲基和乙基；
R2、R3和R4各自是H；
R5是-C(O)-甲基、-C(O)-乙基或-C(O)-乙烯基；
X是哌嗪、4-甲基哌嗪-1-基或4-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基。
7.一种化合物，其选自由表1的化合物或其立体异构体、互变异构体或医药学上可接受的盐组成的群组，
其中所述化合物在针对AML香澄-1(Kasumi-1)细胞中生长抑制的测试中或在针对乳癌SKBr3细胞中生长抑制的测试中或在两者中的IC50值小于100μM。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中所述化合物是N-(6-氨基-2-(4,6-二甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-5-基硫基)嘧啶-4-基)丙烯酰胺或医药学上可接受的盐。
9.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到8中任一权利要求所述的化合物和医药学上可接受的赋形剂。
10.一种根据权利要求1到8中任一权利要求所述的化合物在制备用于治疗动物的癌症或增生性病症的药剂的用途；条件是所述化合物在针对AML香澄-1(Kasumi-1)细胞中生长抑制的测试中或在针对乳癌SKBr3细胞中生长抑制的测试中或在两者中的IC50值小于100μM。
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