CN108350062A - 靶向蛋白降解以减弱过继性t细胞疗法相关的不良炎症反应 - Google Patents

靶向蛋白降解以减弱过继性t细胞疗法相关的不良炎症反应 Download PDF

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Abstract

本发明的领域为用于调节嵌合抗原受体免疫效应细胞，例如T细胞(CAR‑T)的组合物和方法、使用靶向蛋白降解调节相关的不良炎症反应(例如细胞因子释放综合征和肿瘤溶解综合征)的疗法。

Description

靶向蛋白降解以减弱过继性T细胞疗法相关的不良炎症反应
相关申请
本申请要求2015年8月6日提交的美国临时申请号62/202,076，2016年4月15日提交的美国临时申请号62/323,591和2016年4月15日提交的美国临时申请号62/323,575的权益。这些申请中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明在用于调节嵌合抗原受体免疫效应细胞例如T细胞(CAR-T)的改进的组合物和方法、使用靶向蛋白降解调节相关不良炎症反应(例如细胞因子释放综合征和肿瘤溶解综合征)的疗法的领域中。
通过引用并入
在2016年8月8日创建并且大小为256KB的名为"16010-003US1_SequenceListing_ST25.txt"的文本文件的内容全部通过引用并入本文。
背景技术
基因工程化免疫效应细胞的过继转移旨在快速地建立T细胞介导的肿瘤免疫。在这种方法中，患者自身的T细胞通过转基因编码的嵌合抗原受体(CAR)而被定向以与肿瘤细胞结合。当在T细胞中表达时，CAR以独立于抗原加工的机制有效地将T细胞特异性地和细胞毒性地重定向至肿瘤细胞。通过这种方法，CAR T细胞克服了免疫耐受性的问题和对抗原的主要组织相容性复合体(MHC)呈递的需求。CAR是合成的、工程化的受体，其含有编码与细胞内T细胞信号传导序列相连的基于抗体的识别结构域的序列。第一代CAR包含连接至细胞内CD3ζ信号传导模块的、衍生自抗体且针对肿瘤靶向抗原的细胞外单链可变片段(scFv)。第二和第三代CAR已经发展到现在包含多个共刺激结构域，其包括但不限于4-1BB和CD28。
早期临床试验的结果已经确定了CAR-T疗法在多种癌症中的治疗效果，其包括淋巴瘤(Till等,“CD20-specific adoptive immunotherapy for lymphoma using achimeric antigen receptor with both CD28and 4-1 BB domains:pilot clinicaltrial results.”Blood 119(2012):3940-3950)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)(Porter等,“Chimeric antigen receptor modified T-cells in chronic lymphoid leukemia.”NEJM 365(2011):725-733)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)(Grupp等,“Chimeric antigenreceptor modified T-cells for acute lymphoid leukemia.”NEJM 368(2013):1509-1518)和神经母细胞瘤(Louis等,“Antitumor activity and long-term date ofchimeric antigen receptor-positive T-cells in patients with neuroblastoma.”Blood 118(2011):6050-6056)等。
在2014年11月，FDA授予Juno Therapeutic Inc.的JCAR015孤儿药地位。KitePharma Inc.针对难治性侵袭性非霍奇金淋巴瘤的KTE-C19最近也获得了FDA和欧洲药品管理局两者的认定。宾夕法尼亚大学/诺华针对ALL的CTL019也收到了突破性地位。
最近，已经提出了包含靶向实体瘤例如黑色素瘤和胃肠肿瘤的γδ受体的CAR-T细胞。Mirzaei等,“Prospects for chimeric antigen receptor(CAR)γδT cells:Apotential game changer for adoptive T cell cancer immunotherapy,”CancerLetters 380(2016):413-423。
CAR T细胞疗法然而并非没有显著的副作用。虽然CAR-T的大多数不良事件是可容忍的和可接受的，但在许多情况下，CAR T细胞的施用已经导致严重的全身炎症反应，其包括细胞因子释放综合征和肿瘤溶解综合征(Xu等,“Efficacy and safety of adoptiveimmunotherapy using anti-CD19chimeric antigen receptor transduced T-cells:asystemic review of phase I clinical trials.”Leukemia Lymphoma 54(2013):255-260；Minagawa等,“Seatbelts in CAR therapy:how safe are CARS？”Pharmaceuticals 8(2015):230-249)。例如，在2010年，两起死亡被归因于在临床环境中施用CAR T细胞后细胞因子释放综合征的发生(Brentjens等,“Treatment of chronic lymphocytic leukemiawith genetically targeted autologous T-cells:case report of an unforeseenadverse event in a phase I clinical trial.”Mol.Ther.18(2010):666-668；Morgan等,“Case report of a serious adverse event following the administration of T-cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2.”Mol.Ther.18(2010):843-851)。
细胞因子释放综合征(CRS)是临床表现为发热、恶心、头痛、心动过速、低血压、缺氧以及心脏和/或神经学表现的炎症反应。严重的细胞因子释放综合征被描述为细胞因子风暴，并且可以是致命的。据信CRS是多种细胞类型例如单核细胞和巨噬细胞、T细胞和B细胞的持续激活的结果，并且通常特征为在刺激暴露的1至2小时内TNFα和IFNγ水平增加，接着白细胞介素(IL)-6和IL-10增加，并且在一些情况下IL-2和IL-8增加(Doessegger等,“Clinical development methodology for infusion-related reactions withmonoclonal antibodies.”Nat.Clin.Transl.Immuno.4(2015):e39)。
肿瘤溶解综合征(TLS)是由化学疗法突然杀死肿瘤细胞，随后释放细胞内容物，大量钾、磷酸盐和核酸释放到体循环中而引起的代谢综合征。核酸分解代谢成尿酸导致高尿酸血症；尿酸分泌的显著增加可以导致尿酸在肾小管中的沉淀和肾血管收缩、自身调节受损、肾血流减少、氧化、和炎症，导致急性肾损伤。磷酸钙沉积在肾小管中的高磷酸盐血症也可引起急性肾损伤。尿酸和磷酸盐两者的高浓度增加了急性肾损伤的风险，因为尿酸在磷酸钙存在下更容易沉淀，反之亦然，导致高钾血症、高磷血症、低钙血症、remia和急性肾衰竭。它通常发生在具有庞大的、迅速增殖的、治疗反应性的肿瘤的患者中(Wintrobe MM等,“Complications of hematopoietic neoplasms.”Wintrobe's Clinical Hematology,11th ed.Philadelphia,Pa:Lippincott Williams&Wilkins；Vol II(2003):1919-1944)。
CAR T细胞疗法的显著临床活性使得对实施额外的"安全性"策略以快速地逆转或中止正在经历CRS或相关不良事件的患者中的T细胞应答的需要是有必要的。包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的共表达的代谢方法在用更昔洛韦治疗时诱导CAR T细胞的凋亡。该方法受限于应答的延迟的动力学和对HSV的免疫原性反应的可能性。已经开发了细胞凋亡促进策略，其中药物结合结构域与凋亡机制的组分在框架中一起表达，包括Caspase 9和FAS。该系统允许在施用二聚化的小分子诱导剂后细胞凋亡的有条件激活。效果是快速的、非免疫原性的，并且使被转导的细胞的装载量减少90％。目前这两种方法正在临床试验中进行评估。虽然"自杀"基因的表达提供了逆转不希望的毒性的机制，但这两种方法都被认为是不可逆的，实际上限制了对患者的任何进一步的治疗益处。
用于控制CAR T细胞激活的其他策略包括从抗原识别结构域分离双共刺激结构域，其中CAR T细胞的刺激受小分子药物rimiducid控制。这些T细胞，也被称为GoCAR-T，只有当它们暴露于癌细胞和药物两者时才可以被完全激活。此外，引入双特异性CAR的策略，其包括可导致抑制或放大信号的在CAR T细胞上的第二结合结构域，允许降低脱靶效应，其中一种靶蛋白的存在导致CAR T细胞的激活，而第二种蛋白质的存在导致抑制。
Juno Therapeutics Inc.的WO2016/115177，题为“Modified Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Elements”，描述了在施用的蛋白质中包含转录后调节元件(PRE)以通过促进蛋白质的天然泛素化和缩短的半衰期而加速降解，包括例如嵌合抗原受体。然而，所采用的策略是不可调节的。
本发明的目的是提供有效的可逆的治疗，其可以调节CAR T细胞的活性并减少不良炎症反应
发明内容
提供了用于通过在合成嵌合抗原受体(CAR)构建体内引入异型双功能化合物靶向蛋白、蛋白质结构域或多肽序列(“异型双功能化合物靶向结构域”或“dTAG”)而介导CAR免疫效应细胞刺激例如T细胞刺激的组合物、工程化细胞例如免疫或免疫刺激细胞，和方法，其允许使用异型双功能化合物(即，通过其泛素连接酶结合部分与泛素连接酶结合并且还通过体内dTAG靶向配体与含有dTAG的CAR结合的异型双功能化合物，如下文更详细定义的)进行可逆的靶向蛋白质降解。与引入用于快速诱导例如CAR T细胞的细胞死亡的自杀基因策略的方式相比，使用异型双功能化合物在CAR T细胞内靶向CAR泛素化和降解允许CAR表达和继而T细胞应答的可逆控制，同时使CAR T细胞本身不受伤害。dTAG可用作CAR表达和因此CART细胞刺激的变阻器，提供通过施用异型双功能化合物调节CAR表达和CAR T细胞应答程度的能力，以及在清除异型双功能化合物后CAR的再生。此外，通过将异型双功能化合物靶向蛋白引入CAR构建体中，与当前CAR T细胞疗法例如包括CRS的炎症反应和诸如TIL的代谢反应相关的不良副作用，可以通过施用控制CAR表达的异型双功能化合物控制，同时允许CAR T细胞保留其在CAR的再表达和异型双功能化合物的清除后再激活的能力。
因此，在一个实施方式中，提供了方法，其包括以下步骤：
(i)从患有病变细胞的病症的患者移出免疫效应细胞，例如T细胞，所述病变细胞的病症可以通过增加患者T细胞识别和结合病变细胞的能力而治疗；
(ii)通过插入编码具有靶向病变细胞表面抗原的至少序列的CAR和可以被异型双功能化合物识别并结合至dTAG靶向配体的氨基酸序列而离体转化T细胞以形成CAR T细胞；
(iii)向患者施用自体CAR T细胞；和然后
(iv)根据需要向患者施用异型双功能化合物，其以使dTAG(和因此CAR)接近泛素连接酶的方式，连接至a)dTAG和b)泛素连接酶，使得CAR或其一部分被泛素化，然后被蛋白酶体降解。
通过降解CAR的至少一部分细胞质信号传导结构域，CAR激活免疫效应细胞例如CAR T细胞的能力被减弱。如本文所预期的，发生CAR的充分降解，其中CAR的信号传导功能被破坏。
如本文所预期的，可由用于过继性细胞疗法的工程化细胞表达的本发明的合成CAR包含细胞外配体结合结构域、跨膜结构域、和具有至少一个细胞内信号传导结构域和能够被异型双功能化合物的dTAG靶向配体靶向和结合的dTAG的细胞质结构域，其中异型双功能化合物与dTAG的结合导致CAR通过泛素化和泛素介导降解的降解。
CAR的dTAG是异型双功能化合物可以通过其dTAG靶向配体与之结合的任何氨基酸序列，其导致泛素化和然后CAR的蛋白酶体降解。优选地，dTAG不应该干扰CAR的功能。在一个实施方式中，dTAG是非内源肽，其导致异型双功能化合物选择性和允许在施用异型双功能化合物时避免脱靶效应。在一个实施方式中，dTAG是衍生自内源蛋白质的氨基酸序列，其已经被修饰使得异型双功能化合物仅结合至修饰的氨基酸序列而不结合内源表达的蛋白质。
在一个特定的实施方式中，用于本发明的dTAG包括但不限于衍生自内源表达蛋白例如FK506结合蛋白-12(FKBP12)、含溴结构域蛋白4(BRD4)、CREB结合蛋白(CREBBP)或转录激活因子BRG1(SMARCA4)的氨基酸序列。在其他实施方式中，用于本发明的dTAG可以包括例如激素受体例如雌激素受体蛋白、雄激素受体蛋白、类视色素X受体(RXR)蛋白或二氢叶酸还原酶(DHFR)，其包括细菌DHFR。在其他实施方式中，dTAG可以包括例如衍生自细菌脱卤素酶的氨基酸序列。在其他实施方式中，dTAG可以包括衍生自7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤三磷酸酶、AFAD、花生四烯酸酯5-脂氧合酶激活蛋白、载脂蛋白、ASH1L、ATAD2、含杆状病毒IAP重复蛋白2、BAZ1A、BAZ1B、BAZ2A、BAZ2B、Bcl-2、Bcl-xL、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD5、BRD6、BRD7、BRD8、BRD9、BRD10、BRDT、BRPF1、BRPF3、BRWD3、CD209、CECR2、CREBBP、E3连接酶XIAP、EP300、FALZ、来自脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、GCN5L2、GTPase、k-RAS、HDAC6、造血前列腺素D合成酶、KIAA1240、乳糖谷胱甘肽裂解酶、LOC93349、Mcl-1、MLL、PA2GA、PB1、PCAF、肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1、PHIP、聚-ADP-核糖聚合酶14、聚-ADP-核糖聚合酶15、PRKCBP1、蛋白原(prosaposin)、前列腺素E合成酶、视网膜视杆视紫红质敏感性cGMP3','5-环磷酸二酯酶亚基δ、S100-A7、SMARCA2、SMARCA4、SP100、SP110、SP140、Src、Sumo缀合酶UBC9、超氧化物歧化酶、TAF1、TAF1L、端锚聚合酶(tankyrase)1、端锚聚合酶2、TIF1a、TRIM28、TRIM33、TRIM66、WDR9、ZMYND11或MLL4的氨基酸序列。在又一些实施方式中，dTAG可以包括例如衍生自MDM2的氨基酸序列。
在具体实施方式中，dTAG是衍生自BRD2、BRD3、BRD4或BTDT。在某些实施方式中，dTAG是修饰的或突变的BRD2、BRD3、BRD4或BTDT蛋白。在某些实施方式中，BRD2的一个或多个突变包括色氨酸(W)在氨基酸位置97处的突变，缬氨酸(V)在氨基酸位置103处的突变，亮氨酸(L)在氨基酸位置110处的突变，W在氨基酸位置370处的突变，V在氨基酸位置376处的突变，或L在氨基酸位置381处的突变。
在某些实施方式中，BRD3的一个或多个突变包括W在氨基酸位置57处的突变，V在氨基酸位置63处的突变，L在氨基酸位置70处的突变，W在氨基酸位置332处的突变，V在氨基酸位置338处的突变，或L在氨基酸位置345处的突变。在某些实施方式中，BRD4的一个或多个突变包括W在氨基酸位置81处的突变，V在氨基酸位置87处的突变，L在氨基酸位置94处的突变，W在氨基酸位置374处的突变，V在氨基酸位置380处的突变，或L在氨基酸位置387处的突变。在某些实施方式中，BRDT的一个或多个突变包括W在氨基酸位置50处的突变，V在氨基酸位置56处的突变，L在氨基酸位置63处的突变，W在氨基酸位置293处的突变，V在氨基酸位置299处的突变，或L在氨基酸位置306处的突变。
在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自细胞溶质信号传导蛋白FKBP12。在某些实施方式中，dTAG是修饰的或突变的细胞溶质信号传导蛋白FKBP12。在某些实施方式中，修饰的或突变的细胞溶质信号传导蛋白FKBP12含有产生用于FKBP12配体的扩大的结合口袋的一个或多个突变。在某些实施方式中，一个或多个突变包括在氨基酸位置36处苯丙氨酸(F)向缬氨酸(V)的突变(F36V)(在本文中可互换地称为FKBP12*或FKBP*)。
在一个实施方式中，dTAG是衍生自来自SEQ.ID.NO.:1-9或24-58中任一者的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:1的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:2的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:4的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:5的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:6的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:7的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:8的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:9的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:24的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:25的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:26的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:27的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:28的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:29的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:30的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:31的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:32的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:33的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:34的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:35的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:36的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:37的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:38的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:39的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:40的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:41的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:42的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:43的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:44的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:45的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:46的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:47的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:48的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:49的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:50的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:51的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:52的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:53的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:54的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:55的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:56的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:57的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:58的氨基酸序列或其片段。在一个特定的实施方式中，其片段指需要由异型双功能化合物结合的最小氨基酸序列。
在一个实施方式中，dTAG是衍生自本文所述的任何氨基酸序列或其片段，并且dTAG能够被相应的包含能够结合本文所述的dTAG的dTAG靶向配体的异型双功能化合物结合。在一个实施方式中，dTAG是能够被图33、图34、图35、图36、或图37所述的异型双功能化合物或本文所述的任何其他异型双功能化合物结合的氨基酸序列。在一个实施方式中，dTAG是能够被包含在表T中所述的dTAG靶向配体的异型双功能化合物结合的氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.No.1的氨基酸序列或其片段，并且dTAG能够被选自dFKBP-1-dFKBP-5中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.No.2的氨基酸序列或其片段，并且dTAG能够被选自dFKBP-6-dFKBP-13中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.No.3的氨基酸序列或其片段，并且dTAG能够被选自dBET1-dBET18中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.No.3的氨基酸序列或其片段，并且dTAG能够被选自dBromo1-dBromo34中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.No.9的氨基酸序列或其片段，并且dTAG能够被选自dHalo1-dHalo2中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自CREBBP，并且异型双功能化合物含有选自表T的CREBBP dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自SMARCA4、PB1或SMARCA2，并且异型双功能化合物含有选自表T的SMARCA4/PB1/SMARCA2dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自TRIM24或BRPF1，并且异型双功能化合物含有选自表T的TRIM24/BRPF1dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自糖皮质激素受体，并且异型双功能化合物含有选自表T的糖皮质激素受体dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自雌激素或雌激素受体，并且异型双功能化合物含有选自表T的雌激素/雌激素受体dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自DOT1L，并且异型双功能化合物含有选自表T的DOT1L dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自Ras，并且异型双功能化合物含有选自表T的Ras dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自RasG12C，并且异型双功能化合物含有选自表T的RasG12C dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自HER3，并且异型双功能化合物含有选自表T的HER3dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自Bcl-2或Bcl-XL，并且异型双功能化合物含有选自表T的Bcl-2/Bcl-XL dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自HDAC，并且异型双功能化合物含有选自表T的HDAC dTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自PPAR，并且异型双功能化合物含有选自表T的PPARdTAG靶向配体。在一个特定的实施方式中，dTAG衍生自DHFR，并且异型双功能化合物含有选自表T的DHFR dTAG靶向配体。
如本文所预期的，本发明的CAR包括能够结合靶向蛋白(通常为抗原，例如肿瘤抗原)的细胞外配体结合结构域。在一个实施方式中，细胞外配体结合结构域是抗原结合结构域，例如抗体或其抗原结合片段。在一个特定的实施方式中，抗原结合片段是Fab或scFv。在一个实施方式中，细胞外配体结合结构域是肿瘤标志物的配体，例如结合肿瘤细胞表面上表达的标志物的配体，例如IL13，其结合胶质瘤细胞上的IL13受体(IL13R)，或调蛋白，其结合乳腺癌细胞上的erbB2、B3和B4。在一个实施方式中，细胞外配体结合结构域靶向标记的或标签的蛋白或分子，例如生物素或异硫氰酸荧光素，其与靶向肿瘤表达蛋白的抗体结合。例如，细胞外配体结合结构域可以靶向肿瘤特异性抗体上的标记，例如生物素，使得当抗体标记结合至肿瘤细胞时，CAR T细胞的细胞外结合配体结合标记，激活T细胞并杀死肿瘤细胞。在这方面，可以产生能够结合任何标签的或标记的抗体的“通用CAR”。参见例如AbateDaga等,“CAR models:next generation CAR modifications for enhanced T-cellfunction,”Molecular Therapy-Oncolytics(2016)3:1-7。图2中描绘了这种策略的示例性图示
在一个实施方式中，CAR中的抗原结合结构域结合肿瘤抗原，例如，与血液恶性肿瘤或实体瘤相关的肿瘤抗原。能够被CAR T细胞靶向的肿瘤抗原是已知的，并且包括例如但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD40、CD70、CD123、ErbB2(HER2/neu)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)。双唾液酸神经节苷脂GD2、双唾液酸神经节苷脂GD3、mesothelian、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、C-Met、PSMA、糖脂、F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、黑色素瘤相关抗原(MAGE)A3TCR、黑色素瘤相关抗原(MAGE)A1TCR、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、CA15-3、CA27-29、CA19-9、降钙素、钙结合蛋白CD34、CD99MIC2、CD7、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、肌间线蛋白、CD31FL1、神经胶质纤维性酸性蛋白、总囊状体疾病液蛋白、HMB-45、人绒毛膜促性腺激素抑制素、MART-1、Myo D1、神经元特异性烯醇酶(enolast)、胎盘碱性磷酸酶、前列腺特异性抗原、PSCA。PTPRC、S100蛋白、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、肿瘤M2-PK、波形蛋白、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、存活、小鼠双微2同源物(MDM2)、κ-轻链、LeY、L1细胞黏附分子、癌胚抗原(h5T4)、TAG-72、VEGF-R2、及其组合，以及本文所述的其他。CAR的抗原结合结构域可以被引导至其的其他抗原包括但不限于组织或细胞谱系特异性抗原，包括但不限于CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138或其组合。
如本文所预期的，本发明的CAR包含跨越细胞外配体结合结构域和至少一个细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。可用于CAR的构建的跨膜结构域是本领域已知的，并且可以衍生自天然或合成来源。例如，本文预期的跨膜区包括但不限于衍生自(即包含其的至少一个跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD8、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或KIR2DS2的那些。或者，在一些实施方式中跨膜结构域是合成的，例如主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将在合成跨膜结构域的每个末端被发现。
如本文进一步预期的，本发明的CAR包含至少一个细胞内(或细胞质)信号传导结构域。CAR的细胞内信号传导结构域激活免疫细胞的正常效应器功能或应答中的至少一种。例如，在细胞外配体结构域与靶抗原结合后，信号传导结构域可以起到激活CAR T细胞的作用，例如通过诱导T细胞功能，例如细胞溶解活性或T辅助活性，其包括细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方式中，CAR包含TCR复合物的细胞内组分，例如TCR CD3+链，其介导T细胞激活和细胞毒性，例如基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)结构域CD3ζ链(CD3ζ)。因此，在如本文预期的一些方面，抗原结合分子连接至一个或多个细胞信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞信号传导结构域包含CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方式中，CAR还包含一种或多种另外的分子例如Fc受体γ如FcεRIγ、CD8、CD4、CD25或CD16的一部分。例如，在一些方面，CAR包含在CD-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ和CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。在一个实施方式中，细胞内信号传导结构域是Dap-12衍生的信号传导结构域。具有能够被异型双功能化合物结合，导致与一个或多个信号传导结构域组合的CAR的至少一部分的降解的dTAG的CAR的概括实例在图1中示出。
在一些实施方式中，一个或多个细胞内信号传导结构域包含T细胞受体(TCR)的细胞质序列，并且在一些方面还包含在天然情况下起到与这样的受体合作以启动抗原受体接合后的信号转导的作用的共受体和/或这样的分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR的信号传导，而且还需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也包含在CAR中。在其他实施方式中，CAR不包含用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，额外的CAR在同一个细胞中被表达并提供用于产生次级或共刺激信号的组分。在一些方面，细胞包含第一CAR和第二CAR，第一CAR含有诱导初级信号的信号传导结构域，第二CAR结合第二抗原并含有用于产生共刺激信号的组分。例如，第一CAR可以是激活CAR并且第二CAR可以是共刺激CAR。在一些方面，两种CAR必须被连接以在细胞中诱导特定的效应器功能，其可以提供针对被靶向的细胞类型的特异性和选择性。在一个实施方式中，细胞包含第一CAR，其含有诱导初级信号的信号传导结构域和刺激其他免疫细胞的共刺激配体分子。参见例如Abate Daga等,“CARmodels:next generation CARmodifications for enhanced T-cell function,”Molecular Therapy-Oncolytics(2016)3:1-7。图3示出了这样的策略的示例性示意图。
在一些实施方式中，CAR包含共刺激受体的信号传导结构域和/或跨膜部分，例如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS。在一些方面，同一个CAR包含激活和共刺激组分两者；在其他方面，激活结构域由一个CAR提供，而共刺激组分由另一个CAR或识别另外的抗原的配体提供。
在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含与CD3(例如CD3-ε)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含与CD3ε细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB、TNFRSF9)共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含嵌合CD28或CD137(4-1BB、TNFRSF9)共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含嵌合CD28和OX40共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含嵌合CD27共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含嵌合CD27和DAP10共刺激结构域。
在一些实施方式中，CAR包含与细胞质部分中的激活结构域例如主要激活结构域组合的两个或更多个共刺激结构域。一个实例是包含CD3-ε、CD28和4-1BB的细胞内组分的受体。其他实例包括包含CD3-ε、CD28和OX40的细胞内组分的受体。
如本文所预期的，本发明的CAR由免疫效应细胞例如T细胞表达，并且施用于受试者以治疗疾病或病症，例如癌症。可用于表达本发明的CAR的细胞类型包括但不限于T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+细胞和干细胞，例如诱导多能干细胞(iPS细胞)。在一个实施方式中，细胞是自体T细胞。在一个实施方式中，当与含有能够被细胞外配体结合结构域结合的抗原的肿瘤细胞交叉反应时，细胞显示出抗肿瘤活性。
本文进一步预期的是能够结合本发明的CAR的dTAG并通过泛素化诱导降解的异型双功能化合物分子的使用。通过向受试者施用针对dTAG的异型双功能化合物，免疫效应细胞应答可以在先前已经接受表达本发明的CAR的免疫效应细胞的受试者中被调节。用于本发明的异型双功能化合物是小分子拮抗剂，其能够通过降解而使CAR的生物学功能失去能力。用于本发明的异型双功能化合物通过与劫持了Cereblon E3泛素连接酶复合物的功能的衍生化的邻苯二甲酰亚胺的化学缀合提供迅速的配体依赖性靶蛋白降解。使用这种方法，本发明的CAR可以以高特异性和高效率而被快速降解。
可用于本发明的异型双功能化合物包括包含小分子E3连接酶配体的那些，其通过如下文更详细描述的具有不同长度和/或功能的接头共价地连接至dTAG靶向配体。异型双功能化合物能够结合至dTAG并招募E3连接酶，例如通过结合至含有连接酶的Cereblon(CRBN)或Von Hippel-Lindau肿瘤抑制基因(VHL)至CAR用于泛素化和随后的蛋白酶体降解。
此外，通过结合经由本申请的双功能分子的蛋白质降解的化学策略和CAR T细胞疗法的有效性，CAR T细胞的活性和因此副作用可以通过快速地打开和关闭泛素化以及CAR的蛋白酶体降解而以精确的、时间的方式调节。
可用于本发明的异型双功能化合物的实例在以下详细举例说明。
在一个方面，提供了编码CAR的核酸，所述CAR具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和具有至少一个细胞内信号传导结构域和能够被异型双功能化合物结合的dTAG的细胞质结构域。
在一个特定的实施方式中，提供了编码CAR的核酸，所述CAR具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和具有至少一个细胞内信号传导结构域和dTAG的细胞质结构域，其中所述dTAG衍生自SEQ.ID.No.1的氨基酸序列或其片段，并且所述dTAG能够被选自dFKBP-1-dFKBP-5中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，提供了编码CAR的核酸，所述CAR具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和具有至少一个细胞内信号传导结构域和dTAG的细胞质结构域，其中所述dTAG衍生自SEQ.ID.No.2的氨基酸序列或其片段，并且所述dTAG能够被选自dFKBP-6-dFKBP-13中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，提供了编码CAR的核酸，所述CAR具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和具有至少一个细胞内信号传导结构域和dTAG的细胞质结构域，其中所述dTAG衍生自SEQ.ID.No.3的氨基酸序列或其片段，并且所述dTAG能够被选自dBET1-dBET18中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，提供了编码CAR的核酸，所述CAR具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和具有至少一个细胞内信号传导结构域和dTAG的细胞质结构域，其中所述dTAG衍生自SEQ.ID.No.3的氨基酸序列或其片段，并且所述dTAG能够被选自dBromo1-dBromo34中任一种的异型双功能化合物结合。在一个特定的实施方式中，提供了编码CAR的核酸，所述CAR具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和具有至少一个细胞内信号传导结构域和dTAG的细胞质结构域，其中所述dTAG衍生自SEQ.ID.No.9的氨基酸序列或其片段，并且所述dTAG能够被选自dHalo1-dHalo2中任一种的异型双功能化合物结合。
在一个方面，提供了编码CAR的氨基酸，所述CAR具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和具有至少一个细胞内信号传导结构域和能够被异型双功能化合物结合的dTAG的细胞质结构域。
在一个方面，提供了CAR表达细胞，例如自然杀伤(NK)细胞或T淋巴细胞，其中所述CAR具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和具有至少一个细胞内信号传导结构域和能够被异型双功能化合物结合的dTAG的细胞质结构域。
在一个特定方面，提供了调节表达本发明的CAR的细胞的活性的方法，其包括向被施用CAR表达细胞的受试者施用异型双功能化合物。
本发明的其他方面包括编码本发明的CAR的多核苷酸序列、质粒和载体，以及表达本发明的CAR的T细胞。
另外的方面包括调节患者的T淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞活性和通过向个体引入包含本发明的CAR的T淋巴细胞或NK细胞，并且随后向受试者施用能够降解CAR的异型双功能化合物而治疗患有癌症的患者的方法。这些方面特别包括肾细胞癌、宫颈癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、白血病和淋巴瘤的治疗。用于本发明的癌症靶标的实例是B细胞来源的癌症，特别地包括急性淋巴母细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
附图说明
图1是本发明的概括性示例性嵌合抗原受体(CAR)的示意图，其包含单链抗体、铰链结构域(H)、跨膜结构域(TM)、负责T细胞激活的信号传导结构域，和能够被异型双功能化合物结合，导致CAR的至少一部分的降解的dTAG。从左到右，说明性的CAR包含CD3ζ衍生信号传导结构域，共刺激结构域和CD3ζ衍生结构域，和两个共刺激结构域和CD3ζ衍生结构域，均具有3'融合dTAG。
图2是具有能够被异型双功能化合物结合，导致CAR的至少一部分的降解的dTAG的通用CAR的概括性实例的示意图，其中细胞外配体结合结构域靶向标记或标签，其中标记或标签结合于例如能够结合靶配体如肿瘤抗原的抗体。
图3是具有能够被异型双功能化合物结合，导致与包含能够刺激其他免疫效应细胞的共刺激配体的共刺激配体的反式信号传导组合的CAR的至少一部分的降解的dTAG的CAR的概括性实例的示意图。
图4是示例性嵌合抗原受体(CAR)的示意图，其具有靶向肿瘤抗原CD19的scFv细胞外结构域、CD8铰链跨膜结构域、CD28跨膜和信号传导结构域、CD3-ζ共刺激结构域和能够被异型双功能化合物靶向的dTAG。
图5是编码CD19-CAR-dTAG的质粒的质粒图谱。
图6是用本发明描述的双功能分子处理的细胞的免疫印迹。将表达HA标记的FKBP12WT或FKBP*(本文中也被称为dFKBP12*)的293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)用指定浓度的dFKBP7处理4小时。FKBP*而非FKBPWT的CRBN依赖性降解证实了dFKBP7对突变FKBP*的选择性活性。
图7A-B是测量一组dFKBP异型双功能化合物在表达与Nluc融合的FKBP*的细胞中的活性的图。在用指定浓度的dFKBP处理4小时的野生型(图7A)或CRBN-/-(图7B)293FT细胞中，将FKBP*的降解测量为来自相同的多顺反子转录物的NANOluc和萤火虫荧光素酶之间的信号比率(Nluc/Fluc)。信号比率的降低指示FKBP*(Nluc)降解。
图8是用本发明描述的异型双功能化合物处理的细胞的免疫印迹。将表达FKBP12WT或FKBP*的等基因293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)用100nM的dFKBP7或dFKBP13处理4小时。FKBP*而非FKBP12WT或内源FKBP12的CRBN依赖性降解证实了dFKBP7和dFKBP13对突变FKBP*的选择性。
图9是用本发明描述的异型双功能化合物处理的细胞的免疫印迹。将表达HA标记的FKBP*的等基因293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)用指定剂量的dFKBP13处理表达4小时。这些数据证实了dFKBP13对HA标记的FKBP*的剂量和CRBN依赖性降解。
图10是用本发明描述的异型双功能化合物处理的细胞的免疫印迹。将表达HA标记的FKBP*的293FT细胞(CRBN-WT)用100nM的dFKBP13处理指定的时间。收集细胞并对蛋白裂解物进行免疫印迹以测量由dFKBP13诱导的HA标记的FKBP*降解的动力学。
图11是用本发明描述的异型双功能化合物处理的细胞的免疫印迹。在用dFKBP13处理4小时之前，将表达FKBP*的293FT细胞(CRBN-WT)用1μM卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)、0.5μM MLN4924(neddylation抑制剂)和10μM来那度胺(CRBN结合配体)预处理2小时。通过蛋白酶体抑制剂卡非佐米拯救dFKBP13对HA标记的FKBP*的降解，确定了对蛋白酶体功能的需求。用NAE1抑制剂MLN4924进行的预处理拯救了HA标记的FKBP*，确定了对CRL活性的依赖性，如对进行性E3连接酶活性需要neddylation的基于cullin的泛素连接酶所预期的。用过量的来那度胺进行的预处理消除了dFKBP13依赖性FKBP*降解，确认了降解对CRBN参与的需求。
图12是说明CAR-dTAG的变阻器机制的示意图。
图13是用本发明描述的异型双功能化合物处理的细胞的免疫印迹。Jurkat T细胞用表达CD19-CAR-dTAG的慢病毒转导。细胞用杀稻瘟素选择并扩增。证实了CD19-CAR-dTAG的稳定表达。
图14A-B是用本发明描述的异型双功能化合物处理的细胞的免疫印迹。将表达CD19-CAR-dTAG的Jurkat T细胞用指定剂量的dFKBP7或dFKBP13处理4小时。这些数据证实了Jurkat T细胞中CD19-CAR-dTAG的剂量依赖性降解。
图15A-B是用本发明描述的双功能分子处理的细胞的免疫印迹。将表达CD19-CAR-dTAG的Jurkat T细胞用250nM的dFKBP7或dFKBP13处理指定的时间。这些数据证实了在Jurkat T细胞中CD19-CAR-dTAG的时间依赖性降解。
图16是用本发明描述的异型双功能化合物处理的细胞的免疫印迹。将表达CD19-CAR-dTAG的Jurkat T细胞用250nM dFKBP7处理4小时。然后通过冲洗将dFKBP7从Jurkat细胞除去，并在指定时间点通过免疫印迹分析监测CD19-CAR-dTAG的再表达。数据表明在dFKBP7去除之后，CD19-CAR-dTAG蛋白水平恢复。
图17A-B说明了用本发明描述的异型双功能化合物处理的T细胞中CD19-CAR-dTAG表达的变阻器化学控制。图17A说明了测量在添加和除去dFKBP7时控制T细胞中CD19-CAR-dTAG表达的能力的实验设计。将表达CD19-CAR-dTAG的Jurkat细胞在指定的时间点(0和8小时)用250nM dFKBP7处理。在4和12小时，将dFKBP7从Jurkat细胞中洗出。在每个指定的时间点，收集Jurkat细胞以通过免疫印迹分析监测CD19-CAR-dTAG表达水平。图17B是来自图17A中实验设计的最终免疫印迹。异型双功能化合物dFKBP7分子允许CD19-CAR-dTAG蛋白水平的灵敏化学控制，允许在若干小时内的调节。这些数据支持本发明中描述的变阻器机制。
图18A-B是用本发明描述的异型双功能化合物处理的细胞的免疫印迹。表达与具有HA标签的突变FKBP*融合的指定蛋白的MV4；11白血病细胞的免疫印迹。将细胞用指定浓度的FKBP*选择性异型双功能化合物dFKBP7或dFKBP13处理16小时，并通过蛋白免疫印迹分析测量融合蛋白的丰度。
图19是表达在N端或C端与FKBP*融合的KRASG12V等位基因的NIH3T3细胞的免疫印迹。将细胞用500nM dFKBP7处理指定的时间。收集细胞并免疫印迹以测量FKBP*-KRASG12V以及KARS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据表明施用dFKBP7后，N端FKBP*融合是激活的并被降解。
图20是用1μM的指定dFKBP异型双功能化合物处理24小时的表达与KRASG12V的N端融合的FKBP*的NIH3T3细胞的免疫印迹。收集细胞并免疫印迹以测量FKBP*-KRASG12V以及KARS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据表明dFKBP9、dFKBP12和dFKBP13诱导FKBP*-KRASG12V的有效降解并抑制下游信号传导。
图21是用指定浓度的dFKBP13处理24小时的表达与KRASG12V的N端融合的FKBP*的NIH3T3细胞的免疫印迹。收集细胞并免疫印迹以测量FKBP*-KRASG12V以及KARS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据表明dFKBP13诱导FKBP*-KRASG12V的有效降解并以IC50>100nM有效地抑制下游信号传导。
图22是用1μM dFKBP13处理指定时间的表达与KRASG12V的N端融合的FKBP*的NIH3T3细胞的免疫印迹。收集细胞并免疫印迹以测量FKBP*-KRASG12V以及KARS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据表明dFKBP13早在处理后1小时就诱导FKBP*-KRASG12V的强力降解和下游信号传导的抑制。
图23A-D是对照NIH3T3细胞或用DMSO或dFKBP13处理24小时的表达与KRASG12V的N端融合的FKBP*的NIH3T3的相位对比图像组。相位对比图像突出了在FKBP*-KRASG12V的dFKBP13依赖性降解时诱导的形态变化。
图24A-D是增殖图，其测量dFKBP13对表达FKBP*-KRASG12V的NIH3T3的NIH3T3对照细胞的生长的影响。将细胞用指定浓度的dFKBP处理72小时，并使用ATPlite测定法测量细胞计数。ATPlite一步发光测定法基于由ATP与添加的荧光素酶和D-荧光素的反应引起的光的产生测量细胞中的细胞增殖和细胞毒性。信号减少表明细胞数量减少。
图25提供了用于本发明的Degron部分的实例，其中R是接头的连接点，并且X如本文所定义。
图26提供了用于本发明的Degron部分的另外的实例，其中R是接头的连接点，并且X如本文所定义。
图27提供了用于本发明的Degron部分的另外的实例，其中R是接头的连接点，并且X如本文所定义。
图28提供了用于本发明的接头部分的实例。
图29提供了用于本发明的接头部分的另外的实例，其中是指6元含氮杂芳基，例如吡啶基、嘧啶基、三嗪基等。
图30提供了用于本发明的杂脂肪族接头部分的实例。
图31提供了用于本发明的芳香族接头部分的实例，其中X和Y如US2016/0058872A1中限定，其通过引用全文并入本文。例如，X可以是具有2至14个原子的直链，并且所提到的链可以含有杂原子如氧，并且Y可以是O、N或S(O)n(n＝0、1、2)。
图32提供了用于本发明的dTAG靶向配体，其中R是接头连接的点。
图33提供了用于本发明的特定异型双功能化合物。
图34提供了用于本发明的特定异型双功能化合物，其中化学结构中的X是选自F、Cl、Br和I的卤素。
图35提供了用于本发明的特定异型双功能化合物，其中化学结构中的X是选自F、Cl、Br和I的卤素。
图36提供了用于本发明的特定异型双功能化合物，其中RAR1和RAR2在本文描述。
图37提供了用于本发明的另外的异型双功能化合物。
具体实施方式
在一个实施方式中，提供了一种方法，其包括至少以下步骤：
(i)从患有病变细胞的病症的患者移出免疫效应细胞，例如T细胞，所述病变细胞的病症可以通过增加患者的T细胞识别和结合病变细胞的能力而治疗；
(ii)通过插入编码具有靶向病变细胞表面抗原的至少一个序列和可以被异型双功能化合物的dTAG靶向配体识别并与其结合以形成CAR T细胞的氨基酸序列的CAR的基因而离体转化T细胞；
(iii)向患者施用自体CAR T细胞；和然后
(iv)根据需要向患者施用异型双功能化合物，其以使dTAG(因而使CAR T细胞)接近泛素连接酶的方式，连接至a)dTAG和b)泛素连接酶，使得CAR被泛素化，然后被蛋白酶体降解。
在一个实施方式中，提供了一种方法，其包括至少以下步骤：
根据需要向患者施用异型双功能化合物；
其中患者具有可以通过增加患者的免疫效应细胞例如T细胞识别和结合病变细胞的能力而治疗的病变细胞的病症；
其中所述患者先前已经被施用自体免疫效应细胞，例如CAR T细胞，其已经通过插入编码具有靶向病变细胞表面抗原的至少一个序列和可以被异型双功能化合物的dTAG靶向配体识别并与其结合以形成CAR T细胞的氨基酸序列的CAR的基因而被离体转化；
其中异型双功能化合物能够以使dTAG(因而使CAT)接近泛素连接酶的方式，连接至a)dTAG和b)泛素连接酶，使得CAR被泛素化，然后被蛋白酶体降解。
本发明包括通过在允许使用异型双功能化合物进行可逆的靶向蛋白降解的合成嵌合抗原受体(CAR)构建体内，引入统称为dTAG的异型双功能化合物靶向蛋白或异型双功能化合物标签，而介导CART细胞刺激的组合物和方法。本发明的CAR可用于治疗癌症，其包括但不限于血液恶性肿瘤和实体瘤。本发明包括被转导以表达具有能够被异型双功能化合物结合的dTAG的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继性细胞转移的策略，其在与异型双功能化合物接触时，通过泛素蛋白酶体途径降解。
CAR是将针对期望抗原(例如肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与T细胞受体激活细胞内结构域组合以产生展现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
本发明一般涉及被遗传修饰以稳定表达具有dTAG的期望CAR的T细胞的用途。表达这些CAR的T细胞在本文中称为CAR T细胞或CAR修饰T细胞。优选地，细胞可以被遗传修饰以在其表面上稳定表达抗体结合结构域，赋予独立于MHC的新抗原特异性。在一些情况下，T细胞被遗传修饰以稳定表达CAR，其将特定抗体的抗原识别结构域与具有dTAG的细胞内结构域在单一嵌合蛋白中组合。
在一个实施方式中，本发明的CAR包含具有抗原识别结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。在一个实施方式中，使用与CAR中的结构域之一天然地相关联的跨膜结构域。在另一个实施方式中，跨膜结构域可以被选择或被氨基酸取代修饰以避免这样的结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一个实施方式中，跨膜结构域是CD8α铰链结构域。
关于细胞质结构域，本发明的CAR被设计为包含至少一个信号传导结构域和异型双功能化合物靶向蛋白(dTAG)。CAR的异型双功能化合物靶向蛋白是异型双功能化合物可以结合，导致与异型双功能化合物接触时CAR的降解的任何氨基酸序列。优选地，dTAG不应该干扰CAR的功能。在一个实施方式中，dTAG是非内源肽，导致异型双功能化合物选择性和允许在施用异型双功能化合物时避免脱靶效应。在一个实施方式中，dTAG是衍生自内源蛋白质的氨基酸序列，其已经被修饰使得异型双功能化合物仅结合至修饰的氨基酸序列而不结合内源表达的蛋白质。
信号传导结构域可以是能够激活T细胞的任何合适的信号传导结构域，例如CD3ζ、CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、ICOS、DAP-10或DAP-12信号传导结构域，其可以是单独地或与可用于本发明的CAR情况的任何其他期望细胞质结构域组合。在一个实施方式中，CAR的细胞质结构域被设计为进一步包含第二信号传导结构域，例如CD3ζ、CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、ICOS、DAP-10和/或DAP-12信号传导结构域或其任何组合的信号传导结构域。例如，CAR的细胞质结构域可以包括但不限于CD3ζ、4-1BB和/或CD28信号传导模块及其组合。
CAR T细胞的产生是本领域已知的。例如，参见Wang等,“Clinical manufacturingof CAR T cells:foundation of a promising therapy,”Oncolytics(2016)3:1-7(并且并入本文)。通常，本发明的CAR T细胞可以通过将包含期望CAR的慢病毒载体，例如包含抗CD19、CD8α铰链和跨膜结构域、人CD28和CD3ζ信号传导结构域和FKBP*dTAG的CAR，引入细胞而产生。本发明的CAR T细胞能够在体内复制，导致长期存留，其可以导致持续的肿瘤控制，并且通过施用异型双功能化合物而进行调节。
在一个实施方式中，使用淋巴细胞输注施用表达用于治疗患有癌症或处于患癌风险中的患者的CAR的遗传修饰的T细胞。在治疗中使用自体淋巴细胞输注。自体PBMC是从需要治疗的患者收集的，并且T细胞使用本文所述和本领域已知的方法激活和扩增，然后被输注回到患者中。
在又一个实施方式中，提供了对处于发生CLL的风险中的患者的治疗。本发明还包括治疗恶性肿瘤或自身免疫性疾病，其中患者中的化疗和/或免疫治疗导致患者中显著的免疫抑制，从而增加患者发生CLL的风险。
本发明包括使用表达含有dTAG的CAR的CAR T细胞。本发明的CAR T细胞可以经历稳健的体内CAR T细胞扩增并且可以建立靶向的抗原特异性记忆细胞，其在血液和骨髓中以高水平存留延长的时间量。在一些情况下，输注到患者内的本发明的CAR T细胞可以通过向患者施用能够结合CAR上的dTAG的异型双功能化合物而调节，导致dTAG的降解和CAR T细胞激活的下调而不破坏CAR T细胞。
术语
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在用于测试本发明的实践中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但是在本文中描述了典型的材料和方法。
还应该理解的是本文使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而非旨在是限制性的。
如本文所使用的，“嵌合抗原受体(CAR)”指融合蛋白，其包含能够结合抗原的细胞外结构域、跨膜结构域和至少一个细胞内信号传导结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时也被称为“嵌合受体”、“T体”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“细胞外配体结合结构域”指可以与另外的蛋白质结合的任何寡肽或多肽。“细胞内信号传导结构域”或“细胞质信号传导结构域”指已知作为传递信号以引起细胞中的生物学过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。
如本文所使用的，“肿瘤抗原”指具有抗原性的生物学分子，其表达与肿瘤细胞有关。本发明中被靶向的肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原(仅存在于肿瘤细胞中且未见于其他正常细胞中的抗原)，以及肿瘤相关抗原(也存在于其他器官和组织或异质和异基因正常细胞中的抗原，或在发育和分化的路线中表达的抗原)。
如本文所使用的，“单链可变片段(scFv)”指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔区序列连接的抗体多肽。用于制备scFv的各种方法是已知的，并且包括在美国专利号4,694,778、Science,242(1988):423-442、Nature 334(1989):54454和Science 240(1988):1038-1041中描述的方法。
如本文所使用的，“结构域”指多肽中的一个区域，其折叠成独立于其他区域的特定结构。
如本文所用的“激活”指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。激活也可以与诱导的细胞因子生产和可检测的效应器功能相关。术语"激活的T细胞"指特别是正在经历细胞分裂的T细胞。
如本文所使用的，术语“抗体”指特异地与抗原结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或衍生自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等,"Using Antibodies:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY(1999)；Harlow等,"Antibodies:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor,NY(1989)；Houston等,Proc.Natl.Acad.Sci.85(1988):5879-5883和Bird等,Science 242(1988):423-426)。
术语“抗体片段”指完整抗体的一部分并且指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所使用的术语“抗原”或“Ag”被定义为可以被抗体或其抗体片段靶向的分子。
如本文所使用的，术语“自体”是指源自同一个个体的任何材料，其稍后被重新引入该个体。
如本文所使用的术语“共刺激配体”包括在抗原呈递细胞(例如APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，所述抗原呈递细胞特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，由此提供除了由例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合提供的初级信号之外，介导包括但不限于增殖、激活、分化等的T细胞应答的信号。共刺激配体包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或拮抗剂和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括尤其是与存在于T细胞上的共刺激分子(例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性结合的配体)特异性结合的抗体。
如本文所使用的“有效量”指提供治疗或预防益处的量。
“编码”指在具有确定的核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)序列或确定的氨基酸序列和由此而来的生物学性质、用作在生物过程中其他聚合物和大分子的合成的模板的多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸的特定序列的固有性质。因此，基因编码蛋白质，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常提供在序列表中的编码链和用作基因或cDNA的转录模板的非编码链两者可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所使用的“内源的”指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内的任何材料。
如本文所使用的，术语“外源的”指从生物体、细胞、组织或系统外引入或产生的任何材料。
如本文所使用的术语“表达”被定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”指含有包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列的重组多核苷酸的载体。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主T细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如引入重组多核苷酸的黏粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“共刺激分子”指与共刺激配体特异性结合，由此介导例如但不限于增殖的T细胞的共刺激响应的在T细胞上的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体。
除非另外指明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并版本并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子到编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些版本中含有内含子的程度。
如本文所使用的“慢病毒”指逆转录病毒科家族的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒中是独特的；它们可以将大量的遗传信息递送至宿主T细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的手段。
如本文所使用的术语“调节”指与不存在治疗或化合物的情况下受试者的响应水平相比，和/或与其他方面相同但未经治疗的受试者的响应水平相比，介导受试者中的响应水平的可检测的增加或减少。该术语包括干扰和/或影响天然信号或响应，从而介导受试者(优选人)中的有益治疗响应。
如本文所使用的“共刺激信号”指与初级信号例如TCR/CD3连接组合，导致T细胞增殖、激活和/或关键分子的上调或下调的信号。
免疫原性组合物的“胃肠外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射，或输注技术。
如本文所使用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。而且，核酸是核苷酸的聚合物。因此，核酸和多核苷酸可以在本文中互换使用。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”的一般知识。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所使用的多核苷酸包括但不限于由本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段，即使用普通克隆技术和PCRTM等，以及通过合成手段，从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，并且指由肽键共价地连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有施加限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所使用的，该术语指短链和较长链两者，短链在本领域通常称为例如肽、寡肽和寡聚物，较长链在本领域通常称为蛋白质，存在蛋白质的许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
术语“刺激”是指通过刺激性分子(例如TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体结合，由此介导信号转导事件而诱导的初级应答，例如但不限于通过例如TCR/CD3或CD3ζ复合物的信号转导。刺激可以介导T细胞增殖、激活和/或关键分子的上调或下调等。
如本文所使用的术语“治疗”疾病指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。
如本文所使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指将外源核酸传递或引入至例如宿主T细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者T细胞及其后代。
“载体”是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。许多载体是本领域已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语"载体"包括自主复制载体或病毒。该术语还应该解释为包括促进核酸传递入细胞的非质粒和非病毒化合物，例如多聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应该理解，范围形式的描述仅仅是为了方便，不应被解释为对本发明范围的限制。范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，范围的描述如1至6应该被认为已经具体公开子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所使用的，“剂型”指活性剂的施用单位。剂型的实例包括片剂、胶囊剂、注射剂、混悬剂、液体剂、乳剂、植入剂、颗粒剂、球剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、可吸入剂型、透皮剂型、口腔剂型、舌下剂型、局部剂型、凝胶剂、粘膜剂等。"剂型"还可以包括植入剂，例如光学植入剂。
如本文所使用的，“药物组合物”是包含至少一种活性剂和至少一种其他物质例如载体的组合物。“药物组合物”是可以以单一剂型组合或以分开的剂型与活性剂待一起用于治疗本文所述的任何病症的说明书一起提供的至少两种活性剂的组合。
如本文所使用的，“药学上可接受的盐”是公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其无机和有机的、无毒的、酸或碱加成盐而被修饰。本发明化合物的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这样的盐可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量量的合适碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学计量量的合适酸反应而制备。这样的反应通常在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中进行。通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈在切实可行的情况下是典型的。本发明化合物的盐还包括化合物的溶剂合物和化合物盐的溶剂合物。
药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的矿物或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，常规无毒酸盐包括衍生自无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些；以及从有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙酸醇、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸、HOOC-(CH2)n-COOH其中n是0-4，等等，或使用产生相同抗衡离子的不同酸制备的盐。另外的合适的盐的列表可以在Remington'sPharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,(1985):1418中找到。
应用于本发明药物组合物/组合的术语“载体”指用其提供活性化合物的稀释剂、赋形剂或载体。
“药学上可接受的赋形剂”指可用于制备通常安全、无毒并且不在生物学上或在其他方面不适合施用于宿主(通常为人)的药物组合物/组合的赋形剂。在一个实施方式中，使用可接受用于兽医使用的赋形剂。
“患者”或“宿主”或“受试者”是需要治疗或预防本文具体描述的任何病症的人或非人动物，其包括但不限于与任何CAR T细胞癌症治疗相关的不良免疫应答。通常，宿主是人。“患者”或“宿主”或“受试者”也指例如哺乳动物、灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。
本发明的药物组合物/组合的“治疗有效量”指当施用于宿主时，有效提供治疗益处例如症状的改善或疾病本身的减少或减小的量。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明的CAR特征在于它们包含从N端侧以如下顺序的能够与抗原结合的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述细胞内结构域包含至少一个信号传导结构域和dTAG。
(a)细胞外结构域
本发明的CAR包含细胞外靶特异性配体结合结构域，例如抗原结合部分。部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择细胞外配体结合结构域以识别充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记物的配体。因此，可充当本发明的CAR中细胞外配体结合结构域的配体的细胞表面标记物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些。
在一个实施方式中，本发明的CAR可以通过工程化与肿瘤细胞上的抗原特异性结合的期望抗原结合部分而被工程化以靶向感兴趣的肿瘤抗原。在本发明的背景下，肿瘤抗原指特定类型的癌症共有的抗原。本文讨论的抗原仅作为实例被包括。该列表不旨在是排他性的，并且进一步的实例对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
肿瘤抗原是由引起免疫应答特别是T细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体、间皮素、α-叶酸受体、CAIX、EGP-2、EGP-40、IL13R-a2、KDR、κ-轻链、LeY、L1细胞粘附分子、鼠CMV、NKG2D配体、GD2、GD3和VEGF-R2。
在一个实施方式中，肿瘤抗原包含恶性肿瘤相关的一种或多种抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原例如MART-1、黑色素瘤中的酪氨酸酶和GP100，和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子的组，例如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2、Erb-B3、Erb-B4。另一组靶抗原是癌-胚胎抗原，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了对于个体肿瘤独特的精确地肿瘤特异性的免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原例如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)已被用作采用单克隆抗体的被动免疫疗法的靶标，但成功有限。
本发明中涉及的肿瘤抗原的类型也可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对于肿瘤细胞是独特的，并且不出现在体内的其他细胞上。TAA相关抗原对肿瘤细胞不是独特的，而是在不能诱导对抗原具有免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使得免疫系统能够对抗原做出应答的条件下发生。当免疫系统不成熟且不能应答时，TAA可以是在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是通常在正常细胞上以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原例如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达胚胎抗原例如CEA；过表达癌基因和突变的肿瘤抑制基因例如p53、Ras、HER-2/neu；染色体易位造成的独特肿瘤抗原，例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，例如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一个实施方式中，CAR的抗原结合部分部分靶向抗原，其包括但不限于CD19、CD20、CD30、CD44、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR等。
在一个实施方式中，CAR的抗原结合部分部分靶向细胞上的特定细胞表面分子，其中所述细胞表面分子与特定类型的细胞相关，例如分化分子的簇。
取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可以被工程化以包含对期望抗原靶标特异性的适当抗原结合部分。例如，如果CD19是待靶向的期望抗原，则抗体或抗体片段，例如针对CD19的scFv，可用作抗原结合部分以引入本发明的CAR中。在一个实施方式中，抗原结合结构域由scFv组成。单链抗体指通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段通过工程化氨基酸跨段连接至Fv区域。产生单链抗体的各种方法是已知的，其包括在美国专利号4,694,778；Bird(1988)Science 242:423-442；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward等(1989)Nature 341:544-546；Skerra等(1988)Science 240:1038-1041中所述的那些。
在一个实施方式中，细胞外配体结合结构域结合标记或标签，例如生物素或异硫氰酸荧光素，其中生物素或异硫氰酸荧光素与能够结合肿瘤细胞表面上的分子的抗体结合。
在一个实施方式中，细胞外配体结合结构域结合与特定细胞或疾病状态相关的标记物，例如IL13R。在一个实施方式中，细胞外配体结合结构域结合至与特定细胞相关的分化分子的簇。
(b)跨膜结构域
本发明的CAR可以被设计为包含与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用与CAR中的结构域之一天然地相关联的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可以被选择或被氨基酸取代修饰以避免这样的结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可以衍生自天然或合成来源。在来源是天然的的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。特别用于本发明的跨膜区可以衍生自(即包含其的至少跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或GITR。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将见于合成跨膜结构域的每个末端。任选地，短的寡或多肽接头，优选地长度在2至10个氨基酸之间，可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头
在一个实施方式中，本发明的CAR中的跨膜结构域是衍生自CD8跨膜结构域。在一些情况下，本发明的CAR的跨膜结构域包含CD8α铰链结构域。
此外，在本发明的CAR中，信号肽序列可以连接至N端。信号肽序列存在于许多分泌蛋白和膜蛋白的N端，并且具有15至30个氨基酸的长度。由于上述作为细胞内结构域的蛋白质分子中的许多具有信号肽序列，所以所述信号肽可用作本发明的CAR的信号肽。
(c)细胞内信号传导结构域
本发明的CAR的细胞内信号传导结构域或细胞质信号传导结构域(在本文可互换使用)负责激活其中已经放置CAR的免疫细胞的正常效应器功能中的至少一种。术语"效应器功能"指细胞的特化功能。T细胞的效应器功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，其包括细胞因子的分泌。因此术语"细胞内信号传导结构域"指转导效应器功能信号并引导细胞执行特化功能的蛋白质的部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，使用整个链不是必要的。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应器功能信号，就可以使用这样的截短的部分代替完整链。因此术语细胞内信号传导结构域是指包括足以转导效应器功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和在抗原受体衔接后一致起作用以启动信号转导的共受体，以及这些序列和具有相同功能能力的任何合成序列的任何衍生物或变体。
已知通过单独的TCR产生的信号可能不足以完全激活T细胞，并且可能也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞激活可以说是由两种不同类型的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞质信号传导序列)以及以抗原非依赖性方式起到提供次级或共刺激信号的作用的那些(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在本发明中特别适用的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一个实施方式中，本发明的CAR中的细胞质信号传导分子包含衍生自CD3ζ的细胞质信号序列。
CAR的细胞质结构域可以被设计为包含单独或与可用于本发明的CAR的情况的任何其他期望细胞质结构域组合的CD3-ζ信号传导结构域。例如，CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分或共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体以外的细胞表面分子或其配体，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。因此，本领域已知的可用于CAR的构建的任何共刺激元件都在本发明的范围内。
本发明的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以以随机或指定的顺序相互连接。任选地，短的寡或多肽接头，优选地长度在2至10个氨基酸之间，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一个实施方式中，细胞质结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方式中，细胞质结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在另一个实施方式中，细胞质结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28和4-1BB的信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含嵌合CD28和OX40共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含嵌合CD27共刺激结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含嵌合CD27和DAP10共刺激结构域。
(d)异型双功能化合物靶向蛋白(dTAG)
如本文所预期的，本发明的CAR具有位于细胞质中的异型双功能化合物靶向蛋白(dTAG)。CAR的dTAG是在与异型双功能化合物接触时，异型双功能化合物可以与其结合，导致CAR的泛素化和降解的任何氨基酸序列。优选地，dTAG不应该干扰CAR的功能。在一个实施方式中，dTAG是非内源性肽，其导致异型双功能化合物选择性并且最小化如果异型双功能化合物靶向内源性蛋白时可能发生的脱靶效应。在一个实施方式中，dTAG是衍生自内源蛋白质的氨基酸序列，其已经被修饰使得异型双功能化合物仅结合至修饰的氨基酸序列而不结合内源表达的蛋白质。在一个实施方式中，dTAG是内源表达的蛋白质。如本文所预期的，可以被用于异型双功能化合物的配体结合的任何氨基酸序列可用作dTAG。
在特定的实施方式中，用于本发明的dTAG包括但不限于衍生自内源表达的蛋白例如FK506结合蛋白-12(FKBP12)、含溴结构域蛋白4(BRD4)、CREB结合蛋白(CREBBP)和转录激活因子BRG1(SMARCA4)或其变体的氨基酸序列。如本文所预期的，"变体"指包含一个或几个至多个氨基酸的取代、缺失或添加的任何变体，条件是该变体基本上保留与原始序列相同的功能，其在这种情况下为异型双功能化合物提供配体。在其他实施方式中，用于本发明的dTAG可以包括例如激素受体如雌激素受体蛋白、雄激素受体蛋白、类视色素X受体(RXR)蛋白、和二氢叶酸还原酶(DHFR)(包括细菌DHFR)、细菌脱氢酶和变体。
dTAG的一些实施方式可以是但不限于衍生自Hsp90抑制剂、激酶抑制剂、MDM2抑制剂、靶向人BET含溴结构域蛋白的化合物、靶向细胞溶质信号传导蛋白FKBP12的化合物、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、免疫抑制化合物和靶向芳香烃受体(AHR)的化合物的那些。
在某些实施方式中，dTAG衍生自激酶、BET含溴结构域蛋白、细胞溶质信号传导蛋白(例如FKBP12)、核蛋白、组蛋白脱乙酰酶、赖氨酸甲基转移酶、调节血管生成的蛋白、调节免疫应答的蛋白、芳香烃受体(AHR)、雌激素受体、雄激素受体、糖皮质激素受体或转录因子(例如SMARCA4、SMARCA2、TRIM24)。
在某些实施方式中，dTAG衍生自激酶，例如但不限于酪氨酸激酶(例如AATK,ABL,ABL2,ALK,AXL,BLK,BMX,BTK,CSF1R,CSK,DDR1,DDR2,EGFR,EPHA1,EPHA2,EPHA3,EPHA4,EPHA5,EPHA6,EPHA7,EPHA8,EPHA10,EPHB1,EPHB2,EPHB3,EPHB4,EPHB6,ERBB2,ERBB3,ERBB4,FER,FES,FGFR1,FGFR2,FGFR3,FGFR4,FGR,FLT1,FLT3,FLT4,FRK,FYN,GSG2,HCK,IGF1R,ILK,INSR,INSRR,IRAK4,ITK,JAK1,JAK2,JAK3,KDR,KIT,KSR1,LCK,LMTK2,LMTK3,LTK,LYN,MATK,MERTK,MET,MLTK,MST1R,MUSK,NPR1,NTRK1,NTRK2,NTRK3,PDGFRA,PDGFRB,PLK4,PTK2,PTK2B,PTK6,PTK7,RET,ROR1,ROR2,ROS1,RYK,SGK493,SRC,SRMS,STYK1,SYK,TEC,TEK,TEX14,TIE1,TNK1,TNK2,TNNI3K,TXK,TYK2,TYRO3,YES1或ZAP70)、丝氨酸/苏氨酸激酶(例如酪蛋白激酶2、蛋白激酶A、蛋白激酶B、蛋白激酶C、Raf激酶、CaM激酶、AKT1,AKT2,AKT3,ALK1,ALK2,ALK3,ALK4,Aurora A,Aurora B,Aurora C,CHK1,CHK2,CLK1,CLK2,CLK3,DAPK1,DAPK2,DAPK3,DMPK,ERK1,ERK2,ERK5,GCK,GSK3,HIPK,KHS1,LKB1,LOK,MAPKAPK2,MAPKAPK,MNK1,MSSK1,MST1,MST2,MST4,NDR,NEK2,NEK3,NEK6,NEK7,NEK9,NEK11,PAK1,PAK2,PAK3,PAK4,PAK5,PAK6,PIM1,PIM2,PLK1,RIP2,RIP5,RSK1,RSK2,SGK2,SGK3,SIK1,STK33,TAO1,TAO2,TGF-β,TLK2,TSSK1,TSSK2,ULK1或ULK2)、周期素依赖性激酶(例如Cdk1-Cdk11)和富亮氨酸重复激酶(例如LRRK2)。
在某些实施方式中，dTAG衍生自BET含溴结构域蛋白，例如但不限于ASH1L,ATAD2,BAZ1A,BAZ1B,BAZ2A,BAZ2B,BRD1,BRD2,BRD3,BRD4,BRD5,BRD6,BRD7,BRD8,BRD9,BRD10,BRDT,BRPF1,BRPF3,BRWD3,CECR2,CREBBP,EP300,FALZ,GCN5L2,KIAA1240,LOC93349,MLL,PB1,PCAF,PHIP,PRKCBP1,SMARCA2,SMARCA4,SP100,SP110,SP140,TAF1,TAF1L,TIF1a,TRIM28,TRIM33,TRIM66,WDR9,ZMYND11和MLL4。在某些实施方式中，BET含溴结构域蛋白是BRD4。
在某些实施方式中，dTAG衍生自但不限于7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤三磷酸酶、AFAD、花生四烯酸酯5-脂氧合酶激活蛋白、载脂蛋白、含杆状病毒IAP重复蛋白2、Bcl-2、Bcl-xL、E3连接酶XIAP、来自脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、GTPase、k-RAS、HDAC6、造血前列腺素D合成酶、乳糖谷胱甘肽裂解酶、Mcl-1、PA2GA、肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1、聚-ADP-核糖聚合酶14、聚-ADP-核糖聚合酶15、蛋白原、前列腺素E合成酶、视网膜视杆视紫红质敏感性cGMP 3','5-环磷酸二酯酶亚基δ、S100-A7、Src、Sumo缀合酶UBC9、超氧化物歧化酶、端锚聚合酶1或端锚聚合酶2。
在某些实施方式中，dTAG衍生自核蛋白，其包括但不限于BRD2、BRD3、BRD4、触角足同源结构域蛋白、BRCA1、BRCA2、CCAAT增强结合蛋白、组蛋白、多梳组蛋白、高迁移率组蛋白、端粒结合蛋白、FANCA、FANCD2、FANCE、FANCF、肝细胞核因子、Mad2、NF-κB、核受体共激活因子、CREB结合蛋白、p55、p107、p130、Rb蛋白、p53、c-fos、c-jun、c-mdm2、c-myc和c-rel。
在一个特定的实施方式中，dTAG具有衍生自BRD2((通用蛋白质资源知识库(UniProtKB)-p25440(BRD2_HUMAN)通过引用并入本文)、BRD3(UniProtKB-Q15059(BRD3_HUMAN)通过引用并入本文)、BRD4(UniProtKB-O60885(BRD4_HUMAN)通过引用并入本文)或BRDT(UniProtKB-Q58F21(BRDT_HUMAN)通过引用并入本文)(参见Baud等,“A bump-and-hole approach to engineer controlled selectivity of BET Bromodomains chemicalprobes”,Science 346(6209)(2014):638-641；和Baud等,“New Synthetic Routes toTriazolo-benzodiazepine Analogues:Expanding the Scope of the Bump-and-HoleApproach for Selective Bromo and Extra-Terminal(BET)Bromodomain Inhibition”,JMC 59(2016):1492-1500，两者均通过引用并入本文)的氨基酸序列。在某些实施方式中，BRD2的一个或多个突变包括色氨酸(W)在氨基酸位置97处的突变，缬氨酸(V)在氨基酸位置103处的突变，亮氨酸(L)在氨基酸位置110处的突变，W在氨基酸位置370处的突变，V在氨基酸位置376处的突变，或L在氨基酸位置381处的突变。在某些实施方式中，BRD3的一个或多个突变包括W在氨基酸位置57处的突变，V在氨基酸位置63处的突变，L在氨基酸位置70处的突变，W在氨基酸位置332处的突变，V在氨基酸位置338处的突变，或L在氨基酸位置345处的突变。在某些实施方式中，BRD4的一个或多个突变包括W在氨基酸位置81处的突变，V在氨基酸位置87处的突变，L在氨基酸位置94处的突变，W在氨基酸位置374处的突变，V在氨基酸位置380处的突变，或L在氨基酸位置387处的突变。在某些实施方式中，BRDT的一个或多个突变包括W在氨基酸位置50处的突变，V在氨基酸位置56处的突变，L在氨基酸位置63处的突变，W在氨基酸位置293处的突变，V在氨基酸位置299处的突变，或L在氨基酸位置306处的突变。
在某些实施方式中，dTAG衍生自激酶抑制剂、BET含溴结构域蛋白抑制剂、细胞溶质信号传导蛋白FKBR12配体、HDAC抑制剂、赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、免疫抑制化合物和芳基烃受体(AHR)抑制剂。
在一个特定的实施方式中，dTAG是衍生自细胞溶质信号传导蛋白FKBP12。在某些实施方式中，dTAG是修饰的或突变的细胞溶质信号传导蛋白FKBP12。在某些实施方式中，修饰的或突变的细胞溶质信号传导蛋白FKBP12含有产生用于FKBP12配体的扩大的结合口袋的一个或多个的突变。在某些实施方式中，一个或多个突变包括在氨基酸位置36处苯丙氨酸(F)向缬氨酸(V)的突变(F36V)(未计入甲硫氨酸起始密码子)(也称为FKBP12*或FKBP*，在本文中可互换使用)(参见Clackson等,“Redesigning an FKBP–ligand interface togenerate chemical dimerizers with novel specificity”,PNAS 95(1998):10437–10442，通过引用并入本文)。
在一个特定的实施方式中，dTAG具有衍生自FKBP12蛋白(UniProtKB-P62942(FKB1A_HUMAN)，通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:1)GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE。
在一个实施方式中，dTAG是FKBP12衍生的氨基酸序列，其具有在氨基酸位置36处(未计入甲硫氨酸)苯丙氨酸(F)向缬氨酸(V)的突变(F36V)(也称为FKBP12*或FKBP*，在本文中可互换使用)，其具有氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:2)GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRD4蛋白(UniProtKB–O60885(BRD4_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:3)MSAESGPGTRLRNLPVMGDGLETSQMSTTQAQAQPQPANAASTNPPPPETSNPNKPKRQTNQLQYLLRVVLKTLWKHQFAWPFQQPVDAVKLNLPDYYKIIKTPMDMGTIKKRLENNYYWNAQECIQDFNTMFTNCYIYNKPGDDIVLMAEALEKLFLQKINELPTEETEIMIVQAKGRGRGRKETGTAKPGVSTVPNTTQASTPPQTQTPQPNPPPVQATPHPFPAVTPDLIVQTPVMTVVPPQPLQTPPPVPPQPQPPPAPAPQPVQSHPPIIAATPQPVKTKKGVKRKADTTTPTTIDPIHEPPSLPPEPKTTKLGQRRESSRPVKPPKKDVPDSQQHPAPEKSSKVSEQLKCCSGILKEMFAKKHAAYAWPFYKPVDVEALGLHDYCDIIKHPMDMSTIKSKLEAREYRDAQEFGADVRLMFSNCYKYNPPDHEVVAMARKLQDVFEMRFAKMPDEPEEPVVAVSSPAVPPPTKVVAPPSSSDSSSDSSSDSDSSTDDSEEERAQRLAELQEQLKAVHEQLAALSQPQQNKPKKKEKDKKEKKKEKHKRKEEVEENKKSKAKEPPPKKTKKNNSSNSNVSKKEPAPMKSKPPPTYESEEEDKCKPMSYEEKRQLSLDINKLPGEKLGRVVHIIQSREPSLKNSNPDEIEIDFETLKPSTLRELERYVTSCLRKKRKPQAEKVDVIAGSSKMKGFSSSESESSSESSSSDSEDSETEMAPKSKKKGHPGREQKKHHHHHHQQMQQAPAPVPQQPPPPPQQPPPPPPPQQQQQPPPPPPPPSMPQQAAPAMKSSPPPFIATQVPVLEPQLPGSVFDPIGHFTQPILHLPQPELPPHLPQPPEHSTPPHLNQHAVVSPPALHNALPQQPSRPSNRAAALPPKPARPPAVSPALTQTPLLPQPPMAQPPQVLLEDEEPPAPPLTSMQMQLYLQQLQKVQPPTPLLPSVKVQSQPPPPLPPPPHPSVQQQLQQQPPPPPPPQPQPPPQQQHQPPPRPVHLQPMQFSTHIQQPPPPQGQQPPHPPPGQQPPPPQPAKPQQVIQHHHSPRHHKSDPYSTGHLREAPSPLMIHSPQMSQFQSLTHQSPPQQNVQPKKQELRAASVVQPQPLVVVKEEKIHSPIIRSEPFSPSLRPEPPKHPESIKAPVHLPQRPEMKPVDVGRPVIRPPEQNAPPPGAPDKDKQKQEPKTPVAPKKDLKIKNMGSWASLVQKHPTTPSSTAKSSSDSFEQFRRAAREKEEREKALKAQAEHAEKEKERLRQERMRSREDEDALEQARRAHEEARRRQEQQQQQRQEQQQQQQQQAAAVAAAATPQAQSSQPQSMLDQQRELARKREQERRRREAMAATIDMNFQSDLLSIFEENLF。
在一个实施方式中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸75-147。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自ASH1L蛋白(UniProtKB-Q9NR48(ASH1L_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自Q9NR48的氨基酸2463-2533。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自ATAD2蛋白(UniProtKB-Q6PL18(ATAD2_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q6PL18的氨基酸1001-1071。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BAZ1A蛋白(UniProtKB-Q9NRL2(BAZ1A_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9NRL2的氨基酸1446-1516。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BAZ1B蛋白(UniProtKB-Q9UIG0(BAZ1B_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9UIG0的氨基酸1356-1426。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BAZ2A蛋白(UniProtKB-Q9UIF9(BAZ2A_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9UIF9的氨基酸1810-1880。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BAZ2B蛋白(UniProtKB-Q9UIF8(BAZ2B_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9UIF8的氨基酸2077-2147。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRD1蛋白(UniProtKB-O95696(BRD1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自O95696的氨基酸579-649。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRD2蛋白(UniProtKB-P25440(BRD2_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:27)MLQNVTPHNKLPGEGNAGLLGLGPEAAAPGKRIRKPSLLYEGFESPTMASVPALQLTPANPPPPEVSNPKKPGRVTNQLQYLHKVVMKALWKHQFAWPFRQPVDAVKLGLPDYHKIIKQPMDMGTIKRRLENNYYWAASECMQDFNTMFTNCYIYNKPTDDIVLMAQTLEKIFLQKVASMPQEEQELVVTIPKNSHKKGAKLAALQGSVTSAHQVPAVSSVSHTALYTPPPEIPTTVLNIPHPSVISSPLLKSLHSAGPPLLAVTAAPPAQPLAKKKGVKRKADTTTPTPTAILAPGSPASPPGSLEPKAARLPPMRRESGRPIKPPRKDLPDSQQQHQSSKKGKLSEQLKHCNGILKELLSKKHAAYAWPFYKPVDASALGLHDYHDIIKHPMDLSTVKRKMENRDYRDAQEFAADVRLMFSNCYKYNPPDHDVVAMARKLQDVFEFRYAKMPDEPLEPGPLPVSTAMPPGLAKSSSESSSEESSSESSSEEEEEEDEEDEEEEESESSDSEEERAHRLAELQEQLRAVHEQLAALSQGPISKPKRKREKKEKKKKRKAEKHRGRAGADEDDKGPRAPRPPQPKKSKKASGSGGGSAALGPSGFGPSGGSGTKLPKKATKTAPPALPTGYDSEEEEESRPMSYDEKRQLSLDINKLPGEKLGRVVHIIQAREPSLRDSNPEEIEIDFETLKPSTLRELERYVLSCLRKKPRKPYTIKKPVGKTKEELALEKKRELEKRLQDVSGQLNSTKKPPKKANEKTESSSAQQVAVSRLSASSSSSDSSSSSSSSSSSDTSDSDSG。
在一个实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:27的氨基酸91-163或364-436。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRD3蛋白(UniProtKB-Q15059(BRD3_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:28)MSTATTVAPAGIPATPGPVNPPPPEVSNPSKPGRKTNQLQYMQNVVVKTLWKHQFAWPFYQPVDAIKLNLPDYHKIIKNPMDMGTIKKRLENNYYWSASECMQDFNTMFTNCYIYNKPTDDIVLMAQALEKIFLQKVAQMPQEEVELLPPAPKGKGRKPAAGAQSAGTQQVAAVSSVSPATPFQSVPPTVSQTPVIAATPVPTITANVTSVPVPPAAAPPPPATPIVPVVPPTPPVVKKKGVKRKADTTTPTTSAITASRSESPPPLSDPKQAKVVARRESGGRPIKPPKKDLEDGEVPQHAGKKGKLSEHLRYCDSILREMLSKKHAAYAWPFYKPVDAEALELHDYHDIIKHPMDLSTVKRKMDGREYPDAQGFAADVRLMFSNCYKYNPPDHEVVAMARKLQDVFEMRFAKMPDEPVEAPALPAPAAPMVSKGAESSRSSEESSSDSGSSDSEEERATRLAELQEQLKAVHEQLAALSQAPVNKPKKKKEKKEKEKKKKDKEKEKEKHKVKAEEEKKAKVAPPAKQAQQKKAPAKKANSTTTAGRQLKKGGKQASASYDSEEEEEGLPMSYDEKRQLSLDINRLPGEKLGRVVHIIQSREPSLRDSNPDEIEIDFETLKPTTLRELERYVKSCLQKKQRKPFSASGKKQAAKSKEELAQEKKKELEKRLQDVSGQLSSSKKPARKEKPGSAPSGGPSRLSSSSSSESGSSSSSGSSSDSSDSE。
在一个实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:28的氨基酸51-123或326-398。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRD7蛋白(UniProtKB-Q9NPI1(BRD7_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9NP11的氨基酸148-218。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRD8蛋白(UniProtKB-Q9H0E9(BRD8_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9H0E9的氨基酸724-794或1120-1190。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRD9蛋白(UniProtKB-Q9H8M2(BRD9_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9H8M2的氨基酸153-223。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRDT蛋白(UniProtKB-Q58F21(BRDT_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:29)MSLPSRQTAIIVNPPPPEYINTKKNGRLTNQLQYLQKVVLKDLWKHSFSWPFQRPVDAVKLQLPDYYTIIKNPMDLNTIKKRLENKYYAKASECIEDFNTMFSNCYLYNKPGDDIVLMAQALEKLFMQKLSQMPQEEQVVGVKERIKKGTQQNIAVSSAKEKSSPSATEKVFKQQEIPSVFPKTSISPLNVVQGASVNSSSQTAAQVTKGVKRKADTTTPATSAVKASSEFSPTFTEKSVALPPIKENMPKNVLPDSQQQYNVVKTVKVTEQLRHCSEILKEMLAKKHFSYAWPFYNPVDVNALGLHNYYDVVKNPMDLGTIKEKMDNQEYKDAYKFAADVRLMFMNCYKYNPPDHEVVTMARMLQDVFETHFSKIPIEPVESMPLCYIKTDITETTGRENTNEASSEGNSSDDSEDERVKRLAKLQEQLKAVHQQLQVLSQVPFRKLNKKKEKSKKEKKKEKVNNSNENPRKMCEQMRLKEKSKRNQPKKRKQQFIGLKSEDEDNAKPMNYDEKRQLSLNINKLPGDKLGRVVHIIQSREPSLSNSNPDEIEIDFETLKASTLRELEKYVSACLRKRPLKPPAKKIMMSKEELHSQKKQELEKRLLDVNNQLNSRKRQTKSDKTQPSKAVENVSRLSESSSSSSSSSESESSSSDLSSSDSSDSESEMFPKFTEVKPNDSPSKENVKKMKNECIPPEGRTGVTQIGYCVQDTTSANTTLVHQTTPSHVMPPNHHQLAFNYQELEHLQTVKNISPLQILPPSGDSEQLSNGITVMHPSGDSDTTMLESECQAPVQKDIKIKNADSWKSLGKPVKPSGVMKSSDELFNQFRKAAIEKEVKARTQELIRKHLEQNTKELKASQENQRDLGNGLTVESFSNKIQNKCSGEEQKEHQQSSEAQDKSKLWLLKDRDLARQKEQERRRREAMVGTIDMTLQSDIMTMFENNFD。
在一个实施方式中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:29的氨基酸44-116或287-359。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRPF1蛋白(UniProtKB-P55201(BRPF1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自P55201的氨基酸645-715。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRPF3蛋白(UniProtKB-Q9ULD4(BRPF3_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9ULD4的氨基酸606-676。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自BRWD3蛋白(UniProtKB-Q6RI45(BRWD3_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q6RI45的氨基酸1158-1228或1317-1412。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自CECR2蛋白(UniProtKB-Q9BXF3(CECR2_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9BXF3的氨基酸451-521。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自CREBBP蛋白(UniProtKB-Q92793(CBP_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q92793的氨基酸1103-1175。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自EP300蛋白(UniProtKB-Q09472(EP300_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q09472的氨基酸1067-1139。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自FALZ蛋白(UniProtKB-Q12830(BPTF_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q12830的氨基酸2944-3014。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自GCN5L2蛋白(UniProtKB-Q92830(KAT2A_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q92830的氨基酸745-815。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自KIAA1240蛋白(UniProtKB-Q9ULI0(ATD2B_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9ULI0的氨基酸975-1045。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自LOC93349蛋白(UniProtKB-Q13342(SP140_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q13342的氨基酸796-829。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自MLL蛋白(UniProtKB-Q03164(KMT2A_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q03164的氨基酸1703-1748。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自PB1蛋白(UniProtKB-Q86U86(PB1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q86U86的氨基酸63-134、200-270、400-470、538-608、676-746或792-862。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自PCAF蛋白(UniProtKB-Q92831(KAT2B_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q92831的氨基酸740-810。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自PHIP蛋白(UniProtKB-Q8WWQ0(PHIP_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q8WWQ0的氨基酸1176-1246或1333-1403。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自PRKCBP1蛋白(UniProtKB-Q9ULU4(PKCB1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9ULU4的氨基酸165-235。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自SMARCA2蛋白(UniProtKB-P51531(SMCA2_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自P51531的氨基酸1419-1489。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自SMARCA4蛋白(UniProtKB-P51532(SMCA4_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自P51532的氨基酸1477-1547。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自SP100蛋白(UniProtKB-P23497(SP100_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自P23497的氨基酸761-876。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自SP110蛋白(UniProtKB-Q9HB58(SP110_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9HB58的氨基酸581-676。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自SP140蛋白(UniProtKB-Q13342(SP140_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q13342的氨基酸796-829。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自TAF1蛋白(UniProtKB-P21675(TAF1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自P21675的氨基酸1397-1467或1520-1590。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自TAF1L蛋白(UniProtKB-Q8IZX4(TAF1L_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q8IZX4的氨基酸1416-1486或1539-1609。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自TIF1A蛋白(UniProtKB-O15164(TIF1A_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自O15164的氨基酸932-987。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自TRIM28蛋白(UniProtKB-Q13263(TIF1B_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q13263的氨基酸697-801。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自TRIM33蛋白(UniProtKB-Q9UPN9(TRI33_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9UPN9的氨基酸974-1046。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自TRIM66蛋白(UniProtKB-O15016(TRI66_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自O15016的氨基酸1056-1128。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自WDR9蛋白(UniProtKB-Q9NSI6(BRWD1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9NSI6的氨基酸1177-1247或1330-1400。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自ZMYND11蛋白(UniProtKB-Q15326(ZMY11_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q15326的氨基酸168-238。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自MLL4蛋白(UniProtKB-Q9UMN6(KMT2B_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG是衍生自Q9UMN6的氨基酸1395-1509。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自雌激素受体(人类(UniProtKB-P03372-1，通过引用并入本文))的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:4)MTMTLHTKASGMALLHQIQGNELEPLNRPQLKIPLERPLGEVYLDSSKPAVYNYPEGAAYEFNAAAAANAQVYGQTGLPYGPGSEAAAFGSNGLGGFPPLNSVSPSPLMLLHPPPQLSPFLQPHGQQVPYYLENEPSGYTVREAGPPAFYRPNSDNRRQGGRERLASTNDKGSMAMESAKETRYCAVCNDYASGYHYGVWSCEGCKAFFKRSIQGHNDYMCPATNQCTIDKNRRKSCQACRLRKCYEVGMMKGGIRKDRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEG FPATV。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自雌激素受体配体结合结构域的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:5)SLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRL。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自雄激素受体(UniProtKB-P10275(ANDR_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:6)MEVQLGLGRVYPRPPSKTYRGAFQNLFQSVREVIQNPGPRHPEAASAAPPGASLLLLQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQETSPRQQQQQQGEDGSPQAHRRGPTGYLVLDEEQQPSQPQSALECHPERGCVPEPGAAVAASKGLPQQLPAPPDEDDSAAPSTLSLLGPTFPGLSSCSADLKDILSEASTMQLLQQQQQEAVSEGSSSGRAREASGAPTSSKDNYLGGTSTISDNAKELCKAVSVSMGLGVEALEHLSPGEQLRGDCMYAPLLGVPPAVRPTPCAPLAECKGSLLDDSAGKSTEDTAEYSPFKGGYTKGLEGESLGCSGSAAAGSSGTLELPSTLSLYKSGALDEAAAYQSRDYYNFPLALAGPPPPPPPPHPHARIKLENPLDYGSAWAAAAAQCRYGDLASLHGAGAAGPGSGSPSAAASSSWHTLFTAEEGQLYGPCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGEAGAVAPYGYTRPPQGLAGQESDFTAPDVWYPGGMVSRVPYPSPTCVKSEMGPWMDSYSGPYGDMRLETARDHVLPIDYYFPPQKTCLICGDEASGCHYGALTCGSCKVFFKRAAEGKQKYLCASRNDCTIDKFRRKNCPSCRLRKCYEAGMTLGARKLKKLGNLKLQEEGEASSTTSPTEETTQKLTVSHIEGYECQPIFLNVLEAIEPGVVCAGHDNNQPDSFAALLSSLNELGERQLVHVVKWAKALPGFRNLHVDDQMAVIQYSWMGLMVFAMGWRSFTNVNSRMLYFAPDLVFNEYRMHKSRMYSQCVRMRHLSQEFGWLQITPQEFLCMKALLLFSIIPVDGLKNQKFFDELRMNYIKELDRIIACKRKNPTSCSRRFYQLTKLLDSVQPIARELHQFTFDLLIKSHMVSVDFPEMMAEIISVQVPKILSGKVKPIYFHTQ。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自雄激素受体配体结合结构域的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:24)DNNQPDSFAALLSSLNELGERQLVHVVKWAKALPGFRNLHVDDQMAVIQYSWMGLMVFAMGWRSFTNVNSRMLYFAPDLVFNEYRMHKSRMYSQCVRMRHLSQEFGWLQITPQEFLCMKALLLFSIIPVDGLKNQKFFDELRMNYIKELDRIIACKRKNPTSCSRRFYQLTKLLDSVQPIARELHQFTFDLLIKSHMVSVDFPEMMAEIISVQVPKILSGKVKPIYFHT。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自视黄酸受体(UniProtKB-P19793)(RXRA_HUMAN)(通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:7)MDTKHFLPLDFSTQVNSSLTSPTGRGSMAAPSLHPSLGPGIGSPGQLHSPISTLSSPINGMGPPFSVISSPMGPHSMSVPTTPTLGFSTGSPQLSSPMNPVSSSEDIKPPLGLNGVLKVPAHPSGNMASFTKHICAICGDRSSGKHYGVYSCEGCKGFFKRTVRKDLTYTCRDNKDCLIDKRQRNRCQYCRYQKCLAMGMKREAVQEERQRGKDRNENEVESTSSANEDMPVERILEAELAVEPKTETYVEANMGLNPSSPNDPVTNICQAADKQLFTLVEWAKRIPHFSELPLDDQVILLRAGWNELLIASFSHRSIAVKDGILLATGLHVHRNSAHSAGVGAIFDRVLTELVSKMRDMQMDKTELGCLRAIVLFNPDSKGLSNPAEVEALREKVYASLEAYCKHKYPEQPGRFAKLLLRLPALRSIGLKCLEHLFFFKLIGDTPIDTFLMEMLEAPHQMT。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自视黄酸受体配体结合结构域的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:25)SANEDMPVERILEAELAVEPKTETYVEANMGLNPSSPNDPVTNICQAADKQLFTLVEWAKRIPHFSELPLDDQVILLRAGWNELLIASFSHRSIAVKDGILLATGLHVHRNSAHSAGVGAIFDRVLTELVSKMRDMQMDKTELGCLRAIVLFNPDSKGLSNPAEVEALREKVYASLEAYCKHKYPEQPGRFAKLLLRLPALRSIGLKCLEHLFFFKLIGDTPIDTFLMEMLEAPHQMT。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自DHFR(大肠杆菌，UniProtKB-Q79DQ2(Q79DQ2_ECOLX)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:8)MNSESVRIYLVAAMGANRVIGNGPNIPWKIPGEQKIFRRLTEGKVVVMGRKTFESIGKPLPNRHTLVISRQANYRATGCVVVSTLSHAIALASELGNELYVAGGAEIYTLALPHAHGVFLSEVHQTFEGDAFFPMLNETEFELVSTETIQAVIPYTHSVYARRNG。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自细菌脱卤素酶的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:9)MAEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTSSYVWRNIIPHVAPTHRCIAPDLIGMGKSDKPDLGYFFDDHVRFMDAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGIAFMEFIRPIPTWDEWPEFARETFQAFRTTDVGRKLIIDQNVFIEGTLPMGVVRPLTEVEMDHYREPFLNPVDREPLWRFPNELPIAGEPANIVALVEEYMDWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAKSLPNCKAVDIGPGLNLLQEDNPDLIGSEIARWLSTLEISG。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自MDM2的N端的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:26)MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRPKPLLLKLLKSVGAQKDTYTMKEVLFYLGQYIMTKRLYDEKQQHIVYCSNDLLGDLFGVPSFSVKEHRKIYTMIYRNLVVV。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自细胞凋亡调节剂Bcl-xL蛋白(UniProtKB–Q07817(B2CL1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:30)MSQSNRELVVDFLSYKLSQKGYSWSQFSDVEENRTEAPEGTESEMETPSAINGNPSWHLADSPAVNGATGHSSSLDAREVIPMAAVKQALREAGDEFELRYRRAFSDLTSQLHITPGTAYQSFEQVVNELFRDGVNWGRIVAFFSFGGALCVESVDKEMQVLVSRIAAWMATYLNDHLEPWIQENGGWDTFVELYGNNAAAESRKGQERFNRWFLTGMTVAGVVLLGSLFSRK。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自CD209抗原(UniProtKB–Q9NNX6(CD209_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:31)MSDSKEPRLQQLGLLEEEQLRGLGFRQTRGYKSLAGCLGHGPLVLQLLSFTLLAGLLVQVSKVPSSISQEQSRQDAIYQNLTQLKAAVGELSEKSKLQEIYQELTQLKAAVGELPEKSKLQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKLQEIYQELTWLKAAVGELPEKSKMQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKQQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKQQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKQQEIYQELTQLKAAVERLCHPCPWEWTFFQGNCYFMSNSQRNWHDSITACKEVGAQLVVIKSAEEQNFLQLQSSRSNRFTWMGLSDLNQEGTWQWVDGSPLLPSFKQYWNRGEPNNVGEEDCEFSGNGWNDDKCNLAKFWICKKSAASCSRDEEQFLSPAPATPNPPPA。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自E3连接酶XIAP(UniProtKB–P98170(XIAP_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:32)MTFNSFEGSKTCVPADINKEEEFVEEFNRLKTFANFPSGSPVSASTLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSPNCRFINGFYLENSATQSTNSGIQNGQYKVENYLGSRDHFALDRPSETHADYLLRTGQVVDISDTIYPRNPAMYSEEARLKSFQNWPDYAHLTPRELASAGLYYTGIGDQVQCFCCGGKLKNWEPCDRAWSEHRRHFPNCFFVLGRNLNIRSESDAVSSDRNFPNSTNLPRNPSMADYEARIFTFGTWIYSVNKEQLARAGFYALGEGDKVKCFHCGGGLTDWKPSEDPWEQHAKWYPGCKYLLEQKGQEYINNIHLTHSLEECLVRTTEKTPSLTRRIDDTIFQNPMVQEAIRMGFSFKDIKKIMEEKIQISGSNYKSLEVLVADLVNAQKDSMQDESSQTSLQKEISTEEQLRRLQEEKLCKICMDRNIAIVFVPCGHLVTCKQCAEAVDKCPMCYTVITFKQKIFMS。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自含杆状病毒IAP重复蛋白2(UniProtKB–Q13490(BIRC2_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:33)MHKTASQRLFPGPSYQNIKSIMEDSTILSDWTNSNKQKMKYDFSCELYRMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKLGDSPIQKHKQLYPSCSFIQNLVSASLGSTSKNTSPMRNSFAHSLSPTLEHSSLFSGSYSSLSPNPLNSRAVEDISSSRTNPYSYAMSTEEARFLTYHMWPLTFLSPSELARAGFYYIGPGDRVACFACGGKLSNWEPKDDAMSEHRRHFPNCPFLENSLETLRFSISNLSMQTHAARMRTFMYWPSSVPVQPEQLASAGFYYVGRNDDVKCFCCDGGLRCWESGDDPWVEHAKWFPRCEFLIRMKGQEFVDEIQGRYPHLLEQLLSTSDTTGEENADPPIIHFGPGESSSEDAVMMNTPVVKSALEMGFNRDLVKQTVQSKILTTGENYKTVNDIVSALLNAEDEKREEEKEKQAEEMASDDLSLIRKNRMALFQQLTCVLPILDNLLKANVINKQEHDIIKQKTQIPLQARELIDTILVKGNAAANIFKNCLKEIDSTLYKNLFVDKNMKYIPTEDVSGLSLEEQLRRLQEERTCKVCMDKEVSVVFIPCGHLVVCQECAPSLRKCPICRGIIKGTVRTFLS。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自造血前列腺素D合成酶(UniProtKB–O60760(HPGDS_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:34)MPNYKLTYFNMRGRAEIIRYIFAYLDIQYEDHRIEQADWPEIKSTLPFGKIPILEVDGLTLHQSLAIARYLTKNTDLAGNTEMEQCHVDAIVDTLDDFMSCFPWAEKKQDVKEQMFNELLTYNAPHLMQDLDTYLGGREWLIGNSVTWADFYWEICSTTLLVFKPDLLDNHPRLVTLRKKVQAIPAVANWIKRRPQTKL。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自GTPase k-RAS(UniProtKB–P01116(RASK_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:35)MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自聚-ADP-核糖聚合酶15(UniProtKB–Q460N3(PAR15_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:36)MAAPGPLPAAALSPGAPTPRELMHGVAGVTSRAGRDREAGSVLPAGNRGARKASRRSSSRSMSRDNKFSKKDCLSIRNVVASIQTKEGLNLKLISGDVLYIWADVIVNSVPMNLQLGGGPLSRAFLQKAGPMLQKELDDRRRETEEKVGNIFMTSGCNLDCKAVLHAVAPYWNNGAETSWQIMANIIKKCLTTVEVLSFSSITFPMIGTGSLQFPKAVFAKLILSEVFEYSSSTRPITSPLQEVHFLVYTNDDEGCQAFLDEFTNWSRINPNKARIPMAGDTQGVVGTVSKPCFTAYEMKIGAITFQVATGDIATEQVDVIVNSTARTFNRKSGVSRAILEGAGQAVESECAVLAAQPHRDFIITPGGCLKCKIIIHVPGGKDVRKTVTSVLEECEQRKYTSVSLPAIGTGNAGKNPITVADNIIDAIVDFSSQHSTPSLKTVKVVIFQPELLNIFYDSMKKRDLSASLNFQSTFSMTTCNLPEHWTDMNHQLFCMVQLEPGQSEYNTIKDKFTRTCSSYAIEKIERIQNAFLWQSYQVKKRQMDIKNDHKNNERLLFHGTDADSVPYVNQHGFNRSCAGKNAVSYGKGTYFAVDASYSAKDTYSKPDSNGRKHMYVVRVLTGVFTKGRAGLVTPPPKNPHNPTDLFDSVTNNTRSPKLFVVFFDNQAYPEYLITFTA。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自聚-ADP-核糖聚合酶14(UniProtKB–Q460N5(PAR14_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:37)MAVPGSFPLLVEGSWGPDPPKNLNTKLQMYFQSPKRSGGGECEVRQDPRSPSRFLVFFYPEDVRQKVLERKNHELVWQGKGTFKLTVQLPATPDEIDHVFEEELLTKESKTKEDVKEPDVSEELDTKLPLDGGLDKMEDIPEECENISSLVAFENLKANVTDIMLILLVENISGLSNDDFQVEIIRDFDVAVVTFQKHIDTIRFVDDCTKHHSIKQLQLSPRLLEVTNTIRVENLPPGADDYSLKLFFENPYNGGGRVANVEYFPEESSALIEFFDRKVLDTIMATKLDFNKMPLSVFPYYASLGTALYGKEKPLIKLPAPFEESLDLPLWKFLQKKNHLIEEINDEMRRCHCELTWSQLSGKVTIRPAATLVNEGRPRIKTWQADTSTTLSSIRSKYKVNPIKVDPTMWDTIKNDVKDDRILIEFDTLKEMVILAGKSEDVQSIEVQVRELIESTTQKIKREEQSLKEKMIISPGRYFLLCHSSLLDHLLTECPEIEICYDRVTQHLCLKGPSADVYKAKCEIQEKVYTMAQKNIQVSPEIFQFLQQVNWKEFSKCLFIAQKILALYELEGTTVLLTSCSSEALLEAEKQMLSALNYKRIEVENKEVLHGKKWKGLTHNLLKKQNSSPNTVIINELTSETTAEVIITGCVKEVNETYKLLFNFVEQNMKIERLVEVKPSLVIDYLKTEKKLFWPKIKKVNVQVSFNPENKQKGILLTGSKTEVLKAVDIVKQVWDSVCVKSVHTDKPGAKQFFQDKARFYQSEIKRLFGCYIELQENEVMKEGGSPAGQKCFSRTVLAPGVVLIVQQGDLARLPVDVVVNASNEDLKHYGGLAAALSKAAGPELQADCDQIVKREGRLLPGNATISKAGKLPYHHVIHAVGPRWSGYEAPRCVYLLRRAVQLSLCLAEKYKYRSIAIPAISSGVFGFPLGRCVETIVSAIKENFQFKKDGHCLKEIYLVDVSEKTVEAFAEAVKTVFKATLPDTAAPPGLPPAAAGPGKTSWEKGSLVSPGGLQMLLVKEGVQNAKTDVVVNSVPLDLVLSRGPLSKSLLEKAGPELQEELDTVGQGVAVSMGTVLKTSSWNLDCRYVLHVVAPEWRNGSTSSLKIMEDIIRECMEITESLSLKSIAFPAIGTGNLGFPKNIFAELIISEVFKFSSKNQLKTLQEVHFLLHPSDHENIQAFSDEFARRANGNLVSDKIPKAKDTQGFYGTVSSPDSGVYEMKIGSIIFQVASGDITKEEADVIVNSTSNSFNLKAGVSKAILECAGQNVERECSQQAQQRKNDYIITGGGFLRCKNIIHVIGGNDVKSSVSSVLQECEKKNYSSICLPAIGTGNAKQHPDKVAEAIIDAIEDFVQKGSAQSVKKVKVVIFLPQVLDVFYANMKKREGTQLSSQQSVMSKLASFLGFSKQSPQKKNHLVLEKKTESATFRVCGENVTCVEYAISWLQDLIEKEQCPYTSEDECIKDFDEKEYQELNELQKKLNINISLDHKRPLIKVLGISRDVMQARDEIEAMIKRVRLAKEQESRADCISEFIEWQYNDNNTSHCFNKMTNLKLEDARREKKKTVDVKINHRHYTVNLNTYTATDTKGHSLSVQRLTKSKVDIPAHWSDMKQQNFCVVELLPSDPEYNTVASKFNQTCSHFRIEKIERIQNPDLWNSYQAKKKTMDAKNGQTMNEKQLFHGTDAGSVPHVNRNGFNRSYAGKNAVAYGKGTYFAVNANYSANDTYSRPDANGRKHVYYVRVLTGIYTHGNHSLIVPPSKNPQNPTDLYDTVTDNVHHPSLFVAFYDYQAYPEYLITFRK。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自超氧化物歧化酶(UniProtKB–P00441(SODC_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:38)MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自视网膜视杆视紫红质敏感性cGMP 3',5'-环磷酸二酯酶亚基δ(UniProtKB–O43924(PDE6D_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:39)MSAKDERAREILRGFKLNWMNLRDAETGKILWQGTEDLSVPGVEHEARVPKKILKCKAVSRELNFSSTEQMEKFRLEQKVYFKGQCLEEWFFEFGFVIPNSTNTWQSLIEAAPESQMMPASVLTGNVIIETKFFDDDLLVSTSRVRLFYV。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自诱导髓性白血病细胞分化蛋白Mcl-1(UniProtKB–Q07820(MCL1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:40)MFGLKRNAVIGLNLYCGGAGLGAGSGGATRPGGRLLATEKEASARREIGGGEAGAVIGGSAGASPPSTLTPDSRRVARPPPIGAEVPDVTATPARLLFFAPTRRAAPLEEMEAPAADAIMSPEEELDGYEPEPLGKRPAVLPLLELVGESGNNTSTDGSLPSTPPPAEEEEDELYRQSLEIISRYLREQATGAKDTKPMGRSGATSRKALETLRRVGDGVQRNHETAFQGMLRKLDIKNEDDVKSLSRVMIHVFSDGVTNWGRIVTLISFGAFVAKHLKTINQESCIEPLAESITDVLVRTKRDWLVKQRGWDGFVEFFHVEDLEGGIRNVLLAFAGVAGVGAGLAYLIR。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自细胞凋亡调节剂Bcl-2(UniProtKB–Q07820(Bcl2_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:41)MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAGDVGAAPPGAAPAPGIFSSQPGHTPHPAASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALSPVPPVVHLTLRQAGDDFSRRYRRDFAEMSSQLHLTPFTARGRFATVVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIALWMTEYLNRHLHTWIQDNGGWDAFVELYGPSMRPLFDFSWLSLKTLLSLALVGACITLGAYLGHK。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA-相互作用1(UniProtKB–Q13526(PIN1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:42)MADEEKLPPGWEKRMSRSSGRVYYFNHITNASQWERPSGNSSSGGKNGQGEPARVRCSHLLVKHSQSRRPSSWRQEKITRTKEEALELINGYIQKIKSGEEDFESLASQFSDCSSAKARGDLGAFSRGQMQKPFEDASFALRTGEMSGPVFTDSGIHIILRTE。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自端锚聚合酶1(UniProtKB–O95271(TNKS1_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:43)MAASRRSQHHHHHHQQQLQPAPGASAPPPPPPPPLSPGLAPGTTPASPTASGLAPFASPRHGLALPEGDGSRDPPDRPRSPDPVDGTSCCSTTSTICTVAAAPVVPAVSTSSAAGVAPNPAGSGSNNSPSSSSSPTSSSSSSPSSPGSSLAESPEAAGVSSTAPLGPGAAGPGTGVPAVSGALRELLEACRNGDVSRVKRLVDAANVNAKDMAGRKSSPLHFAAGFGRKDVVEHLLQMGANVHARDDGGLIPLHNACSFGHAEVVSLLLCQGADPNARDNWNYTPLHEAAIKGKIDVCIVLLQHGADPNIRNTDGKSALDLADPSAKAVLTGEYKKDELLEAARSGNEEKLMALLTPLNVNCHASDGRKSTPLHLAAGYNRVRIVQLLLQHGADVHAKDKGGLVPLHNACSYGHYEVTELLLKHGACVNAMDLWQFTPLHEAASKNRVEVCSLLLSHGADPTLVNCHGKSAVDMAPTPELRERLTYEFKGHSLLQAAREADLAKVKKTLALEIINFKQPQSHETALHCAVASLHPKRKQVTELLLRKGANVNEKNKDFMTPLHVAAERAHNDVMEVLHKHGAKMNALDTLGQTALHRAALAGHLQTCRLLLSYGSDPSIISLQGFTAAQMGNEAVQQILSESTPIRTSDVDYRLLEASKAGDLETVKQLCSSQNVNCRDLEGRHSTPLHFAAGYNRVSVVEYLLHHGADVHAKDKGGLVPLHNACSYGHYEVAELLVRHGASVNVADLWKFTPLHEAAAKGKYEICKLLLKHGADPTKKNRDGNTPLDLVKEGDTDIQDLLRGDAALLDAAKKGCLARVQKLCTPENINCRDTQGRNSTPLHLAAGYNNLEVAEYLLEHGADVNAQDKGGLIPLHNAASYGHVDIAALLIKYNTCVNATDKWAFTPLHEAAQKGRTQLCALLLAHGADPTMKNQEGQTPLDLATADDIRALLIDAMPPEALPTCFKPQATVVSASLISPASTPSCLSAASSIDNLTGPLAELAVGGASNAGDGAAGTERKEGEVAGLDMNISQFLKSLGLEHLRDIFETEQITLDVLADMGHEELKEIGINAYGHRHKLIKGVERLLGGQQGTNPYLTFHCVNQGTILLDLAPEDKEYQSVEEEMQSTIREHRDGGNAGGIFNRYNVIRIQKVVNKKLRERFCHRQKEVSEENHNHHNERMLFHGSPFINAIIHKGFDERHAYIGGMFGAGIYFAENSSKSNQYVYGIGGGTGCPTHKDRSCYICHRQMLFCRVTLGKSFLQFSTMKMAHAPPGHHSVIGRPSVNGLAYAEYVIYRGEQAYPEYLITYQIMKPEAPSQTATAAEQKT。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自端锚聚合酶2(UniProtKB–O9H2K2(TNKS2_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:44)MSGRRCAGGGAACASAAAEAVEPAARELFEACRNGDVERVKRLVTPEKVNSRDTAGRKSTPLHFAAGFGRKDVVEYLLQNGANVQARDDGGLIPLHNACSFGHAEVVNLLLRHGADPNARDNWNYTPLHEAAIKGKIDVCIVLLQHGAEPTIRNTDGRTALDLADPSAKAVLTGEYKKDELLESARSGNEEKMMALLTPLNVNCHASDGRKSTPLHLAAGYNRVKIVQLLLQHGADVHAKDKGDLVPLHNACSYGHYEVTELLVKHGACVNAMDLWQFTPLHEAASKNRVEVCSLLLSYGADPTLLNCHNKSAIDLAPTPQLKERLAYEFKGHSLLQAAREADVTRIKKHLSLEMVNFKHPQTHETALHCAAASPYPKRKQICELLLRKGANINEKTKEFLTPLHVASEKAHNDVVEVVVKHEAKVNALDNLGQTSLHRAAYCGHLQTCRLLLSYGCDPNIISLQGFTALQMGNENVQQLLQEGISLGNSEADRQLLEAAKAGDVETVKKLCTVQSVNCRDIEGRQSTPLHFAAGYNRVSVVEYLLQHGADVHAKDKGGLVPLHNACSYGHYEVAELLVKHGAVVNVADLWKFTPLHEAAAKGKYEICKLLLQHGADPTKKNRDGNTPLDLVKDGDTDIQDLLRGDAALLDAAKKGCLARVKKLSSPDNVNCRDTQGRHSTPLHLAAGYNNLEVAEYLLQHGADVNAQDKGGLIPLHNAASYGHVDVAALLIKYNACVNATDKWAFTPLHEAAQKGRTQLCALLLAHGADPTLKNQEGQTPLDLVSADDVSALLTAAMPPSALPSCYKPQVLNGVRSPGATADALSSGPSSPSSLSAASSLDNLSGSFSELSSVVSSSGTEGASSLEKKEVPGVDFSITQFVRNLGLEHLMDIFEREQITLDVLVEMGHKELKEIGINAYGHRHKLIKGVERLISGQQGLNPYLTLNTSGSGTILIDLSPDDKEFQSVEEEMQSTVREHRDGGHAGGIFNRYNILKIQKVCNKKLWERYTHRRKEVSEENHNHANERMLFHGSPFVNAIIHKGFDERHAYIGGMFGAGIYFAENSSKSNQYVYGIGGGTGCPVHKDRSCYICHRQLLFCRVTLGKSFLQFSAMKMAHSPPGHHSVTGRPSVNGLALAEYVIYRGEQAYPEYLITYQIMRPEGMVDG。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤核苷酸(UniProtKB–P36639(8ODP_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:45)MYWSNQITRRLGERVQGFMSGISPQQMGEPEGSWSGKNPGTMGASRLYTLVLVLQPQRVLLGMKKRGFGAGRWNGFGGKVQEGETIEDGARRELQEESGLTVDALHKVGQIVFEFVGEPELMDVHVFCTDSIQGTPVESDEMRPCWFQLDQIPFKDMWPDDSYWFPLLLQKKKFHGYFKFQGQDTILDYTLREVDTV。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(UniProtKB–P12931(SRC_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:46)MGSNKSKPKDASQRRRSLEPAENVHGAGGGAFPASQTPSKPASADGHRGPSAAFAPAAAEPKLFGGFNSSDTVTSPQRAGPLAGGVTTFVALYDYESRTETDLSFKKGERLQIVNNTEGDWWLAHSLSTGQTGYIPSNYVAPSDSIQAEEWYFGKITRRESERLLLNAENPRGTFLVRESETTKGAYCLSVSDFDNAKGLNVKHYKIRKLDSGGFYITSRTQFNSLQQLVAYYSKHADGLCHRLTTVCPTSKPQTQGLAKDAWEIPRESLRLEVKLGQGCFGEVWMGTWNGTTRVAIKTLKPGTMSPEAFLQEAQVMKKLRHEKLVQLYAVVSEEPIYIVTEYMSKGSLLDFLKGETGKYLRLPQLVDMAAQIASGMAYVERMNYVHRDLRAANILVGENLVCKVADFGLARLIEDNEYTARQGAKFPIKWTAPEAALYGRFTIKSDVWSFGILLTELTTKGRVPYPGMVNREVLDQVERGYRMPCPPECPESLHDLMCQCWRKEPEERPTFEYLQAFLEDYFTSTEPQYQPGENL。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自前列腺素E合成酶(UniProtKB–O14684(PTGES_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:47)MPAHSLVMSSPALPAFLLCSTLLVIKMYVVAIITGQVRLRKKAFANPEDALRHGGPQYCRSDPDVERCLRAHRNDMETIYPFLFLGFVYSFLGPNPFVAWMHFLVFLVGRVAHTVAYLGKLRAPIRSVTYTLAQLPCASMALQILWEAARHL。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白(UniProtKB–P20292(AL5AP_HUMAN)通过引用并入本文)，的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:48)MDQETVGNVVLLAIVTLISVVQNGFFAHKVEHESRTQNGRSFQRTGTLAFERVYTANQNCVDAYPTFLAVLWSAGLLCSQVPAAFAGLMYLFVRQKYFVGYLGERTQSTPGYIFGKRIILFLFLMSVAGIFNYYLIFFFGSDFENYIKTISTTISPLLLIP。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自来自脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白质(UniProtKB–P15090(FABP4_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:49)MCDAFVGTWKLVSSENFDDYMKEVGVGFATRKVAGMAKPNMIISVNGDVITIKSESTFKNTEISFILGQEFDEVTADDRKVKSTITLDGGVLVHVQKWDGKSTTIKRKREDDKLVVECVMKGVTSTRVYERA。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自PH-相互作用蛋白(UniProtKB–Q8WWQ0(PHIP_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:50)MSCERKGLSELRSELYFLIARFLEDGPCQQAAQVLIREVAEKELLPRRTDWTGKEHPRTYQNLVKYYRHLAPDHLLQICHRLGPLLEQEIPQSVPGVQTLLGAGRQSLLRTNKSCKHVVWKGSALAALHCGRPPESPVNYGSPPSIADTLFSRKLNGKYRLERLVPTAVYQHMKMHKRILGHLSSVYCVTFDRTGRRIFTGSDDCLVKIWATDDGRLLATLRGHAAEISDMAVNYENTMIAAGSCDKMIRVWCLRTCAPLAVLQGHSASITSLQFSPLCSGSKRYLSSTGADGTICFWLWDAGTLKINPRPAKFTERPRPGVQMICSSFSAGGMFLATGSTDHIIRVYFFGSGQPEKISELEFHTDKVDSIQFSNTSNRFVSGSRDGTARIWQFKRREWKSILLDMATRPAGQNLQGIEDKITKMKVTMVAWDRHDNTVITAVNNMTLKVWNSYTGQLIHVLMGHEDEVFVLEPHPFDPRVLFSAGHDGNVIVWDLARGVKIRSYFNMIEGQGHGAVFDCKCSPDGQHFACTDSHGHLLIFGFGSSSKYDKIADQMFFHSDYRPLIRDANNFVLDEQTQQAPHLMPPPFLVDVDGNPHPSRYQRLVPGRENCREEQLIPQMGVTSSGLNQVLSQQANQEISPLDSMIQRLQQEQDLRRSGEAVISNTSRLSRGSISSTSEVHSPPNVGLRRSGQIEGVRQMHSNAPRSEIATERDLVAWSRRVVVPELSAGVASRQEEWRTAKGEEEIKTYRSEEKRKHLTVPKENKIPTVSKNHAHEHFLDLGESKKQQTNQHNYRTRSALEETPRPSEEIENGSSSSDEGEVVAVSGGTSEEEERAWHSDGSSSDYSSDYSDWTADAGINLQPPKKVPKNKTKKAESSSDEEEESEKQKQKQIKKEKKKVNEEKDGPISPKKKKPKERKQKRLAVGELTENGLTLEEWLPSTWITDTIPRRCPFVPQMGDEVYYFRQGHEAYVEMARKNKIYSINPKKQPWHKMELREQELMKIVGIKYEVGLPTLCCLKLAFLDPDTGKLTGGSFTMKYHDMPDVIDFLVLRQQFDDAKYRRWNIGDRFRSVIDDAWWFGTIESQEPLQLEYPDSLFQCYNVCWDNGDTEKMSPWDMELIPNNAVFPEELGTSVPLTDGECRSLIYKPLDGEWGTNPRDEECERIVAGINQLMTLDIASAFVAPVDLQAYPMYCTVVAYPTDLSTIKQRLENRFYRRVSSLMWEVRYIEHNTRTFNEPGSPIVKSAKFVTDLLLHFIKDQTCYNIIPLYNSMKKKVLSDSEDEEKDADVPGTSTRKRKDHQPRRRLRNRAQSYDIQAWKKQCEELLNLIFQCEDSEPFRQPVDLLEYPDYRDIIDTPMDFATVRETLEAGNYESPMELCKDVRLIFSNSKAYTPSKRSRIYSMSLRLSAFFEEHISSVLSDYKSALRFHKRNTITKRRKKRNRSSSVSSSAASSPERKKRILKPQLKSESSTSAFSTPTRSIPPRHNAAQINGKTESSSVVRTRSNRVVVDPVVTEQPSTSSAAKTFITKANASAIPGKTILENSVKHSKALNTLSSPGQSSFSHGTRNNSAKENMEKEKPVKRKMKSSVLPKASTLSKSSAVIEQGDCKNNALVPGTIQVNGHGGQPSKLVKRGPGRKPKVEVNTNSGEIIHKKRGRKPKKLQYAKPEDLEQNNVHPIRDEVLPSSTCNFLSETNNVKEDLLQKKNRGGRKPKRKMKTQKLDADLLVPASVKVLRRSNRKKIDDPIDEEEEFEELKGSEPHMRTRNQGRRTAFYNEDDSEEEQRQLLFEDTSLTFGTSSRGRVRKLTEKAKANLIGW。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自SUMO-缀合酶UBC9(UniProtKB–P63279(UBC9_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:51)MSGIALSRLAQERKAWRKDHPFGFVAVPTKNPDGTMNLMNWECAIPGKKGTPWEGGLFKLRMLFKDDYPSSPPKCKFEPPLFHPNVYPSGTVCLSILEEDKDWRPAITIKQILLGIQELLNEPNIQDPAQAEAYTIYCQNRVEYEKRVRAQAKKFAPS。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自蛋白S100-A7(UniProtKB–P31151(S10A7_HUMAN)通过引用并入本文，的氨基酸序列)或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:52)MSNTQAERSIIGMIDMFHKYTRRDDKIEKPSLLTMMKENFPNFLSACDKKGTNYLADVFEKKDKNEDKKIDFSEFLSLLGDIATDYHKQSHGAAPCSGGSQ。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自膜结合的磷脂酶A2(UniProtKB–P14555(PA2GA_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:53)MKTLLLLAVIMIFGLLQAHGNLVNFHRMIKLTTGKEAALSYGFYGCHCGVGGRGSPKDATDRCCVTHDCCYKRLEKRGCGTKFLSYKFSNSGSRITCAKQDSCRSQLCECDKAAATCFARNKTTYNKKYQYYSNKHCRGSTPRC。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自组蛋白脱乙酰酶6(UniProtKB–Q9UBN7(HDAC6_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:54)MTSTGQDSTTTRQRRSRQNPQSPPQDSSVTSKRNIKKGAVPRSIPNLAEVKKKGKMKKLGQAMEEDLIVGLQGMDLNLEAEALAGTGLVLDEQLNEFHCLWDDSFPEGPERLHAIKEQLIQEGLLDRCVSFQARFAEKEELMLVHSLEYIDLMETTQYMNEGELRVLADTYDSVYLHPNSYSCACLASGSVLRLVDAVLGAEIRNGMAIIRPPGHHAQHSLMDGYCMFNHVAVAARYAQQKHRIRRVLIVDWDVHHGQGTQFTFDQDPSVLYFSIHRYEQGRFWPHLKASNWSTTGFGQGQGYTINVPWNQVGMRDADYIAAFLHVLLPVALEFQPQLVLVAAGFDALQGDPKGEMAATPAGFAQLTHLLMGLAGGKLILSLEGGYNLRALAEGVSASLHTLLGDPCPMLESPGAPCRSAQASVSCALEALEPFWEVLVRSTETVERDNMEEDNVEESEEEGPWEPPVLPILTWPVLQSRTGLVYDQNMMNHCNLWDSHHPEVPQRILRIMCRLEELGLAGRCLTLTPRPATEAELLTCHSAEYVGHLRATEKMKTRELHRESSNFDSIYICPSTFACAQLATGAACRLVEAVLSGEVLNGAAVVRPPGHHAEQDAACGFCFFNSVAVAARHAQTISGHALRILIVDWDVHHGNGTQHMFEDDPSVLYVSLHRYDHGTFFPMGDEGASSQIGRAAGTGFTVNVAWNGPRMGDADYLAAWHRLVLPIAYEFNPELVLVSAGFDAARGDPLGGCQVSPEGYAHLTHLLMGLASGRIILILEGGYNLTSISESMAACTRSLLGDPPPLLTLPRPPLSGALASITETIQVHRRYWRSLRVMKVEDREGPSSSKLVTKKAPQPAKPRLAERMTTREKKVLEAGMGKVTSASFGEESTPGQTNSETAVVALTQDQPSEAATGGATLAQTISEAAIGGAMLGQTTSEEAVGGATPDQTTSEETVGGAILDQTTSEDAVGGATLGQTTSEEAVGGATLAQTTSEAAMEGATLDQTTSEEAPGGTELIQTPLASSTDHQTPPTSPVQGTTPQISPSTLIGSLRTLELGSESQGASESQAPGEENLLGEAAGGQDMADSMLMQGSRGLTDQAIFYAVTPLPWCPHLVAVCPIPAAGLDVTQPCGDCGTIQENWVCLSCYQVYCGRYINGHMLQHHGNSGHPLVLSYIDLSAWCYYCQAYVHHQALLDVKNIAHQNKFGEDMPHPH。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自激活蛋白原(prosaposin)(UniProtKB–P07602(SAP_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:55)MYALFLLASLLGAALAGPVLGLKECTRGSAVWCQNVKTASDCGAVKHCLQTVWNKPTVKSLPCDICKDVVTAAGDMLKDNATEEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEVCSALNLCESLQKHLAELNHQKQLESNKIPELDMTEVVAPFMANIPLLLYPQDGPRSKPQPKDNGDVCQDCIQMVTDIQTAVRTNSTFVQALVEHVKEECDRLGPGMADICKNYISQYSEIAIQMMMHMQPKEICALVGFCDEVKEMPMQTLVPAKVASKNVIPALELVEPIKKHEVPAKSDVYCEVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCSKLPKSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSGTRLPALTVHVTQPKDGGFCEVCKKLVGYLDRNLEKNSTKQEILAALEKGCSFLPDPYQKQCDQFVAEYEPVLIEILVEVMDPSFVCLKIGACPSAHKPLLGTEKCIWGPSYWCQNTETAAQCNAVEHCKRHVWN。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自载脂蛋白a(UniProtKB–P08519(APOA_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:56)MEHKEVVLLLLLFLKSAAPEQSHVVQDCYHGDGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHNRTTENYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDPVAAPYCYTRDPSVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTITPIPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYQGTYFITVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPAYYPNAGLIKNYCRNPDPVAAPWCYTTDPSVRWEYCNLTRCSDAEWTAFVPPNVILAPSLEAFFEQALTEETPGVQDCYYHYGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHSRTPENYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCLVTESSVLATLTVVPDPSTEASSEEAPTEQSPGVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEISPWCYTMDPNVRWEYCNLTQCPVTESSVLATSTAVSEQAPTEQSPTVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCPVMESTLLTTPTVVPVPSTELPSEEAPTENSTGVQDCYRGDGQSYRGTLSTTITGRTCQSWSSMTPHWHRRIPLYYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTRCPVTESSVLTTPTVAPVPSTEAPSEQAPPEKSPVVQDCYHGDGRSYRGISSTTVTGRTCQSWSSMIPHWHQRTPENYPNAGLTENYCRNPDSGKQPWCYTTDPCVRWEYCNLTQCSETESGVLETPTVVPVPSMEAHSEAAPTEQTPVVRQCYHGNGQSYRGTFSTTVTGRTCQSWSSMTPHRHQRTPENYPNDGLTMNYCRNPDADTGPWCFTMDPSIRWEYCNLTRCSDTEGTVVAPPTVIQVPSLGPPSEQDCMFGNGKGYRGKKATTVTGTPCQEWAAQEPHRHSTFIPGTNKWAGLEKNYCRNPDGDINGPWCYTMNPRKLFDYCDIPLCASSSFDCGKPQVEPKKCPGSIVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGKHFCGGTLISPEWVLTAAHCLKKSSRPSSYKVILGAHQEVNLESHVQEIEVSRLFLEPTQADIALLKLSRPAVITDKVMPACLPSPDYMVTARTECYITGWGETQGTFGTGLLKEAQLLVIENEVCNHYKYICAEHLARGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYARVSRFVTWIEGMMRNN。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自乳糖谷胱甘肽(lactoglutathione)裂解酶(UniProtKB–Q04760(LGUL_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:57)MAEPQPPSGGLTDEAALSCCSDADPSTKDFLLQQTMLRVKDPKKSLDFYTRVLGMTLIQKCDFPIMKFSLYFLAYEDKNDIPKEKDEKIAWALSRKATLELTHNWGTEDDETQSYHNGNSDPRGFGHIGIAVPDVYSACKRFEELGVKFVKKPDDGKMKGLAFIQDPDGYWIEILNPNKMATLM。
在一个实施方式中，dTAG具有衍生自蛋白质丝状肌动蛋白结合蛋白抗体(afadin)(UniProtKB–P55196(AFAD_HUMAN)通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方式中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:58)MSAGGRDEERRKLADIIHHWNANRLDLFEISQPTEDLEFHGVMRFYFQDKAAGNFATKCIRVSSTATTQDVIETLAEKFRPDMRMLSSPKYSLYEVHVSGERRLDIDEKPLVVQLNWNKDDREGRFVLKNENDAIPPKKAQSNGPEKQEKEGVIQNFKRTLSKKEKKEKKKREKEALRQASDKDDRPFQGEDVENSRLAAEVYKDMPETSFTRTISNPEVVMKRRRQQKLEKRMQEFRSSDGRPDSGGTLRIYADSLKPNIPYKTILLSTTDPADFAVAEALEKYGLEKENPKDYCIARVMLPPGAQHSDEKGAKEIILDDDECPLQIFREWPSDKGILVFQLKRRPPDHIPKKTKKHLEGKTPKGKERADGSGYGSTLPPEKLPYLVELSPGRRNHFAYYNYHTYEDGSDSRDKPKLYRLQLSVTEVGTEKLDDNSIQLFGPGIQPHHCDLTNMDGVVTVTPRSMDAETYVEGQRISETTMLQSGMKVQFGASHVFKFVDPSQDHALAKRSVDGGLMVKGPRHKPGIVQETTFDLGGDIHSGTALPTSKSTTRLDSDRVSSASSTAERGMVKPMIRVEQQPDYRRQESRTQDASGPELILPASIEFRESSEDSFLSAIINYTNSSTVHFKLSPTYVLYMACRYVLSNQYRPDISPTERTHKVIAVVNKMVSMMEGVIQKQKNIAGALAFWMANASELLNFIKQDRDLSRITLDAQDVLAHLVQMAFKYLVHCLQSELNNYMPAFLDDPEENSLQRPKIDDVLHTLTGAMSLLRRCRVNAALTIQLFSQLFHFINMWLFNRLVTDPDSGLCSHYWGAIIRQQLGHIEAWAEKQGLELAADCHLSRIVQATTLLTMDKYAPDDIPNINSTCFKLNSLQLQALLQNYHCAPDEPFIPTDLIENVVTVAENTADELARSDGREVQLEEDPDLQLPFLLPEDGYSCDVVRNIPNGLQEFLDPLCQRGFCRLIPHTRSPGTWTIYFEGADYESHLLRENTELAQPLRKEPEIITVTLKKQNGMGLSIVAAKGAGQDKLGIYVKSVVKGGAADVDGRLAAGDQLLSVDGRSLVGLSQERAAELMTRTSSVVTLEVAKQGAIYHGLATLLNQPSPMMQRISDRRGSGKPRPKSEGFELYNNSTQNGSPESPQLPWAEYSEPKKLPGDDRLMKNRADHRSSPNVANQPPSPGGKSAYASGTTAKITSVSTGNLCTEEQTPPPRPEAYPIPTQTYTREYFTFPASKSQDRMAPPQNQWPNYEEKPHMHTDSNHSSIAIQRVTRSQEELREDKAYQLERHRIEAAMDRKSDSDMWINQSSSLDSSTSSQEHLNHSSKSVTPASTLTKSGPGRWKTPAAIPATPVAVSQPIRTDLPPPPPPPPVHYAGDFDGMSMDLPLPPPPSANQIGLPSAQVAAAERRKREEHQRWYEKEKARLEEERERKRREQERKLGQMRTQSLNPAPFSPLTAQQMKPEKPSTLQRPQETVIRELQPQQQPRTIERRDLQYITVSKEELSSGDSLSPDPWKRDAKEKLEKQQQMHIVDMLSKEIQELQSKPDRSAEESDRLRKLMLEWQFQKRLQESKQKDEDDEEEEDDDVDTMLIMQRLEAERRARLQDEERRRQQQLEEMRKREAEDRARQEEERRRQEEERTKRDAEEKRRQEEGYYSRLEAERRRQHDEAARRLLEPEAPGLCRPPLPRDYEPPSPSPAPGAPPPPPQRNASYLKTQVLSPDSLFTAKFVAYNEEEEEEDCSLAGPNSYPGSTGAAVGAHDACRDAKEKRSKSQDADSPGSSGAPENLTFKERQRLFSQGQDVSNKVKASRKLTELENELNTK。
能够结合上述氨基酸序列或其片段的异型双功能化合物可以使用表T中所述的dTAG靶向配体产生。在一个实施方式中，CAR含有衍生自上述氨基酸序列的dTAG或其片段，并且通过向受试者施用包含表T中所述的dTAG靶向配体的异型双功能化合物而降解。在一个实施方式中，CAR含有衍生自上述氨基酸序列的dTAG或其片段，并且通过向受试者施用其相应的异型双功能化合物而降解，其能够结合CAR中所述的dTAG，例如图33、图34、图35、图36或图37中所述的异型双功能化合物或本文所述的任何其他异型双功能化合物。
核酸编码CAR
本发明提供了编码如本文所述的CAR的核酸。编码CAR的核酸可以容易地通过常规方法从指定的CAR的氨基酸序列制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以容易地从例如上述氨基酸序列或公众可获得的参考序列，例如，NIBI RefSeq ID或GenBank的登录号，针对每个结构域的氨基酸序列获得，并且本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学程序制备。通常使用的CAR结构域的RefSeq ID是本领域已知的，例如美国专利号9,175,308(其通过引用并入本文)公开了许多特定的氨基酸序列，其特别地用作CAR跨膜和细胞内信号传导结构域。作为一个实例，基于碱基序列，可以合成核酸，并且本发明的核酸可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)将从cDNA文库获得的DNA片段组合而制备。
本发明的核酸可以与另外的核酸连接以便在合适的启动子的控制下表达。启动子的实例包括组成性促进基因表达的启动子、通过药物等(例如四环素或多柔比星)的作用诱导基因表达的启动子。为了获得核酸的有效转录，本发明的核酸也可以连接至其他调控元件，其配合启动子或转录起始位点，例如包含增强子序列或终止子序列的核酸。除了本发明的核酸之外，可以引入可以作为确认核酸表达的标记物的基因(例如耐药基因、编码报道酶的基因或编码荧光蛋白的基因)。
合适的启动子的一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成性启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其他组成性启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应局限于组成性启动子的使用。诱导型启动子也被预期为本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当这样的表达是期望的时，其能够启动它可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者当表达不是期望的时，能够关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
本发明预期包含本发明的核酸作为活性成分及药学上可接受的赋形剂的组合物。合适的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员熟知的。药学上可接受的赋形剂的实例包括磷酸盐缓冲盐水(例如0.01M磷酸盐、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH 7.4)、含有无机盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐的水溶液、盐水、二醇或乙醇溶液、以及有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。也可以使用助剂，例如润湿剂或乳化剂，和pH缓冲剂。作为药学上可接受的赋形剂，在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.(1991))(其通过引用并入本文)中描述的赋形剂可以适当地使用。本发明的组合物可以配制成适用于胃肠外施用(例如注射或输注)的已知形式。此外，本发明的组合物可以包含制剂添加剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂，和用于在储存期间延长有效性的防腐剂。在使用前，组合物可以是用于用合适的无菌液体重构的干燥形式。对于细颗粒介导的施用，颗粒例如微观尺寸的金颗粒可以用DNA涂覆。
当将本发明的核酸引入离体细胞中时，除了上述赋形剂之外，本发明的核酸可以与促进核酸转移至细胞中的物质组合，例如，用于引入核酸的试剂，例如脂质体或阳离子脂质。或者，携带本发明的核酸的载体也是有用的，如后文所述。特别地，适合于施用于活体的形式的组合物，其含有由合适的载体携带的本发明的核酸，适合于体内基因治疗。
包含本发明的核酸作为活性成分的组合物可以施用于治疗例如癌症[血癌(白血病)、实体瘤等]、炎症性疾病/自身免疫性疾病(哮喘，湿疹)，肝炎，或感染性疾病，其原因是病毒，例如流感和HIV，细菌，或真菌，例如，疾病如结核病、MRSA、VRE或深部霉菌病，取决于由核酸编码的CAR结合的抗原。包含本发明的核酸作为活性成分的组合物可通过任何期望的途径施用，包括但不限于皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内、肿瘤内，或者通过胃肠外施用，例如通过注射或输注，施用到淋巴输入管中，尽管施用途径没有特别限制。
表达CAR的免疫效应细胞
表达本发明的CAR的免疫效应细胞可以通过将编码上述CAR的核酸引入细胞中而工程化。在一个实施方式中，该步骤离体进行。例如，细胞可以用携带本发明的核酸的病毒载体或非病毒载体离体转化以产生表达本发明的CAR的细胞。
编码本发明的CAR的核酸可以插入至载体中，并将载体引入细胞中。例如，可以使用病毒载体例如逆转录病毒载体(包括肿瘤逆转录病毒载体、慢病毒载体、假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、牛痘病毒载体或仙台病毒载体、Epstein-Barr病毒(EBV)载体和HSV载体。优选地，优选使用缺乏复制能力以便不在受感染细胞中自我复制的病毒载体。
此外，本发明中还可以使用非病毒载体与WO 96/10038、WO 97/18185、WO 97/25329、WO 97/30170和WO 97/31934(通过引用并入本文)中所述的脂质体和缩合剂例如阳离子脂质的组合。本发明的核酸也可以通过磷酸钙转导、DEAE-葡聚糖、电穿孔或粒子轰击引入细胞中。
例如，当使用逆转录病毒载体时，本发明的方法可以通过基于载体具有的LTR序列和包装信号序列选择合适的包装细胞，和使用包装细胞制备逆转录病毒而进行。包装细胞的实例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12(美国专利号5,278,056)和Psi-Crip(PNAS 85(1988):6460-6464)。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒制备的许多种类的逆转录病毒载体和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞可从许多公司广泛地商购。
在将核酸引入细胞的步骤中，也可以使用用于改善引入效率的功能性物质(例如WO 95/26200和WO 00/01836(其通过引用并入本文))。用于改善引入效率的物质的实例包括具有与病毒载体结合的能力的物质，例如纤连蛋白和纤连蛋白片段。优选地，可以使用具有肝素结合位点的纤连蛋白片段，例如可作为RetroNetcin(注册商标，CH-296，由TAKARABIC INC.制造)商购的片段。此外，可以使用作为具有改善逆转录病毒感染到细胞中的效率的效果的合成聚阳离子的聚凝胺、成纤维细胞生长因子、V型胶原蛋白、聚赖氨酸或DEAE-葡聚糖。
在本发明的一个方面，功能性物质可以以固定在适合固相上的状态使用，例如，用于细胞培养的容器(平板、皮氏培养皿、烧瓶或袋子)或载体(微珠等)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可含有可选择标记基因或报告基因或两者以促进从寻求被通过病毒载体转染或感染的细胞群中识别和选择表达细胞。在其他方面，可选择标记物可以被携带在单独的DNA片上并用于共转染过程。可选择标记物和报道基因两者可以侧接合适的调控序列以使得能够在宿主T细胞中表达。有用的可选择标记物包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报道基因用于识别潜在转染的细胞并评估调节序列的功能。通常，报道基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达，并且编码其表达通过一些容易地可检测的性质(例如酶活性)表现的多肽的基因。报道基因的表达是在将DNA引入至受体细胞后在合适的时间测定的。合适的报道基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等,2000FEBS Letters479:79-82)的基因。合适的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知的技术制备或商业地获得。通常，具有显示报道基因的最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体被识别为启动子。这样的启动子区可以连接至报道基因并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
表达本发明的CAR的细胞是其中引入了编码上述CAR的核酸并由该细胞表达的细胞。本发明的细胞通过CAR与特定抗原结合，然后将信号传递至细胞中，结果，细胞被激活。表达CAR的细胞的激活根据宿主细胞的种类和CAR的细胞内结构域而不同，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖速率的提高、细胞表面分子的改变等作为指标而确定。例如，从激活的细胞释放细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)导致表达抗原的靶细胞的破坏。此外，细胞因子的释放或细胞表面分子的改变刺激其他免疫细胞，例如B细胞、树突细胞、NK细胞和巨噬细胞。为了确认细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种分析。这样的分析包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”分析，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”分析，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白印迹)或通过本文所述的分析，检测特定肽的存在或不存在，以识别落入本发明范围内的试剂。
可以使用免疫效应细胞例如淋巴细胞，包括但不限于细胞毒性淋巴细胞、T细胞、细胞毒性T细胞、T辅助细胞、Th17T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、树突细胞、杀伤树突细胞、或B细胞，其衍生自哺乳动物，例如人细胞，或衍生自非人哺乳动物例如猴、小鼠、大鼠、猪、马或狗的细胞。例如，可以使用从体液、组织或器官如血液(外周血、脐带血等)或骨髓中收集、分离、纯化或诱导的细胞。可以使用外周血单核细胞(PBMC)、免疫细胞(树突细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞或造血细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞))、脐带血单核细胞、成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、皮肤角化细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、各种癌细胞株，或神经干细胞。在本发明中，特别地，T细胞、T细胞的前体细胞(造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或含有它们的细胞群的使用是优选的。T细胞的实例包括CD8阳性T细胞、CD4阳性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。含有T细胞和T细胞的前体细胞的细胞群包含PBMC。上述细胞可以从活体中收集，通过对从活体收集的细胞的扩增培养获得，或作为细胞株建立。当将产生的CAR表达细胞或从产生的CAR表达细胞分化的细胞移植到活体中是期望的时，优选将核酸引入到从活体本身或其同种活体收集的细胞中。
在一个实施方式中，CAR表达细胞是从受试者分离的用于自体治疗的T细胞。典型地，在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞的来源。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术，例如FicollTM分离，从从受试者收集的血液单位获得T细胞。在一个优选的实施方式中，来自个体的循环血液的细胞通过机采获得。机采产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，由机采收集的细胞可以被洗涤以除去血浆部分，并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方式中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBC)洗涤。在替代性实施方式中，洗涤溶液缺少钙，并且可以缺少镁或可以缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在没有钙的情况下，初始激活步骤可能导致放大激活。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过根据制造商的说明书使用半自动"流通"离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或HaemoneticsCell Saver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬浮于各种生物相容性缓冲液中，例如不含Ca2+、不含Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或含有或不含缓冲液的其他盐水溶液。或者，可以去除机采样品的不期望组分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。
在另一个实施方式中，T细胞通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析而裂解红细胞并耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞分离。T细胞的特定亚群，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞，可以通过正或负选择技术进一步分离。例如，在一个实施方式中，T细胞通过与抗CD3/抗CD28(即3×28)-缀合的珠，例如M-450CD3/CD28T，一起孵育足以正选择期望T细胞的时间段而分离。在一个实施方式中，时间段是约30分钟。在另一个实施方式中，时间段的范围从30分钟到36小时或更长，以及它们之间的所有整数值。在另一个实施方式中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选的实施方式中，时间段是10至24小时。在一个优选的实施方式中，孵育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长孵育时间例如24小时可以增加细胞产率。在与其他细胞类型相比，存在少量T细胞的任何情况下，例如从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，更长的孵育时间可用于分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以增加补获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长时间允许T细胞与CD3/CD28珠结合，和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养开始时或在过程期间的其他时间点针对或相对地(for or against)优先地选择T细胞的亚群。此外，通过增加或减少珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可以在培养开始时或在其他期望时间点针对或相对地优先地选择T细胞的亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施方式中，可以期望的是执行选择过程并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以进行更多轮选择。
通过负选择富集T细胞群可以通过针对负选择的细胞特有的表面标记物的抗体的组合完成。一种方法是通过负磁性免疫黏附或流式细胞术的细胞分选和/或选择，其使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方式中，可以期望的是富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方式中，T调节性细胞通过抗C25缀合珠或其他类似的选择方法耗尽。
为了通过正选择或负选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒，如珠)的浓度。在某些实施方式中，可以期望的是显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方式中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用7500、8000、8500、9000、9500或10000万个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用12500或15000万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，高细胞浓度的使用允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或从其中存在在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病血液、肿瘤组织等)。这样的细胞群可以具有治疗价值并且将是期望获得的。例如，使用高浓度细胞允许通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞的更高效选择。
在相关的实施方式中，可以期望的是使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒，如珠)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这选择表达待与细胞结合的大量期望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28并比CD8+T细胞在稀释浓度下更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度是5×106/ml。在其他实施方式中，使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml，以及之间的任何整数值。
在其他实施方式中，细胞可以在旋转器上在2-10℃或室温下以变化的速度孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后被冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞而提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，细胞可以悬浮于冷冻溶液中。虽然许多冷冻方案和参数是本领域已知的并在此情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡聚糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或其他合适的含有例如Hespan和Plasmalyte A的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1℃的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的蒸汽相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即在-20℃或液氮中不受控制的冷冻。
在某些实施方式中，将冷冻保存的细胞如本文所述解冻并洗涤，并在使用本发明的方法激活之前允许其在室温下静置1小时。
在本发明的上下文中还预期了在可能需要本文所述的扩增细胞的时候之前的时间段从受试者收集血液样品或机采产品。因此，待扩增的细胞的来源可以在有必要的任何时间点收集，并且期望的细胞，如T细胞，其被分离和冷冻用于T细胞疗法中的后续使用，用于受益于T细胞疗法的任何数量的疾病或病症，如本文所述的那些。在一个实施方式中，血样或机采是从普通健康受试者取得的。在某些实施方式中，血样或机采是从具有发生疾病的风险但尚未发生疾病的普通健康受试者取得，并且感兴趣的细胞被分离并冷冻用于稍后使用。在某些实施方式中，T细胞可以扩增、冷冻并在稍后使用。在某些实施方式中，样品从在诊断出如本文所述的特定疾病之后不久，但在任何治疗之前的患者收集。在另外的实施方式中，将细胞在任何数量的相关治疗方式之前从受试者的血液样品或机采分离，所述相关治疗方式包括但不限于采用试剂例如那他珠单抗、依法利珠单抗、抗病毒剂、化疗、辐照、免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体、或其他免疫消融剂(immunoablative agent)例如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐照的治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等,Cell 66(1991):807-815；Henderson et al.,Immun 73(1991):316-321；Bierer等,Curr.Opin.Immun 5(1993):763-773)。在进一步的实施方式中，针对患者分离细胞并冷冻用于稍后与骨髓或干细胞移植，使用化学治疗剂例如氟达拉滨的T细胞消融治疗、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺、或例如OKT3或CAMPATH的抗体联合使用(例如之前、同时或之后)。在另一个实施方式中，细胞在之前被分离并且可以被冷冻用于随后用于B细胞消融疗法之后的治疗，例如与CD20反应的试剂，例如Rituxan。
在本发明的另一个实施方式中，治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗之后，特别是采用损坏免疫系统的药物的治疗，在患者通常从治疗恢复的时间段期间的治疗后不久，所获得的T细胞的质量可以是最佳的或者其离体扩增能力改善。类似地，在使用本发明所述的方法进行离体操纵之后，这些细胞可以处于对增强的植入和体内扩增优选的状态。因此，在本发明的上下文中预期在该恢复阶段期间收集血细胞，其包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方式中，可以使用动员(例如用GM-CSF动员)和调理方案以在受试者中创造状况，其中特定细胞类型的复育、再循环、再生和/或扩增是有利的，特别是在治疗后的确定的时间窗期间。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
无论在T细胞的遗传修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞通常可以使用例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041中；和美国专利申请公布号20060121005中所述的方法激活和扩增。
通常，本发明的T细胞通过与具有附着于其的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。特别是，T细胞群可以如本文所述被刺激，例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上的辅助细胞的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可以在适合于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。可以使用抗CD28抗体的实例，包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)。可以使用本领域公知的其他方法(Berge等,Transplant Proc.30(8)(1998):3975-3977；Haanen等,J.Exp.Med.190(9)(1999):1319-1328,1999；和Garland等,J.Immunol Meth.227(1-2)(1999):53-63)。
在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，试剂可以偶联到相同的表面(即，以“顺式”形式)或分开的表面(即，以“反式”形式)。或者，一种试剂可以偶联至表面，而其他试剂在溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，并且提供初级激活信号的试剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方式中，试剂两者可以在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可以是溶液形式，然后交联至表面，例如表达Fc受体的细胞或抗体或与试剂结合的其他结合试剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810，针对在本发明中预期用于激活和扩增T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)。
在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，或者在相同的珠上，即“顺式”，或者在分开的珠上，即“反式”。举例来说，提供初级激活信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且试剂两者是以等同的分子量共固定到相同的珠上。在一个实施方式中，使用1:1比率的与用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长的珠结合的每种抗体。在本发明的某些方面中，使用一定比率的与珠结合的抗CD3:CD28抗体，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定的实施方式中，与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到约1至3倍的增加。在一个实施方式中，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率在100:1至1:100范围内以及之间的所有整数值。在本发明的一个方面中，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些实施方式中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定的实施方式中，使用1:100的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用1:75的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用1:50的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用1:30的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个优选的实施方式中，使用1:10的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用1:3的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在另一个实施方式中，使用3:1的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。
1:500至500:1以及之间的任何整数值的颗粒与细胞的比率可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的那样，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸珠只可以结合一些细胞，而较大的珠可以结合很多。在某些实施方式中，细胞与颗粒的比率为1:100至100:1和其间的任何整数值，并且在进一步实施方式中，该比率包括1:9至9:1和其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。如上所述，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联的颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个优选的比率是至少1:1的颗粒每T细胞。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个特定实施方式中，优选的颗粒:细胞比率是1:5。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为1:1至10:1，并且之后每天或每隔一天将另外的颗粒加入细胞，至多10天，最终比率为1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定的实施方式中，在刺激的第一天颗粒与细胞的比率是1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整至1:5。在另一个实施方式中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒至第一天的终比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天为1:5。在另一个实施方式中，在刺激的第一天颗粒与细胞的比率是2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整至1:10。在另一个实施方式中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒至第一天的终比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技术人员将会理解各种其他比率可适合用于本发明。特别是，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。
在本发明的另一个实施方式中，将细胞例如T细胞与试剂涂覆的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在替代性实施方式中，在培养之前，试剂涂覆的珠和细胞不分离，而是在一起培养。在另一个实施方式中，珠和细胞首先通过施加力例如磁力而浓缩，导致细胞表面标记物的增加的连接，从而诱导细胞刺激。
举例来说，细胞表面蛋白可以通过使抗CD3和抗CD28连接的顺磁珠(3×28珠)与T细胞接触而连接。在一个实施方式中，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如比率为1:1的M-450CD3/CD28T顺磁珠)组合在缓冲液中，优选地PBS(不含二价阳离子如钙和镁)。再次地，本领域普通技术人员可以容易地认识到可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常少，并且仅占样品的0.01％，或整个样品(即100％)可以包含感兴趣的靶细胞。任何细胞数量都在本发明的上下文内。在某些实施方式中，可以期望的是显著降低其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方式中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用7500、8000、8500、9000、9500或10000万个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用12500或15000万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞激活和细胞扩增。此外，高细胞浓度的使用允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且期望的是在某些实施方式中获得。例如，使用高浓度细胞允许通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞的更高效选择。
在本发明的一个实施方式中，可以将混合物培养数小时(例如3小时)至约14天或之间的任何小时整数值。在另一个实施方式中，混合物可以培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞一起培养约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养2-3天。多个周期的刺激也可以是期望的，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适合T细胞培养的条件包括可以含有增殖和存活力所必要的因子的合适培养基(例如最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，包括血清(如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉、和还原剂例如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素的，无血清或补充有适量血清(或血浆)或限定组的激素，和/或对T细胞的生长和扩增充分的量的细胞因子。抗生素例如青霉素和链霉素仅包含在实验培养基中，而不包含在要输注到受试者中的细胞培养物中。靶T细胞被维持在支持生长所必要的条件下，例如合适的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液和机采外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(TH、CD4+)，其大于细胞毒性或抑制T细胞群(TC、CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体的T细胞的离体扩增产生T细胞群，其在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在第8-9天之后，T细胞群包含越来越多的TC细胞群。取决于治疗的目的，用主要包含TH细胞的T细胞群输注受试者可以是有利的。类似地，如果已经分离出TC细胞的抗原特异性子集，将这个子集扩增到更大程度可以是有益的。
此外，除了CD4和CD8标记物以外，其他表型标记物也显著地变化，但在很大程度上在细胞扩增过程的过程中可重复地变化。因此，这样的再现性使得能够为特定目的定制激活的T细胞产品。
CAR表达细胞治疗疾病的用途
表达CAR的细胞可用做疾病的治疗剂。治疗剂可以是作为活性成分的表达CAR的细胞，并且还可以包含合适的赋形剂。赋形剂的实例包括用于组合物的上述药学上可接受的赋形剂，所述组合物包含本发明的核酸作为活性成分、各种细胞培养基和等渗氯化钠。施用表达CAR的细胞以对抗的疾病不受限制，只要疾病对细胞显示敏感性。疾病的实例包括癌症(血癌(白血病)、实体瘤等)、炎症性疾病/自身免疫性疾病(哮喘、湿疹)、肝炎、和感染性疾病，其原因是病毒，例如流感和HIV，细菌，或真菌，例如肺结核、MRSA、VRE和深部霉菌病。施用表达本发明的CAR的细胞以治疗这些疾病，所述CAR与期望减少或消除以治疗前述疾病的细胞具有的抗原结合，即肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原等。本发明的细胞还可用于预防骨髓移植或暴露于辐射后的感染性疾病、用于缓解复发性白血病的供者淋巴细胞输注等。包含表达CAR的细胞作为活性成分的治疗剂可以皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内施用，或者通过胃肠外施用，例如通过注射或输注，施用到淋巴输入管中，尽管施用途径不受限制。
在一个特定的实施方式中，CAR表达细胞是来自癌症受试者的自体T细胞。可以治疗的癌症包括没有血管化或尚未实质性血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体肿瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤、以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、以及恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症也被包括。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或造血)癌症的实例包括白血病，其包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
其他血液癌症包括T细胞或NK细胞淋巴瘤，例如但不限于：外周T细胞淋巴瘤；间变性大细胞淋巴瘤，例如间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性、ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤或原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞性淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤，例如蕈样肉芽肿病、Sézary综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、原发性皮肤CD30+T细胞淋巴增殖性疾病；原发皮肤侵袭性表皮性CD8+细胞毒性T细胞淋巴瘤；原发皮肤γ-δT细胞淋巴瘤；原发皮肤小/中CD4+T细胞淋巴瘤和淋巴瘤样丘疹病；成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)；BlasticNK细胞淋巴瘤；肠病型T细胞淋巴瘤；肝脾γ-δT细胞淋巴瘤；淋巴细胞性淋巴瘤；鼻NK/T细胞淋巴瘤；治疗相关的T细胞淋巴瘤；例如在实体器官或骨髓移植后出现的淋巴瘤；T细胞幼淋巴细胞白血病；T细胞大颗粒淋巴细胞白血病；NK细胞的慢性淋巴增生性疾病；侵袭性NK细胞白血病；儿童系统性EBV+T细胞淋巴增殖性疾病(与慢性活动性EBV感染相关)；种痘样水疱病样淋巴瘤；成人T细胞白血病/淋巴瘤；肠病相关的T细胞淋巴瘤；肝脾T细胞淋巴瘤；或皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，CAR表达细胞可以以有效量用于治疗具有淋巴瘤或淋巴细胞或髓细胞增殖疾病或异常的宿主，例如人。例如，如本文所述的CAR表达细胞可以施用于患有霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤的宿主。例如，宿主可以患有非霍奇金淋巴瘤，例如但不限于：AIDS相关的淋巴瘤；间变性大细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞性淋巴瘤；Blastic NK细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；伯基特样淋巴瘤(小非分裂细胞淋巴瘤)；慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；肠病型T细胞淋巴瘤；滤泡性淋巴瘤；肝脾γδT细胞淋巴瘤；淋巴细胞性淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；边缘区淋巴瘤；鼻部T细胞淋巴瘤；小儿淋巴瘤；外周T细胞淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；T细胞白血病；转化的淋巴瘤；治疗相关的T细胞淋巴瘤；或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
或者，本文公开的CAR表达细胞可以以有效量用于治疗患有霍奇金淋巴瘤的宿主，例如人，例如但不限于：结节性硬化症经典霍奇金淋巴瘤(CHL)；混合细胞性CHL；淋巴细胞耗竭CHL；淋巴细胞富集CHL；淋巴细胞主要霍奇金淋巴瘤；或结节性淋巴细胞主要HL。
或者，本文公开的CAR表达细胞可以以有效量用于治疗患有特异性B细胞淋巴瘤或增殖性疾病的宿主，例如人，其例如但不限于：多发性骨髓瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；滤泡性淋巴瘤；粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤(MALT)；小细胞淋巴细胞性淋巴瘤；纵隔大B细胞淋巴瘤；节点边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)；脾边缘区淋巴瘤(SMZL)；血管内大B细胞淋巴瘤；原发性渗出性淋巴瘤；或淋巴瘤样肉芽肿病；B细胞幼淋巴细胞白血病；毛细胞白血病；脾淋巴瘤/白血病，不可分类；脾弥漫性红髓浆小B细胞淋巴瘤；毛细胞白血病变种；淋巴浆细胞性淋巴瘤；重链疾病，例如α重链疾病、γ重链疾病、Mu重链疾病；浆细胞骨髓瘤；骨孤立性浆细胞瘤；骨外浆细胞瘤；原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤；T细胞/组织细胞富集大B细胞淋巴瘤；慢性炎症相关的DLBcl；老年人的Epstein-Barr病毒(EBV)+DLBcl；原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤；原发性皮肤DLBcl，腿型；ALK+大B细胞淋巴瘤；浆细胞淋巴瘤；与HHV8相关的多中心发生的大B细胞淋巴瘤；卡斯尔曼病；B细胞淋巴瘤，不可分类，具有中间弥漫性大B细胞淋巴瘤之间的特征；或B细胞淋巴瘤，不可分类，具有介于弥漫性大B细胞淋巴瘤和经典霍奇金淋巴瘤之间的特征。
在一个实施方式中，本文公开的CAR表达细胞可以以有效量用于治疗患有白血病的宿主，例如人。例如，宿主可以患有淋巴细胞或骨髓来源的急性或慢性白血病，例如但不限于：急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；慢性粒细胞白血病(CML)；青少年骨髓单核细胞白血病(JMML)；毛细胞白血病(HCL)；急性早幼粒细胞白血病(AML的亚型)；大颗粒淋巴细胞白血病；或成人T细胞慢性白血病。在一个实施方式中，患者患有急性骨髓性白血病，例如未分化的AML(M0)；成髓细胞性白血病(M1；有/无最小的细胞成熟)；成髓细胞性白血病(M2；随着细胞成熟)；早幼粒细胞白血病(M3或M3变体[M3V])；骨髓单核细胞白血病(M4或嗜酸粒细胞增多的M4变体[M4E])；单核细胞白血病(M5)；红白血病(M6)；或巨核细胞白血病(M7)。
在一个实施方式中，本文公开的CAR表达细胞可以以有效量用于治疗患有实体瘤的宿主，例如人。实例包括但不限于：雌激素受体阳性，HER2阴性晚期乳腺癌、晚期转移性乳腺癌、脂肪肉瘤、非小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、难治性实体瘤、视网膜母细胞瘤阳性乳腺癌以及成视网膜细胞瘤阳性子宫内膜癌，阴道癌和卵巢癌以及肺和支气管癌、结肠腺癌、直肠腺癌、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、畸胎瘤、雌激素受体阴性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌、家族性睾丸生殖细胞肿瘤、HER2阴性乳腺癌、HER2阳性乳腺癌、男性乳腺癌、卵巢未成熟畸胎瘤、卵巢成熟畸胎瘤、卵巢单胚和高度专门化的畸胎瘤、黄体酮受体阴性乳腺癌、黄体酮受体阳性乳腺癌、复发性乳腺癌、复发性结肠癌、复发性外生殖细胞肿瘤、复发性的非正常外胚层非精原细胞性生殖细胞肿瘤、反复出现的兴奋性精原细胞瘤、复发性恶性睾丸生殖细胞肿瘤、复发性黑素瘤、复发性卵巢生殖细胞肿瘤、复发性直肠癌、III期性腺外非精原细胞性生殖细胞肿瘤、III期性腺外精原细胞瘤、III期恶性睾丸生殖细胞肿瘤、III期卵巢生殖细胞肿瘤、IV期乳腺癌、IV期结肠癌、IV期性腺外非精原细胞性生殖细胞肿瘤、IV期性腺外精原细胞瘤、IV期黑色素瘤、IV期卵巢生殖细胞肿瘤、IV期直肠癌、睾丸未成熟畸胎瘤、睾丸成熟畸胎瘤、雌激素受体阳性，HER2阴性晚期乳腺癌、晚期转移性乳腺癌、脂肪肉瘤、非小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、难治性实体瘤、成视网膜细胞瘤阳性乳腺癌以及成视网膜细胞瘤阳性子宫内膜癌、阴道癌和卵巢癌以及肺癌和支气管癌、转移性结直肠癌、转移性黑素瘤、或顺铂难治性，不可切除的生殖细胞肿瘤、癌、肉瘤，其包括但不限于肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌症、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门部位的癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、恶性纤维组织细胞瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管。间皮瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌；表皮样癌、恶性皮肤附件肿瘤、腺癌、肝细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、胆管癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、胶质瘤间变性；多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、甲状旁腺癌、甲状腺髓样癌、支气管类癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、恶性类癌、恶性副神经节瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞肿瘤、叶状囊肉瘤、唾液癌症、胸腺癌、膀胱癌和肾母细胞瘤、血液疾病或血液恶性肿瘤，其包括但不限于髓系病症、淋巴病症、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPS)、肥大细胞紊乱和骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)。
在另一个实施方式中，本文公开的CAR表达细胞可以以有效量用于治疗患有自身免疫病症的宿主，例如人。实例包括但不限于：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)；艾迪生病；丙种球蛋白血症；斑秃；肌萎缩性侧索硬化(也是Lou Gehrig氏疾病；运动神经元疾病)；强直性脊柱炎；抗磷脂综合征；Antisynthetase综合征；特应性过敏；特应性皮炎；自身免疫性再生障碍性贫血；自身免疫性关节炎；自身免疫性心肌病；自身免疫性肠病；自身免疫性粒细胞减少症；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性肝炎；自身免疫性甲状旁腺功能减退症；自身免疫性内耳疾病；自身免疫性淋巴增殖综合征；自身免疫性心肌炎；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性周围神经病；自身免疫性卵巢衰竭；自身免疫性多内分泌综合征；自身免疫性黄体酮皮炎；自身免疫性血小板减少性紫癜；自身免疫性甲状腺疾病；自身免疫性荨麻疹；自身免疫性葡萄膜炎；自身免疫性血管炎；Balo病/Balo同心硬化症；白塞氏病；伯杰病；比克斯塔夫的脑炎；布劳综合征；大疱性类天疱疮；癌症；卡斯尔曼病；乳糜泻；恰加斯病；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病；慢性阻塞性肺疾病；慢性复发性多灶性骨髓炎；Churg-Strauss综合征；瘢痕性类天疱疮；科根综合征；冷凝集素疾病；补充成分2缺陷；接触性皮炎；颅骨动脉炎；CREST综合征；克罗恩病；库欣综合征；皮肤白细胞碎屑性血管炎；德戈斯病；Dercum病；疱疹样皮炎；皮肌炎；糖尿病1型；弥漫性皮肤系统性硬化症；盘状红斑狼疮；德斯勒氏症候群；药物引起的狼疮；湿疹；子宫内膜异位症；与粘膜炎相关的关节炎；嗜酸性粒细胞性筋膜炎；嗜酸性粒细胞胃肠炎；嗜酸性粒细胞性肺炎；大疱性表皮松解症；红斑结节；胎儿成红细胞增多症；基本的混合冷球蛋白血症；埃文综合征；外在和内在的反应性气道疾病(哮喘)；纤维发育不良进行性骨化；纤维化肺泡炎(或特发性肺纤维化)；胃炎；消化道类天疱疮；肾小球肾炎；古德帕斯丘综合征；格雷夫斯病；格林巴利综合征(GBS)；桥本脑病；桥本氏甲状腺炎；溶血性贫血；过敏性紫癜；妊娠疱疹(妊娠类天疱疮)；化脓性汗腺炎；休斯-斯托文综合征；丙种球蛋白血症；特发性炎症性脱髓鞘疾病；特发性肺纤维化；特发性血小板减少性紫癜；IgA肾病；免疫性肾小球肾炎；免疫性肾炎；免疫性肺炎；包涵体肌炎；炎症性肠病；间质性膀胱炎；少年特发性关节炎即幼年类风湿性关节炎；川崎病；兰伯特-伊顿肌无力综合征；白细胞碎屑性血管炎；扁平苔藓；地衣硬化；线性IgA疾病(LAD)；Lupoid肝炎即自体免疫性肝炎；红斑狼疮；Majeed综合征；显微镜下多血管炎；米勒-费舍尔综合征；混合性结缔组织病；硬斑病；Mucha-Habermann病即苔藓病etvarioliformis acuta；多发性硬化症；重症肌无力；肌炎；梅尼埃病；发作性睡病；视神经脊髓炎(也是德维克病)；神经性肌强直；眼瘢痕性类天疱疮；Opsoclonus肌阵挛综合征；奥德氏甲状腺炎；回文风湿病；PANDAS(与链球菌有关的小儿自身免疫性神经精神障碍)；副肿瘤性小脑变性；阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)；Parry Romberg综合征；帕尔斯平板炎；帕森纳-特纳综合征；寻常型天疱疮；周围性脑脊髓炎；恶性贫血；POEMS综合征；结节性多动脉炎；风湿性多肌痛；多发性肌炎；原发性胆汁性肝硬化；原发性硬化性胆管炎；渐进性炎症性神经病；银屑病；银屑病关节炎；纯红细胞再生障碍；脓皮病；拉斯穆森的脑炎；雷诺现象；赖特综合征；复发性多软骨炎；不安腿综合症；腹膜后纤维化；风湿热；类风湿关节炎；结节病；精神分裂症；施密特综合征；施尼茨勒综合征；巩膜炎；硬皮病；硬化性胆管炎；血清病；舍格伦综合征；脊柱关节病；僵硬的人综合征；斯提耳病；亚急性细菌性心内膜炎(SBE)；苏萨克综合症；急性发热性中性白细胞增多性皮病；锡德纳姆舞蹈；交感性眼炎；系统性红斑狼疮；Takayasu的动脉炎；颞动脉炎(也称为巨细胞动脉炎)；血小板减少症；Tolosa-Hunt综合征；横贯性脊髓炎；溃疡性结肠炎；未分化结缔组织病；未分化结缔组织病；未分化脊柱关节病；荨麻疹血管炎；血管炎；白癜风；病毒性疾病例如Epstein Barr病毒(EBV)、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、HTLV 1、水痘-带状疱疹病毒(VZV)和人乳头瘤病毒(HPV)；或韦格纳肉芽肿病。在一些实施方式中，自身免疫疾病是过敏性病症，其包括来自哮喘、食物过敏、特应性皮炎、和鼻炎的那些。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤例如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤、和CNS肿瘤(例如胶质瘤(例如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、Schwannoma颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分部分被设计用于治疗特定的癌症。例如，设计为靶向CD29的CAR可用于治疗癌症和病症，其包括但不限于前B ALL(小儿适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、同种异体骨髓移植后的补救等。
在另一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向CD22以治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，癌症和病症包括但不限于可以使用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的组合治疗的前B ALL(小儿适应症)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、同种异体骨髓移植后的补救等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向间皮素以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向CD33/IL3Ra以治疗急性骨髓性白血病等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向CD30以治疗淋巴瘤，例如霍奇金淋巴瘤等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向c-Met以治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向PSMA以治疗前列腺癌等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向Glycolipid F77以治疗前列腺癌等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向EGFRvIII以治疗胶质母细胞瘤等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向GD-2以治疗成神经细胞瘤、黑素瘤等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向NY-ESO-1TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向MAGE A3TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向CEA以治疗结直肠癌等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向erb-B2、erb-B3和/或erb-B4以治疗乳腺癌等。
在一个实施方式中，CAR可以被设计为靶向IL-13R-a2以治疗神经胶质瘤、成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤等。
然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原靶标和疾病。相反，应将本发明解释为包括与其中具有dTAG的CAR可用于治疗疾病的疾病相关的任何抗原性或配体靶标。
本发明的CAR表达细胞还可以用作用于哺乳动物离体免疫和/或体内治疗的疫苗类型。优选地，哺乳动物是人。
就离体免疫而言，在将细胞施用于哺乳动物之前，以下中的至少一种体外发生：i)细胞的扩增，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)细胞的冷冻保存。
本发明的CAR表达细胞可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合施用。简而言之，本发明的药物组合物可以包含如本文所述的靶T细胞群，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地配制用于静脉给药。
本发明的CAR表达细胞的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定合适的剂量，但施用的数量和频率将由诸如患者的状况，患者的疾病的类型和严重程度等因素决定。
当指出“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，考虑到患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异，待施用的本发明组合物的确切量可以由医师确定。通常可以说包含本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，优选地105至106个细胞/kg体重的剂量施用，其包括这些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用(参见例如Rosenberg等,New Eng.J.of Med.319(1988):1676)。对于特定患者最佳的剂量和治疗方案可以容易地由医学领域技术人员通过监测患者的疾病征兆和相应地调整治疗而确定。
CAR表达细胞的施用可以以任何方便的方式进行，其包括通过气雾吸入、注射、摄食、输送、植入或移植。本文所述的CAR表达细胞可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内施用于患者。在一个实施方式中，本发明的CAR表达细胞通过皮内或皮下注射施用于患者。在一个实施方式中，本发明的CAR表达细胞优选地通过静脉内注射施用。CAR表达细胞可以直接地注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
待施用于患者的上述治疗剂量将随着所治疗的病症和治疗的接受者的确切性质而变化。可以根据本领域接受的实践进行人施用剂量的缩放。
异型双功能化合物
如上所述，本发明的CAR包括细胞内异型双功能化合物结合部分或结构域，其为靶向异型双功能化合物提供配体。通过在CAR构建体中包含dTAG，如CAR表达细胞表达的CAR可以在暴露于异型双功能化合物时容易地并快速地降解，其利用泛素蛋白酶体途径降解CAR。以这种方式，施用靶向CAR内的特定dTAG的异型双功能化合物允许调节CAR表达细胞的激活，因为CAR表达细胞内的CAR或其部分的降解阻止发生激活信号传导。该策略可用于调节CAR表达细胞的激活，例如减少CAR表达细胞的激活以减少不良炎症反应。此外，通过利用异型双功能化合物策略，CAR表达细胞幸免。
利用泛素蛋白酶体途径(UPP)选择性靶向和降解蛋白质的策略已被用于蛋白质功能的翻译后控制。异型双功能化合物由靶蛋白结合配体和E3泛素连接酶配体组成。异型双功能化合物能够通过它们对E3泛素连接酶的募集和随后的泛素化诱导选定蛋白质的蛋白酶体介导的降解。这些药物样分子提供了对蛋白水平的可逆的、剂量响应的、可调的、时间控制的可能性。这样的化合物的早期描述在由Deshales等人于2000年9月提交并于2006年5月获批的标题为“Proteolysis Targeting Chimeric Pharmaceutical”的美国专利7,041,298中提供。Sakamoto等人的出版物(PNAS 98(15)(2001):8554-8559)，标题为“PROTACS:Chimeric Molecules that Target Proteins to the Skp1-Cullin F Box Complex forUbiquitination and Degradation”，描述了由与能够结合F盒蛋白β-TRCP的肽连接的MAP-AP-2的小分子结合剂组成的异型双功能化合物，其公开内容也在美国专利7,041,298中提供。Sakamoto等人的出版物(Molecular and Cellular Proteomics 2(2003):1350-1358)，标题为“Development of PROTACS to Target Cancer-promoting Proteins forUbiquitination and Degradation”，描述了类似的异型双功能化合物(PROTAC2)，其降解雌激素和雄激素受体而非降解MAP-AP-2。Schneekloth等人的出版物(JACS 126(2004):3748-3754)，标题为“Chemical Genetic Control of Protein Levels:Selective invivo Targeted Degradation”，描述了靶向FK506结合蛋白(FKBP12)的类似的异型双功能化合物(PROTAC3)，并且用绿色荧光蛋白(GFP)成像显示PROTAC2和PROTAC3两者击中它们各自的靶标。Schneekloth等人的出版物(ChemBioChem 6(2005)40-46)，标题为“ChemicalApproaches to Controlling Intracellular Protein Degradation”描述了使用该技术的当时的领域的状态。Schneekloth等人的出版物(BMCL 18(22)(2008):5904-5908)，标题为“Targeted Intracellular Protein Degradation Induced by a Small Molecule:EnRoute to Chemical Proteomics”，描述了由通过PEG连接的两个小分子化合物组成的异型双功能化合物，其通过同时结合雌激素受体和泛素E3连接酶来体内降解雄激素受体。Crews等人标题为“Compounds Useful for Promoting Protein Degradation and MethodsUsing Same”的WO 2013/170147描述了包含与接头共价地结合的蛋白质降解部分的化合物，其中化合物的ClogP等于或高于1.5。Buckley等人对上述出版物的综述(Angew.Chem.Int.Ed.53(2014):2312-2330)标题为“Small-Molecule Control ofIntraceullular Protein Levels through Modulation of the Ubiquitin ProteasomeSystem”。转让给Arvinas Inc.的WO 2015/160845，标题为“Imide Based Modulators ofProteolysis and Associated methods of Use”描述了使用Degron技术与沙利度胺以利用作为E3连接酶蛋白的cereblon。J.Lu等人的以下出版物(Chemistry and Biol.22(6)(2015):755-763)，标题为“Hijacking the E3Ubiquitin Ligase Cereblon toefficiently Target BDR4”，类似地描述了可用于降解BDR4的基于沙利度胺的化合物。描述这项技术的另外的出版物包括Bondeson等(Nature Chemical Biology 11(2015):611-617)、Gustafson等(Angew.Chem.Int.Ed.54(2015):9659-9662)、Buckley等(ACSChem.Bio.10(2015):1831-1837)、转让给Arvinas Inc.标题为“Imide Based Modulatorsof Proteolysis and Associated Methods of Use”的美国专利2016/0058872、转让给Arvinas Inc.标题为“Estrogen-related Receptor Alpha Based PROTAC Compounds andAssociated Methods of Use”的美国专利2016/0045607、转让给耶鲁大学、GlaxoSmithKline和Cambridge Enterprise Limited University of Cambridge标题为“Compounds and Methods for the Enhanced Degradation of Targeted Proteins&Other Polypeptides by an E3Ubiquitin Ligase”的美国专利2014/0356322、Lai等(Angew.Chem.Int.Ed.55(2016):807-810)、Toure等(Angew.Chem.Int.Ed.55(2016):1966-1973)和转让给Dana Farber Cancer Institute标题为“Methods to Induce TargetedProtein Degradation Through Bifuncational Molecules”的美国专利2016/0176916。
靶蛋白降解技术的其他描述包括Itoh等(JACS 132(16)(2010):5820-5826)，标题为“Protein Knockdown Using Methyl Bestatin-Ligand Hybrid Molecules:Design andSynthesis of Inducers ofUbiquitination-Mediated Degradation of CellularRetinoic Acid-Binding Proteins”，其描述了与利用E3泛素连接酶以降解视黄酸结合蛋白的肽连接的小分子，以及Winter等(Science 348(2015):1376-1381)，标题为“Phthalimide Conjugation as a Strategy for in vivo Target ProteinDegradation”描述了基于沙利度胺的靶向蛋白降解技术。
可用于降解本发明的CAR的异型双功能化合物可以是能够结合CAR内的dTAG以诱导降解的任何异型双功能化合物。异型双功能化合物通常是本领域已知的，例如，参见美国专利7,041,298；Sakamoto等(PNAS,2001,98(15):8554-8559)；Sakamoto等(Molecular andCellular Proteomics 2(2003)1350-1358)；Schneekloth等(JACS 126(2004):3748-3754)；Schneekloth等(ChemBioChem 6(2005):40-46)；Schneekloth等(BMCL 18(22)(2008):5904-5908)；WO 2013/170147；Buckley等(Angew.Chem.Int.Ed.53(2014):2312-2330)；WO 2015/160845；Lu等(Chemistry and Biol.22(6)(2015):755-763)；Bondeson等(Nature Chemical Biology 11(2015):611-617)；Gustafson等(Angew.Chem.Int.Ed.54(2015):9659-9662)；Buckley等(ACS Chem.Bio.10(2015):1831-1837)；转让给ArvinasInc.的标题为“Imide Based Modulators of Proteolysis and Associated Methods ofUse”的美国专利2016/0058872；转让给Arvinas Inc.的标题为“Estrogen-relatedReceptor Alpha Based PROTAC Compounds and Associated Methods of Use”的美国专利2016/0045607；转让给耶鲁大学、GlaxoSmithKline和Cambridge Enterprise LimitedUniversity of Cambridge的标题为“Compounds and Methods for the EnhancedDegradation of Targeted Proteins&Other Polypeptides by an E3Ubiquitin Ligase”的美国专利2014/0356322；转让给Dana-Farber癌症研究所公司的标题为“Methods toInduce Targeted Protein Degradation Through Bifunctional Molecules”的美国专利2016/0176916；Lai等(Angew.Chem.Int.Ed.55(2016):807-810)；Toure等(Angew.Chem.Int.Ed.55(2016):1966-1973)；Itoh等(JACS 132(16)(2010):5820-5826)；和Winter等(Science 348(2015):1376-1381)，其中的每一个通过引用并入本文。
在本发明的某些方面，本文所述的异型双功能化合物可用于调节本发明的CAR表达细胞的激活。特别是，适用于本申请的异型双功能化合物含有配体，例如小分子配体(即具有低于2000、1000、500或200道尔顿的分子量)，例如沙利度胺样配体，其能够结合至泛素连接酶，例如cereblon，和能够结合靶标或被靶标结合的部分，其允许标记发生。
通常，适用于本申请的异型双功能化合物具有以下一般结构：
降解决定子(degron)-接头-dTAG靶向配体
其中接头共价地结合至降解决定子和dTAG靶向配体，降解决定子是能够结合至泛素连接酶例如E3泛素连接酶(例如cereblon)的化合物，并且dTAG靶向配体能够结合至CAR上的dTAG。
在某些实施方式中，本申请使用式I或式II的化合物：
其中：
接头是共价地结合至dTAG靶向配体和Y的基团；和
dTAG靶向配体能够结合至dTAG靶标或被dTAG靶标结合，其允许标记发生。
在某些实施方式中，本申请提供了式(I)的化合物或其对映异构体、非对映异构体、立体异构体、或药学上可接受的盐，
其中：
接头(L)是共价地连接至dTAG靶向配体和Y的基团；和
dTAG靶向配体能够结合或结合dTAG靶向的蛋白；
并且其中X1、X2、Y、R1、R2、R2'、R3、R3'、R4、R5、m和n各自如本文所定义。
在某些实施方式中，本申请提供了式(II)的化合物或其对映异构体、非对映异构体、立体异构体、或药学上可接受的盐，
其中：
接头是共价地连接至dTAG靶向配体和Y的基团；和
dTAG靶向配体能够结合或结合dTAG靶向的蛋白；
并且其中X1、X2、Y、R1、R2、R2'、R3、R3'、R4、R5、m和n各自如本文所定义。
在某些实施方式中，本发明使用式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII和式IX：
其中：
接头(L)是共价地连接至dTAG靶向配体和Z2的基团；
dTAG靶向配体是能够结合至靶dTAG或被靶dTAG结合；
Z2是键、烷基、-O、-C(O)NR2、-NR6C(O)、-NH或–NR6；
R6是H、烷基、-C(O)烷基或-C(O)H；
X3独立地选自O、S和CH2；
W2独立地选自基团CH2、CHR、C═O、SO2、NH和N-烷基；
Y2独立地选自基团NH、N-烷基、N-芳基、N-杂芳基、N-环烷基、N-杂环基、O和S；
G和G'独立地选自基团H、烷基、OH、任选地用R'取代的CH2-杂环基、以及任选地用R'取代的苄基；
Q1、Q2、Q3和Q4独立地选自CH、N、CR'和N-氧化物。
A2独立地选自基团烷基、环烷基、Cl和F；
R7选自：—CONR′R″、—OR′、—NR′R″、—SR′、—SO2R′、—SO2NR′R″、-CR′R″-、-CR′NR′R″-、芳基、杂芳基、烷基、环烷基、杂环基、-P(O)(OR′)R″、-P(O)R′R″、-OP(O)(OR′)R″、-OP(O)R′R″、-Cl、-F、-Br、-I、-CF3、-CN、-NR′SO2NR′R″、-NR′CONR′R″、-CONR′COR″、-NR′C(═N-CN)NR′R″、-C(═N-CN)NR′R″、-NR′C(═N-CN)R″、-NR′C(═C-NO2)NR′R″、-SO2NR′COR″、-NO2、-CO2R′、-C(C═N-OR′)R″、-CR′═CR′R″、-CCR′、-S(C═O)(C═N-R′)R″、-SF5和-OCF3。
R′和R″独立地选自键、H、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基
用于本发明的dTAG靶向配体的非限制实例包括：
脱卤酶靶向配体，例如
FKBP12靶向配体，例如
在一些实施方式中，dTAG靶向配体靶向突变的内源性靶标或非内源性靶标。
降解决定子
降解决定子是通过接头和dTAG靶向配体将dTAG连接至泛素连接酶用于蛋白酶体降解的化合物部分。在某些实施方式中，降解决定子是结合至泛素连接酶的化合物。在另一个实施方式中，降解决定子是结合至E3泛素连接酶的化合物。在另一个实施方式中，降解决定子是结合至cereblon的化合物。在另一个实施方式中，降解决定子是沙利度胺或其衍生物或其类似物。
在某些实施方式中，降解决定子是式D、式D0、式D’的部分：
或其对映异构体、非对映异构体或立体异构体，其中：
Y是键、(CH2)1-6、(CH2)0-6-O、(CH2)0-6-C(O)NR2'、(CH2)0-6-NR2'C(O)、(CH2)0-6-NH或(CH2)0-6-NR2；
X是C(O)或C(R3)2；
X1-X2是C(R3)＝N或C(R3)2-C(R3)2；
每个R1独立地为卤素、OH、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；
R2是C1-C6烷基、C(O)-C1-C6烷基或C(O)-C3-C6环烷基；
R2'是H或C1-C6烷基；
每个R3独立地为H或C1-C3烷基；
每个R3'独立地为C1-C3烷基；
每个R4独立地为H或C1-C3烷基；或两个R4与它们所连接的碳原子一起形成C(O)，C3-C6碳环、或包含1或2个选自N和O的杂原子的4-,5-、或6元杂环；
R5是H、氘、C1-C3烷基、F或Cl；
m是0、1、2或3；和
n是0、1或2；
其中所述化合物通过共价地结合至另一部分(例如化合物或接头)。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中是
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中是
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中X是C(O)。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中X是C(R3)2；和每个R3是H。在某些实施方式中，X是C(R3)2；和R3的一个是H，并且其他是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。在某些实施方式中，X是C(R3)2；和每个R3独立地选自甲基、乙基和丙基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中X1-X2是C(R3)＝N。在某些实施方式中，X1-X2是CH＝N。在某些实施方式中，X1-X2是C(R3)＝N；和R3是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。在某些实施方式中，X1-X2是C(CH3)＝N。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中X1-X2是C(R3)2-C(R3)2；和每个R3是H。在某些实施方式中，X1-X2是C(R3)2-C(R3)2；和R3的一个是H，并且其他三个R3独立地为选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。在某些实施方式中，X1-X2是C(R3)2-C(R3)2；和R3的两个是H，并且其他两个R3独立地为选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。在某些实施方式中，X1-X2是C(R3)2-C(R3)2；和R3的三个是H，并且剩余R3是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中Y是键。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中Y是(CH2)1、(CH2)2、(CH2)3、(CH2)4、(CH2)5或(CH2)6。在某些实施方式中，Y是(CH2)1、(CH2)2或(CH2)3。在某些实施方式中，Y是(CH2)1或(CH2)2。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中Y是O、CH2-O、(CH2)2-O、(CH2)3-O、(CH2)4-O、(CH2)5-O或(CH2)6-O。在某些实施方式中，Y是O、CH2-O、(CH2)2-O或(CH2)3-O。在某些实施方式中，Y是O或CH2-O。在某些实施方式中，Y是O。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中Y是C(O)NR2'、CH2-C(O)NR2'、(CH2)2-C(O)NR2'、(CH2)3-C(O)NR2'、(CH2)4-C(O)NR2'、(CH2)5-C(O)NR2'或(CH2)6-C(O)NR2'。在某些实施方式中，Y是C(O)NR2'、CH2-C(O)NR2'、(CH2)2-C(O)NR2'或(CH2)3-C(O)NR2'。在某些实施方式中，Y是C(O)NR2'或CH2-C(O)NR2'。在某些实施方式中，Y是C(O)NR2'。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中Y是NR2'C(O)、CH2-NR2'C(O)、(CH2)2-NR2'C(O)、(CH2)3-NR2'C(O)、(CH2)4-NR2'C(O)、(CH2)5-NR2'C(O)或(CH2)6-NR2'C(O)。在某些实施方式中，Y是NR2'C(O)、CH2-NR2'C(O)、(CH2)2-NR2'C(O)或(CH2)3-NR2'C(O)。在某些实施方式中，Y是NR2'C(O)或CH2-NR2'C(O)。在某些实施方式中，Y是NR2'C(O)。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R2'是H。在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R2'选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。在某些实施方式中，R2'是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中Y是NH、CH2-NH、(CH2)2-NH、(CH2)3-NH、(CH2)4-NH、(CH2)5-NH或(CH2)6-NH。在某些实施方式中，Y是NH、CH2-NH、(CH2)2-NH或(CH2)3-NH。在某些实施方式中，Y是NH或CH2-NH。在某些实施方式中，Y是NH。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中Y是NR2、CH2-NR2、(CH2)2-NR2、(CH2)3-NR2、(CH2)4-NR2、(CH2)5-NR2或(CH2)6-NR2。在某些实施方式中，Y是NR2、CH2-NR2、(CH2)2-NR2或(CH2)3-NR2。在某些实施方式中，Y是NR2或CH2-NR2。在某些实施方式中，Y是NR2。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R2选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。在某些实施方式中，R2是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R2选自C(O)-甲基、C(O)-乙基、C(O)-丙基、C(O)-丁基、C(O)-异丁基、C(O)-叔丁基、C(O)-戊基、C(O)-异戊基和C(O)-己基。在某些实施方式中，R2是选自C(O)-甲基、C(O)-乙基和C(O)-丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R2选自C(O)-环丙基、C(O)-环丁基、C(O)-环戊基和C(O)-环己基。在某些实施方式中，R2是C(O)-环丙基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R3是H。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R3是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。在某些实施方式中，R3是甲基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中n是0。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中n是1。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中n是2。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中每个R3'独立地为选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中m是0。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中m是1。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中m是2。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中m是3。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中每个R1独立地选自卤素(例如F、Cl、Br和I)、OH、C1-C6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基)和C1-C6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基和戊氧基)。在另一个实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中每个R1独立地选自F、Cl、OH、甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基、甲氧基和乙氧基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中每个R4是H。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R4的一个是H，并且其他R4是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中每个R4独立地为选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中两个R4与它们所连接的碳原子一起形成C(O)。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中两个R4与它们所连接的碳原子一起形成环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中两个R4与它们所连接的碳原子一起形成选自氧杂环丁烷、氮杂环丁烷、四氢呋喃、吡咯烷、哌啶、哌嗪和吗啉的4-、5-或6-元杂环。在某些实施方式中，两个R4与它们所连接的碳原子一起形成氧杂环丁烷。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R5是H、氘或C1-C3烷基。在另一个实施方式中，R5是(S)或(R)构型。在另一个实施方式中，R5是(S)构型。在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中所述化合物包含(S)-R5和(R)-R5的外消旋混合物。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R5是H。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R5是氘。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R5是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。在某些实施方式中，R5是甲基。
在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中R5是F或Cl。在另一个实施方式中，R5是(S)或(R)构型。在另一个实施方式中，R5是(R)构型。在某些实施方式中，降解决定子是式D的部分，其中所述化合物包含(S)-R5和(R)-R5的外消旋混合物。在某些实施方式中，R5是F。
在某些实施方式中，降解决定子是选自图25中的结构，其中X是H、氘、C1-C3烷基或卤素；和R是接头的连接点。
在某些实施方式中，降解决定子是选自图26中的结构。
在某些实施方式中，降解决定子是选自图27中的结构。
接头
接头是将dTAG靶向配体与降解决定子连接的键或化学基团。在某些实施方式中，接头是碳链。在某些实施方式中，碳链任选地包含一个、两个、三个或更多个选自N、O和S的杂原子。在某些实施方式中，碳链仅包含饱和链碳原子。在某些实施方式中，碳链任选地包含两个或更多个不饱和链碳原子(例如C＝C或C≡C)。在某些实施方式中，碳链中的一个或多个链碳原子任选地被一个或多个取代基(例如oxo、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C3烷氧基、OH、卤素、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2、CN、C3-C8环烷基、杂环基、苯基和杂芳基)取代。
在某些实施方式中，接头包含至少5个链原子(例如C、O、N和S)。在某些实施方式中，接头包含少于20个链原子(例如C、O、N和S)。在某些实施方式中，接头包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个链原子(例如C、O、N和S)。在某些实施方式中，接头包含5、7、9、11、13、15、17或19个链原子(例如C、O、N和S)。在某些实施方式中，接头包含5、7、9或11个链原子(例如C、O、N和S)。在某些实施方式中，接头包含6、8、10、12、14、16或18个链原子(例如C、O、N和S)。在某些实施方式中，接头包含6、8、10或12个链原子(例如C、O、N和S)。
在某些实施方式中，接头是任选地被非大体积取代基(例如oxo、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C3烷氧基、OH、卤素、NH2、NH(C1-C3烷基)、N(C1-C3烷基)2和CN)取代的碳链。在某些实施方式中，非大体积取代基位于降解决定子附近的链碳原子上(即，碳原子与降解决定子键合的碳原子分割至少3个、4个或5个链原子)。
在某些实施方式中，接头具有式L0：
或其对映异构体、非对映异构体或立体异构体，其中
p1是选自0至12的整数；
p2是选自0至12的整数；
p3是选自1至6的整数；
每个W独立地不存在，CH2、O、NH或NR5；
Z不存在，CH2、O、NH或NR5；
每个R5独立地为C1-C3烷基；和
Q不存在或-CH2C(O)NH-，
其中所述接头用Q旁边的共价地结合至降解决定子，并且用Z旁边的共价地结合至dTAG靶向配体，并且其中接头中链原子的总数少于20。
在某些实施方式中，接头-dTAG靶向配体(TL)具有式L1或L2的结构：
或其对映异构体、非对映异构体或立体异构体，其中
p1是选自0至12的整数；
p2是选自0至12的整数；
p3是选自1至6的整数；
每个W独立地是不存在，CH2、O、NH或NR5；
Z是不存在、CH2、O、NH或NR5；
每个R5独立地为C1-C3烷基；和
TL是dTAG靶向配体，
其中所述接头用共价地结合至降解决定子。
在某些实施方式中，p1是选自0至10整数。
在某些实施方式中，p1是选自2至10整数。
在某些实施方式中，p1选自1、2、3、4、5和6。
在某些实施方式中，p1选自1、3和5。
在某些实施方式中，p1选自1、2和3。
在某些实施方式中，p1是3。
在某些实施方式中，p2是选自0至10的整数。
在某些实施方式中，p2选自0、1、2、3、4、5和6。
在某些实施方式中，p2是选自0和1的整数。
在某些实施方式中，p3是选自1至5整数。
在某些实施方式中，p3选自2、3、4和5。
在某些实施方式中，p3选自1、2和3。
在某些实施方式中，p3选自2和3。
在某些实施方式中，至少一个W是CH2。
在某些实施方式中，至少一个W是O。
在某些实施方式中，至少一个W是S。
在某些实施方式中，至少一个W是NH。
在某些实施方式中，至少一个W是NR5；和R5是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，W是O。
在某些实施方式中，Z是不存在的。
在某些实施方式中，Z是CH2。
在某些实施方式中，Z是O。
在某些实施方式中，Z是NH。
在某些实施方式中，Z是NR5；和R5是选自甲基、乙基和丙基的C1-C3烷基。
在某些实施方式中，Z是结合至接头的dTAG靶向配体的一部分，即Z由dTAG靶向配体的官能团与接头反应形成。
在某些实施方式中，W是CH2，和Z是CH2。
在某些实施方式中，W是O，和Z是CH2。
在某些实施方式中，W是CH2，和Z是O。
在某些实施方式中，W是O，和Z是O。
在某些实施方式中，接头-dTAG靶向配体具有选自表L的结构：
表L
其中Z、TL和p1各自如上所述。
本文所述的任何一个降解决定子可以共价地结合至本文所述的任何一个接头。
在某些实施方式中，本申请包括具有以下结构的降解决定子-接头(DL)：
其中每个变量如上在式D0和式L0中所述，并且dTAG靶向配体用Z旁边的共价地结合至DL。
在某些实施方式中，本申请包括具有以下结构的降解决定子-接头(DL)：
其中每个变量如上在式D和式L0中所述，并且dTAG靶向配体用Z旁边的共价地结合至DL。
本申请的一些实施方式涉及具有以下结构的双功能化合物：
或其对映异构体、非对映异构体或立体异构体，其中每个变量如上在式D和式L0中所述，并且dTAG靶向配体在下文中描述。
本申请的另外实施方式涉及具有以下结构的双功能化合物：
或其对映异构体、非对映异构体或立体异构体，其中每个变量如上在式D和式L0中所述，并且dTAG靶向配体在下文中描述。
本申请的某些实施方式涉及具有以下结构之一的双功能化合物：
在某些实施方式中，接头可以是大小范围为约1至约12个乙二醇单位、1和约10个乙二醇单位之间、约2和约6个乙二醇单位之间、约2和5个乙二醇单位之间、约2和4个乙二醇单位之间的聚乙二醇基团。
在某些实施方式中，基于dTAG靶向配体关于接头的连接位置的SAR(结构-活性关系)和X射线晶体学设计和优化接头。
在某些实施方式中，最佳接头长度和组成根据靶标而变化，并且可以基于与其靶标结合的原始dTA靶向配体的X射线结构来估计。接头长度和组成还可以被修饰以调节代谢稳定性和药代动力学(PK)和药效学(PD)参数。
在某些实施方式中，其中dTAG靶向配体结合多个靶标，选择性可以通过改变接头长度来实现，其中配体在不同结合口袋中结合其靶标中的一些，例如比其他结合口袋更深或更浅的结合口袋。
在另外的实施方式中，用于本发明的异型双功能化合物包含化学接头(L)。在某些实施方式中，接头基团L是包含A的一个或多个共价地连接的结构单元(例如-A1...Aq-)的基团，其中A1是与降解决定子、dTAG靶向配体或其组合中的至少一个偶联的基团。在某些实施方式中，A1将降解决定子、dTAG靶向配体或其组合直接连接至另一个降解决定子、dTAG靶向配体或其组合。在其他实施方式中，A1通过Aq将降解决定子、dTAG靶向配体或其组合间接地连接至另一个降解决定子、dTAG靶向配体或其组合。
在某些实施方式中，A1至Aq各自独立地为键、CRL1RL2、O、S、SO、SO2、NRL3、SO2NRL3、SONRL3、CONRL3、NRL3CONRL4、NRL3SO2NRL4、CO、CRL1═CRL2、C≡C、SiRL1RL2、P(O)RL1、P(O)ORL1、NRL3C(═NCN)NRL4、NRL3C(═NCN)、NRL3C(═CNO2)NRL4、任选地被0-6个RL1和/或RL2基团取代的C3-11环烷基、任选地被0-6个RL1和/或RL2基团取代的C3-11杂环基、任选地被0-6个RL1和/或RL2基团取代的芳基、任选地被0-6个RL1和/或RL2基团取代的杂芳基，其中RL1或RL2各自独立地可以连接至其他A基团以形成可以进一步被0-4个RL5基团取代的环烷基和/或杂环基部分；其中
RL1、RL2、RL3、RL4和RL5各自独立地为H、卤素、C1-8烷基、OC1-8烷基、SC1-8烷基、NHC1-8烷基、N(C 1-8烷基)2、C3-11环烷基、芳基、杂芳基、C3-11杂环基、OC1-8环烷基、SC1-8环烷基、NHC1-8环烷基、N(C 1-8环烷基)2、N(C 1-8环烷基)(C 1-8烷基)、OH、NH2、SH、SO2C1-8烷基、P(O)(OC 1-8烷基)(C 1-8烷基)、P(O)(OC 1-8烷基)2、CC-C1-8烷基、CCH、CH＝CH(C1-8烷基)、C(C 1-8烷基)＝CH(C 1-8烷基)、C(C 1-8烷基)＝C(C 1-8烷基)2、Si(OH)3、Si(C 1-8烷基)3、Si(OH)(C 1-8烷基)2、COC1-8烷基、CO2H、卤素、CN、CF3、CHF2、CH2F、NO2、SF5、SO2NHC1-8烷基、SO 2N(C 1-8烷基)2、SONHC1-8烷基、SON(C 1-8烷基)2、CONHC1-8烷基、CON(C 1-8烷基)2、N(C 1-8烷基)CONH(C 1-8烷基)、N(C 1-8烷基)CON(C 1-8烷基)2、NHCONH(C 1-8烷基)、NHCON(C 1-8烷基)2、NHCONH2、N(C 1-8烷基)SO 2NH(C 1-8烷基)、N(C 1-8烷基)SO 2N(C 1-8烷基)2、NH SO 2NH(C 1-8烷基)、NH SO 2N(C 1-8烷基)2、NH SO2NH2。
在某些实施方式中，q是大于或等于0的整数。在某些实施方式中，q是大于或等于1的整数。
在某些实施方式中，例如，其中q大于2时，Aq是与降解决定子连接的基团，并且A1和Aq经由A的结构单元(A的这样的结构单元的数量：q-2)连接。
在某些实施方式中，例如，其中q是2时，Aq是与A1连接且与降解决定子部分连接的基团。
在某些实施方式中，例如，其中q是1时，接头基团L的结构是-A1-，并且A1是连接至降解决定子和dTAG靶向配体部分的基团。
在另外的实施方式中，q是1至100、1至90、1至80、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至20或1至10的整数。
在某些实施方式中，接头(L)选自图28中的结构。
在某些实施方式中，接头(L)选自图29中的结构。
在另外的实施方式中，接头基团是任选地取代的(聚)乙二醇，其具有1至约100个乙二醇单位之间、约1至约50个乙二醇单位之间、1至约25个乙二醇单位之间、约1至10个乙二醇单位之前、1至约8个乙二醇单位之间和1至6个乙二醇单位之间、2至4个乙二醇单位之间、或任选地取代的烷基，其中分散有任选地取代的O、N、S、P或Si原子。在某些实施方式中，接头被芳基、苯基、苄基、烷基、亚烷基或杂环基团取代。在某些实施方式中，接头可以是不对称的或对称的。
在本文所述的化合物的任何实施方式中，接头基团可以是如本文所述的任何合适的部分。在一个实施方式中，接头是取代的或未取代的聚乙二醇基团，其大小范围为约1至12个乙二醇单位、1和约10个乙二醇单位之间、约2和约6个乙二醇单位之间、约2和5个乙二醇单位之间、约2和4个乙二醇单位之间。
尽管降解决定子基团和dTAG靶向配体基团可以通过任何适合的并且对接头的化学性质稳定的基团共价地连接至接头基团，接头独立地共价地结合至降解决定子基团和dTAG靶向配体基团，优选地通过酰胺、酯、硫酯、酮基、氨基甲酸酯(尿烷)、碳或醚，其基团各自可以被插入到降解决定子基团和dTAG靶向配体基团上的任何位置以提供泛素连接酶的降解决定子基团和靶标dTAG上的dTAG靶向配体基团的最大结合。(注意在其中降解决定子基团靶向泛素连接酶的某些方面，用于降解的靶蛋白可以是泛素连接酶本身)。接头可以连接至降解决定子和/或dTAG靶向配体基团上任选地取代的烷基、亚烷基、烯烃或炔烃基团、芳基或杂环基团。
在某些实施方式中，“L”可以是具有4至24个直链原子的直链，直链中的碳原子可以被氧、氮、酰胺、氟化碳等取代，例如图30中的结构。
在某些实施方式中，“L”可以是非直链，并且可以是脂肪族或芳香族或杂芳香族环状部分，"L"的一些实例包括但不限于图31的结构。
dTAG靶向配体
dTAG靶向配体(TL)能够与dTAG结合或被dTAG靶标结合，其允许采用泛素的标记发生。
如本文所预期的，本发明的CAR包括位于细胞质中的异型双功能化合物靶向蛋白(dTAG)。CAR的异型双功能化合物靶向蛋白是在与异型双功能化合物接触时，异型双功能化合物可以结合，导致CAR降解的任何氨基酸序列。优选地，dTAG不应该干扰CAR的功能。在一个实施方式中，dTAG是非内源肽，导致异型双功能化合物选择性和允许在施用异型双功能化合物时避免脱靶效应。在一个实施方式中，dTAG是衍生自内源蛋白质的氨基酸序列，其已经被修饰使得异型双功能化合物仅结合至修饰的氨基酸序列而不结合内源表达的蛋白质。在一个实施方式中，dTAG是内源表达的蛋白质。如本文所预期的，可以被用于异型双功能化合物的配体结合的任何氨基酸序列结构域可用作dTAG。
在特定的实施方式中，用于本发明的dTAG包括但不限于衍生自内源表达的蛋白的氨基酸序列，例如FK506结合蛋白-12(FKBP12)、含溴结构域蛋白4(BRD4)、CREB结合蛋白(BREBBP)和转录激活因子BRG1(SMARCA4)或其变体。如本文所预期的，“变体”指任何变体，例如一个或几个或多个氨基酸的取代、缺失或添加，条件是变体基本上保留与原始序列相同的功能，其在这种情况下是为异型双功能化合物提供配体。在其他实施方式中，用于本发明的dTAG可以包括例如激素受体如雌激素受体蛋白、雄激素受体蛋白、类视色素X受体(RXR)蛋白和二氢叶酸还原酶(DHFR)，包括细菌DHFR、细菌脱氢酶和变体。
本申请的一些实施方式包括靶向dTAG的TL，其包括但不限于衍生自Hsp90抑制剂、激酶抑制剂、MDM2抑制剂、靶向人BET含溴结构域蛋白的化合物、靶向细胞溶质信号传导蛋白FKBP12的化合物、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、免疫抑制剂化合物和靶向芳香烃受体(AHR)的化合物的那些。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是能够结合或结合源自激酶、BET含溴结构域蛋白抑制剂、细胞溶质信号传导蛋白(例如FKBP12)、核蛋白、组蛋白脱乙酰酶、赖氨酸甲基转移酶、蛋白质调节血管生成、蛋白质调节免疫应答、芳烃受体(AHR)、雌激素受体、雄激素受体、糖皮质激素受体或转录因子(例如SMARCA4、SMARCA2、TRIM24)的dTAG。
在某些实施方式中，dTAG衍生自dTAG靶向配体能够结合或结合的激酶，其包括但不限于酪氨酸激酶(例如AATK、ABL、ABL2、ALK、AXL、BLK、BMX、BTK、CSK、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB6、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FER、FES、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGR、FLT1、FLT3、FLT4、FRK、FYN、GSG2、HCK、IG1R、ILK、INSR、INSRR、IRAK4、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KDR、KIT、KSR1、LCK、LMTK2、LMTK3、LTK、LYN、MATK、MERTK、MET、MLTK、MST1R、MUSK、NPR1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、TXK、TXK2、TYRO3、YES1或ZAP70)、丝氨酸/苏氨酸激酶(例如酪蛋白激酶2、蛋白激酶A、蛋白激酶B、蛋白激酶C、Raf激酶、CaM激酶、AKT1、AKT2、AKT3、ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、极光激酶A、极光激酶B、极光激酶C、CHK1、CHK2、CLK1、CLK2、CLK3、DAPK1、DAPK2、DAPK3、DMPK、ERK1、ERK2、ERK5、GCK、GSK3、HIPK、KHS1、LKB1、LOK、MAPKAPK2、MAPKAPK、MNK1、MSSK1、MST1、MST2、MST4、NDR、NEK2、NEK3、NEK6、NEK7、NEK9、NEK11、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PAK5、PAK6、PIM1、PIM2、PLK1、RIP2、RIP5、RSK1、RSK2、SGK2、SGK3、SIK1、STK22、TAO1、TAO2、TGF-β、TLK2、TSSK2、ULK1或ULK2)、周期素依赖性激酶(例如Cdk1-Cdk11)和亮氨酸富集重复激酶(例如LRRK2)。
在某些实施方式中，dTAG衍生自dTAG靶向配体能够结合或结合的BET含溴结构域蛋白，其包括但不限于ASH1L、ATAD2、BAZ1A、BAZ1B、BAZ2A、BAZ2B、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD5、BRD6、BRD7、BRD8、BRD9、BRD10、BRDT、BRPF1、BRPF3、BRWD3、CECR2、CREBBP、EP300、FALZ、GCN5L2、KIAA1240、LOC93349、MLL、PB1、PCAF、PHIP、PRKCBP1、SMARCA2、SMARCA4、SP100、SP110、SP140、TAF1、TAF1L、TIF1a、TRIM28、TRIM33、TRIM66、WDR9、ZMYND11和MLL4。在某些实施方式中，BET含溴结构域蛋白是BRD4。
在某些实施方式中，dTAG衍生自dTAG靶向配体能够结合或结合的核蛋白，其包括但不限于BRD2、BRD3、BRD4、触角足同源结构域蛋白、BRCA1、BRCA2、CCAAT增强的结合蛋白、组蛋白、多梳蛋白质组、高迁移率组蛋白、端粒结合蛋白、FANCA、FANCD2、FANCE、FANCF、肝细胞核因子、Mad2、NF-κB、核受体共激活因子、CREB结合蛋白、p55、p107、p130、Rb蛋白、p53、c-fos、c-jun、c-mdm2、c-myc和c-rel。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体选自激酶抑制剂、BET含溴结构域蛋白抑制剂、细胞溶质信号传导蛋白FKBR12配体、HDAC抑制剂、赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、免疫抑制化合物和芳基烃受体(AHR)抑制剂。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是SERM(选择性雌激素受体调节剂)或SERD(选择性雌激素受体降解剂)。SERM和SERD的非限制性实例提供在转让给Astra Zeneca的WO2014/191726、WO2013/090921、WO 2014/203129、WO 2014/203132和转让给OlemaPharmaceuticals的US2013/0178445，以及美国专利号9,078,871、8,853,423和8,703,810，以及US 2015/0005286、WO 2014/205136和转让给Seragon Pharmaceuticals的WO 2014/205138中。
另外的dTAG靶向配体包括例如结合至内源性蛋白(结合靶dTAG)的任何部分。说明性的dTAG靶向配体包括小分子dTAG靶向配体：Hsp90抑制剂、激酶抑制剂、HDM2和MDM2抑制剂、靶向人BET含溴结构域蛋白的化合物、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、血管生成抑制剂、核激素受体化合物、免疫抑制化合物、以及靶向芳基烃受体(AHR)的化合物等等。这样的小分子靶dTAG结合部分还包括这些组合物的药学上可接受的盐、对映异构体、溶剂合物和多晶型物，以及可以靶向感兴趣的dTAG的其他小分子。
在一些实施方式中，dTAG靶向配体是Ubc9SUMO E2连接酶5F6D靶向配体，其包括但不限于在由W.M.,等人在“Insights Into the Allosteric Inhibition of the SUMOE2Enzyme Ubc9”(2016)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.55:5703-5707中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是Tank1靶向配体，其包括但不限于在“Structure of human tankyrase 1in complex with small-molecule inhibitorsPJ34and XAV939”.Kirby,C.A.,Cheung,A.,Fazal,A.,Shultz,M.D.,Stams,T,(2012)ActaCrystallogr.,Sect.F 68:115-118和“Structure-Efficiency Relationship of [1,2,4]Triazol-3-ylamines as Novel Nicotinamide Isosteres that Inhibit Tankyrases.”Shultz,M.D.,et al.(2013)J.Med.Chem.56:7049-7059中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是pp60Src靶向配体的SH2结构域，其包括但不限于在“Requirements for Specific Binding of Low Affinity InhibitorFragments to the SH2Domain of pp60Src Are Identical to Those for HighAffinity Binding of Full Length Inhibitors”Gudrun Lange等,J.Med.Chem.2003,46,5184-5195中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是Sec7结构域靶向配体，其包括但不限于在“The Lysosomal Protein Saposin B Binds Chloroquine.”Huta,B.P.,等,(2016)Chemmedchem 11:277中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是Saposin-B靶向配体，其包括但不限于在“The structure of cytomegalovirus immune modulator UL141highlights structuralIg-fold versatility for receptor binding”I.Nemcovicova and D.M.Zajonc ActaCryst.(2014).D70,851-862中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是蛋白S100-A7 2OWS靶向配体，其包括但不限于在“2WOS STRUCTURE OF HUMAN S100A7 IN COMPLEX WITH 2,6ANS”DOI:10.2210/pdb2wos/pdb和“Identification and Characterization of Binding Sites on S100A7,a Participant in Cancer and Inflammation Pathways.”Leon,R.,Murray,等,(2009)Biochemistry 48:10591-10600中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是磷脂酶A2靶向配体，其包括但不限于在“Structure-based design of the first potent and selective inhibitor of humannon-pancreatic secretory phospholipase A2”Schevitz,R.W.,等,Nat.Struct.Biol.1995,2,458-465中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是PHIP靶向配体，其包括但不限于在“APoised Fragment Library Enables Rapid Synthetic Expansion Yielding the FirstReported Inhibitors of PHIP(2),an Atypical Bromodomain”Krojer,T.；等Chem.Sci.2016,7,2322-2330中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是PDZ靶向配体，其包括但不限于在“Discovery of Low-Molecular-Weight Ligands for the AF6 PDZ Domain”MangeshJoshi,等Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3790-3795中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是PARP15靶向配体，其包括但不限于在“Structural Basis for Lack of ADP-ribosyltransferase Activity in Poly(ADP-ribose)Polymerase-13/Zinc Finger Antiviral Protein.”Karlberg,T.,等,(2015)J.Biol.Chem.290:7336-7344中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是PARP14靶向配体，其包括但不限于在“Discovery of Ligands for ADP-Ribosyltransferases via Docking-Based VirtualScreening.”Andersson,C.D.,等,(2012)J.Med.Chem.55:7706-7718；“Family-widechemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.”Wahlberg,E.,等(2012)Nat.Biotechnol.30:283-288；“Discovery of Ligands for ADP-Ribosyltransferases via Docking-Based Virtual Screening.”Andersson,C.D.,等(2012)J.Med.Chem.55:7706-7718中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是MTH1靶向配体，其包括但不限于在“MTH1inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool”Helge Gad,等Nature,2014,508,215-221中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是mPGES-1靶向配体，其包括但不限于在“Crystal Structures of mPGES-1Inhibitor Complexes Form a Basis for theRational Design of Potent Analgesic and Anti-Inflammatory Therapeutics.”Luz,J.G.,等,(2015)J.Med.Chem.58:4727-4737中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是FLAP-5-脂氧合酶激活蛋白靶向配体，其包括但不限于在“Crystal structure of inhibitor-bound human 5-lipoxygenase-activating protein.”Ferguson,A.D.,McKeever,B.M.,Xu,S.,Wisniewski,D.,Miller,D.K.,Yamin,T.T.,Spencer,R.H.,Chu,L.,Ujjainwalla,F.,Cunningham,B.R.,Evans,J.F.,Becker,J.W.(2007)Science 317:510-512中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是FA结合蛋白靶向配体，其包括但不限于在“A Real-World Perspective on Molecular Design.”Kuhn,B.；等J.Med.Chem.2016,59,4087-4102中描述的那些。
在另一个实施方式中，dTAG靶向配体是BCL2靶向配体，其包括但不限于在“ABT-199,a potent and selective BCL-2inhibitor,achieves antitumor activity whilesparing platelets.”Souers,A.J.,等(2013)NAT.MED.(N.Y.)19:202-208中描述的那些。
能够结合至dTAG靶向配体基团并作用于泛素连接酶或被泛素连接酶降解的任何蛋白质是根据本发明的靶蛋白。通常，用作dTAG的内源性靶蛋白可以包括，例如，结构蛋白、受体、酶、细胞表面蛋白、与细胞的完整功能相关的蛋白，包括涉及催化活性、芳香酶活性、运动活性、解旋酶活性、代谢过程(合成代谢和分解代谢)、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成的蛋白质，具有激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节剂活性、信号传导活性、结构分子活性、结合活性(蛋白质、脂质碳水化合物)、受体活性、膜融合、细胞通讯、生物过程的调节、发育、细胞分化、对刺激的反应的蛋白，行为蛋白质，细胞粘附蛋白，涉及细胞死亡的蛋白质，涉及转运的蛋白质(包括蛋白转运蛋白活性、核转运、离子转运蛋白活性、通道转运蛋白活性、载体活性、通透酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机制、伴侣调节剂活性、核酸结合活性、转录调节活性、细胞外组织和生物起源活性、翻译调节器活性。
更具体地说，用于人治疗剂的许多药物靶标代表dTAG靶标，蛋白质靶标或dTAG靶向配体可以结合至其并引入至根据本发明的化合物中。这些包括可用于恢复许多多基因疾病中的功能的蛋白质，包括例如B7.1和B7、TINFR1m、TNFR2、NADPH氧化酶、BclIBax和在凋亡途径中的其他配偶体、C5a受体、HMG-CoA还原酶、PDE V型磷酸二酯酶、PDE IV磷酸二酯酶4型、PDE I、PDE II、PDE III、角鲨烯环化酶抑制剂、CXCR1、CXCR2、一氧化氮(NO)合酶、环加氧酶1、环加氧酶2、5HT受体、多巴胺受体、G蛋白如Gq、组胺受体、5-脂氧合酶、类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶、胸苷酸合酶、嘌呤核苷磷酸化酶、GAPDH锥虫、糖原磷酸化酶、碳酸酐酶、趋化因子受体、JAW STAT、RXR和类似、HIV 1蛋白酶、HIV 1整合酶、流感、神经氨酸酶、乙肝逆转录酶、钠通道、多重耐药性(MDR)、蛋白质P-糖蛋白(和MRP)、酪氨酸激酶、CD23、CD124、酪氨酸激酶p56lck、CD4、CD5、IL-2受体、IL-1受体、TNF-α、ICAM1、Cat+通道、VCAM、VLA-4整联蛋白、选择素、CD40/CD40L、新激肽和受体、肌苷单磷酸脱氢酶、p38MAP激酶、RaslRaflMEWERK途径、白细胞介素-1转化酶、半胱天冬、HCV、NS3蛋白酶、HCV NS3RNA解旋酶、甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶、鼻病毒3C蛋白酶、单纯疱疹病毒-1(HSV-I)、蛋白酶、巨细胞病毒(CMV)蛋白酶、聚(ADP-核糖)聚合酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、血管内皮生长因子、催产素受体、微粒体转移蛋白抑制剂、胆汁酸转运抑制剂、5α还原酶抑制剂、血管紧张素11、甘氨酸受体、去甲肾上腺素再摄取受体、内皮素受体、神经肽Y和受体、雌激素受体、雄激素受体、腺苷受体、腺苷激酶和AMP脱氨酶、嘌呤能受体(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2X1-7)、法尼基转移酶、香叶基香叶基转移酶、TrkA a NGF受体、β-淀粉样蛋白、酪氨酸激酶Flk-IIKDR、玻连蛋白受体、整联蛋白受体、Her-21neu、端粒酶抑制、胞质磷脂酶A2和EGF受体酪氨酸激酶。可用作dTAG的另外的蛋白靶标包括例如蜕皮激素20-单加氧酶、GABA门控氯离子通道的离子通道、乙酰胆碱酯酶、电压敏感的钠通道蛋白、钙释放通道和氯离子通道。用作dTAG的更进一步靶蛋白包括乙酰辅酶A羧化酶、腺苷琥珀酸合成酶、原卟啉原氧化酶和烯醇式丙酮酸莽草酸磷酸合酶。
卤代烷脱卤素酶是可用作dTAG的根据本发明的特定化合物的另一靶标。含有氯烷基肽结合部分(C1-C12，通常为约C2-C10烷基卤素基团)的本发明化合物可用于抑制和/或降解卤代烷脱卤素酶，其用于融合蛋白或相关诊断蛋白中，如2011年12月6日提交的PCT/US2012/063401中所述，并且在2012年6月14日以WO2012/078559公开，其内容通过引用并入本文。
dTAG靶向配体的非限制性实例显示于下表T中，并且代表能够靶向可用作dTAG的蛋白质或氨基酸序列的dTAG靶向配体。
表T
BRD dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点；和
R’：是甲基或乙基。
CREBBP dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点；
A是N或CH；和
m是0、1、2、3、4、5、6、7或8。
SMARCA4/PB1/SMARCA2dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点；
A是N或CH；和
m是0、1、2、3、4、5、6、7或8。
TRIM24/BRPF1dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点；和
m是0、1、2、3、4、5、6、7或8。
糖皮质激素受体dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
雌激素/雄激素受体dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
DOT1L dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点；
A是N或CH；和
m是0、1、2、3、4、5、6、7或8。
Ras dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
RasG12C dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
Her3dTAG dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点；和R’是
Bcl-2/Bcl-XL dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
HDAC dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
PPAR-γdTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
RXR dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
DHFR dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
热休克蛋白90(HSP90)抑制剂：
本文使用的HSP90抑制剂包括，但不限于：
1.HSP90抑制剂确定于Vallee等“Tricyclic Series of Heat Shock Protein 90(HSP90)Inhibitors Part I:Discovery of Tricyclic Imidazo[4,5-C]Pyridines asPotent Inhibitors of the HSP90Molecular Chaperone(2011)J.Med.Chem.54:7206，其包括YKB(N-[4-(3H-咪唑并[4,5-C]吡啶-2-基)-9H-芴-9-基]-琥珀酰胺)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团通过例如末端酰胺基团连接；
2.HSP90抑制剂p54(修饰的)8-[(2,4-二甲基苯基)硫烷基]-3]戊-4-炔-1-基-3H-嘌呤-6-胺)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团通过例如末端乙炔基团连接；
3.HSP90抑制剂确定于Brough,等,“4,5-Diarylisoxazole HSP90 ChaperoneInhibitors:Potential Therapeutic Agents for the Treatment of Cancer”，J.MED.CHEM.vol:51,page:196(2008)，其包括具有以下结构的化合物2GJ(5-[2,4-二羟基-5-(1-甲基乙基)苯基]-n-乙基-4-[4-(吗啉-4-基甲基)苯基]异噁唑-3-甲酰胺)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团通过例如酰胺基团(在胺上或在胺的烷基上)连接；
4.HSP90抑制剂(修饰的)确定于Wright,等,“Structure-ActivityRelationships in Purine-Based Inhibitor Binding to HSP90Isoforms”，ChemBiol.2004June；11(6):775-85，其包括具有以下结构的HSP90抑制剂PU3：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团通过例如丁基基团连接；和
5.HSP90抑制剂格尔德霉素((4E，6Z，8S，9S，10E，12S，13R，14S，16R)-13-羟基8,14,19三甲氧基4,10,12,16-四甲基3,20,22三氧代-2-氮杂双环[16.3.1](衍生化的)或其任何衍生物(例如17烷基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(“17-AAG”)或17-(2-二甲氨基乙基)氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(“17-DMAG”))(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团通过例如酰胺基团连接)。
激酶和磷酸酶抑制剂：
本文使用的激酶抑制剂包括，但不限于：
1.厄洛替尼衍生酪氨酸激酶抑制剂：
其中R是例如通过醚基团连接的接头接团L或(L-降解决定子)基团；
2.激酶抑制剂舒尼替尼(衍生化的)：
衍生化的，其中R是连接至例如吡咯部分的接头接团L或(L-降解决定子)基团；
3.激酶抑制剂索拉菲尼(衍生化的)：
衍生化的，其中R是连接至例如酰胺部分的接头接团L或(L-降解决定子)基团；
4.激酶抑制剂达沙替尼(衍生化的)：
衍生化的，其中R是连接至例如嘧啶的接头接团L或(L-降解决定子)基团；
5.激酶抑制剂拉帕替尼(衍生化的)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过磺酰甲基的末端甲基连接。
6.激酶抑制剂U09-CX-5279(衍生化的)：
衍生化的，其中接头接团L或(L-降解决定子)基团例如通过胺(苯胺)、羧酸或胺α连接至环丙基或环丙基。
7.激酶抑制剂确定于Millan,等,Design and Synthesis ofInhaledP38Inhibitors for the Treatment of Chronic ObstructivePulmonaryDisease,J.MED.CHEM.vol:54,page:7797(2011)，其包括具有以下结构的激酶抑制剂Y1W和Y1X(衍生化的)：
YIX(1-乙基-3-(2-{[3-(1-甲基乙基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基]硫烷基}苄基)脲，衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过异丙基连接；
1-(3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(2-{[3-(1-甲基乙基)-[1,2,4]三唑并[4,3-一个]吡啶-6-基]硫烷基}苄基)脲
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如优选地通过异丙基或叔丁基连接。
8.激酶抑制剂额确定于Schenkel,等,Discovery of Potent and HighlySelective Thienopyridine Janus Kinase 2Inhibitors J.Med.Chem.,2011,54(24),pp8440-8450，其包括具有以下结构的化合物6TP和0TP(衍生化的)：
4-氨基-2-[4-(叔丁基氨磺酰基)苯基]-N-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7-甲酰胺噻吩并吡啶19
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过与酰胺部分结合的末端甲基连接；
4-氨基-N-甲基-2-[4-(吗啉-4-基)苯基]噻吩并[3,2-c]吡啶-7-甲酰胺噻吩并吡啶8
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过与酰胺部分结合的末端甲基连接；
9.激酶抑制剂确定于Van Eis,等,“2,6-Naphthyridines as potent andselective inhibitors of the novel protein kinase C isozymes”,Biorg.Med.Chem.Lett.2011Dec.15；21(24):7367-72，其包括具有以下结构的激酶抑制剂07U：
2-甲基N～1～-[3-(吡啶-4-基)-2,6-二氮杂萘-1-基]丙烷-1,2-二胺
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过伯胺或末端氨基基团连接；
10.激酶抑制剂确定于Lountos,等,“Structural Characterization ofInhibitor Complexes with Checkpoint Kinase 2(Chk2),a Drug Target for CancerTherapy”，J.STRUCT.BIOL.vol:176,pag:292(2011)，其包括具有以下结构的激酶抑制剂XK9和NXP(衍生化的)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过末端羟基中的任何一个连接；
11.激酶抑制剂确定于Lountos,等,“Structural Characterization ofInhibitor Complexes with Checkpoint Kinase 2(Chk2),a Drug Target for CancerTherapy”，J.STRUCT.BIOL.vol:176,pag:292(2011)，其包括具有以下结构的激酶抑制剂XK9和NXP(衍生化的)：
N-{4-[(1E)-N-(N-羟基甲脒基)乙烷亚肼基]苯基}-7-硝基-1H-吲哚-2-甲酰胺
N-{4-[(1E)-N-乙酰氨基乙烷肼基]苯基}-1H-吲哚-3-甲酰胺
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过末端羟基(XK9)或腙基(NXP)连接；
12.激酶抑制剂阿法替尼(衍生化的)(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲氨基)-2-丁烯酰胺)(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过脂肪族胺基团连接)；
13.激酶抑制剂fostamatinib(衍生化的)([6-({5-氟-2-[(3,4,5-三甲氧基苯基)氨基]嘧啶-4-基}氨基)-2,2-二甲基-3-氧代-2,3-二氢-4H-吡啶并[3,2-b]-1,4-噁嗪-4-基]甲基磷酸二钠六水合物)(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过甲氧基连接)；
14.激酶抑制剂吉非替尼(衍生化的)(N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过甲氧基或醚基团连接；
15.激酶抑制剂lenvatinib(衍生化的)(4-[3-氯-4-(环丙基氨基甲酰基氨基)苯氧基]-7-甲氧基-喹啉-6-甲酰胺)(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过环丙基连接)；
16.激酶抑制剂vandetanib(衍生化的)(N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺)(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过甲氧基或羟基连接)；
17.激酶抑制剂vemurafenib(衍生化的)(丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺)，衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过磺酰基丙基连接；
18.激酶抑制剂格列卫(衍生化的)：
衍生化的，其中R作为接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过酰胺基团或通过苯胺基团连接；
19.激酶抑制剂帕唑帕尼(衍生化的)(VEGFR3抑制剂)：
衍生化的，其中R是接头基团L或-(L-降解决定子)基团，其例如连接至苯基部分或通过苯胺基团连接；
20.激酶抑制剂AT-9283(衍生化的)极光激酶抑制剂
其中R是接头基团L或-(L-降解决定子)基团，其例如连接至苯基部分；
21.激酶抑制剂TAE684(衍生化的)ALK抑制剂
其中R是接头基团L或-(L-降解决定子)基团，其例如连接至苯基部分；
22.激酶抑制剂尼罗尼布(衍生化的)Abl抑制剂：
衍生化的，其中R是接头基团L或-(L-降解决定子)基团，其例如连接至苯基部分或苯胺基团；
23.激酶抑制剂NVP-BSK805(衍生化的)JAK2抑制剂
衍生化的，其中R是接头基团L或-(L-降解决定子)基团，其例如连接至苯基部分或二唑基团；
24.激酶抑制剂克唑替尼衍生的Alk抑制剂
衍生化的，其中R是接头基团L或-(L-降解决定子)基团，其例如连接至苯基部分或二唑基团；
25.激酶抑制剂JNJ FMS(衍生化的)抑制剂
衍生化的，其中R是接头基团L或-(L-降解决定子)基团，其例如连接至苯基部分；
26.激酶抑制剂foretinib(衍生化的)Met抑制剂
衍生化的，其中R是接头基团L或-(L-降解决定子)基团，其例如连接至苯基部分或喹啉部分上的羟基或醚基团；
27.变构蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂PTP1B(衍生化的)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在R处连接，如所示：
28.酪氨酸磷酸酶SHP-2结构域抑制剂(衍生化的)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在R处连接；
29.BRAF(BRAFV600E)/MEK的抑制剂(衍生化的)：
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在R处连接；
30.酪氨酸激酶ABL的抑制剂(衍生化的)
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在R处连接；
31.激酶抑制剂OSI-027(衍生化的)mTORC1/2抑制剂
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在R处连接；
32.激酶抑制剂OSI-930(衍生化的)c-Kit/KDR抑制剂
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在R处连接；和
33.激酶抑制剂OSI-906(衍生的)IGF1R/IR抑制剂
衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在R处连接。
其中，在节I-XVII中所述的任何实施方式中，"R"表示接头基团L或-(L-降解决定子)基团在哌嗪部分上的连接位点。
HDM2/MDM2抑制剂：
本文使用的HDM2/MDM2抑制剂包括，但不限于：
1.HDM2/MDM2抑制剂确定于Vassilev,等,In vivo activation of thep53pathway by small-molecule antagonists of MDM2,SCIENCE vol:303,pag:844-848(2004)和Schneekloth,等,Targeted intracellular protein degradation induced bya small molecule:En route to chemical proteomics,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)5904-5908，其包括(或另外地)如下所述的化合物nutlin-3、nutlin-2和nutlin-1(衍生化的)，以及其所有衍生物和类似物：
(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在甲氧基上或作为羟基基团连接)；
(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如在甲氧基或羟基基团上连接)；
(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过甲氧基或作为羟基基团连接)；和
2.反式-4-碘-4'-硼烷基-查耳酮
(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过羟基连接)。
靶向人BET含溴结构域蛋白的化合物：
在某些实施方式中，“dTAG靶向配体”可以是结合至溴和额外末端(BET)蛋白BRD2、BRD3和BRD4的配体。靶向人BET含溴结构域蛋白的化合物包括但不限于与如下所示的靶标相关的化合物，其中“R”或“接头”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接的位点，例如：
1.JQ1，Filippakopoulos等Selective inhibition of BETBromodomains.Nature(2010)：
2.I-BET，Nicodeme等Suppression of Inflammation by a Synthetic HistoneMimic.Nature(2010)。Chung等Discovery and Characterization of Small MoleculeInhibitors of the BET Family Bromodomains.J.Med Chem.(2011)：
3.Hewings等3,5-Dimethylisoxazoles Act as Acetyl-lysine BromodomainLigands.J.Med.Chem.(2011)54 6761-6770描述的化合物。
4.I-BET151，Dawson等Inhibition of BET Recruitment to Chromatin as anEffective Treatment for MLL-fusionLeukemia.Nature (2011)：
5.咔唑类型(US 2015/0256700)
6.吡咯并吡啶类型(US 2015/0148342)
7.四氢喹啉类型(WO 2015/074064)
8.三唑吡嗪类型(WO 2015/067770)
9.吡啶酮类型(WO 2015/022332)
10.喹唑啉酮类型(WO 2015/015318)
11.二氢吡啶并吡嗪酮类型(WO 2015/011084)
(其中R或L或接头，在每种情况下，指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团的连接位点)。
HDAC抑制剂：
HDAC抑制剂(衍生化的)包括，但不限于：
1.Finnin，M.S.等Structures of Histone Deacetylase Homologue Bound tothe TSA and SAHA Inhibitors.Nature 40,188-193(1999)。
(衍生化的，其中“R”指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团的连接位点)；和
2.如PCT WO0222577(“DEACETYLASE INHIBITORS”)的式(I)所定义的化合物(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过羟基连接)；
人赖氨酸甲基转移酶抑制剂：
人赖氨酸甲基转移酶抑制剂包括，但不限于：
1.Chang等Structural Basis for G9a-Like protein LysineMethyltransferase Inhibition by BIX-1294.Nat.Struct.Biol.(2009)16(3)312。
(衍生化的，其中“R”指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团的连接位点)；
2.Liu,F等l Discovery of a 2,4-Diamino-7-aminoalkoxyquinazoline as aPotent and Selective Inhibitor of Histone Methyltransferase G9a.J.Med.Chem.(2009)52(24)7950。
(衍生化的，其中“R”指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团的连接位点)；
3.阿扎胞苷(衍生化的)(4-氨基-1-(3-d-D-呋喃核糖基-1,3,5-三嗪-2(1H)-酮)(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过羟基或氨基连接)；和
4.地西他滨(衍生化的)(4-氨基-1-(2-脱氧-B-d赤式-呋喃戊糖基)-1,3,5-三嗪-2(1H)-酮)(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团例如通过任一羟基或在氨基处连接)。
血管生成抑制剂：
血管生成抑制剂包括，但不限于：
1.GA-1(衍生化的)和其衍生物和类似物，其具有如Sakamoto,等,Development ofProtacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination anddegradation,Mol Cell Proteomics 2003December；2(12):1350-8中所述的结构并结合至接头；
2.雌二醇(衍生化的)，其可以结合至接头基团L或-(L-降解决定子)基团，如在Rodriguez-Gonzalez,等,Targeting steroid hormone receptors for ubiquitinationand degradation in breast and prostate cancer,Oncogene(2008)27,7201-7211中通常地描述的；
3.雌二醇、睾酮(衍生化的)和相关的衍生物，其包括但不限于DHT及其衍生物和类似物，其具有如Sakamoto,等,Development of Protacs to target cancer-promotingproteins for ubiquitination and degradation,Mol Cell Proteomics 2003December；2(12):1350-8中通常所述的结构并连接至接头基团L或-(L-降解决定子)基团；和
4.Ovalicin、烟曲霉素(衍生化的)，及其衍生物和类似物，其具有如Sakamoto,等,Protacs:chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F boxcomplex for ubiquitination and degradation Proc Natl Acad Sci USA.2001Jul.17；98(15):8554-9和美国专利号7,208,157中通常所述的结构并连接至接头基团L或-(L-降解决定子)基团。
免疫抑制化合物：
免疫抑制化合物包括，但不限于：
1.AP21998(衍生化的)，其具有Schneekloth,等,Chemical Genetic Control ofProtein Levels:Selective in Vivo Targeted Degradation,J.AM.CHEM.SOC.2004,126,3748-3754中通常所述的结构并连接至接头基团L或-(L-降解决定子)基团。
2.糖皮质激素(例如氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙和甲泼尼龙)(衍生化的，其中接头L或-(L-降解决定子)基团被连接至例如任何羟基)和倍氯米松二丙酸酯(衍生化的，其中接头L或-(L-降解决定子)基团被连接至例如丙酸)；
3.甲氨蝶呤(衍生化的，其中接头基团或-(L-降解决定子)基团可以被连接至例如任一末端羟基)；
4.环孢素(衍生化的，其中接头基团或-(L-降解决定子)基团可以被连接在例如任何丁基上)；
5.他克莫司(FK-506)和雷帕霉素(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团可以被连接在例如一个甲氧基上)；
6.放线菌素(衍生化的，其中接头基团L或-(L-降解决定子)基团可以被连接在例如一个异丙基上)。
靶向芳基烃受体(AHR)的化合物：
靶向芳基烃受体(AHR)的化合物包括，但不限于：
1.芹菜素(衍生化的，其结合至如Lee,等,Targeted Degradation of the ArylHydrocarbon Receptor by the PROTAC Approach:A Useful Chemical Genetic Tool,Chem Bio Chem Volume 8,Issue 17,pages 2058-2062,Nov.23,2007中通常说明的接头基团L或-(L-降解决定子)基团)；和
2.SR1和LGC006(衍生化的，使得接头基团L或-(L-降解决定子)被连接)，如Boitano,等,Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion ofHuman Hematopoietic Stem Cells,Science 10 Sep.2010:Vol.329no.5997pp.1345-1348中所述。
靶向RAF受体(激酶)的化合物：
(衍生化的，其中“R”指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。
靶向FKBP的化合物：
(衍生化的，其中“R”指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。
靶向雄激素受体(AR)的化合物
1.雄激素受体的RU59063配体(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。
2.雄激素受体的SARM配体(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。
3.雄激素受体配体DHT(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示例如接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。
4.MDV3100配体(衍生化的)
5.ARN-509配体(衍生化的)
6.六氢苯并异噁唑
7.四甲基环丁烷
靶向雌激素受体(ER)ICI-182780的化合物
1.雌激素受体配体
(衍生化的，其中“R”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。
靶向甲状腺激素受体(TR)的化合物
1.甲状腺激素受体配体(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点以及MOMO表示甲氧基甲氧基基团)。
靶向HIV蛋白酶的化合物
1.HIV蛋白酶的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。参见J.Med.Chem.2010,53,6466。
2.HIV蛋白酶的抑制剂
(衍生化的，其中“R”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接的潜在位点)。参见J.Med.Chem.2010,53,6466。
靶向HIV整合酶的化合物
1.HIV整合酶的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。参见J.Med.Chem.2010,53,6466。
2.HIV整合酶的抑制剂(衍生化的)
3.HIV整合酶的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。参见J.Med.Chem.2010,53,6466。
靶向HCV蛋白酶的化合物
1.HIV蛋白酶的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)
靶向酰基蛋白硫酯酶-1和-2(APT1和APT2)的化合物
1.ATP1和APT2的抑制剂(衍生化的)
(衍生化的，其中“R”指示接头基团L或-(L-降解决定子)基团连接位点)。参见Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9838-9842，其中L是如本文另外描述的接头基团，并且所述降解决定子基团是如本文另外所述，使得如本文另外所述接头将降解决定子基团连接至dTAG靶向配体基团。
Bcl2dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
Bcl-XL dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
FA结合蛋白dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
FLAP-5-氧脂合酶激活蛋白dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
HDAC6锌指结构域dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
三环域V 4BVV dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
乳糖谷胱甘肽裂解酶dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
mPGES-1dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
MTH1dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
PARP14dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
PARP15dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
PDZ结构域dTAG靶向配体：
其中：
R和R’是接头所连接的点。
PHIP结构域dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
磷脂酶A2结构域dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
蛋白S100-A7 2WOS dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
激活蛋白(saposin)-B dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。Sec7dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
pp60Src的SH2结构域dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
Tank1dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
Ubc9SUMO E2连接酶SF6D dTAG靶向配体：
其中：
R是接头所连接的点。
在某些实施方式中，本申请包括含有表1所示的dTAG靶向配体的化合物。
表1.dTAG靶向配体1-6
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
是
A1是S或C＝C；
A2是NRa5或O；
nn1是0、1或2；
每个Ra1是独立地C1-C3烷基、(CH2)0-3-CN、(CH2)0-3-卤素、(CH2)0-3-OH、(CH2)0-3-C1-C3烷氧基、C(O)NRa5L、OL、NRa5L或L；
Ra2是H、C1-C6烷基、(CH2)0-3-杂环基、(CH2)0-3-苯基或L，其中所述杂环基包含一个饱和的5-或6-元环和1-2个选自N、O和S的杂原子并且任选地被C1-C3烷基、L或C(O)L取代，并且其中所述苯基任选地被C1-C3烷基、CN、卤素、OH、C1-C3烷氧基或L取代；
nn2是0、1、2或3；
每个Ra3是独立地C1-C3烷基、(CH2)0-3-CN、(CH2)0-3-卤素、L或C(O)NRa5L；
Ra4是C1-C3烷基；
Ra5是H或C1-C3烷基；和
L是接头，
条件是式TL-I的化合物仅用一个L取代。
在某些实施方式中，是
在某些实施方式中，是
在某些实施方式中，A1是S。
在某些实施方式中，A1是C＝C。
在某些实施方式中，A2是NRa5。在另一个实施方式中，Ra5是H。在其他实施方式中，Ra5是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在另一个实施方式中，Ra5是甲基。
在某些实施方式中，A2是O。
在某些实施方式中，nn1是0。
在某些实施方式中，nn1是1。
在某些实施方式中，nn1是2。
在某些实施方式中，至少一个Ra1是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在另一个实施方式中，至少一个Ra1是甲基。在另一个实施方式中，两个Ra1是甲基。
在另一个实施方式中，至少一个Ra1是CN、(CH2)-CN、(CH2)2-CN或(CH2)3-CN。在另一个实施方式中，至少一个Ra1是(CH2)-CN。
在某些实施方式中，至少一个Ra1是卤素(例如F、Cl或Br)、(CH2)-卤素、(CH2)2-卤素或(CH2)3-卤素。在另一个实施方式中，至少一个Ra1是Cl、(CH2)-Cl、(CH2)2-Cl或(CH2)3-Cl。
在某些实施方式中，至少一个Ra1是OH、(CH2)-OH、(CH2)2-OH或(CH2)3-OH。
在某些实施方式中，至少一个Ra1是C1-C3烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或丙氧基)、(CH2)-C1-C3烷氧基、(CH2)2C1-C3烷氧基或(CH2)3-C1-C3烷氧基。在某些实施方式中，至少一个Ra1是甲氧基。
在某些实施方式中，至少一个Ra1是C(O)NRa5L。在另一个实施方式中，Ra5是H。在其他实施方式中，Ra5是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在某些实施方式中，一个Ra1是OL。
在某些实施方式中，一个Ra1是NRa5L。在另一个实施方式中，Ra5是H。在其他实施方式中，Ra5是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在其他实施方式中，Ra5是甲基。
在某些实施方式中，一个Ra1是L。
在某些实施方式中，Ra2是H。
在某些实施方式中，Ra2是直链C1-C6或支链C3-C6烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基)。在另一个实施方式中，Ra2是甲基、乙基或叔丁基。
在某些实施方式中，Ra2是杂环基、(CH2)-杂环基、(CH2)2-杂环基或(CH2)3-杂环基。在另一个实施方式中，Ra2是(CH2)3-杂环基。在另一个实施方式中，杂环基是选自吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、六氢嘧啶基、吗啉基和硫代吗啉基。在另一个实施方式中，杂环基是哌嗪基。
在某些实施方式中，杂环基被C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)取代。
在某些实施方式中，杂环基被C(O)L取代。
在某些实施方式中，杂环基被L取代。
在某些实施方式中，Ra2是苯基、(CH2)-苯基、(CH2)2-苯基或(CH2)3-苯基。在另一个实施方式中，Ra2是苯基。
在某些实施方式中，苯基被C1-C3苯基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)取代。在某些实施方式中，苯基被CN取代。在某些实施方式中，苯基被卤素(例如F、Cl或Br)取代。在某些实施方式中，苯基被OH取代。在某些实施方式中，苯基被C1-C3烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或丙氧基)取代。
在某些实施方式中，苯基被L取代。
在某些实施方式中，Ra2是L。
在某些实施方式中，nn2是0。
在某些实施方式中，nn2是1。
在某些实施方式中，nn2是2。
在某些实施方式中，nn2是3。
在某些实施方式中，至少一个Ra3是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在另一个实施方式中，至少一个Ra3是甲基。
在某些实施方式中，至少一个Ra3是CN、(CH2)-CN、(CH2)2-CN或(CH2)3-CN。在另一个实施方式中，至少一个Ra3是CN。
在某些实施方式中，至少一个Ra3是卤素(例如F、Cl或Br)、(CH2)-卤素、(CH2)2-卤素或(CH2)3-卤素。在另一个实施方式中，至少一个Ra3是Cl、(CH2)-Cl、(CH2)2-Cl或(CH2)3-Cl。在另一个实施方式中，至少一个Ra3是Cl。
在某些实施方式中，一个Ra3是L。
在某些实施方式中，一个Ra3是C(O)NRa5L。在另一个实施方式中，Ra5是H。在其他实施方式中，Ra5是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在某些实施方式中，Ra4是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在另一个实施方式中，Ra4是甲基。
在某些实施方式中，Ra5是H。
在某些实施方式中，Ra5是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在另一个实施方式中，Ra5是甲基。
在某些实施方式中，是和A1是S。
在某些实施方式中，是和A1是C＝C。
在某些实施方式中，是和A1是C＝C。
在某些实施方式中，A2是NH，和Ra2是(CH2)0-3-杂环基。在另一个实施方式中，Ra2是(CH2)3-杂环基。在另一个实施方式中，杂环基是哌嗪基。在另一个实施方式中，杂环基被C1-C3烷基、L或C(O)L取代。
在某些实施方式中，A2是NH，和Ra2是(CH2)0-3-苯基。在另一个实施方式中，Ra2是苯基。在另一个实施方式中，苯基被OH或L取代。
在某些实施方式中，A2是NH，和Ra2是L。
在某些实施方式中，A2是NH，和Ra2是H或C1-C6烷基。在另一个实施方式中，Ra2是C1-C4烷基。
在某些实施方式中，A2是O，和Ra2是H或C1-C6烷基。在另一个实施方式中，Ra2是C1-C4烷基。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-I1的化合物：
(TL-I1)，
或其药学上可接受的盐，其中A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1、nn2各自如上式TL-I1中所定义。
A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2的每一个可以选自式TL-I中上述的部分。对于A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2中的一个所定义的每个部分可以与针对A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2的其他所定义的任何部分组合，如以上在式TL-I中所述。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-I1a–TL-I1d的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
每个Ra6是独立地C1-C3烷基、(CH2)0-3-CN、(CH2)0-3-卤素、(CH2)0-3-OH、(CH2)0-3-C1-C3烷氧基；
Ra7是(CH2)0-3-杂环基、(CH2)0-3-苯基或L，其中所述杂环基包含一个饱和的5-或6-元环和1-2个选自N、O和S的杂原子并且任选地被L或C(O)L取代，并且其中所述苯基被L取代；
Ra8是H、C1-C6烷基、(CH2)0-3-杂环基或(CH2)0-3-苯基，其中所述杂环基包含一个饱和的5-或6-元环和1-2个选自N、O和S的杂原子并且任选地被C1-C3烷基取代，并且所述苯基任选地被C1-C3烷基、CN、卤素、OH或C1-C3烷氧基取代；
Ra10是C1-C3烷基、(CH2)0-3-CN或(CH2)0-3-卤素；和
A2、Ra4、Ra5、nn1和L各自如上式TL-I中所定义。
在某些实施方式中，nn1是0。
在某些实施方式中，nn1是1。
在某些实施方式中，nn1是2。
在某些实施方式中，至少一个Ra6是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在另一个实施方式中，至少一个Ra6是甲基。在另一个实施方式中，两个Ra6是甲基。
在某些实施方式中，至少一个Ra6是CN、(CH2)-CN、(CH2)2-CN或(CH2)3-CN。在另一个实施方式中，至少一个Ra6是(CH2)-CN。
在某些实施方式中，至少一个Ra6是卤素(例如F、Cl或Br)、(CH2)-卤素、(CH2)2-卤素或(CH2)3-卤素。在另一个实施方式中，至少一个Ra6是Cl、(CH2)-Cl、(CH2)2-Cl或(CH2)3-Cl。
在某些实施方式中，至少一个Ra6是OH、(CH2)-OH、(CH2)2-OH或(CH2)3-OH。
在某些实施方式中，至少一个Ra6是C1-C3烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或丙氧基)、(CH2)-C1-C3烷氧基、(CH2)2-C1-C3烷氧基或(CH2)3-C1-C3烷氧基。在某些实施方式中，至少一个Ra6是甲氧基。
在某些实施方式中，Ra7是杂环基、(CH2)-杂环基、(CH2)2-杂环基或(CH2)3-杂环基。在另一个实施方式中，Ra7是(CH2)3-杂环基。在另一个实施方式中，杂环基是选自吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、六氢嘧啶基、吗啉基和硫代吗啉基。在另一个实施方式中，杂环基是哌嗪基。
在某些实施方式中，杂环基被C(O)L取代。
在某些实施方式中，杂环基被L取代。
在某些实施方式中，Ra7是苯基、(CH2)-苯基、(CH2)2-苯基或(CH2)3-苯基。在另一个实施方式中，Ra7是苯基。
在某些实施方式中，Ra7是L。
在某些实施方式中，Ra8是H。
在某些实施方式中，Ra8是直链C1-C6或支链C3-C6烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基)。在另一个实施方式中，Ra8是甲基、乙基或叔丁基。
在某些实施方式中，Ra8是杂环基、(CH2)-杂环基、(CH2)2-杂环基或(CH2)3-杂环基。在另一个实施方式中，Ra8是(CH2)3-杂环基。在另一个实施方式中，杂环基是选自吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、六氢嘧啶基、吗啉基和硫代吗啉基。在另一个实施方式中，杂环基是哌嗪基。
在某些实施方式中，杂环基被C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)取代。
在某些实施方式中，Ra8是苯基、(CH2)-苯基、(CH2)2-苯基或(CH2)3-苯基。在另一个实施方式中，Ra8是苯基。
在某些实施方式中，苯基被C1-C3苯基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)取代。在某些实施方式中，苯基被CN取代。在某些实施方式中，苯基被卤素(例如F、Cl或Br)取代。在某些实施方式中，苯基被OH取代。在某些实施方式中，苯基被C1-C3烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或丙氧基)取代。
在某些实施方式中，Ra10是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在另一个实施方式中，Ra10是CN、(CH2)-CN、(CH2)2-CN或(CH2)3-CN。
在某些实施方式中，Ra10是卤素(例如F、Cl或Br)、(CH2)-卤素、(CH2)2-卤素或(CH2)3-卤素。在另一个实施方式中，Ra10是Cl、(CH2)-Cl、(CH2)2-Cl或(CH2)3-Cl。在另一个实施方式中，Ra10是Cl。
A2、Ra4、Ra5和nn1的每一个可以选自式TL-I中上述的部分。对于A2、Ra4、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Ra10和nn1中的一个所定义的每个部分可以与针对A2、Ra4、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Ra10和nn1的其他所定义的任何部分组合，如以上在式TL-I中所述。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-I2的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1、nn2各自如上式TL-I1中所定义。
A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2的每一个可以选自式TL-I中上述的部分。对于A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2中的一个所定义的每个部分可以与针对A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2的其他所定义的任何部分组合，如以上在式TL-I中所述。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-I2a–TL-I2c的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中A2、Ra4、Ra5、nn1和L各自如上式TL-I1中所定义，并且Ra6、Ra7、Ra8和Ra10各自如上式TL-I1a–TL-I1d中所定义。
A2、Ra4、Ra5和nn1的每一个可以选自式TL-I中上述的部分，并且Ra6、Ra7、Ra8和Ra10的每一个可以选自式TL-I1a–TL-I1d中上述的部分。对于A2、Ra4、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Ra10和nn1中的一个所定义的每个部分可以与针对A2、Ra4、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Ra10和nn1的其他所定义的任何部分组合，如以上在式TL-I和TL-I1a–TL-I1d中所述。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-I3的化合物：
或其药学上可接受的盐。
A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2各自如上式TL-I1中所定义。A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2的每一个可以选自式TL-I中上述的部分。对于A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2中的一个所定义的每个部分可以与针对A2、Ra1、Ra2、Ra3、Ra4、Ra5、nn1和nn2的其他所定义的任何部分组合，如以上在式TL-I中所述。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-I3a–TL-I3c的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
Ra9是C(O)NRa5L、OL、NRa5L或L；
A2、Ra4、Ra5、nn1和L各自如上式TL-I1中所定义；和
Ra6、Ra7、Ra8和Ra10各自如上式TL-I1a–TL-I1d中所定义。
在某些实施方式中，Ra9是C(O)NRa5L。在另一个实施方式中，Ra5是H。在其他实施方式中，Ra5是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在某些实施方式中，Ra9是OL。
在某些实施方式中，Ra9是NRa5L。在另一个实施方式中，Ra5是H。在其他实施方式中，Ra5是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在其他实施方式中，Ra5是甲基。
在某些实施方式中，Ra9是L。
A2、Ra4、Ra5和nn1的每一个可以选自式TL-I中上述的部分，并且Ra6、Ra7、Ra8和Ra10的每一个可以选自式TL-I1a–TL-I1d中上述的部分。对于A2、Ra4、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Ra10和nn1中的一个所定义的每个部分可以与针对A2、Ra4、Ra5、Ra6、Ra7、Ra8、Ra10和nn1的其他所定义的任何部分组合，如以上在式TL-I和TL-I1a–TL-I1d中所述。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-VI的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
Rf1是C(O)NRf2L、OL、NRf2L或L；
Rf2独立地为H或C1-C3烷基；和
L是接头。
在某些实施方式中，Rf1是C(O)NRf2L。在另一个实施方式中，Rf2是H。在其他实施方式中，Rf2是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在某些实施方式中，Rf1是OL。
在某些实施方式中，Rf1是NRe4L。在另一个实施方式中，Rf2是H。在其他实施方式中，Rf2是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在另一个实施方式中，Rf2是甲基。
在某些实施方式中，Rf1是L。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是式TL-VII的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
T7是CH2或CH2CH2；
Rg1是C(O)Rg5或(CH2)1-3Rg6；
nn10是0、1、2或3；
nn11是0、1、2或3；
每个Rg2独立地为C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、CN或卤素；
Rg3是C(O)NRg4L、OL、NRg4L、L、O-(CH2)1-3-C(O)NRg4L或NHC(O)-(CH2)1-3-C(O)NRg4L；
Rg4是H或C1-C3烷基；
Rg5是C1-C6烷基；
Rg6是苯基，其任选地被C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、CN或卤素取代；和
L是接头。
在某些实施方式中，T7是CH2。
在某些实施方式中，T7是CH2CH2。
在某些实施方式中，Rg1是C(O)Rg5。
在某些实施方式中，Rg1是(CH2)-Rg6、(CH2)2-Rg6或(CH2)3-Rg6。
在某些实施方式中，Rg5是直链C1-C6或支链C3-C6烷基(例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基)。
在某些实施方式中，Rg6是未取代的苯基。
在某些实施方中，Rg6是被一个、两个、三个或更多个取代基取代的苯基，所述取代基独立地选自C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)、C1-C3烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或丙氧基)、CN和卤素(例如F、Cl或Br)。
在某些实施方式中，nn10是0。
在某些实施方式中，nn10是1。
在某些实施方式中，nn10是2。
在某些实施方式中，nn10是3。
在某些实施方式中，nn11是0。
在某些实施方式中，nn11是1。
在某些实施方式中，nn11是2。
在某些实施方式中，nn11是3。
在某些实施方式中，至少一个Rg2是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在另一个实施方式中，至少一个Rg2是甲基。
在某些实施方式中，至少一个Rg2是C1-C3烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或丙氧基)。在另一个实施方式中，至少一个Rg2是甲氧基。
在某些实施方式中，至少一个Rg2是CN。
在某些实施方式中，至少一个Rg2是卤素(例如F、Cl或Br)。
在某些实施方式中，Rg3是C(O)NRg4L。在另一个实施方式中，Rg4是H。在其他实施方式中，Rg4是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在某些实施方式中，Rg3是OL。
在某些实施方式中，Rg3是NRg4L。在另一个实施方式中，Rg4是H。在其他实施方式中，Rg4是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。在其他实施方式中，Rg4是甲基。
在某些实施方式中，Rg3是L。
在某些实施方式中，Rg3是O-(CH2)-C(O)NRg4L、O-(CH2)2-C(O)NRg4L或O-(CH2)3-C(O)NRg4L。在另一个实施方式中，Rg3是O-(CH2)-C(O)NRg4L。在另一个实施方式中，Rg4是H。在其他实施方式中，Rg4是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在某些实施方式中，Rg3是NHC(O)-(CH2)-C(O)NRg4L、NHC(O)-(CH2)2-C(O)NRg4L或NHC(O)-(CH2)3-C(O)NRg4L。在另一个实施方式中，Rg3是NHC(O)-(CH2)-C(O)NRg4L、NHC(O)-(CH2)2-C(O)NRg4L。在另一个实施方式中，Rg3是NHC(O)-(CH2)2-C(O)NRg4L。在另一个实施方式中，Rg4是H。在其他实施方式中，Rg4是C1-C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基)。
在某些实施方式中，dTAG靶向配体是选自图32的结构，其中R是接头连接的点。
在某些实施方式中，基于存在(已知的dTAG结合部分)和开发具有可容纳接头的功能位置的有效和选择性配体的能力而选择dTAG靶向配体或靶标。一些实施方式涉及具有较少选择性的dTAG靶向配体，其可以受益于作为化合物选择性或靶标ID的量度的与蛋白质组学结合的降解。
本申请的一些实施方式涉及CAR的30％至100％的降解或损失。某些实施方式涉及CAR的50-100％的损失。其他实施方式涉及CAR的75-95％的损失。
用于本发明的异型双功能化合物的非限制性实例包括：
图33提供了用于本发明的具体化合物。
图34提供了用于本发明的具体化合物，其中上述结构中的X是选自F、Cl、Br和I的卤素。
图35提供了用于本发明的具体化合物。
图36提供了用于本发明的具体化合物，
其中：
RAR1选自： 和
RAR2选自：
用于本发明的另外的化合物包括图37的结构。
一些上述异型双功能化合物包含一个或多个不对称中心，并且因此可以以各种异构体形式存在，例如立体异构体和/或非对映异构体。因此，化合物和其药物组合物可以是单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或可以是立体异构体的混合物的形式。在某些实施方式中，本申请的化合物是对映异构纯化合物。在某些实施方式中，提供了立体异构体或非对映异构体的混合物。
此外，除非另有说明，否则如本文所述的某些异型双功能化合物可以具有一个或多个可以作为Z或E异构体存在的双键。本申请另外地包括作为单独的异构体的化合物，其基本上不含其它异构体，或者作为各种异构体的混合物，例如立体异构体的外消旋混合物。除了上述化合物本身之外，本申请还包括这些异型双功能化合物的药学上可接受的衍生物和包含一种或多种本申请化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂或添加剂的组合物。
本申请的异型双功能化合物可以通过化合物在不同条件下结晶来制备，并且可以作为形成本申请的一部分的化合物的多晶型物中的一种或组合存在。例如，不同的多晶型物可以通过在不同温度进行重结晶；或通过使用范围从结晶过程中非常快到非常缓慢的冷却的各种冷却模型，使用用于重结晶的不同溶剂或不同溶剂混合物识别和/或制备。多晶型物也可以通过加热或熔化化合物然后逐渐或快速冷却来获得。多晶型物的存在可以通过固体探针NMR光谱学、IR光谱学、差示扫描量热法、粉末X射线衍射图和/或其他技术来确定。因此，本申请包括包括异型双功能化合物、它们的衍生物、它们的互变异构形式、它们的立体异构体、它们的多晶型物、它们的药学上可接受的盐、它们的药学上可接受的溶剂合物和含有它们的药学上可接受的组合物。
异型双功能化合物的通用合成
本文所述的异型双功能化合物可以通过本领域技术人员已知的方法制备。在一个非限制性实例中，所公开的异型双功能化合物可以通过以下方案制备。
方案1
方案2
如方案1中所示，用于本发明的异型双功能化合物可以通过将降解决定子和接头化学地结合，随后加入dTAG靶向配体来制备。类似地，在方案2中用于本发明的异型双功能化合物通过首先将dTAG靶向配体和接头化学地结合，随后加入降解决定子来制备。如以上和以下方案所示，用于本发明的异型双功能化合物可以容易地由本领域技术人员在各种方法和化学反应中合成。
方案3
方案3：在步骤1中，亲核降解决定子取代接头上的离去基团以制备降解决定子接头片段。在步骤2中，保护基通过本领域已知的方法去除以释放接头上的亲核位点。在步骤3中，亲核降解决定子接头片段取代dTAG靶向配体上的离去基团以形成用于本发明的化合物。在另一个实施方式中，步骤1和/或步骤2通过偶联反应而不是亲核攻击来完成。
方案4
方案4：在步骤1中，亲核dTAG靶向配体取代接头上的离去基团以制备dTAG靶向配体接头片段。在步骤2中，保护基通过本领域已知的方法去除以释放接头上的亲核位点。在步骤3中，亲核dTAG靶向配体接头片段取代降解决定子上的离去基团以形成用于本发明的化合物。在另一个实施方式中，步骤1和/或步骤2通过偶联反应而不是亲核攻击来完成。
方案5
方案6
方案5和方案6：在步骤1中，亲核降解决定子取代接头上的离去基团以制备降解决定子接头片段。在步骤2中，保护基通过本领域已知的方法去除以释放接头上的亲核位点。在步骤3中，亲核降解决定子接头片段取代dTAG靶向配体上的离去基团以形成式I或式II的化合物。在另一个实施方式中，步骤1和/或步骤2通过偶联反应而不是亲核攻击来完成。
a)在合适的条件下使(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯或其类似物(例如，n＝1-20)(1)或其类似物(例如，n＝1-20)与氯乙酰氯反应以生成(2-(2-氯乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯或其类似物(例如，n＝1-20)(2)；
b)在合适的条件下使2-(2-氯乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯或其类似物(2)与3-羟基邻苯二甲酸二甲酯反应以得到3-(2-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸酯或其类似物(3)；
c)使3-(2-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸酯或其类似物(3)与强碱反应，接着3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐反应以生成2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯或其类似物(4)；
d)脱保护化合物(4)以得到二氨基乙基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐或其类似物(5)
e)在合适的条件下使化合物(5)与dTAG靶向配体的酸衍生物(化合物(6))反应以产生双功能化合物(7)。
在某些实施方式中，上述方法在溶液相中进行。在某些实施方式中，上述方法在固相上进行。在某些实施方式中，合成方法适用于高通量技术或通常用于组合化学的技术。
异型双功能化合物的代表性合成
除非另有说明，否则起始材料可以商购或容易地通过合理熟悉本领域的任何人通过实验合成获得。下文一般描述的是用于合成一般描述和在本文的子类和种类中的化合物的程序和一般指导。
实例1'：IMiD衍生物和降解决定子的合成
通用程序I：IMiD冷凝
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(D-1)
在20mL玻璃瓶中，将3-羟基邻苯二甲酸酐(500mg，3.05mmol，1当量)、乙酸钾(927mg，9.44mmol，3.1当量)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(552mg，3.35mmol，1.1当量)的混合物在乙酸(10.2mL，0.3M)中加热至90℃过夜。将黑色反应混合物冷却至室温并用水稀释至20mL，并随后在冰上冷却30分钟。将所得浆液转移至50mLFalcon管中，其以3500rpm离心5分钟。弃去上清液，并将黑色固体用甲醇转移至250mL RBF中并真空浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(9:1))以提供标题化合物，为白色固体(619mg，74％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.07(s,1H),7.65(dd,J＝8.4,6.8Hz,1H),7.31(d,J＝6.8Hz,1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),5.06(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),2.94–2.82(m,1H),2.64–2.43(m,2H),2.08–1.97(m,1H)；MS(ESI)计算为C13H11N2O5[M+H]+275.07,发现275.26。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(D-10)
遵循通用程序I使用3-硝基邻苯二甲酸酐(300mg，1.55mmol，1当量)、乙酸钾(473mg，4.82mmol，3.1当量)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(281mg，1.71mmol，1.1当量)以提供标题化合物，为淡黄色固体(280mg，59％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(9:1))纯化。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),8.35(d,J＝8.1Hz,1H),8.24(d,J＝7.5Hz,1H),8.14–8.10(m,1H),5.20(dd,J＝12.9,5.5Hz,1H),2.93–2.84(m,1H),2.64–2.45(m,2H),2.11–2.04(m,1H)；MS(ESI)计算为C13H10N3O6[M+H]+304.06,发现304.19。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(D-2)
遵循通用程序I使用4-硝基邻苯二甲酸酐(300mg，1.55mmol，1当量)、乙酸钾(473mg，4.82mmol，3.1当量)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(281mg，1.71mmol)以提供标题化合物，为白色固体(409mg，87％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(30:1))纯化。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.18(s,1H),8.68(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),8.56(d,J＝1.9Hz,1H),8.19(d,J＝8.1Hz,1H),5.24(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),2.90(ddd,J＝17.2,13.9,5.5Hz,1H),2.69–2.48(m,2H),2.14–2.05(m,1H)；MS(ESI)计算为C13H10N3O6[M+H]+304.06,发现304.19。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-6)
遵循通用程序I使用邻苯二甲酸酐(155mg，1.05mmol)、乙酸钾(318mg，3.24mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(189mg，1.15mmol)以提供标题化合物，为白色固体(235mg，87％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(15:1))纯化。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.13(s,1H),8.00–7.76(m,4H),5.16(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),2.89(ddd,J＝16.8,13.7,5.4Hz,1H),2.65–2.42(m,2H),2.12–1.99(m,1H)；MS(ESI)计算为C13H11N2O4[M+H]+259.07,发现259.23。
(2,5-二氧代吡咯烷-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-7)
遵循通用程序I使用邻苯二甲酸酐(90mg，0.608mmol)、乙酸钾(185mg，1.88mmol)和3-氨基吡咯烷-2,5-二酮盐酸盐(101mg，0.668mmol)以提供标题化合物，为白色固体(95mg，64％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(14:1))纯化。MS(ESI)计算为C12H9N2O4[M+H]+245.06,发现245.26。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-羧酸(D-13)
遵循通用程序I使用1,2,4-苯三甲酸酐(200mg，1.04mmol)、乙酸钾(317mg，3.23mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(188mg，1.15mmol)以提供标题化合物，为白色固体(178mg，57％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(9:1))纯化。MS(ESI)计算为C14H11N2O6[M+H]+303.06,发现303.24。
(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(D-14)
遵循通用程序I使用3-氟邻苯二甲酸酐(200mg，1.20mmol)、乙酸钾(366mg，3.73mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(218mg，1.32mmol)以提供标题化合物，为白色固体(288mg，86％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(50:1))纯化。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.15(s,1H),7.96(ddd,J＝8.3,7.3,4.5Hz,1H),7.82–7.71(m,2H),5.17(dd,J＝13.0,5.4Hz,1H),2.90(ddd,J＝17.1,13.9,5.4Hz,1H),2.65–2.47(m,2H),2.10–2.04(m,1H),MS(ESI)计算为C13H10FN2O4[M+H]+277.06,发现277.25。
(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基异吲哚啉-1,3-二酮(D-19)
遵循通用程序I使用3-甲基邻苯二甲酸酐(150mg，0.925mmol)、乙酸钾(281mg，2.87mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(167mg，1.02mmol)以提供标题化合物，为白色固体(168mg，67％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(15:1))纯化。MS(ESI)计算为C14H13N2O4[M+H]+273.09,发现273.24。
(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(D-24)
遵循通用程序I使用4-氟邻苯二甲酸酐(200mg，1.20mmol)、乙酸钾(366mg，3.73mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(218mg，1.32mmol)以提供标题化合物(254mg，76％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(15:1))纯化。MS(ESI)计算为C13H10FN2O4[M+H]+277.06,发现277.24。
(2,6-二氧代哌啶-4-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-43)
遵循通用程序I使用邻苯二甲酸酐(60mg，0.311mmol)、乙酸钾(95mg，0.963mmol)和4-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(56mg，0.342mmol)以提供标题化合物，为白色固体(40mg，43％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(9:1))纯化。
MS(ESI)计算为C13H11N2O4[M+H]+259.07,发现259.18。
通用程序II：芳族硝基的还原
4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-4)
将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(173mg，0.854mmol)、Pd(OAc)2(12.8mg，0.0854mmol，10mol％)和氯化钾(66mg，1.71mmol，2当量)在THF:水(8:1)(5.7mL，0.1M)中的溶液在室温下搅拌。将三乙基硅烷(365μL，3.41mmol，4当量)缓慢加入，并将所得黑色溶液在室温下搅拌1小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，其用乙酸乙酯过量洗涤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(7:1))纯化以提供标题化合物，为黄色粉末(72mg，46％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.08(s,1H),7.47(dd,J＝8.5,7.0Hz,1H),7.06–6.95(m,1H),6.59–6.44(m,1H),5.04(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),2.93–2.82(m,1H),2.64–2.45(m,2H),2.05–1.98(m,1H)；MS(ESI)计算为C13H11N3O4[M+H]+274.08,发现274.23。
(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(D-8)
遵循通用程序II使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(100mg，0.330mmol)、Pd(OAc)2(7.4mg，0.033mmol)、氯化钾(38mg，0.660mmol)和三乙基硅烷(211μL，1.32mmol)以提供标题化合物，为黄色固体(33mg，37％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(9:1))纯化。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.52(d,J＝8.2Hz,1H),6.94(d,J＝2.0Hz,1H),6.83(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.55(s,2H),5.01(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),2.86(ddd,J＝16.9,13.9,5.5Hz,1H),2.68–2.43(m,2H),2.03–1.93(m,1H)；MS(ESI)计算为C13H12N3O4[M+H]+274.08,发现274.59。
4-氨基-2-(1-苄基-2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-12)
遵循通用程序II使用2-(1-苄基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(48mg，0.122mmol)、Pd(OAc)2(2.7mg，0.0122mmol)、氟化钾(14mg，0.244mmol)和三乙基硅烷(78μL，0.488mmol)以提供标题化合物，为黄色固体(7mg，16％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0至100％EtOAc的己烷溶液)纯化。MS(ESI)计算为C20H18N3O4[M+H]+364.13,发现364.34。
3-(5-氨基-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-17)
遵循通用程序II使用3-(2-甲基-5-硝基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(21mg，0.0664mmol)、Pd(OAc)2(1.5mg，0.0066mmol)、氟化钾(7.7mg，0.133mmol)和三乙基硅烷(42μL，0.266mmol)以提供标题化合物，为白色固体(7mg，37％)，随后通过制备型HPLC纯化。MS(ESI)计算为C14H15N4O3[M+H]+287.11,发现287.30。
3-(7-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(D-41)
遵循通用程序II使用3-(7-硝基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(11mg，0.038mmol)、Pd(OAc)2(0.9mg，0.0038mmol)、氟化物(4.4mg，0.076mmol)和三乙基硅烷(24μL，0.152mmol)以提供标题化合物，为黄色固体(2mg，21％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0至100％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。MS(ESI)计算为C13H14N3O3[M+H]+260.10,发现260.52。
通用程序III：苯胺的酰化
N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)乙酰胺(D-5)
在4mL的玻璃瓶中，将5-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.110mmol，1当量)和乙酰氯(26μL，0.220mmol，2当量)在THF(1.8mL，0.1M)中的混合物加热回流过夜。将反应混合物过滤，并将滤饼用Et2O洗涤以得到标题化合物，为白色固体(27mg，47％)，其未经进一步纯化即使用。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.11(s,1H),10.63(s,1H),8.24(d,J＝1.5Hz,1H),7.91–7.83(m,2H),5.11(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),2.88(ddd,J＝17.0,13.8,5.4Hz,1H),2.63–2.46(m,2H),2.13(s,3H),2.09–2.00(m,1H)；MS(ESI)计算为C15H14N3O5[M+H]+316.09，发现316.23。
N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(D-3)
遵循通用程序III使用4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(50mg，0.183mmol)和乙酰氯(26μL，0.366mmol)以提供标题化合物，为白色固体(10mg，17％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.14(s,1H),9.73(s,1H),8.44(d,J＝8.4Hz,1H),7.83(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),7.62(d,J＝7.2Hz,1H),5.14(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),2.90(ddd,J＝17.1,13.9,5.4Hz,1H),2.66–2.45(m,2H),2.19(s,3H),2.14–2.00(m,1H)；MS(ESI)计算为C15H14N3O5[M+H]+316.09,发现316.27。
2-氯-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)乙酰胺(D-32)
遵循通用程序III使用5-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(10mg，0.0366mmol)和氯乙酰氯(6μL，0.0732mmol)以提供标题化合物，为白色固体(7.1mg，55％)。MS(ESI)计算为C15H13ClN3O5[M+H]+350.05,发现350.23。
2-氯-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(D-34)
遵循通用程序III使用3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(20mg，0.0771mmol)和氯乙酰氯(12μL，0.154mmol)以提供标题化合物，为白色固体(14.9mg，56％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.02(s,1H),10.20(s,1H),7.81(dd,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.65–7.47(m,2H),5.16(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.45–4.34(m,2H),4.33(s,2H),3.00–2.85(m,1H),2.68–2.56(m,1H),2.41–2.28(m,1H),2.09–1.97(m,1H)；MS(ESI)计算为C15H15ClN3O4[M+H]+336.07,发现336.31。
N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)丙烯酰胺(D-35)
遵循通用程序III使用3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(20mg，0.0771mmol)和丙烯酰氯(13μL，0.154mmol)以提供标题化合物，为白色固体(18mg，76％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ15.77(s,1H),14.81(s,1H),12.65(dd,J＝7.4,1.6Hz,1H),12.37–12.18(m,2H),11.28(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),11.06(dd,J＝17.0,1.9Hz,1H),10.57(dd,J＝10.2,1.9Hz,1H),9.91(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),9.24–9.05(m,2H),7.67(ddd,J＝17.2,13.7,5.5Hz,1H),7.36(dt,J＝17.3,3.8Hz,1H),7.20–7.03(m,1H),6.83–6.72(m,1H)；MS(ESI)计算为C16H16N3O4[M+H]+314.11,发现314.24。
N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)丙烯酰胺(D-36)
遵循通用程序III使用5-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(10mg，0.0366mmol)和丙烯酰氯(6μL，0.0732mmol)以提供标题化合物，为白色固体(8.8mg，73％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.12(s,1H),10.83(s,1H),8.33(d,J＝1.8Hz,1H),7.99(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),7.90(d,J＝8.2Hz,1H),6.48(dd,J＝17.0,10.1Hz,1H),6.36(dd,J＝17.0,1.9Hz,1H),5.88(dd,J＝10.0,1.9Hz,1H),5.13(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),2.95–2.84(m,1H),2.67–2.46(m,2H),2.09–2.01(m,1H)；MS(ESI)计算为C16H14N3O5[M+H]+328.09，发现328.23。
N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(D-37)
遵循通用程序III使用3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(20mg，0.0771mmol)和乙酰氯(11μL，0.154mmol)以提供标题化合物，为白色固体(17mg，71％)。MS(ESI)计算为C15H16N3O4[M+H]+302.11,发现301.99。
N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)环丙烷甲酰胺(D-38)
遵循通用程序III使用3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(20mg，0.0771mmol)和环丙烷甲酰氯(14μL，0.154mmol)以提供标题化合物，为白色固体(19mg，75％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.01(s,1H),10.06(s,1H),7.84(dd,J＝7.2,1.9Hz,1H),7.66–7.38(m,2H),5.14(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.52–4.30(m,2H),2.92(ddd,J＝17.3,13.6,5.4Hz,1H),2.64–2.54(m,1H),2.45–2.27(m,1H),2.08–1.95(m,1H),1.93–1.83(m,1H),0.90–0.75(m,4H)；MS(ESI)计算为C17H18N3O4[M+H]+328.13,发现328.00。
通用程序IV：喹唑啉酮缩合
3-(2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-9)
在20mL的玻璃瓶中，将邻氨基苯甲酸(100mg，0.729mmol，1当量)、乙酸(42μL，0.729mmol，1当量)和P(OPh)3(479μL，1.82mmol，2.5当量)在吡啶(1.0μL，0.7M)中加热至90℃。4小时后，将反应混合物冷却至室温，并加入3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(144mg，0.875mmol，1.2当量)。将反应混合物再加热至90℃1.5小时，届时在室温下搅拌过夜。将反应混合物溶于EtOAc(15mL)和水(15mL)中。将有机层用盐水(2x25mL)洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱(0-5％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化以提供标题化合物，为白色固体(79mg，40％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.03(s,1H),8.03(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.82(ddd,J＝8.5,7.1,1.6Hz,1H),7.62(dd,J＝8.3,1.1Hz,1H),7.50(ddd,J＝8.1,7.1,1.1Hz,1H),5.27(dd,J＝11.5,5.7Hz,1H),2.92–2.78(m,1H),2.73–2.56(m,5H),2.26–2.06(m,1H)；MS(ESI)计算为C14H14N3O3[M+H]+272.10,发现272.33。
3-(2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)吡咯烷-2,5-二酮(D-11)
遵循通用程序IV使用邻氨基苯甲酸(200mg，1.46mmol)、乙酸(84μL，1.46mmol)、P(OPh)3(959μL，3.65mmol)和3-氨基吡咯烷-2,5-二酮盐酸盐(263mg，1.75mmol)以提供标题化合物，为白色固体(25mg，7％)，随后通过硅胶快速柱色谱(CH2Cl2：MeOH(15:1))纯化。MS(ESI)计算为C13H12N3O3[M+H]+258.09,发现258.22。
3-(5-氟-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-66)
遵循通用程序IV使用6-氟邻氨基苯甲酸(100mg，0.645mmol)、乙酸(37μL，0.644mmol)、P(OPh)3(424μL，1.61mmol)和3-氨基吡咯烷-2,6-二酮盐酸盐(127mg，0.774mmol)以提供标题化合物，为白色固体(70mg，38％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.03(s,1H),7.84–7.76(m,1H),7.44(dd,J＝8.2,1.0Hz,1H),7.25(ddd,J＝11.1,8.2,1.0Hz,1H),5.24(dd,J＝11.3,5.7Hz,1H),2.90–2.75(m,1H),2.62(s,3H),2.61–2.56(m,2H),2.20–2.12(m,1H)；MS(ESI)计算为C14H13FN3O3[M+H]+290.09,发现290.27。
3-(2-甲基-5-硝基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-67)
遵循通用程序IV使用6-硝基邻氨基苯甲酸(100mg，0.549mmol)、乙酸(31μL，0.549mmol)、P(OPh)3(361μL，1.37mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(108mg，0.659mmol)以提供标题化合物，为白色固体(29mg，17％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。
MS(ESI)计算为C14H13N4O5[M+H]+317.09,发现317.58。
通用程序V：酰胺偶联
N-苄基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺(D-15)
在4mL玻璃瓶中，将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酸(10mg，0.033mmol，1当量)、HATU(13mg，0.033mmol，1当量)、DIPEA(17μL，0.099mmol，3当量)和苄胺(4μL，0.036mmol，1.1当量)在DMF(331μL，0.1M)在室温下搅拌过夜。将反应混合物用MeOH稀释至4mL，过滤，然后通过制备型HPLC纯化以提供标题化合物，为白色固体(6mg，46％)。MS(ESI)计算为C21H18N3O5[M+H]+392.12,发现392.33。
通用程序VI：亲核芳香族取代
4-(苄基氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-16)
在4mL的玻璃瓶中，将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(10mg，0.036mmol，1当量)、苄胺(4.4μL，0.040mmol，1.1当量)和DIPEA(13μL，0.072mmol，2当量)在NMP(362μL，0.1M)中加热至90℃过夜。将反应混合物冷却至室温并溶于EtOAc(15mL)。将有机层用NaHCO3(aq)(15mL)、水(15mL)和盐水(3x15mL)洗涤，并随后用Na2SO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱(0-100％EtOAc的己烷溶液)纯化以提供标题化合物，为黄色膜(5mg，38％)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.10(s,1H),7.44(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.40–7.25(m,5H),7.12(d,J＝7.1Hz,1H),6.84(d,J＝8.5Hz,1H),6.71(t,J＝5.9Hz,1H),4.93(dd,J＝12.3,5.3Hz,1H),4.51(d,J＝5.9Hz,2H),2.93–2.66(m,3H),2.21–2.07(m,1H)；MS(ESI)计算为C20H18N3O4[M+H]+364.13,发现364.31。
(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-(异丙基氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-18)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)、异丙胺(10μL，0.119mmol)和DIPEA(21μL，0.119mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(11mg，32％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0至100％EtOAc的己烷溶液)纯化。MS(ESI)计算为C16H18N3O4[M+H]+316.13,发现316.65。
(二乙基氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-21)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)、乙二胺(11μL，0.130mmol)和DIPEA(32μL，0.181mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(28mg，97％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0至100％EtOAc的己烷溶液)纯化。MS(ESI)计算为C17H20N3O4[M+H]+330.14,发现330.62。
5-(苄基氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-25)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)、苄胺(13μL，0.119mmol)和DIPEA(38μL，0.217mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(6mg，15％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0至100％EtOAc的己烷溶液)纯化。MS(ESI)计算为C20H18N3O4[M+H]+364.13,发现364.34。
(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-(异丙基氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-26)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)、异丙胺(11μL，0.130mmol)和DIPEA(38μL，0.217mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(6mg，17％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0至100％EtOAc的己烷溶液)纯化。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.00(s,1H),7.53(d,J＝8.3Hz,1H),6.87(d,J＝2.1Hz,1H),6.64(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),4.86(dd,J＝12.3,5.4Hz,1H),4.30(d,J＝7.8Hz,1H),2.86–2.58(m,3H),2.12–2.01(m,1H),1.26–1.15(m,6H)；MS(ESI)计算为C16H18N3O4[M+H]+316.13,发现316.30。
5-(二乙基氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-27)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)、二乙胺(14μL，0.130mmol)和DIPEA(38μL，0.217mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(6mg，31％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0至100％EtOAc的己烷溶液)纯化。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.08(s,1H),7.57(d,J＝8.6Hz,1H),6.98(d,J＝2.4Hz,1H),6.72(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),4.90–4.80(m,1H),3.40(q,J＝7.1Hz,4H),2.89–2.61(m,3H),2.11–2.01(m,1H),1.16(t,J＝7.1Hz,6H)；MS(ESI)计算为C17H20N3O4[M+H]+330.14,发现330.69。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-((呋喃-2-基甲基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-28)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(50mg，0.181mmol)、糠胺(18μL，0.199mmol)和DIPEA(63μL，0.362mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(8mg，13％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-5％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。MS(ESI)计算为C18H16N3O4[M+H]+354.11,发现354.25。
叔丁基(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(D-29)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(50mg，0.181mmol)、1-Boc-乙二胺(32mg，0.199mmol)和DIPEA(63μL，0.362mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(31mg，41％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.08(bs,1H),7.50(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.12(d,J＝7.1Hz,1H),6.98(d,J＝8.5Hz,1H),6.39(t,J＝6.1Hz,1H),4.96–4.87(m,1H),4.83(bs,1H),3.50–3.41(m,2H),3.41–3.35(m,2H),2.92–2.66(m,3H),2.16–2.09(m,1H),1.45(s,9H)；MS(ESI)计算为C20H25N4O6[M+H]+417.18,发现417.58。
叔丁基(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(D-30)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(50mg，0.181mmol)、1-Boc-乙二胺(32mg，0.199mmol)和DIPEA(63μL，0.362mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(22mg，29％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。MS(ESI)计算为C20H25N4O6[M+H]+417.18,发现417.32。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((呋喃-2-基甲基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-31)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(19.5mg，0.0706mmol)、糠胺(7μL，0.078mmol)和DIPEA(25μL，0.141mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(19mg，76％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-2.5％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。MS(ESI)计算为C18H16N3O4[M+H]+354.11,发现354.27。
3-(5-(苄基氨基)-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-39)
除了将反应混合物加热至170℃而不是90℃外，遵循通用程序VI使用3-(5-氟-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二甲酸(30mg，0.104mmol)、苄胺(13μL，0.114mmol)和DIPEA(36μL，0.207mmol)以提供标题化合物，为白色固体(15mg，38％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.73(t,J＝5.7Hz,1H),8.39(s,1H),7.41(t,J＝8.1Hz,1H),7.39–7.19(m,5H),6.77(d,J＝7.7Hz,1H),6.41(d,J＝8.3Hz,1H),4.67(dd,J＝11.5,5.9Hz,1H),4.43(d,J＝5.7Hz,2H),3.03–2.79(m,2H),2.72–2.61(m,1H),2.60(s,3H),2.15–2.07(m,1H)；MS(ESI)计算为C21H21N4O3[M+H]+377.16,发现377.02。
3-(5-(异丙基氨基)-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-40)
除了将反应混合物加热至170℃而不是90℃外，遵循通用程序VI使用3-(5-氟-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二甲酸二酮(30mg，0.104mmol)、异丙胺(10μL，0.114mmol)和DIPEA(36μL，0.207mmol)以提供标题化合物，为白色固体(5mg，15％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1HNMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.31(s,1H),8.21(d,J＝7.2Hz,1H),7.50–7.37(m,1H),6.70(dd,J＝7.9,0.9Hz,1H),6.47(d,J＝8.4Hz,1H),4.65(dd,J＝11.4,5.9Hz,1H),3.69–3.56(m,1H),3.03–2.80(m,3H),2.58(s,3H),2.14–2.03(m,1H),1.27(d,J＝2.7Hz,3H),1.26(d,J＝2.7Hz,3H)；MS(ESI)计算为C17H21N4O3[M+H]+329.16,发现329.97。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-羟乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-68)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)、氨基乙醇(7μL，0.119mmol)和DIPEA(38μL，0.217mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(6mg，18％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-5％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.26(s,1H),7.50(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.12(d,J＝7.0Hz,1H),6.95(d,J＝8.5Hz,1H),6.50(t,J＝5.9Hz,1H),4.97–4.85(m,1H),3.94–3.79(m,2H),3.47(q,J＝5.5Hz,2H),3.03–2.68(m,3H),2.19–2.04(m,1H)；MS(ESI)计算为C15H16N3O5[M+H]+318.11,发现318.22。
4-(环丙基氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D47)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(20mg，0.0724mmol)、环丙胺(6μL，0.080mmol)和DIPEA(25μL，0.141mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(16mg，70％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-5％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.05(s,1H),7.53(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.33–7.21(m,1H),7.15(dd,J＝7.1,0.7Hz,1H),6.44(bs,1H),4.95–4.85(m,1H),2.98–2.66(m,3H),2.62–2.50(m,1H),2.19–2.06(m,1H),0.92–0.78(m,2H),0.67–0.56(m,2H)；MS(ESI)计算为C16H16N3O4[M+H]+314.11,发现314.54。
4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-48)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(20mg，0.0724mmol)、色胺(13mg，0.080mmol)和DIPEA(25μL，0.141mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(10mg，33％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.14(s,1H),8.11(s,1H),7.65–7.55(m,1H),7.45(dd,J＝8.6,7.1Hz,1H),7.37(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H),7.21(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.16–7.04(m,3H),6.88(d,J＝8.5Hz,1H),6.34(t,J＝5.6Hz,1H),4.89(dd,J＝12.4,5.4Hz,1H),3.59(td,J＝6.8,5.5Hz,2H),3.19–3.03(m,2H),2.93–2.64(m,3H),2.14–2.04(m,1H)；MS(ESI)计算为C23H21N4O4[M+H]+417.16,发现417.26。
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-49)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(20mg，0.0724mmol)、酪胺(11mg，0.080mmol)和DIPEA(25μL，0.141mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(15mg，54％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-5％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.20(s,1H),7.51(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.17–7.08(m,2H),6.90(d,J＝8.5Hz,1H),6.85–6.72(m,2H),4.95–4.90(m,1H),3.52–3.46(m,2H),2.97–2.87(m,2H),2.86–2.72(m,2H),2.21–2.09(m,1H)；MS(ESI)计算为C21H20N3O5[M+H]+394.14,发现394.25。
4-((2-(1H-咪唑-2-基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-50)
遵循通用程序VI使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(20mg，0.0724mmol)、组胺(15mg，0.080mmol)和DIPEA(25μL，0.141mmol)以提供标题化合物，为黄色膜(5mg，19％)，随后通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.19(s,1H),7.61(d,J＝1.2Hz,1H),7.47(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.07(d,J＝6.9Hz,1H),6.96–6.83(m,2H),6.39(t,J＝5.7Hz,1H),4.97–4.79(m,1H),3.59(q,J＝6.5Hz,2H),2.95(t,J＝6.6Hz,2H),2.92–2.62(m,2H),2.16–2.04(m,1H)；MS(ESI)计算为C18H18N5O4[M+H]+368.14,发现368.47。
通用程序VII：伯胺的酰化
N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基)环丙烷甲酰胺(D-22)
在4mL玻璃瓶中，将4-(氨基甲基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(25mg，0.087mmol，1当量)和DIPEA(30μL，0.174mmol，2当量)在MeCN(250μL，0.35M)冷却至0℃。将环丙烷碳酰氯(8.7μL，0.096mmol)缓慢加入，并将反应混合物在室温搅拌过夜。将产物过滤分离以提供标题化合物，为白色固体(4.8mg，15％)，其未经进一步纯化即使用。MS(ESI)计算为C18H18N3O5[M+H]+356.12,发现356.32。
N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基)乙酰胺(D-23)
遵循通用程序VII使用4-(氨基甲基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(25mg，0.087mmol)、DIPEA(30μL，0.174mmol)和乙酰氯(7μL，0.096mmol)以提供标题化合物，为白色固体(4.5mg，16％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.13(s,1H),8.47(t,J＝6.0Hz,1H),7.88–7.76(m,2H),7.70(dt,J＝7.3,1.1Hz,1H),5.15(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),4.69(d,J＝6.0Hz,2H),2.90(ddd,J＝16.8,13.8,5.4Hz,1H),2.64–2.44(m,2H),2.15–2.01(m,1H),1.92(s,3H)；MS(ESI)计算为C16H16N3O5[M+H]+330.11,发现330.05。
2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙烷-1-酮2,2,2-三氟乙酸盐(D-33)
(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(205mg，0.492mmol，1当量)的二氯甲烷(2.25mL)搅拌溶液中加入三氟乙酸(0.250mL)。将反应混合物在室温下搅拌4小时，随后真空除去挥发物。获得标题化合物，为黄色固体(226mg，>95％)，其未经进一步纯化即使用。1H NMR(500MHz,MeOD)δ7.64(d,J＝1.4Hz,1H),7.27–7.05(m,2H),5.10(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),3.70(t,J＝6.0Hz,2H),3.50–3.42(m,2H),3.22(t,J＝6.0Hz,1H),2.93–2.85(m,1H),2.80–2.69(m,2H),2.17–2.10(m,1H)；MS(ESI)计算为C15H17N4O4[M+H]+317.12,发现317.53。
通用程序VIII：苯酚烷基化
2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-45)
在4mL的玻璃瓶中，将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol，1当量)和K2CO3(15mg，0.109mmol，1当量)在DMF(365μL，0.3M)中室温搅拌。将4-(4-(溴甲基)苄基)吗啉(30mg，0.109mmol)的DMF(200μL)溶液加入，并将反应混合物在室温下搅拌4天。将反应混合物溶于水(15mL)和EtOAc(15mL)，并将有机层用盐水(3x15mL)洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱(0至10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化以提供标题化合物，为白色固体(20mg，40％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.10(s,1H),7.82(dd,J＝8.5,7.2Hz,1H),7.60(d,J＝8.5Hz,1H),7.50–7.42(m,3H),7.35(d,J＝8.1Hz,2H),5.35(s,2H),5.09(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),3.64–3.51(m,4H),3.46(s,2H),2.88(ddd,J＝17.0,14.1,5.4Hz,1H),2.63–2.47(m,2H),2.38–2.31(m,4H),2.07–1.99(m,1H)；MS(ESI)计算为C25H26N3O6[M+H]+464.18,发现464.00.
4-(苄氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-46)
遵循通用程序VIII使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)、K2CO3(15mg，0.109mmol)和苄基溴(8μL，0.109mmol)，通过通过硅胶快速柱色谱(0至10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化后以提供标题化合物，为白色固体(8mg，20％)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.10(s,1H),7.83(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.60(d,J＝8.5Hz,1H),7.53–7.50(m,2H),7.47(d,J＝7.2Hz,1H),7.45–7.39(m,2H),7.38–7.32(m,1H),5.38(s,2H),5.09(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),2.88(ddd,J＝16.9,13.8,5.5Hz,1H),2.64–2.46(m,2H),2.07–1.99(m,1H)；MS(ESI)计算为C20H17N2O5[M+H]+365.11,发现365.21.
2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基4-甲基苯磺酸盐(D-44)
在4mL的玻璃瓶中，将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-羟乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(7mg，0.0221mmol，1当量)和Et3N(3μL，0.033mmol，1.5当量)在CH2Cl2(200μL)中在室温下搅拌。将甲苯磺酰氯(6mg，0.026mmol，1.2当量)的CH2Cl2(100μL)溶液加入，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩并将残余物通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化以提供标题化合物，为白色固体(4mg，40％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.13(s,1H),7.64–7.59(m,2H),7.46(dd,J＝8.6,7.1Hz,1H),7.33–7.27(m,2H),7.04–6.93(m,2H),6.58(t,J＝6.4Hz,1H),5.09(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),4.15(t,J＝5.1Hz,2H),3.65–3.52(m,2H),2.97–2.83(m,1H),2.67–2.46(m,2H),2.27(s,3H),2.12–2.02(m,1H)；MS(ESI)计算为C22H22N3O7S[M+H]+472.12,发现472.39.
(R)-4-羟基-2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-52)
将羟基异苯并呋喃-1,3-二酮(147.08mg，0.896mmol，1当量)加入至(R)-3-氨基-3-甲基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(127.32mg，0.896mmol，1当量)中。然后将吡啶(3.584ml，0.25M)加入至该混合物中，并将其在110℃下搅拌17小时。将混合物用甲醇稀释并在减压下浓缩。粗物质通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0至10％MeOH/DCM 25分钟梯度)纯化以得到白色油状物(110.9mg，42.63％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.95(s,1H),7.61(dd,J＝8.4,7.2Hz,1H),7.27–7.14(m,2H),2.73–2.63(m,1H),2.57–2.51(m,1H),2.04–1.97(m,1H),1.86(s,3H).
LCMS 289(M+H).
(S)-4-羟基-2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-53)
将4-羟基异苯并呋喃-1,3-二酮(148.99mg，0.907mmol，1当量)加入至(S)-3-氨基-3-甲基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(128.97mg，0.907mmol，1当量)中。然后将吡啶(3.628ml，0.25M)加入至该混合物中，并将其在110℃下搅拌17小时。将混合物用甲醇稀释并在减压下浓缩。粗物质通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0至10％MeOH/DCM 25分钟梯度)纯化以得到白色油状物(150mg，57.4％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.95(s,1H),7.62(dd,J＝8.4,7.2Hz,1H),7.27–7.16(m,2H),2.75–2.62(m,1H),2.55(dd,J＝14.0,4.3Hz,1H),2.05–1.96(m,1H),1.86(s,3H).LCMS 289(M+H).
(S)-2-((2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(D-55)
将TFA(0.64ml，0.1M)加入至(S)-2-((2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁酯(25.4mg，0.063mmol，1当量)，并将混合物在50℃搅拌1小时。然后将混合物用甲醇稀释并在减压下浓缩以得到白色粉末(20.5mg，93.9％产率)，其未经进一步纯化即使用。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.81–7.75(m,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),7.43–7.37(m,3H),5.09(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),4.76(s,2H),4.63(dd,J＝9.1,5.2Hz,1H),3.66–3.55(m,30H),3.51–3.41(m,5H),2.90–2.83(m,1H),2.79–2.71(m,2H),2.69(s,3H),2.43(s,3H),2.14(ddt,J＝10.5,5.5,3.2Hz,1H),1.69(s,3H).LCMS 347(M+H).
(R)-2-((2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(D-54)
将TFA(1.78ml，0.1M)加入至(R)-2-((2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁酯(71.3mg，0.178mmol，1当量)，并将混合物在50℃搅拌1小时。然后将混合物用甲醇稀释并在减压下浓缩以得到白色粉末(47.2mg，76.63％产率)，其未经进一步纯化即使用。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.72(ddd,J＝8.5,7.3,5.0Hz,1H),7.46–7.42(m,1H),7.30(dd,J＝8.6,4.5Hz,1H),4.94(d,J＝5.3Hz,2H),2.81–2.56(m,2H),2.24–2.07(m,1H),2.00(s,2H),0.90(t,J＝6.5Hz,2H).LCMS 347(M+H).
4,7-二氯-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-51)
将4,7-二氯异苯并呋喃-1,3-二酮(434.6mg，2.002mmol，1当量)加入至3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸(362.6mg，2.203mmol，1.1当量)中。然后将乙酸钾(609.07mg，6.206mmol。3.1当量)和乙酸(6.67ml，0.3M)加入至混合物中，并将其在90℃搅拌18小时。然后将混合物冷却至室温，用去离子水稀释并离心5分钟。将沉淀用甲醇稀释并在减压下浓缩。粗物质通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0至10％MeOH/DCM 25分钟梯度)纯化以得到白色粉末(160.4mg，24.5％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.15(s,1H),7.91(s,2H),5.17(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),2.88(ddd,J＝17.2,13.9,5.4Hz,1H),2.68–2.54(m,1H),2.05(ddd,J＝10.5,5.4,2.7Hz,1H).LCMS328(M+H).
实例1：dBET1的合成
(1)JQ-酸的合成
在室温下将JQ1(1.0g，2.19mmol，1当量)溶于甲酸(11mL，0.2M)中并搅拌75小时。将混合物减压浓缩以得到黄色固体(0.99g，定量产率)，其不经纯化即使用。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.50–7.36(m,4H),4.59(t,J＝7.1Hz,1H),3.51(d,J＝7.1Hz,2H),2.70(s,3H),2.45(s,3H),1.71(s,3H).LCMS 401.33(M+H).
根据先前公开的程序(Fischer等,Nature 512(2014):49)合成N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐。
(2)dBET1的合成
在室温下将JQ-酸(11.3mg，0.0281mmol，1当量)和N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(14.5mg，0.0281mmol，1当量)溶于DMF(0.28mL，0.1M)中。然后加入DIPEA(14.7微升，0.0843mmol，3当量)和HATU(10.7mg，0.0281mmol，1当量)，并将混合物搅拌19小时。然后将混合物通过制备型HPLC纯化以得到dBET1，为黄色固体(15.90mg，0.0202mmol，72％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.77(dd,J＝8.3,7.5Hz,1H),7.49(d,J＝7.3Hz,1H),7.47–7.37(m,5H),5.07(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),4.74(s,2H),4.69(dd,J＝8.7,5.5Hz,1H),3.43–3.32(m,3H),3.29–3.25(m,2H),2.87–2.62(m,7H),2.43(s,3H),2.13–2.04(m,1H),1.72–1.58(m,7H).13CNMR(100MHz,cd3od)δ174.41,172.33,171.27,171.25,169.87,168.22,167.76,166.73,166.70,156.26,138.40,138.23,137.44,134.83,133.92,133.40,132.30,132.28,131.97,131.50,129.87,121.85,119.31,118.00,69.53,54.90,50.54,40.09,39.83,38.40,32.12,27.74,27.65,23.61,14.42,12.97,11.57.LCMS 785.44(M+H).
实例2：dBET4的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.438mL，0.0438mmol，1.2当量)中的0.1M溶液加入至(R)-JQ-酸(以类似于JQ-酸的方法从(R)-JQ1制备)(14.63mg，0.0365mmol，1当量)。加入DIPEA(19.1微升，0.1095mmol，3当量)和HATU(15.3mg，0.0402mmol，1.1当量)并将混合物搅拌24小时，然后用MeOH稀释并减压浓缩。粗物质通过制备型HPLC纯化以得到黄色固体(20.64mg，0.0263mmol，72％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.79(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),7.47–7.39(m,5H),5.11–5.06(m,1H),4.75(s,2H),4.68(dd,J＝8.8,5.5Hz,1H),3.47–3.31(m,5H),2.83–2.65(m,7H),2.44(s,3H),2.13–2.06(m,1H),1.68(s,3H),1.67–1.60(m,4H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.43,172.40,171.29,169.92,168.24,167.82,166.71,156.31,153.14,138.38,138.24,137.54,134.88,133.86,133.44,132.29,132.00,131.49,129.88,122.46,121.90,119.38,118.02,69.59,54.96,50.55,40.09,39.84,38.45,32.14,27.75,27.65,23.62,14.41,12.96,11.56.MS 785.48(M+H).
实例3：dBET3的合成
在室温下将N-(2-氨基乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.475mL，0.0475mmol，1.2当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(15.86mg，0.0396mmol，1当量)中。加入DIPEA(20.7微升，0.1188mmol，3当量)和HATU(16.5mg，0.0435mmol，1.1当量)并将混合物搅拌24小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到黄色固体(22.14mg，0.0292 mmol，74％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.82–7.75(m,1H),7.52–7.32(m,6H),5.04(dd,J＝11.6,5.5Hz,1H),4.76(d,J＝3.2Hz,2H),4.66(d,J＝6.6Hz,1H),3.58–3.35(m,6H),2.78–2.58(m,6H),2.48–2.41(m,3H),2.11–2.02(m,1H),1.70(d,J＝11.8Hz,3H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.38,171.26,171.19,170.26,168.86,168.21,167.76,166.72,156.27,153.14,138.44,138.36,138.19,134.87,133.71,132.31,131.57,131.51,129.90,129.86,121.81,119.36,117.95,69.48,54.83,50.52,40.09,39.76,38.30,32.09,23.63,14.40,11.61.LCMS 757.41(M+H).
实例4：dBET5的合成
在室温下将N-(6-氨基己基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.247mL，0.0247mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(9.9mg，0.0247mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(12.9微升，0.0741mmol，3当量)和HATU(9.4mg，0.0247mmol，1当量)。将混合物搅拌21小时，然后用MeOH稀释并减压浓缩。粗物质通过制备型HPLC纯化以得到黄色固体(13.56mg，0.0167mmol，67％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.82–7.78(m,1H),7.53(dd,J＝7.3,2.0Hz,1H),7.49–7.37(m,5H),5.10(dt,J＝12.4,5.3Hz,1H),4.76(s,2H),4.70(dd,J＝8.7,5.5Hz,1H),3.42–3.33(m,2H),3.25(dt,J＝12.3,6.0Hz,3H),2.87–2.67(m,7H),2.48–2.42(m,3H),2.14–2.09(m,1H),1.69(d,J＝4.8Hz,3H),1.58(s,4H),1.42(d,J＝5.2Hz,4H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.51,171.31,171.26,169.82,168.27,168.26,167.75,156.26,150.46,138.20,134.92,133.92,133.47,132.34,132.01,131.52,129.88,121.69,119.34,117.95,111.42,69.39,54.97,50.56,40.39,40.00,38.40,32.15,30.46,30.16,27.58,27.48,23.64,14.41,12.96,11.55.LCMS813.38.
实例5：dBET6的合成
在室温下将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.191mL，0.0191mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(7.66mg，0.0191 mmol，1当量)中。加入DIPEA(10微升，0.0574mmol，3当量)和HATU(7.3mg，0.0191mmol，1当量)并将混合物搅拌22小时，用MeOH稀释并减压浓缩。粗物质通过制备型HPLC纯化以得到奶油色固体(8.53mg，0.0101mmol，53％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.80(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.53(d,J＝7.4Hz,1H),7.49–7.36(m,5H),5.10(dt,J＝12.3,5.3Hz,1H),4.75(s,2H),4.69(dd,J＝8.8,5.3Hz,1H),3.42(dd,J＝15.0,8.9Hz,1H),3.30–3.18(m,4H),2.90–2.64(m,7H),2.45(s,3H),2.13(dtt,J＝10.8,5.2,2.6Hz,1H),1.71(d,J＝4.4Hz,3H),1.56(d,J＝6.2Hz,4H),1.33(d,J＝17.1Hz,8H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.50,172.38,171.30,169.81,168.28,167.74,166.64,156.25,138.38,138.20,137.55,134.92,133.88,133.42,132.27,132.02,131.50,129.85,121.66,119.30,117.95,69.37,55.01,50.58,40.51,40.12,38.44,32.18,30.46,30.33,30.27,30.21,27.91,27.81,23.63,14.42,12.96,11.55.LCMS 841.64(M+H).
实例6：dBET9的合成
在室温下将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.321mL，0.0321mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(12.87mg，0.0321mmol，1当量)中。加入DIPEA(16.8微升，0.0963mmol，3当量)和HATU(12.2mg，0.0321mmol，1当量)并将混合物搅拌24小时，用MeOH稀释并减压浓缩。粗物质通过制备型HPLC纯化以得到黄色油状物(16.11mg，0.0176mmol，55％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.79(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.52(d,J＝7.2Hz,1H),7.49–7.36(m,5H),5.10(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),4.78–4.67(m,3H),3.64–3.52(m,11H),3.48–3.32(m,6H),2.94–2.64(m,7H),2.52–2.43(m,3H),2.18–2.08(m,1H),1.81(p,J＝6.3Hz,4H),1.73–1.67(m,3H).LCMS 918.45(M+H).
实例7：dBET17的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.281mL，0.0281mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-2-(4-(4-氰基苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4,3-A][1,4]二氮杂--6-基)乙酸(11mg，0.0281mmol，1当量)中。加入DIPEA(14.7微升，0.0843mmol，3当量)和HATU(10.7mg，0.0281mmol，1当量)并将混合物搅拌24小时，用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱0-10％MeOH/DCM)纯化得到白色固体(14.12mg，0.0182mmol，65％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.82–7.72(m,3H),7.61(dd,J＝8.5,2.0Hz,2H),7.51(d,J＝7.9Hz,1H),7.44–7.40(m,1H),5.11–5.05(m,1H),4.76(s,2H),4.66(dd,J＝9.0,5.1Hz,1H),3.48–3.32(m,4H),3.30–3.23(m,1H),2.87–2.61(m,7H),2.43(s,3H),2.10(dt,J＝10.7,5.2Hz,1H),1.70–1.59(m,7H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.42,172.65,171.27,169.92,168.25,167.80,165.88,156.31,143.55,138.24,134.88,133.92,133.50,133.39,131.72,131.46,130.55,121.93,119.39,119.21,118.02,115.17,69.59,55.50,50.55,40.10,39.83,38.86,32.11,27.78,27.67,23.62,14.41,12.91,11.64.LCMS 776.39(M+H).
实例8：dBET15的合成
将N-(6-氨基己基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺三氟乙酸盐(13.29mg，0.258mmol，1当量)和JQ-SUAN(10.3mg，0.0258mmol，1当量)溶于DMF(0.26mL)中。加入DIPEA(13.5微升，0.0775mmol，3当量)，然后加入HATU(9.8mg，0.0258mmol，1当量)，并将该混合物在室温下搅拌。24小时后，将材料用DCM稀释并通过柱色谱(ISCO，0-15％MeOH/DCM)纯化，然后通过制备型HPLC以得到浅黄色固体(11.44mg，0.0146mmol，57％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.29–8.23(m,2H),7.93(dd,J＝8.1,4.2Hz,1H),7.50–7.34(m,4H),5.17–5.11(m,1H),4.75–4.69(m,1H),3.53–3.32(m,6H),3.25(dd,J＝13.8,6.7Hz,1H),2.90–2.67(m,6H),2.49–2.38(m,3H),2.18–2.10(m,1H),1.64(d,J＝22.4Hz,6H),1.47(s,4H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.48,171.17,168.05,168.03,167.99,167.70,166.63,141.81,138.40,137.47,135.09,134.77,134.74,133.96,133.94,133.38,132.24,132.05,131.44,129.85,124.57,123.12,123.09,54.98,50.78,40.88,40.08,38.37,32.13,30.40,30.23,27.34,27.26,23.58,14.40,12.96,11.54.LCMS 783.43(M+H).
实例9：dBET2的合成
(1)(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯的合成
将(R)-2-氯-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(44.2mg，0.15mmol，1当量)、4-氨基-3-甲氧基苯甲酸乙酯(35.1mg，0.18mmol，1.2当量)、Pd2dba3(6.9mg，0.0075mmol，5mol％)、XPhos(10.7mg，0.0225mmol，15mol％)和碳酸钾(82.9mg，0.60mmol，4当量)溶于tBuOH(1.5mL，0.1M)中并加热至100℃。21小时后，将混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤，用DCM洗涤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱0-100％EtOAc/己烷，18分钟梯度)纯化得到黄色油状物(52.3mg，0.115mmol，77％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.57(d,J＝8.5Hz,1H),7.69(td,J＝6.2,2.9Hz,2H),7.54(d,J＝1.8Hz,1H),4.52(t,J＝7.9Hz,1H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),4.23(dd,J＝7.9,3.7Hz,1H),3.97(s,3H),3.33(s,3H),2.20–2.12(m,1H),2.03–1.97(m,1H),1.86(ddd,J＝13.9,7.6,3.6Hz,4H),1.78–1.65(m,4H),1.40(t,J＝7.1Hz,3H),0.88(t,J＝7.5Hz,3H).LCMS 454.32(M+H).
(2)(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸的合成
将(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯(73.8mg，0.163mmol，1当量)和LiOH(11.7mg，0.489mmol，3当量)溶于MeOH(0.82mL)THF(1.63mL)和水(0.82mL)中。20小时后，将另外的0.82mL的水加入，并将混合物再搅拌24小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到奶油色固体(53mg，0.125mmol，76％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(dd,J＝8.3,1.6Hz,1H),7.64–7.59(m,2H),4.38(dd,J＝7.0,3.2Hz,1H),4.36–4.29(m,1H),3.94(s,3H),3.30(s,3H),2.13–1.98(m,2H),1.95–1.87(m,2H),1.87–1.76(m,2H),1.73–1.57(m,4H),0.86(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ168.67,163.72,153.59,150.74,150.60,130.95,127.88,125.97,123.14,121.68,116.75,112.35,61.76,61.66,56.31,29.40,29.00,28.68,28.21,23.57,23.41,8.69.LCMS 426.45(M+H).
(3)dBET2的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.183mL，0.0183mmol，1.2当量)中的0.1M溶液加入至(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(6.48mg，0.0152mmol，1当量)中。加入DIPEA(7.9微升，0.0456mmol，3当量)和HATU(6.4mg，0.0168mmol，1.1当量)并将混合物搅拌23小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到黄色固体(9.44mg，0.0102mmol，67％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.84–7.77(m,2H),7.58(d,J＝1.8Hz,2H),7.53–7.46(m,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),5.11–5.05(m,1H),4.76(s,2H),4.48(dd,J＝6.5,3.1Hz,1H),4.33–4.24(m,1H),3.95(s,3H),3.49–3.35(m,4H),2.97(d,J＝10.5Hz,3H),2.89–2.65(m,5H),2.17–1.99(m,4H),1.89(dd,J＝14.5,7.3Hz,2H),1.69–1.54(m,6H),1.36(dt,J＝7.6,3.9Hz,1H),0.85(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ176.52,174.48,173.05,171.34,169.99,168.91,168.25,167.80,164.58,156.34,154.48,153.10,150.63,138.22,134.89,133.96,129.53,123.93,121.87,120.78,119.36,117.99,111.54,69.55,63.29,63.10,56.68,50.55,40.71,39.86,32.15,29.43,29.26,28.73,28.63,27.81,27.77,24.25,23.63,8.47.LCMS810.58(M+H).
实例10：dBET7的合成
在室温下将N-(6-氨基己基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.186mL，0.0186mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.9mg，0.0186mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.7微升，0.0557mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0186mmol，1.1当量)并将混合物搅拌19小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到期望的三氟乙酸盐，为黄色固体(13.62mg，0.0143mmol，77％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.80(t,J＝8.3Hz,2H),7.61–7.57(m,2H),7.55–7.49(m,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),4.48(dd,J＝6.5,3.2Hz,1H),4.33–4.24(m,1H),3.97(s,3H),3.40(t,J＝7.1Hz,2H),3.34(d,J＝6.7Hz,2H),3.30(s,3H),2.98(d,J＝8.5Hz,1H),2.89–2.82(m,1H),2.79–2.63(m,3H),2.17–2.00(m,4H),1.91(dt,J＝14.4,7.1Hz,3H),1.61(dt,J＝13.4,6.6Hz,7H),1.47–1.41(m,3H),0.86(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.54,171.37,169.84,168.84,168.27,167.74,164.59,156.26,154.47,153.18,150.69,138.19,134.91,134.05,129.47,124.78,124.01,121.65,120.77,119.29,117.92,117.86,111.55,69.34,63.31,63.13,56.67,50.53,40.97,39.96,32.16,30.42,30.19,29.42,29.26,28.72,28.62,27.65,27.46,24.26,23.65,8.47.LCMS 838.60(M+H).
实例11：dBET8的合成
在室温下将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.186mL，0.0186mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.9mg，0.0186mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.7微升，0.0557mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0186mmol，1.1当量)并将混合物搅拌16小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到期望的三氟乙酸盐，为灰白色固体(7.15mg，0.007296mmol，39％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.83–7.77(m,2H),7.61–7.56(m,2H),7.55–7.50(m,2H),7.42(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),4.49(dd,J＝6.6,3.3Hz,1H),4.33–4.24(m,1H),3.97(s,3H),3.39(t,J＝7.1Hz,2H),3.34–3.32(m,2H),3.30(s,3H),3.01–2.83(m,2H),2.82–2.65(m,3H),2.17–2.01(m,4H),1.91(dt,J＝14.2,7.4Hz,1H),1.68–1.54(m,7H),1.37(s,7H),0.86(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.52,171.35,169.81,168.85,168.28,167.74,164.58,156.27,154.47,153.89,150.64,138.19,134.93,134.18,129.52,129.41,124.91,123.83,121.67,120.76,119.31,117.95,117.89,111.57,69.37,63.37,63.17,56.67,50.58,41.12,40.12,32.19,30.43,30.28,30.22,30.19,29.40,29.25,28.71,28.62,27.94,27.75,24.29,23.65,8.46.LCMS 866.56(M+H).
实例12：dBET10的合成
在室温下将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.172mL，0.0172mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.3mg，0.0172mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.0微升，0.0515mmol，3当量)和HATU(6.5mg，0.0172mmol，1当量)并将混合物搅拌23小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到期望的三氟乙酸盐，为灰白色固体(10.7mg，0.0101mmol，59％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.78(d,J＝8.3Hz,1H),7.75(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.56–7.51(m,2H),7.49–7.44(m,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,1H),5.08(dd,J＝12.4,5.4Hz,1H),4.69(s,2H),4.44(dd,J＝6.7,3.2Hz,1H),4.30–4.21(m,1H),3.92(s,3H),3.59–3.42(m,12H),3.35(t,J＝6.7Hz,2H),3.25(s,3H),2.95–2.64(m,5H),2.13–1.95(m,4H),1.91–1.71(m,7H),1.65–1.48(m,4H),0.81(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.50,171.35,169.83,168.77,168.25,167.68,164.57,156.26,154.47,153.05,150.59,138.19,134.92,133.89,129.53,124.57,123.98,121.72,120.75,119.26,117.95,117.86,111.54,71.51,71.46,71.28,71.20,70.18,69.65,69.41,63.27,63.07,56.71,50.57,38.84,37.59,32.17,30.41,30.32,29.46,29.26,28.73,28.64,24.27,23.65,8.49.LCMS 942.62(M+H).
实例13：dBET16的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.402mL，0.0402mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(R)-4-((4-环戊基-1,3-二甲基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-6-基)氨基)-3-甲氧基酸(16.55mg，0.0402mmol，1当量)中。加入DIPEA(21微升，0.1206mmol，3当量)和HATU(15.3mg，0.0402mmol，1.当量)并将混合物搅拌21小时，然后通过制备型HPLC，接着柱色谱(ISCO，12g NH2-二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，20分钟梯度)以得到棕色固体(10.63mg，0.0134mmol，33％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.22(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.73–7.68(m,1H),7.49(d,J＝7.4Hz,2H),7.46–7.39(m,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,1H),5.97–5.87(m,1H),5.06(dd,J＝12.6,5.4Hz,1H),4.76(s,2H),3.98(s,3H),3.61(s,2H),3.44–3.36(m,4H),2.92(s,1H),2.78(dd,J＝14.3,5.2Hz,1H),2.68(ddd,J＝17.7,8.2,4.5Hz,2H),2.36–2.26(m,2H),2.10–1.90(m,5H),1.76–1.62(m,6H),1.31(d,J＝16.0Hz,4H).LCMS795.38(M+H).
实例14：dBET11的合成
(1)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸酯的合成
将2-氯-5,11-二甲基-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4-B][1,4]二氮杂-6(11H)-酮(82.4mg，0.30mmol，1当量)、4-氨基-3-甲氧基苯甲酸乙酯(70.3mg，0.36mmol，1.2当量)、Pd2dba3(13.7mg，0.015mmol，5mol％)、XPhos(21.5mg，0.045mmol，15mol％)和碳酸钾(166mg，1.2mmol，
4当量)溶于tBuOH(3.0mL)中并加热至100℃。17小时后，将混合物冷却至室温并通过硅藻土过滤。混合物通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0-100％EtOAc/己烷，19分钟梯度)纯化以得到灰白色固体(64.3mg，0.148mmol，49％)。
1H NMR(400MHz,50％cd3od/cdcl3)δ8.51(d,J＝8.5Hz,1H),8.17(s,1H),7.73(ddd,J＝18.7,8.1,1.7Hz,2H),7.52(d,J＝1.8Hz,1H),7.46–7.41(m,1H),7.15–7.10(m,2H),4.34(q,J＝7.1Hz,4H),3.95(s,3H),3.47(s,3H),3.43(s,3H),1.38(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(100MHz,50％cd3od/cdcl3)δ169.28,167.39,164.29,155.64,151.75,149.73,147.45,146.22,133.88,133.18,132.37,126.44,124.29,123.70,123.36,122.26,120.58,118.05,116.83,110.82,61.34,56.20,38.62,36.25,14.51.LCMS 434.33(M+H).
(2)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二吖庚因-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸
将4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二氮杂卓-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸酯(108.9mg，0.251mmol，1当量)和LiOH(18mg)溶于THF(2.5mL)和水(1.25mL)中。24小时后，将MeOH(0.63mL)加入以改善溶解度并再搅拌24小时，然后用MeOH稀释并通过制备型HPLC纯化以得到淡黄色固体(41.31mg)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.51(d,J＝8.5Hz,1H),8.22(s,1H),7.73(ddd,J＝11.8,8.1,1.7Hz,2H),7.57(d,J＝1.8Hz,1H),7.49–7.44(m,1H),7.19–7.11(m,2H),3.97(s,3H),3.48(s,3H),3.45(s,3H).LCMS 406.32(M+H).
(3)dBET11的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.190mL，0.0190mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4-B][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.71mg，0.0190mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.9微升，0.0571mmol，3当量)和HATU(7.2mg，0.0190mmol，1当量)并将混合物搅拌22小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到期望的三氟乙酸盐，为奶油色固体(6.72mg，0.00744mmol，39％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.46(d,J＝8.3Hz,1H),8.21(s,1H),7.79–7.73(m,2H),7.52(d,J＝7.1Hz,1H),7.50–7.43(m,3H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),7.15(dd,J＝7.7,5.9Hz,2H),4.98(dd,J＝12.0,5.5Hz,1H),4.69(s,2H),3.97(s,3H),3.49(s,3H),3.46–3.34(m,7H),2.81–2.67(m,3H),2.13–2.08(m,1H),1.69(dt,J＝6.6,3.5Hz,4H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ173.40,170.10,169.68,169.00,168.85,167.60,167.15,164.77,156.01,155.42,151.83,150.03,148.21,137.82,134.12,133.48,132.58,132.52,128.11,126.72,124.54,122.33,121.06,120.63,118.77,118.38,117.94,117.62,109.67,68.90,56.33,49.96,40.16,39.48,38.72,36.34,31.82,27.24,23.16.LCMS 790.48(M+H).
实例15：dBET12的合成
在室温下将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.186mL，0.0186mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4-B][1,4]二氮杂-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.53mg，0.0186mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.7微升，0.0557mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0186mmol，1当量)并将混合物搅拌22小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到期望的三氟乙酸盐，为奶油色固体(7.50mg，0.00724mmol，39％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.46(d,J＝8.9Hz,1H),8.21(s,1H),7.73(dd,J＝15.2,7.8Hz,2H),7.50–7.42(m,3H),7.28(d,J＝8.5Hz,1H),7.15(t,J＝7.7Hz,2H),5.01(dd,J＝11.8,5.8Hz,1H),4.68(s,2H),3.97(s,3H),3.67–3.58(m,7H),3.58–3.43(m,10H),3.39(t,J＝6.8Hz,2H),3.35(s,2H),2.97(s,1H),2.84–2.70(m,3H),2.16–2.07(m,1H),1.93–1.76(m,4H).LCMS 922.57(M+H).
实例16：dBET13的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.501mL，0.0501mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至2-((2-(4-(3,5-二甲基异唑-4-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基)氨基)乙酸(如McKeown等，J.Med.Chem，2014,57,9019中所述合成)(18.22mg，0.0501mmol，1当量)中。加入DIPEA(26.3微升，0.150mmol，3当量)和HATU(19.0mg，0.0501mmol，1当量)并将混合物搅拌21小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到期望的三氟乙酸盐，为深黄色油状物(29.66mg，0.0344mmol，69％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.09(s,1H),8.65(d,J＝5.2Hz,1H),8.14–8.06(m,2H),7.94–7.88(m,1H),7.80–7.74(m,1H),7.59–7.47(m,3H),7.40(dd,J＝8.4,4.7Hz,1H),5.11–5.06(m,1H),4.72(d,J＝9.8Hz,2H),3.90(s,2H),3.25–3.22(m,1H),3.12(t,J＝6.4Hz,1H),2.96(s,2H),2.89–2.79(m,1H),2.76–2.62(m,2H),2.48–2.42(m,3H),2.29(s,3H),2.10(ddq,J＝10.2,5.3,2.7Hz,1H),1.49–1.45(m,2H),1.37(dd,J＝6.7,3.6Hz,2H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.45,171.98,171.35,169.88,168.17,167.85,167.40,159.88,156.28,141.82,138.26,135.85,134.82,133.09,132.06,130.75,129.67,122.07,121.94,119.30,118.98,118.06,117.24,69.56,50.56,40.05,39.73,32.13,27.53,23.62,18.71,17.28,11.64,10.85.LCMS 748.49(M+H).
实例17：dBET4的合成
在室温下将0.1M的N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.501mL，0.0501mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至2-((2-(4-(3,5-二甲基异唑-4-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基)氨基)乙酸(如McKeown等，J.Med.Chem，2014,57,9019中所述合成)(18.52mg，0.0510mmol，1当量)中。加入DIPEA(26.6微升，0.153mmol，3当量)和HATU(19.4mg，0.0510mmol，1当量)并将混合物搅拌22小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到期望的三氟乙酸盐，为深黄色油状物(32.63mg，0.0328mmol，64％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ9.09(s,1H),8.66(d,J＝5.4Hz,1H),8.17–8.08(m,2H),7.92(d,J＝5.6Hz,1H),7.77(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.60–7.47(m,3H),7.39(d,J＝8.4Hz,1H),5.09(dd,J＝12.4,5.5Hz,1H),4.71(s,2H),3.91(s,2H),3.62–3.46(m,10H),3.38(dt,J＝16.0,6.4Hz,3H),3.18(t,J＝6.8Hz,2H),2.97(s,1H),2.89–2.81(m,1H),2.78–2.66(m,2H),2.47(s,3H),2.31(s,3H),2.16–2.08(m,1H),1.79(dt,J＝12.8,6.5Hz,2H),1.64(t,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.48,171.88,171.34,169.80,168.22,167.69,167.42,159.87,156.24,141.87,138.21,135.89,134.88,133.13,132.04,130.76,129.67,122.08,121.69,119.20,117.94,117.23,71.44,71.22,71.10,69.92,69.62,69.38,50.57,49.64,38.11,37.55,32.16,30.30,30.20,23.63,11.67,10.88.LCMS 880.46(M+H).
实例18：dBET18的合成
(1)(S)-4-(3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并)并[4,3-α][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酰氨基)丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成
在室温下将JQ-酸(176.6mg，0.441mmol，1当量)溶于DMF(4.4mL)中。加入HATU(176mg，0.463mmol，1.05当量)，随后加入DIPEA(0.23mL，1.32mmol，3当量)。10分钟后，将4-(3-氨基丙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(118mg，0.485mmol，1.1当量)的DMF(0.44mL)溶液加入。24小时后，将混合物用半饱和碳酸氢钠稀释并用DCM萃取两次并用EtOAc萃取一次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱0-15％MeOH/DCM，23分钟梯度)纯化得到黄色油状物(325.5mg，定量产率)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.67(t,J＝5.3Hz,1H),7.41–7.28(m,4H),4.58(dd,J＝7.5,5.9Hz,1H),3.52–3.23(m,8H),2.63(s,9H),2.37(s,3H),1.80–1.69(m,2H),1.64(s,3H),1.42(s,9H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ171.41,164.35,155.62,154.45,150.20,136.92,136.64,132.19,131.14,130.98,130.42,129.98,128.80,80.24,56.11,54.32,52.70,38.96,37.85,28.42,25.17,14.43,13.16,11.82.LCMS626.36(M+H).
(2)(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4,3-A][11,4]二氮杂-6-基)-N-(3-(哌嗪-1-基)丙基)乙酰胺的合成
将(S)-4-(3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并)并[4,3-α][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酰氨基)丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(325.5mg)溶于DCM(5mL)和MeOH(0.5mL)中。将4M HCl的二噁烷溶液(1mL)加入并将混合物搅拌16小时，然后在氮气流下浓缩，得到黄色固体(231.8mg)，其未经进一步纯化即使用。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.64–7.53(m,4H),5.05(t,J＝7.1Hz,1H),3.81–3.66(m,6H),3.62–3.33(m,9H),3.30(p,J＝1.6Hz,1H),2.94(s,3H),2.51(s,3H),2.09(dq,J＝11.8,6.1Hz,2H),1.72(s,3H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ171.78,169.38,155.83,154.03,152.14,140.55,136.33,134.58,134.53,133.33,132.73,130.89,130.38,56.07,53.54,41.96,37.22,36.23,25.11,14.48,13.14,11.68.LCMS526.29(M+H).
(3)(S)-(6-(4-(3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2，4]三唑并[4,3-α][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酰氨基)丙基)哌嗪-1-基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4,3-A][11,4]二氮杂-6-基)-N-(3-(哌嗪-1-基)丙基)乙酰胺(62.1mg)和6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(24.0mg，0.1037mmol，1当量)溶于DMF(1mL)中。加入DIPEA(72.2微升，0.4147mmol，4当量)，然后加入HATU(39.4mg，0.1037mmol，1当量)，并将混合物搅拌25小时。将混合物用半饱和碳酸氢钠稀释并用DCM萃取三次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，15分钟梯度)纯化得到黄色油状物(71.75mg，0.0970mmol，94％)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.61(s,1H),7.43–7.28(m,4H),4.63(s,1H),4.61–4.56(m,1H),3.82–3.21(m,10H),3.11–3.01(m,2H),2.61(d,J＝24.3Hz,9H),2.38(s,3H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),1.73(dq,J＝13.8,7.4Hz,2H),1.63–1.55(m,2H),1.53–1.24(m,14H).13CNMR(100MHz,cdcl3)δ171.63,171.11,164.34,156.17,155.66,150.21,136.96,136.72,132.25,131.14,131.01,130.47,130.00,128.85,79.11,56.42,54.46,53.06,52.82,45.04,41.02,40.47,39.29,38.33,33.00,29.90,28.54,26.60,25.29,24.86,14.47,13.20,11.86.LCMS 739.37(M+H).
(4)(S)-N-(3-(4-(6-氨基己酰基)哌嗪-1-基)丙基)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-F][1,2,4]三唑并[4,3-α][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酰胺的合成
将(S)-(6-(4-(3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2，4]三唑并[4,3-α][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酰氨基)丙基)哌嗪-1-基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(71.75mg，0.0970mmol，1当量)溶于DCM(2mL)和MeOH(0.2mL)中。将4M HCl的二噁烷溶液(0.49mL)加入并将混合物搅拌2小时，然后在氮气流下浓缩，得到黄色泡沫(59.8mg，0.0840mmol，87％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.68–7.53(m,4H),5.04(d,J＝6.6Hz,1H),4.66(d,J＝13.6Hz,1H),4.23(d,J＝13.6Hz,1H),3.63–3.34(m,7H),3.29–3.00(m,5H),2.95(d,J＝6.0Hz,5H),2.51(d,J＝9.2Hz,5H),2.08(s,2H),1.77–1.62(m,7H),1.45(dt,J＝15.3,8.6Hz,2H).13CNMR(100MHz,cd3od)δ173.77,171.84,169.35,155.85,153.99,140.56,136.40,134.58,133.35,132.70,130.39,55.83,53.57,52.92,52.70,43.57,40.55,39.67,37.33,36.25,33.17,28.26,26.94,25.33,25.26,14.49,13.15,11.65.LCMS 639.35(M+H).
(5)dBET18的合成
将(S)-N-(3-(4-(6-氨基己酰基)哌嗪-1-基)丙基)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)乙酰胺二盐酸盐(20.0mg，0.0281mmol，1当量)和2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(9.32mg，0.0281mmol，1当量)溶于DMF(0.281mL)中。加入DIPEA(19.6微升，0.1124mmol，4当量)，然后加入HATU(10.7mg，0.0281mmol，1当量)。24小时后，将混合物用MeOH稀释并通过制备型HPLC纯化以得到期望的三氟乙酸盐。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.83–7.79(m,1H),7.54(d,J＝7.1Hz,1H),7.45(q,J＝8.8Hz,5H),5.12(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),4.76(s,2H),4.68(t,J＝7.3Hz,1H),3.59–3.32(m,8H),3.28–3.18(m,4H),2.87(ddd,J＝19.0,14.7,5.3Hz,2H),2.80–2.65(m,6H),2.44(d,J＝6.8Hz,5H),2.33–2.25(m,1H),2.14(dd,J＝9.8,4.9Hz,1H),2.06–1.89(m,3H),1.70(s,3H),1.61(dq,J＝14.4,7.3,6.9Hz,4H),1.45–1.37(m,2H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.52,173.97,173.69,171.44,169.88,168.26,167.83,166.72,156.36,138.28,137.84,134.89,133.52,132.12,131.83,131.38,129.89,121.87,119.32,118.01,69.52,55.64,55.03,52.79,50.58,43.69,39.77,38.57,36.89,33.47,32.16,29.93,27.34,25.76,25.45,23.63,14.39,12.94,11.66.LCMS 953.43(M+H).
实例19：dBET19的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(235微升，0.0235mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2-(氰基甲基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4,3-a〕〔1,4〕二氮杂-6-基)乙酸(10mg，0.0235mmol，1当量)中。加入DIPEA(12.3微升，0.0704mmol，3当量)和HATU(8.9mg，0.0235mmol，1当量)并将混合物搅拌18.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(12.96mg，0.0160mmol，68％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.80(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.55–7.37(m,6H),5.14–5.06(m,1H),4.77(d,J＝1.5Hz,2H),4.64(dd,J＝8.0,5.6Hz,1H),3.45–3.32(m,5H),3.29–3.21(m,2H),2.83–2.66(m,6H),2.58(s,3H),2.14–2.06(m,1H),1.71–1.57(m,4H).LCMS 810.30,M+H).
实例20：dBET20的合成
在室温下将3-((2-((4-(4-(4-氨基丁酰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(叔丁基)苯磺酰胺三氟乙酸盐(7.41mg，0.0107mmol，1当量)和2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(3.6mg，0.0107mmol，1当量)溶于DMF(214微升，0.05M)。加入DIPEA(5.6微升，0.0321mmol，3当量)和HATU(4.1mg，0.0107mmol，1当量)。22.5小时后，将混合物用MeOH稀释并通过制备型HPLC纯化以得到期望产物，为棕色残留物(6.27mg，0.00701mmol，65％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ8.06(s,1H),7.84–7.75(m,3H),7.65(s,1H),7.55(t,J＝7.8Hz,2H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.25–7.20(m,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H),5.11(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),4.78(s,2H),3.79–3.66(m,4H),3.40(t,J＝6.6Hz,2H),3.24–3.13(m,4H),2.82–2.68(m,3H),2.52(t,J＝7.4Hz,2H),2.24–2.19(m,3H),2.12(dd,J＝10.2,5.1Hz,1H),1.92(dd,J＝13.4,6.4Hz,2H),1.18(s,9H).LCMS895.63(M+H).
实例21：dBET21的合成
在室温下将4-((10-氨基癸基)氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸盐在DMF(232微升，0.0232mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(9.3mg，0.0232mmol，1当量)中。加入DIPEA(12.1微升，0.0696mmol，3当量)和HATU(8.8mg，0.0232mmol，1当量)并将混合物搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为灰白色残留物(1.84mg，0.00235mmol，10％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.77–7.73(m,1H),7.50–7.33(m,6H),5.09(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),4.62(s,1H),4.21(t,J＝6.4Hz,2H),3.36(s,2H),2.87–2.67(m,6H),2.44(s,3H),1.88–1.82(m,2H),1.70(s,3H),1.58(s,4H),1.29(s,8H).LCMS784.51(M+H).
实例22：dBET22的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(247微升，0.0247mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4，3-a][1,4]二氮杂-2-羧酸(10.98mg，0.0247mmol，1当量)中。加入DIPEA(12.9微升，0.0740mmol，3当量)和HATU(9.4mg，0.0247mmol，1当量)。然后将混合物搅拌21小时，然后用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(9.79mg，0.0118mmol，48％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.80(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.51(dd,J＝7.1,1.5Hz,1H),7.48–7.34(m,5H),5.11(ddd,J＝12.4,5.4,3.5Hz,1H),4.76(s,2H),4.69(td,J＝7.2,1.4Hz,1H),3.76(s,3H),3.55(d,J＝7.2Hz,2H),3.48–3.33(m,4H),2.93–2.82(m,1H),2.78–2.64(m,5H),2.14–2.07(m,1H),1.96(d,J＝0.9Hz,3H),1.66(s,4H).LCMS 829.39(M+H).
实例23：dBET23的合成
在室温下将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(220微升，0.0220mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4，3-a][1,4]二氮杂-2-羧酸(9.87mg，0.0220mmol，1当量)中。加入DIPEA(11.5微升，0.0660mmol，3当量)和HATU(8.4mg，0.0220mmol，1当量)。然后将混合物搅拌21小时，然后用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(8.84mg，0.00998mmol，45％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.81(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.53(d,J＝7.3Hz,1H),7.50–7.39(m,5H),5.12(dd,J＝12.6,5.4Hz,1H),4.75(s,2H),4.68(t,J＝7.2Hz,1H),3.76(s,3H),3.54(d,J＝7.2Hz,2H),3.39–3.32(m,3H),3.29(s,1H),2.90–2.83(m,1H),2.79–2.68(m,5H),2.14(dd,J＝8.9,3.7Hz,1H),1.99(s,3H),1.65–1.53(m,4H),1.36(d,J＝6.5Hz,8H).LCMS 885.47(M+H).
实例24：dBET24的合成
步骤1：2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸溶于DMF(6.0mL，0.1M)中。依次加入HATU(228.9mg，0.602mmol，1当量)、DIPEA(0.315mL，1.81mmol，3当量)和N-Boc-2,2'-(亚乙二氧基)二乙胺(0.143mL，0.602mmol，1当量)。6小时后，加入另外的HATU(114mg，0.30mmol，0.5当量)以确保反应完全。再过24小时后，将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，15分钟梯度)纯化得到期望产物，为黄色油状物(0.25g，0.44mmol，74％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.82–7.75(m,1H),7.51(d,J＝7.4Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝12.4,5.5Hz,1H),4.76(s,2H),3.66–3.58(m,6H),3.53–3.45(m,4H),3.19(t,J＝5.6Hz,2H),2.95–2.83(m,1H),2.80–2.67(m,2H),2.19–2.12(m,1H),1.41(s,9H).LCMS 563.34(M+H).
步骤2：N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成
将2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸溶于THF(4.5mL)中并加热至50℃。3小时后，将混合物冷却至室温，用MeOH稀释，并减压浓缩。通过制备型HPLC纯化得到期望产物，为棕褐色固体(0.197g，0.342mmol，77％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.81(ddd,J＝8.4,7.4,1.1Hz,1H),7.55–7.50(m,1H),7.43(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝12.7,5.5Hz,1H),4.78(s,2H),3.74–3.66(m,6H),3.64(t,J＝5.4Hz,2H),3.52(t,J＝5.3Hz,2H),3.14–3.08(m,2H),2.89(ddd,J＝17.5,13.9,5.2Hz,1H),2.80–2.66(m,2H),2.16(dtd,J＝13.0,5.7,2.7Hz,1H).LCMS 463.36(M+H).
步骤2：dBET24的合成
将0.1M的N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的DMF(0.324mL，0.0324mmol，1当量)溶液加入至JQ-酸(13.0mg，0.324mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(16.9微升，0.0972mmol，3当量)和HATU(12.3mg，0.0324mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为灰白色固体(20.0mg，0.0236mmol，73％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.77–7.72(m,1H),7.49(d,J＝7.4Hz,1H),7.45–7.35(m,5H),5.09(ddd,J＝12.3,5.4,3.7Hz,1H),4.76(s,2H),4.60(dd,J＝8.9,5.3Hz,1H),3.68–3.62(m,6H),3.59(t,J＝5.6Hz,2H),3.54–3.48(m,2H),3.47–3.35(m,4H),2.84(ddd,J＝19.4,9.9,4.6Hz,1H),2.77–2.69(m,2H),2.68(d,J＝1.8Hz,3H),2.43(s,3H),2.12(dt,J＝9.8,5.3Hz,1H),1.68(s,3H).LCMS 845.39(M+H).
实例25：dBET25的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(183微升，0.0183mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4，3-a][1,4]二氮杂-3-羧酸(8.16mg，0.0183mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.6微升，0.0550mmol，3当量)和HATU(7.0mg，0.0183mmol，1当量)。然后将混合物搅拌23小时，然后用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为黄色固体(4.39mg，0.00529mmol，29％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.82(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.55(d,J＝7.3Hz,1H),7.45(d,J＝8.2Hz,1H),7.43–7.31(m,4H),5.16–5.10(m,1H),4.77(d,J＝1.5Hz,2H),4.56(s,1H),3.74(d,J＝1.8Hz,3H),3.66–3.60(m,1H),3.50(dd,J＝16.5,7.3Hz,1H),3.37–3.32(m,1H),3.28(s,3H),2.85(t,J＝7.2Hz,2H),2.75(d,J＝7.8Hz,1H),2.71(d,J＝0.9Hz,3H),2.59(d,J＝1.0Hz,3H),2.18–2.10(m,1H),1.36–1.24(m,4H).LCMS 829.38(M+H).
实例26：dBET26的合成
在室温下将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(186微升，0.0186mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4，3-a][1,4]二氮杂-3-羧酸(8.26mg，0.0186mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.7微升，0.0557mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0186mmol，1当量)。然后将混合物搅拌23小时，然后用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为奶油色固体(6.34mg，0.00716mmol，38％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.83–7.78(m,1H),7.53(dd,J＝7.3,2.2Hz,1H),7.45–7.38(m,3H),7.32(dd,J＝8.5,1.3Hz,2H),5.16–5.08(m,1H),4.76(s,2H),4.56(s,1H),3.75(s,3H),3.66(dd,J＝15.9,8.7Hz,1H),3.50(dd,J＝16.9,6.9Hz,1H),3.32(d,J＝2.8Hz,4H),2.84–2.74(m,3H),2.70(d,J＝1.1Hz,3H),2.66–2.54(m,3H),2.14(d,J＝5.3Hz,1H),1.62–1.22(m,12H).LCMS885.48(M+H).
实例27：dBET27的合成
将4-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸盐在DMF(257微升，0.0257mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(10.3mg，0.0257mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(13.4微升，0.0771mmol，3当量)和HATU(9.8mg，0.0257mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(14.53mg，0.0195mmol，76％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.75(ddd,J＝8.5,7.3,1.3Hz,1H),7.47–7.30(m,6H),5.00(ddd,J＝25.4,12.2,5.2Hz,1H),4.61(td,J＝9.4,5.0Hz,1H),4.36(q,J＝4.8Hz,2H),3.96–3.89(m,2H),3.74(q,J＝5.6Hz,2H),3.53–3.41(m,3H),3.30–3.24(m,1H),2.78–2.53(m,6H),2.41(d,J＝3.9Hz,3H),2.09–1.98(m,1H),1.67(d,J＝5.0Hz,3H).
实例28：dBET28的合成
将4-(4-氨基丁氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸盐在DMF(202微升，0.0202mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.1mg，0.0202mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(10.6微升，0.0606mmol，3当量)和HATU(7.7mg，0.0202mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌18.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为奶油色固体(10.46mg，0.0144mmol，71％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.76(t,J＝7.5Hz,1H),7.43(td,J＝6.5,2.5Hz,4H),7.34(t,J＝8.8Hz,2H),5.08–4.98(m,1H),4.64(td,J＝9.1,5.0Hz,1H),4.26(t,J＝5.3Hz,2H),3.57–3.32(m,4H),2.84–2.59(m,6H),2.45–2.37(m,3H),2.08–2.01(m,1H),2.00–1.91(m,2H),1.82(dq,J＝13.8,6.9Hz,2H),1.68(d,J＝11.7Hz,3H).LCMS 728.38(M+H).
实例29：dBET29的合成
将4-((6-氨基己基)氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异二氢吲哚-1,3-二酮在DMF(205微升，0.0205mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.2mg，0.0205mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(10.7微升，0.0614mmol，3当量)和HATU(7.8mg，0.0205mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌19小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(8.04mg，0.0106mmol，52％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.75–7.71(m,1H),7.51–7.34(m,6H),5.07(ddd,J＝12.1,5.4,2.4Hz,1H),4.62(dd,J＝9.0,5.2Hz,1H),4.22(t,J＝6.4Hz,2H),3.44–3.32(m,2H),3.29–3.21(m,2H),2.88–2.65(m,6H),2.43(s,3H),2.13–2.06(m,1H),1.86(dt,J＝13.9,6.7Hz,2H),1.68(s,3H),1.59(dq,J＝14.2,7.0Hz,4H),1.54–1.45(m,2H).LCMS 756.40(M+H).
实例30：dBET30的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(163微升，0.0163mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-4-(4-氯苯基)-3,9-二甲基-6-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂-2-羧酸(9.31mg，0.0163mmol，1当量)中。加入DIPEA(8.5微升，0.0490mmol，3当量)和HATU(6.2mg，0.0163mmol，1当量)。然后将混合物搅拌23.5小时，然后用制备型HPLC纯化以得到期望产物，为黄色油状物(11.48mg，0.0107mmol，66％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.82–7.78(m,1H),7.54–7.35(m,6H),5.09(td,J＝12.7,5.4Hz,1H),4.77–4.70(m,3H),3.56–3.31(m,12H),3.23(dd,J＝8.0,6.0Hz,3H),3.05(d,J＝3.2Hz,2H),2.93–2.81(m,5H),2.78–2.63(m,5H),2.15–2.05(m,2H),1.96–1.86(m,4H),1.68(s,4H).LCMS954.55(M+H).
实例31：dBET31的合成
在室温下将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(153微升，0.0153mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-4-(4-氯苯基)-3,9-二甲基-6-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂-2-羧酸(8.7mg，0.0153mmol，1当量)中。加入DIPEA(7.9微升，0.0458mmol，3当量)和HATU(5.8mg，0.0153mmol，1当量)。然后将混合物搅拌25小时，然后用制备型HPLC纯化以得到期望产物，为漂亮的棕色(不像粪便棕色，有点像砖)油状物(9.52mg，0.00847mmol，55％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.81(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.59–7.40(m,6H),5.12(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),4.75(s,2H),4.71(t,J＝7.4Hz,1H),3.53–3.34(m,8H),3.29–3.11(m,6H),3.03–2.61(m,13H),2.15(s,1H),2.01–1.84(m,5H),1.59(s,4H),1.37(s,8H).LCMS 1010.62(M+H).
实例32：dBET32的合成
在室温下将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(180微升，0.0180mmol，1.2当量)中的0.1M溶液加入至4-(4-(4-((4-((3-(N-(叔丁基)氨磺酰基)苯基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸(10.7mg，0.0180mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.4微升，0.0539mmol，3当量)和HATU(6.8mg，0.0180mmol，1当量)并将混合物搅拌19小时。然后将混合物用甲醇稀释并通过制备型HPLC纯化以得到期望产物，为棕色油状物(4.40mg，0.00449mmol，25％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ8.08(d,J＝13.6Hz,1H),7.84–7.76(m,3H),7.63(s,1H),7.57–7.51(m,2H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.22(td,J＝6.7,2.2Hz,2H),7.03–6.97(m,2H),5.14(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),4.76(d,J＝16.8Hz,2H),3.72(dt,J＝10.0,5.2Hz,4H),3.34–3.33(m,1H),3.23–3.12(m,5H),2.97(dd,J＝8.8,4.0Hz,3H),2.80–2.69(m,4H),2.64(dd,J＝7.6,5.5Hz,1H),2.50(t,J＝6.8Hz,1H),2.22(dd,J＝2.4,0.9Hz,3H),2.17–2.11(m,1H),1.67–1.52(m,4H),1.18(d,J＝0.8Hz,9H).LCMS 980.64(M+H).
实例33：dBET33的合成
在室温下将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(188微升，0.0188mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至4-(4-(4-((4-((3-(N-(叔丁基)氨磺酰基)苯基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸(10.8mg，0.0188mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.8微升，0.0564mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0188mmol，1当量)并将混合物搅拌23小时。然后将混合物用甲醇稀释并通过制备型HPLC纯化以得到期望产物，为棕色残留物(7.41mg，0.00715mmol，38％)。1HNMR(500MHz,甲醇-d4)δ8.06(s,1H),7.80(ddd,J＝10.5,7.6,3.2Hz,3H),7.65(d,J＝4.5Hz,1H),7.57–7.51(m,2H),7.41(dd,J＝8.4,2.9Hz,1H),7.25(td,J＝6.7,2.9Hz,2H),7.02(t,J＝8.0Hz,2H),5.16–5.09(m,1H),4.75(d,J＝9.5Hz,2H),3.76(dq,J＝16.0,5.3Hz,4H),3.29–3.12(m,7H),3.00–2.67(m,7H),2.51(t,J＝6.8Hz,1H),2.22(d,J＝3.1Hz,3H),2.13(dtd,J＝10.4,5.7,3.1Hz,1H),1.59–1.52(m,2H),1.51–1.43(m,2H),1.32(t,J＝16.6Hz,8H),1.18(d,J＝1.3Hz,9H).LCMS 1036.69(M+H).
实例34：dBET34的合成
在室温下将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(173微升，0.0173mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至4-(4-(4-((4-((3-(N-(叔丁基)氨磺酰基)苯基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸(10.3mg，0.0173mmol，1当量)中。加入DIPEA(9.0微升，0.0519mmol，3当量)和HATU(6.6mg，0.0173mmol，1当量)并将混合物搅拌25小时。然后将混合物用甲醇稀释并通过制备型HPLC纯化以得到期望产物，为棕色残留物(7.99mg，0.00718mmol，42％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ8.06(s,1H),7.83–7.76(m,3H),7.65(s,1H),7.58–7.50(m,2H),7.43(dd,J＝17.7,8.4Hz,1H),7.27–7.21(m,2H),7.02(t,J＝8.0Hz,2H),5.13(dt,J＝12.7,5.2Hz,1H),4.76(d,J＝12.4Hz,2H),3.73(q,J＝6.3Hz,4H),3.63–3.49(m,10H),3.41(q,J＝6.6Hz,2H),3.27–3.15(m,5H),3.01–2.81(m,4H),2.79–2.63(m,5H),2.50(t,J＝6.8Hz,1H),2.22(d,J＝2.3Hz,3H),2.17–2.11(m,1H),1.88–1.70(m,4H),1.18(d,J＝1.2Hz,9H).LCMS1112.74(M+H).
实例35：dBET35的合成
将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(185微升，0.0185mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(7.4mg，0.0185mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(9.6微升，0.0554mmol，3当量)和HATU(7.0mg，0.0185mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌17小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(2.71mg，0.00351mmol，19％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.48–7.37(m,4H),7.34(t,J＝7.8Hz,1H),7.14(dd,J＝7.4,2.4Hz,1H),6.67(d,J＝8.1Hz,1H),5.14(td,J＝13.5,5.2Hz,1H),4.66–4.60(m,1H),4.59(d,J＝8.3Hz,2H),4.43–4.31(m,2H),3.88(s,2H),3.25(dd,J＝14.8,7.1Hz,4H),2.94–2.72(m,3H),2.68(d,J＝4.9Hz,3H),2.49–2.40(m,4H),2.21–2.12(m,1H),1.68(s,3H),1.53(s,4H).LCMS 770.51(M+H).
实例36：dBET36的合成
将N-(4-氨基丁基)-2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(222微升，0.0222mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.9mg，0.0222mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(11.6微升，0.0666mmol，3当量)和HATU(8.4mg，0.0222mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌17.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(12.42mg，0.0156mmol，70％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.80–7.74(m,2H),7.68(d,J＝6.8Hz,1H),7.42(q,J＝8.7Hz,4H),5.11(dt,J＝12.3,4.6Hz,1H),4.63(dd,J＝8.8,5.5Hz,1H),4.10–4.00(m,2H),3.39(ddd,J＝14.9,8.8,2.5Hz,1H),3.30–3.21(m,5H),2.88–2.76(m,1H),2.74–2.65(m,5H),2.44(s,3H),2.15–2.08(m,1H),1.69(s,3H),1.63–1.55(m,4H).LCMS 769.49(M+H).
实例37：dBET37的合成
将6-氨基-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基)己酰胺三氟乙酸盐在DMF(195微升，0.0195mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(7.8mg，0.0195mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(10.2微升，0.0584mmol，3当量)和HATU(7.4mg，0.0195mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(11.83mg，0.0151mmol，77％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.78–7.74(m,2H),7.71(dd,J＝5.3,3.5Hz,1H),7.42(q,J＝8.5Hz,4H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.82(s,2H),4.63(dd,J＝8.8,5.5Hz,1H),3.40(ddd,J＝15.0,8.8,1.6Hz,1H),3.30–3.21(m,3H),2.86(ddd,J＝18.4,14.6,4.8Hz,1H),2.74(ddd,J＝13.8,10.1,2.8Hz,2H),2.69(s,3H),2.44(s,3H),2.30(t,J＝7.4Hz,2H),2.13(dtd,J＝12.9,4.9,2.3Hz,1H),1.74–1.64(m,5H),1.59(p,J＝7.0Hz,2H),1.46–1.38(m,2H).LCMS 783.47(M+H).
实例38：dBET38的合成
步骤1：(3-(3-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)丙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(3-(3-氨基丙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(134.5mg，0.579mmol，1当量)溶于DMF(5.79ml，0.05M)中然后加入至2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(192.38mg，0.579mmol，1当量)。加入DIPEA(0.28ml，1.74mmol，3当量)和HATU(153.61mg，0.579mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到黄色油状物(157.1mg)。粗物质通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0至15％MeOH/DCM 25分钟梯度)纯化以得到黄色油状物(121.3mg，0.222mmol，38.27％产率)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.78(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝12.4,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),3.53–3.37(m,6H),3.14–3.07(m,2H),2.94–2.88(m,1H),2.79–2.68(m,2H),2.16(ddd,J＝12.8,6.6,2.7Hz,1H),1.81(p,J＝6.4Hz,2H),1.73–1.65(m,2H),1.40(s,9H).LCMS 547.6(M+H).
步骤2：N-(3-(3-氨基丙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成
将TFA(2.22ml，0.1M)加入至(3-(3-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)丙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(121.3mg，0.222mmol，1当量)中并将混合物在50℃下搅拌2小时。然后将混合物溶于MeOH中并减压浓缩以得到棕色油状物(114.1mg)，其未经进一步纯化即使用。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.81–7.74(m,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,1H),5.12(dd,J＝12.7,5.5Hz,1H),4.76(s,2H),3.57–3.52(m,2H),3.48(t,J＝5.9Hz,2H),3.40(t,J＝6.6Hz,2H),3.06(t,J＝6.5Hz,2H),2.87(ddd,J＝14.1,10.1,7.0Hz,1H),2.79–2.65(m,2H),2.15(dtd,J＝12.8,5.5,2.6Hz,1H),1.92(dt,J＝11.7,5.9Hz,2H),1.81(p,J＝6.3Hz,2H).LCMS 447.2(M+H).
实例3：dBET38的合成
在室温下将N-(3-(3-氨基丙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.215mL，0.0215mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.6mg，0.0215mmol，1当量)中。加入DIPEA(11.2微升，0.0644mmol，3当量)和HATU(8.2mg，0.0215mmol，1当量)。19小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为奶油色固体(10.6mg，0.0127mmol，59％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.79–7.74(m,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,1H),7.46–7.36(m,5H),5.11(ddd,J＝12.4,5.5,1.7Hz,1H),4.73(s,2H),4.62(ddd,J＝8.7,5.4,1.4Hz,1H),3.50(q,J＝6.3Hz,4H),3.43(t,J＝6.5Hz,2H),3.41–3.32(m,3H),3.29–3.24(m,1H),2.85(ddd,J＝18.3,14.6,4.2Hz,1H),2.77–2.65(m,5H),2.43(s,3H),2.17–2.09(m,1H),1.80(h,J＝6.4Hz,4H),1.68(s,3H).LCMS 829.32(M+H).
实例39：dBET39的合成
在室温下将4-((10-氨基癸基)氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸盐在DMF(0.212mL，0.0212mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.5mg，0.0212mmol，1当量)中。加入DIPEA(11.1微升，0.0636mmol，3当量)和HATU(8.1mg，0.0212mmol，1当量)。19小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，25分钟梯度)和制备型HPLC纯化得到期望产物(0.39mg，0.00048mmol，2.3％)。1HNMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.77–7.73(m,1H),7.56–7.31(m,6H),5.11–5.06(m,1H),4.62(dd,J＝9.2,5.0Hz,1H),4.58(s,2H),4.21(t,J＝6.3Hz,2H),3.42–3.38(m,1H),3.24–3.20(m,1H),2.90–2.68(m,6H),2.45(d,J＝6.7Hz,3H),2.11(s,1H),1.83(dd,J＝14.7,6.6Hz,2H),1.70(s,3H),1.61–1.49(m,4H),1.32(d,J＝23.2Hz,10H).LCMS 812.60(M+H).
实例40：dBET40的合成
在室温下将4-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸盐在DMF(0.242mL，0.0242mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(9.7mg，0.0242mmol，1当量)中。加入DIPEA(12.6微升，0.0726mmol，3当量)和HATU(9.2mg，0.0242mmol，1当量)。22小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)和制备型HPLC纯化得到期望产物，为棕色油状物(4.74mg，0.00601mmol，25％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.77–7.67(m,1H),7.52–7.36(m,5H),5.09–5.03(m,1H),4.64(d,J＝4.8Hz,1H),4.40–4.32(m,2H),3.97–3.88(m,2H),3.81–3.74(m,2H),3.69–3.60(m,5H),3.55–3.38(m,4H),2.89–2.54(m,6H),2.45(d,J＝5.9Hz,3H),2.11(s,1H),1.70(d,J＝8.6Hz,3H).LCMS 788.42(M+H).
实例41：dBET41的合成
步骤1：(4-((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(4-(氨基甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(183.14mg，0.755mmol，1当量)溶于DMF(15.1ml，0.05M)并加入至2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(250.90mg，0.755mmol，1当量)。加入DIPEA(0.374ml，2.265mmol，3当量)和HATU(296.67mg，0.755mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌20小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到浅棕色油状物。粗物质通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0至15％MeOH/DCM 25分钟梯度)纯化以得到浅棕色油状物(373.1mg，0.678mmol，89.8％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.10(s,2H),8.48(t,J＝5.8Hz,1H),7.80(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),7.49(d,J＝7.2Hz,1H),7.40(d,J＝8.6Hz,1H),7.26–7.08(m,4H),5.11(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),4.86(s,2H),4.33(d,J＝3.9Hz,2H),4.09(d,J＝5.3Hz,2H),2.65–2.51(m,3H),2.07–1.99(m,1H),1.38(s,9H).LCMS551.5(M+H).
步骤2：N-(4-(氨基甲基)苄基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成
将TFA(6.77ml，0.1M)加入至4-((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(373.1mg，0.677mmol，1当量)并将混合物在50℃搅拌1.5小时。然后将混合物溶于MeOH并减压浓缩以得到棕色油状物(270.29mg)，其未经进一步纯化即使用。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.11(s,1H),8.55(t,J＝6.2Hz,1H),8.07(s,3H),7.81(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.51(d,J＝7.2Hz,1H),7.40(dd,J＝14.9,8.3Hz,3H),7.31(d,J＝8.2Hz,2H),5.11(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),4.87(s,2H),4.37(d,J＝6.1Hz,2H),4.01(q,J＝5.8Hz,2H),2.66–2.51(m,3H),2.07–1.99(m,1H).LCMS451.3(M+H).
步骤3：dBET41的合成
在室温下将N-(4-(氨基甲基)苄基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(0.237mL，0.0237mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(9.5mg，0.0237mmol，1当量)中。23小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为奶油色固体(11.8mg，0.0142mmol，60％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.80–7.75(m,1H),7.51(dd,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.36(d,J＝2.2Hz,4H),7.34–7.28(m,4H),5.10–5.00(m,1H),4.82(s,2H),4.67–4.64(m,1H),4.61–4.42(m,4H),4.34(dd,J＝14.9,12.8Hz,1H),3.49(ddd,J＝14.8,9.5,5.2Hz,1H),2.83–2.75(m,1H),2.73–2.61(m,5H),2.44–2.39(m,3H),2.06(ddq,J＝9.8,4.7,2.6Hz,1H),1.66(d,J＝4.2Hz,3H).LCMS832.92(M+H).
实例42：dBET42的合成
将5-氨基-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)戊酰胺三氟乙酸盐在DMF(222微升，0.0222mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.9mg，0.0222mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(11.6微升，0.0666mmol，3当量)和HATU(8.4mg，0.0222mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌24小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为白色固体(12.23mg，0.0165mmol，74％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.76–7.71(m,1H),7.66–7.62(m,1H),7.51(td,J＝7.8,2.5Hz,1H),7.45–7.35(m,4H),5.11(ddd,J＝13.2,11.3,5.2Hz,1H),4.63(ddd,J＝8.8,5.7,3.2Hz,1H),4.47(s,2H),3.45–3.32(m,3H),3.30–3.27(m,1H),2.90–2.80(m,1H),2.73–2.63(m,4H),2.49(t,J＝7.4Hz,2H),2.46–2.38(m,4H),2.11(ddtd,J＝12.8,10.5,5.3,2.3Hz,1H),1.84–1.75(m,2H),1.66(dd,J＝16.2,7.6Hz,5H).LCMS 741.46(M+H).
实例43：dBET43的合成
将7-氨基-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)庚酰胺三氟乙酸盐在DMF(227微升，0.0227mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(9.1mg，0.0227mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(11.0微升，0.0681mmol，3当量)和HATU(8.6mg，0.0227mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌25.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为灰白色固体(12.58mg，0.0164mmol，72％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.71(d,J＝7.9Hz,1H),7.64(d,J＝7.4Hz,1H),7.51(t,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.38(m,4H),5.14(ddd,J＝13.3,5.2,2.2Hz,1H),4.62(ddd,J＝8.6,5.6,2.1Hz,1H),4.49–4.45(m,2H),3.39(ddd,J＝14.9,8.7,1.3Hz,1H),3.30–3.24(m,3H),2.93–2.83(m,1H),2.79–2.65(m,4H),2.50–2.40(m,6H),2.16(ddq,J＝9.9,5.2,2.6Hz,1H),1.78–1.70(m,2H),1.68(d,J＝2.1Hz,3H),1.63–1.57(m,2H),1.50–1.42(m,4H).LCMS 769.55(M+H).
实例44：dBET44的合成
将8-氨基-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)辛酰胺三氟乙酸盐在DMF(217微升，0.0217mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.7mg，0.0217mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(11.3微升，0.0651mmol，3当量)和HATU(8.3mg，0.0217mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌20.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为奶油色固体(14.28mg，0.0182mmol，84％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.72–7.68(m,1H),7.64(d,J＝7.5Hz,1H),7.51(t,J＝7.7Hz,1H),7.46–7.39(m,4H),5.14(dt,J＝13.3,5.0Hz,1H),4.62(dd,J＝8.8,5.4Hz,1H),4.48–4.44(m,2H),3.40(ddd,J＝14.9,8.8,0.9Hz,1H),3.26(dt,J＝13.2,6.9Hz,3H),2.88(ddd,J＝18.7,13.5,5.4Hz,1H),2.75(dddd,J＝17.6,7.1,4.5,2.4Hz,1H),2.68(d,J＝2.2Hz,3H),2.49–2.39(m,6H),2.17(ddt,J＝9.8,5.3,2.3Hz,1H),1.76–1.70(m,2H),1.70–1.67(m,3H),1.61–1.54(m,2H),1.42(s,6H).LCMS 783.53(M+H).
实例45：dBET45的合成
在室温下将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(268微升，0.0268mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(R)-4-((4-环戊基-1,3-二甲基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-6-基)氨基)-3-甲氧基酸(11.0mg，0.0268mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(14.0微升，0.0804mmol，3当量)和HATU(10.2mg，0.0268mmol，1当量)，并将混合物搅拌18.5小时。然后将混合物用甲醇稀释并通过制备型HPLC纯化以得到期望产物，为棕色固体(10.44mg，0.0108mmol，40％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ8.38(d,J＝8.4Hz,1H),7.80–7.75(m,1H),7.55–7.48(m,1H),7.48–7.35(m,3H),7.27(d,J＝8.3Hz,1H),6.45(d,J＝8.2Hz,1H),5.12(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),4.72(d,J＝5.1Hz,2H),4.53(s,1H),4.28(d,J＝6.8Hz,1H),3.98(d,J＝4.1Hz,3H),3.48–3.33(m,4H),2.90–2.82(m,1H),2.80–2.69(m,2H),2.18–2.01(m,4H),1.88–1.52(m,10H),1.34(d,J＝42.9Hz,10H),1.17(d,J＝6.8Hz,3H).LCMS 851.67(M+H).
实例46：dBET46的合成
在室温下将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(256微升，0.0256mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(R)-4-((4-环戊基-1,3-二甲基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-6-基)氨基)-3-甲氧基酸(10.5mg，0.0256mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(13.4微升，0.0767mmol，3当量)和HATU(9.7mg，0.0256mmol，1当量)，并将混合物搅拌20小时。然后将混合物用甲醇稀释并通过制备型HPLC纯化以得到期望产物，为棕色固体(13.69mg，0.0132mmol，51％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ8.28–8.24(m,1H),7.74–7.71(m,1H),7.49(dd,J＝7.3,3.7Hz,1H),7.39–7.34(m,2H),7.28–7.25(m,1H),7.14–7.10(m,1H),6.34(d,J＝8.3Hz,1H),5.01–4.97(m,1H),4.62(s,2H),4.25(q,J＝6.7Hz,1H),3.95(d,J＝5.4Hz,3H),3.60(ddd,J＝9.0,6.1,1.6Hz,8H),3.53–3.46(m,6H),3.40–3.37(m,2H),2.78(td,J＝11.1,6.6Hz,3H),2.16–2.00(m,4H),1.84(ddt,J＝33.5,13.0,6.4Hz,7H),1.75–1.60(m,6H),1.17(d,J＝6.8Hz,3H).LCMS 927.74(M+H).
实例47：dBET50的合成
在室温下将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4，3-a][1,4]二氮杂-2-羧酸(8.9mg，0.020mmol，1当量)中。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。然后将混合物搅拌17小时，然后用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为奶油色固体(9.31mg，0.00968mmol，48％)。1HNMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.82–7.78(m,1H),7.52(dd,J＝7.1,1.6Hz,1H),7.49–7.40(m,5H),5.10(ddd,J＝12.8,5.5,2.9Hz,1H),4.74(s,2H),4.67(t,J＝7.1Hz,1H),3.76(s,3H),3.62–3.50(m,14H),3.49–3.43(m,2H),3.40(q,J＝6.5Hz,2H),2.87(ddd,J＝17.6,14.0,5.3Hz,1H),2.79–2.67(m,5H),2.12(ddq,J＝10.3,5.4,2.9Hz,1H),2.00(s,3H),1.86(q,J＝6.3Hz,2H),1.80(p,J＝6.4Hz,2H).LCMS 961.67(M+H).
实例48：dBET51的合成
在室温下将N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4]三唑并[4，3-a][1,4]二氮杂-2-羧酸(8.9mg，0.020mmol，1当量)中。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。然后将混合物搅拌17小时，然后用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为灰白色固体(8.38mg，0.00942mmol，47％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.80(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.52(dd,J＝7.2,1.3Hz,1H),7.48–7.38(m,5H),5.08(ddd,J＝12.7,5.5,1.6Hz,1H),4.74(d,J＝2.7Hz,2H),4.66(t,J＝7.1Hz,1H),3.75(d,J＝3.0Hz,3H),3.65(t,J＝4.1Hz,6H),3.59(t,J＝5.3Hz,2H),3.57–3.49(m,4H),3.49–3.40(m,2H),2.93–2.84(m,1H),2.78–2.64(m,5H),2.15–2.09(m,1H),2.00(d,J＝0.9Hz,3H).LCMS889.58(M+H).
实例49：dBET52的合成
在室温下将N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.0mg，0.020mmol，1当量)中。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。17.5小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为无色残留物(9.12mg，0.01025mmol，51％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.77(t,J＝7.9Hz,1H),7.50(dd,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.47–7.36(m,5H),5.09(ddd,J＝13.0,7.6,5.5Hz,1H),4.76(s,2H),4.62(dd,J＝9.1,5.1Hz,1H),3.62(ddt,J＝17.3,11.2,6.5Hz,12H),3.52–3.41(m,5H),3.28(d,J＝5.1Hz,1H),2.90–2.81(m,1H),2.79–2.66(m,5H),2.44(s,3H),2.16–2.09(m,1H),1.69(s,3H).LCMS 889.38(M+H).
实例50：dBET53的合成
在室温下将N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.0mg，0.020mmol，1当量)中。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。17.5小时后，加入另外的HATU(7.6mg)和DIPEA(10.5微升)并将混合物再搅拌5小时。将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物(3.66mg)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.79(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),7.45(d,J＝7.7Hz,2H),7.43–7.36(m,3H),5.08(ddd,J＝12.7,5.5,2.2Hz,1H),4.78–4.74(m,2H),4.62(dd,J＝9.1,5.1Hz,1H),3.70–3.51(m,16H),3.50–3.41(m,5H),3.27(dd,J＝5.1,2.3Hz,1H),2.87(ddt,J＝18.2,9.5,4.9Hz,1H),2.78–2.66(m,5H),2.44(s,3H),2.16–2.09(m,1H),1.69(s,3H).LCMS933.43(M+H).
实例51：dBET54的合成
在室温下将N-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.0mg，0.020mmol，1当量)中。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。16小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物(6.27mg，0.00641mmol，32％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.81–7.76(m,1H),7.51(d,J＝7.1Hz,1H),7.47–7.38(m,5H),5.09(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.77(s,2H),4.62(dd,J＝8.8,5.0Hz,1H),3.67–3.55(m,20H),3.46(ddd,J＝20.1,10.2,4.7Hz,5H),3.28(d,J＝5.1Hz,1H),2.91–2.83(m,1H),2.78–2.68(m,5H),2.44(s,3H),2.16–2.10(m,1H),1.72–1.66(m,3H).LCMS 977.50(M+H).
实例52：dBET55的合成
在室温下将N-(29-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧基二十九烷基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.0mg，0.020mmol，1当量)中。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。18小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物(10.55mg，0.00914mmol，46％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.82(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.55(d,J＝7.0Hz,1H),7.49–7.41(m,5H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.80(s,2H),4.65(dd,J＝9.1,5.1Hz,1H),3.68–3.58(m,36H),3.53–3.44(m,5H),2.94–2.86(m,1H),2.81–2.70(m,5H),2.46(s,3H),2.19–2.13(m,1H),1.74–1.69(m,3H).LCMS 1153.59(M+H).
实例53：dBET56的合成
在室温下将N-(35-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧化五十三烷基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐在DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)中的0.1M溶液加入至JQ-酸(8.0mg，0.020mmol，1当量)中。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。20小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到期望产物，为油状残留物(9.03mg，0.00727mmol，36％)。1H NMR(500MHz,甲醇-d4)δ7.81(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.53(d,J＝7.1Hz,1H),7.50–7.40(m,5H),5.11(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.78(s,2H),4.68(dd,J＝8.6,5.0Hz,1H),3.69–3.56(m,44H),3.52–3.43(m,5H),3.34(dd,J＝7.9,3.5Hz,1H),2.88(ddd,J＝18.0,14.0,5.2Hz,1H),2.79–2.68(m,5H),2.46(s,3H),2.17–2.12(m,1H),1.71(s,3H).LCMS 1241.60(M+H).
实例54：dBET57的合成
步骤1：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮的合成
向4-氟异苯并呋喃-1,3-二酮(200mg，1.20mmol，1当量)的AcOH(4.0mL，0.3M)溶液加入2,6-二氧代哌啶-3-胺盐酸盐(218mg，1.32mmol，1.1当量)和乙酸钾(366mg，3.73mmol，3.1当量)。将反应混合物加热至90℃过夜，随后将其用水稀释至20mL并在冰上冷却30分钟。将得到的浆液过滤，然后将黑色固体通过硅胶快速柱色谱(2％MeOH的CH2Cl2，Rf＝0.3)过滤以提供标题化合物，为白色固体(288mg，86％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.15(s,1H),7.96(ddd,J＝8.3,7.3,4.5Hz,1H),7.82–7.71(m,2H),5.17(dd,J＝13.0,5.4Hz,1H),2.90(ddd,J＝17.1,13.9,5.4Hz,1H),2.65–2.47(m,2H),2.10–2.04(m,1H),MS(ESI)计算成C13H10FN2O4[M+H]+277.06,发现277.25.
步骤2：(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
向搅拌的(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(174mg，0.630mmol，1当量)的DMF(6.3mL，0.1M)溶液中加入DIPEA(220μL，1.26mmol，2当量)和1-Boc-乙二胺(110μL，0.693mmol，1.1当量)。将反应混合物加热至90℃过夜，随后将其冷却至室温并溶于EtOAc(30mL)和水(30mL)。将有机层用盐水(3x20mL)洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化以得到标题化合物，为黄色固体(205mg，79％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.08(bs,1H),7.50(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.12(d,J＝7.1Hz,1H),6.98(d,J＝8.5Hz,1H),6.39(t,J＝6.1Hz,1H),4.96–4.87(m,1H),4.83(bs,1H),3.50–3.41(m,2H),3.41–3.35(m,2H),2.92–2.66(m,3H),2.16–2.09(m,1H),1.45(s,9H)；MS(ESI)计算为C20H25N4O6[M+H]+417.18,发现417.58.
步骤3：2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙烷-1-酮2,2,2-三氟乙酸盐的合成
向搅拌的(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(205mg，0.492mmol，1当量)的二氯甲烷(2.25mL)溶液中加入三氟乙酸(0.250mL)。将反应混合物在室温下搅拌4小时，随后真空除去挥发物。获得标题化合物，为黄色固体(226mg，>95％)，其未经进一步纯化即使用。1H NMR(500MHz,MeOD)δ7.64(d,J＝1.4Hz,1H),7.27–7.05(m,2H),5.10(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),3.70(t,J＝6.0Hz,2H),3.50–3.42(m,2H),3.22(t,J＝6.0Hz,1H),2.93–2.85(m,1H),2.80–2.69(m,2H),2.17–2.10(m,1H)；MS(ESI)计算为C15H17N4O4[M+H]+317.12,发现317.53.
步骤2：dBET57的合成
在室温下将JQ-酸(8.0mg，0.0200mmol，1当量)和2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙烷-1-酮2，2，2-三氟乙酸盐(8.6mg，0.0200mmol，1当量)溶于DMF(0.200mL，0.1M)中。然后加入DIPEA(17.4μL，0.100mmol，5当量)和HATU(7.59mg，0.0200mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物溶于EtOAc(15mL)中，并用饱和NaHCO3(溶液)(15mL)、水(15mL)和盐水(3x15mL)洗涤。NaHCO3(aq)(15mL),water(15mL)and brine(3x15mL).将有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱(0-10％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化以得到标题化合物，为黄色固体(11.2mg，80％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.49(bs,0.6H),8.39(bs,0.4H),7.51–7.43(m,1H),7.38(d,J＝7.8Hz,2H),7.29(dd,J＝8.8,1.7Hz,2H),7.07(dd,J＝7.1,4.9Hz,1H),6.97(dd,J＝8.6,4.9Hz,1H),6.48(t,J＝5.9Hz,1H),6.40(t,J＝5.8Hz,0.6H),4.91–4.82(m,0.4H),4.65–4.60(m,1H),3.62–3.38(m,6H),2.87–2.64(m,3H),2.63(s,3H),2.40(s,6H),2.12–2.04(m,1H),1.67(s,3H),rotamers；MS(ESI)计算为C34H32ClN8O5S[M+H]+700.19,发现700.34.
实例55：dGR1的合成
实例56：dGR2的合成
实例57：dGR3的合成
实例58：dFKBP-1的合成
(1)SLF琥珀酸酯的合成
将SLF(25mg，2.5mL的10mg/mL MeOAc溶液，0.0477mmol，1当量)与DMF(0.48mL，0.1M)和琥珀酸酐(7.2mg，0.0715mmol，1.5当量)合并，并在室温下搅拌24小时。观察到低转化率，并将混合物置于N2流下以除去MeOAc。加入另外0.48mL的DMF以及另外7.2mg琥珀酸酐和DMAP(5.8mg，0.0477mmol，1当量)。然后将混合物搅拌24小时，然后通过制备型HPLC纯化以得到SLF-琥珀酸酯，为黄色油状物(24.06mg，0.0385mmol，81％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.62(d,J＝10.7Hz,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),7.26(td,J＝7.9,2.7Hz,1H),7.07–6.97(m,1H),6.80(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),6.74–6.66(m,2H),5.73(dd,J＝8.1,5.5Hz,1H),5.23(d,J＝4.8Hz,1H),3.83(s,3H),3.81(s,3H),3.39–3.29(m,4H),3.21(td,J＝13.2,3.0Hz,1H),2.68–2.50(m,5H),2.37–2.19(m,2H),2.12–2.02(m,1H),1.79–1.61(m,4H),1.49–1.30(m,2H),1.27–1.05(m,6H),0.82(dt,J＝41.2,7.5Hz,3H).LCMS 624.72(M+H).
(2)dFKBP-1的合成
将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(9.9mg，0.0192mmol，1当量)加入至SLF琥珀酸酯(11.98mg，0.0192mmol，1当量)的0.192mL DMF(0.1M)溶液中。加入DIPEA(10.0微升，0.0575mmol，3当量)，然后加入HATU(7.3mg，0.0192mmol，1当量)。将混合物搅拌17小时，然后用MeOH稀释，并通过制备型HPLC纯化以得到dFKBP-1(7.7mg，0.00763mmol，40％)，为黄色固体。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.81(s,1H),7.77–7.70(m,1H),7.55–7.49(m,2H),7.26(dd,J＝8.0,5.3Hz,2H),7.05–6.99(m,1H),6.77(d,J＝8.8Hz,1H),6.66(d,J＝6.8Hz,2H),5.77–5.72(m,1H),5.24(d,J＝4.8Hz,1H),4.99(dd,J＝12.3,5.7Hz,1H),4.68–4.59(m,2H),3.82(s,3H),3.81(s,3H),3.32(dt,J＝3.3,1.6Hz,4H),3.26–3.14(m,3H),2.79(dd,J＝18.9,10.2Hz,3H),2.64–2.48(m,5H),2.34(d,J＝14.4Hz,1H),2.22(d,J＝9.2Hz,1H),2.14–2.02(m,2H),1.78–1.49(m,9H),1.43–1.30(m,2H),1.20–1.04(m,6H),0.90–0.76(m,3H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ208.51,173.27,172.64,171.63,169.93,169.51,168.04,167.69,167.09,166.71,154.92,149.05,147.48,140.76,138.89,137.48,133.91,133.67,129.36,122.19,120.61,120.54,119.82,118.41,118.12,117.79,112.12,111.76,68.54,56.10,55.98,51.67,46.94,44.57,39.32,39.01,38.23,32.64,31.55,31.43,26.68,26.64,25.08,23.52,23.21,22.85,21.27,8.76.LCMS 1009.66(M+H).
实例59：dFKBP-2的合成
(1)(1-氯-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g，3.12mmol，1当量)溶于THF(31mL，0.1M)中。加入DIPEA(0.543mL，3.12mmol，1当量)并将溶液冷却至0℃。加入氯乙酰氯(0.273mL，3.43mmol，1.1当量)并将混合物缓慢升温至室温。24小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到黄色油状物(1.416g)，其未经进一步纯化即可继续使用。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.24(s,1H),5.00(s,1H),3.98–3.89(m,2H),3.54(dddt,J＝17.0,11.2,5.9,2.2Hz,10H),3.47–3.40(m,2H),3.37–3.31(m,2H),3.17–3.07(m,2H),1.79–1.70(m,2H),1.67(p,J＝6.1Hz,2H),1.35(s,9H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ165.83,155.97,78.75,70.49,70.47,70.38,70.30,70.14,69.48,42.61,38.62,38.44,29.62,28.59,28.40.LCMS 397.37(M+H).
(2)3-((2,2-二甲基-4,20-二氧代-3,9,12,15-四氧杂-5,19-二氮杂二十一烷-2-基)氧代)邻苯二甲酸二甲酯的合成
将(1-氯-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(1.41g，3.12mmol，1当量)溶于MeCN(32mL，0.1M)中。加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯(0.721g，3.43mmol，1.1当量)和碳酸铯(2.80g，8.58mmol，2.75当量)。烧瓶装有回流冷凝器并加热至80℃ 19小时。将混合物冷却至室温并用水稀释，用氯仿萃取一次并用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。粗物质通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM 25分钟梯度)纯化以得到黄色油状物(1.5892mg，2.78mmol，两个步骤后89％)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.52(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(t,J＝8.1Hz,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),7.00(t,J＝5.3Hz,1H),5.06(s,1H),4.46(s,2H),3.83(s,3H),3.78(s,3H),3.47(ddd,J＝14.9,5.5,2.8Hz,8H),3.39(dt,J＝9.4,6.0Hz,4H),3.29(q,J＝6.5Hz,2H),3.09(d,J＝6.0Hz,2H),1.70(p,J＝6.5Hz,2H),1.63(p,J＝6.3Hz,2H),1.31(s,9H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ167.68,167.36,165.45,155.93,154.41,130.87,129.60,125.01,123.20,117.06,78.60,70.40,70.17,70.06,69.39,68.67,68.25,52.77,52.57,38.38,36.58,29.55,29.20,28.34.LCMS 571.47(M+H).
(3)N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成
将3-((2,2-二甲基-4,20-二氧代-3,9,12,15-四氧杂-5,19-二氮杂二十一烷-2-基)氧代)邻苯二甲酸二甲酯(1.589g，2.78mmol，1当量)溶于EtOH(14mL，0.2M)中。加入3MNaOH(2.8mL，8.34mmol，3当量)并将混合物加热至80℃22小时。然后将混合物冷却至室温，用50mL DCM和20mL 0.5M HCl稀释。分层，有机层用25mL水洗涤。将水层合并并用50mL氯仿萃取三次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到1.53g物质，其未经进一步纯化即继续使用。LCMS 553.44.
将所得物质(1.53g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.480g，2.92mmol，1当量)溶于吡啶(11.7mL，0.25M)中并加热至110℃17分钟。将混合物冷却至室温并减压浓缩以得到粗的(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸，为黑色污泥(3.1491g)，其未经进一步纯化即使用。LCMS 635.47.
将粗的(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸(3.15g)溶于TFA(20mL)中并加热至50℃ 2.5小时。将混合物冷却至室温，用MeOH稀释，并减压浓缩。将该物质通过制备型HPLC纯化以得到N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(1.2439g，1.9598mmol，3个步骤71％)，为深红色油状物。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.77(dd,J＝8.3,7.5Hz,1H),7.49(d,J＝7.3Hz,1H),7.40(d,J＝8.5Hz,1H),5.12(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),3.68–3.51(m,12H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),3.10(t,J＝6.4Hz,2H),2.94–2.68(m,3H),2.16(dtd,J＝12.6,5.4,2.5Hz,1H),1.92(p,J＝6.1Hz,2H),1.86–1.77(m,2H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ173.17,169.97,168.48,166.87,166.30,154.82,136.89,133.41,120.29,117.67,116.58,69.96,69.68,69.60,68.87,68.12,67.92,49.19,38.62,36.14,30.80,28.92,26.63,22.22.LCMS536.41(M+H).
(4)dFKBP-2的合成
将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(12.5mg，0.0193mmol，1当量)加入至SLF-琥珀酸酯(12.08mg，0.0193mmol，1当量)的0.193mL DMF溶液中。加入DIPEA(10.1微升，0.0580mmol，3当量)和HATU(7.3mg，0.0193mmol，1当量)并将混合物搅拌19小时。然后将混合物用MeOH稀释并通过制备型HPLC纯化以得到dFKBP-2(9.34g，0.00818mmol，42％)，为黄色油状物。
1H NMR(400MHz,50％MeOD/氯仿-d)δ7.76–7.70(m,1H),7.58–7.45(m,3H),7.26(t,J＝8.2Hz,2H),7.05–6.98(m,1H),6.77(d,J＝7.9Hz,1H),6.71–6.63(m,2H),5.73(dd,J＝8.1,5.6Hz,1H),5.23(d,J＝5.4Hz,1H),5.03–4.95(m,1H),4.64(s,2H),3.82(s,3H),3.80(s,3H),3.62–3.52(m,8H),3.47(t,J＝6.1Hz,2H),3.44–3.33(m,3H),3.27–3.14(m,3H),2.84–2.70(m,3H),2.64–2.47(m,6H),2.34(d,J＝14.1Hz,1H),2.24(dd,J＝14.3,9.3Hz,2H),2.13–2.00(m,2H),1.83(p,J＝6.3Hz,2H),1.67(dtd,J＝38.4,16.8,14.8,7.0Hz,7H),1.51–1.26(m,3H),1.22–1.05(m,6H),0.80(dt,J＝39.8,7.5Hz,3H).13CNMR(100MHz,cdcl3)δ208.64,173.39,173.01,171.76,170.11,169.62,168.24,167.92,167.36,166.69,155.02,149.23,147.66,140.94,139.18,137.57,134.09,133.91,129.49,122.32,120.75,120.52,119.93,118.42,117.75,112.33,111.98,70.77,70.51,70.40,69.45,69.04,68.48,56.20,56.10,51.88,47.09,44.78,38.40,37.48,36.91,32.80,32.71,31.70,31.59,31.55,29.53,29.30,26.77,25.22,23.63,23.33,22.98,21.43.LCMS1141.71(M+H).
实例60：dFKBP-3的合成
根据dFKBP-1的合成步骤(1)制备SLF-琥珀酸酯。
将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(0.233mL，0.0233mmol，1当量)的0.1M溶液加入至2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-(3,3-二甲基-2-氧代戊基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(13.3mg，0.0233mmol，1当量)。加入DIPEA(12.2微升，0.0700mmol，3当量)，随后加入HATU(8.9mg，0.0233mmol，1当量)。将混合物搅拌23小时，然后用MeOH稀释并通过制备型HPLC纯化以得到白色固体(10.72mg，0.0112mmol，48％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.79–7.74(m,1H),7.52(d,J＝7.4Hz,1H),7.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.26(t,J＝8.1Hz,1H),6.97–6.90(m,2H),6.89–6.84(m,1H),6.79(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),6.73–6.64(m,2H),5.73–5.65(m,1H),5.07–4.99(m,1H),4.67(s,2H),4.57–4.51(m,1H),4.48(dd,J＝5.7,2.5Hz,2H),3.82(d,J＝1.9Hz,3H),3.80(s,3H),3.66–3.39(m,3H),2.88–2.48(m,6H),2.42–1.87(m,9H),1.73–1.51(m,6H),1.19–0.92(m,6H),0.75(dt,J＝56.7,7.5Hz,3H).LCMS 954.52(M+H).
实例61：dFKBP-4的合成
根据dFKBP-1的合成步骤(1)制备SLF-琥珀酸酯。
将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(0.182mL，0.0182mmol，1当量)的0.1M溶液加入至2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-(3,3-二甲基-2-氧代戊基)哌啶-2-羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(10.6mg，0.0182mmol，1当量)。加入DIPEA(9.5微升，0.0545mmol，3当量)，随后加入HATU(6.9mg，0.0182mmol，1当量)。将混合物搅拌26小时，然后用MeOH稀释并通过制备型HPLC纯化以得到白色固体(9.74mg，0.01006mmol，55％)。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.75(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),7.53(d,J＝2.3Hz,1H),7.33–7.25(m,2H),7.00–6.84(m,3H),6.79(dd,J＝8.1,2.5Hz,1H),6.72–6.65(m,2H),5.75–5.70(m,1H),5.23(d,J＝4.9Hz,1H),5.05–4.96(m,1H),4.66(s,2H),4.46(s,2H),3.82(s,3H),3.81(s,3H),3.39–3.32(m,4H),3.20–3.12(m,1H),2.82–2.69(m,3H),2.62–2.49(m,2H),2.37–2.00(m,5H),1.78–1.30(m,11H),1.24–1.08(m,6H),0.81(dt,J＝32.9,7.5Hz,3H).LCMS 968.55(M+H).
实例62：dFKBP-5的合成
根据dFKBP-1的合成步骤(1)制备SLF-琥珀酸酯。
将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(0.205mL，0.0205mmol，1当量)的0.1M溶液加入至2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-(2-苯基乙酰基)哌啶-2-羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(11.8mg，0.0205mmol，1当量)。加入DIPEA(10.7微升，0.0615mmol，3当量)，随后加入HATU(7.8mg，0.0205mmol，1当量)。将混合物搅拌29小时，然后用MeOH稀释并通过制备型HPLC纯化以得到白色固体(10.62mg，0.01106mmol，54％)。.
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.77–7.72(m,1H),7.52(s,1H),7.31–7.11(m,7H),6.92–6.77(m,4H),6.68–6.62(m,2H),5.70–5.64(m,1H),5.38(d,J＝3.8Hz,1H),4.99(d,J＝4.6Hz,1H),4.65(s,2H),4.45–4.39(m,2H),3.80(dd,J＝6.7,2.4Hz,8H),3.13–3.03(m,1H),2.83–2.68(m,3H),2.63–2.45(m,3H),2.34–1.93(m,6H),1.71–1.52(m,7H),1.34–1.20(m,3H).LCMS 960.54(M+H).
实例63：dFKBP-6的合成
将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(11.9mg，0.0231mmol，1当量)加入至作为在0.231mL DMF中的溶液(0.1M)的2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-((S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基)哌啶羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(16.0mg，0.0231mmol，1当量)。加入DIPEA(12.1微升，0.0696mmol，3当量)和HATU(8.8mg，0.0232mmol，1当量)并将混合物搅拌21小时。将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。将粗物质通过柱色谱纯化。
实例64：dFKBP-7的合成
将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(12.3mg，0.0189mmol，1当量)加入至作为在0.189mL DMF中的溶液(0.1M)的2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-((S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基)哌啶羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(13.1mg，0.0189mmol，1当量)。加入DIPEA(9.9微升，0.0566mmol，3当量)和HATU(7.2mg，0.0189mmol，1当量)并将混合物搅拌17小时。将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。将粗物质通过柱色谱纯化。
实例65：dFKBP-8的合成
将N-(6-氨基己基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(12.7mg，0.0233mmol，1.3当量)加入至作为在0.233mL DMF中的溶液(0.1M)的2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-((S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基)哌啶羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(12.4mg，0.0179mmol，1当量)。加入DIPEA(9.3微升，0.0537mmol，3当量)和HATU(6.8mg，0.0179mmol，1当量)并将混合物搅拌22小时。将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。将粗物质通过柱色谱纯化。
实例66：dFKBP-9的合成
将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(10.4mg，0.0181mmol，1当量)加入至作为在0.181mL DMF中的溶液(0.1M)的2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-((S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基)哌啶羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(12.5mg，0.0181mmol，1当量)。加入DIPEA(9.5微升，0.0543mmol，3当量)和HATU(6.9mg，0.0181mmol，1当量)并将混合物搅拌22小时。将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。将粗物质通过柱色谱纯化。
实例67：dFKBP的合成
在室温下将FKBP*-酸(14.0mg，0.202mmol，1当量)和2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙烷-1-酮2,2,2-三氟乙酸盐(8.7mg，0.0202mmol，1当量)溶于DMF(0.202mL，0.1M)中然后加入DIPEA(17.6μL，0.101mmol，5当量)和HATU(7.6mg，0.0200mmol，1当量)，并将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物溶于EtOAc(15mL)中，并用饱和NaHCO3(溶液)(15mL)、水(15mL)和盐水(3x15mL)洗涤。将有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。将粗物质通过柱色谱纯化。
实例68：二氨基乙基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐的合成
(1)2-(2-氯乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
在0℃下将(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.40mL，2.5mmol，1当量)溶于THF(25mL，0.1M)和DIPEA(0.44mL，2.5mmol，1当量)。加入氯乙酰氯(0.21mL，2.75mmol，1.1当量)并将混合物升温至室温。22小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到白色固体(0.66g，定量收率)，其未经进一步纯化即可继续使用。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.16(s,1H),4.83(s,1H),4.04(s,2H),3.42(q,J＝5.4Hz,2H),3.32(q,J＝5.6Hz,2H),1.45(s,9H).LCMS 237.30(M+H).
(2)3-(2-((2-((叔丁氧基羰基)氨基))乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸酯的合成
将2-(2-氯乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.66g，1当量)溶于MeCN(17mL，0.15M)中。然后加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯(0.578g，2.75mmol，1.1当量)和碳酸铯(2.24g，6.88mmol，2.75当量)。烧瓶装有回流冷凝器并加热至80℃32小时。然后将混合物冷却至室温，用EtOAc稀释并用水洗涤三次。将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，15分钟梯度)纯化得到黄色固体(0.394g，0.960mmol，2步骤后38％)。)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.65–7.56(m,1H),7.50–7.41(m,1H),7.27(s,1H),7.11(dd,J＝8.4,4.1Hz,2H),5.17(s,1H),4.57(d,J＝6.3Hz,2H),3.94(s,2H),3.88(s,2H),3.40(p,J＝5.8Hz,4H),3.32–3.19(m,4H),1.39(d,J＝5.7Hz,13H).13CNMR(100MHz,cdcl3)δ168.37,168.23,165.73,156.13,154.71,131.24,130.09,124.85,123.49,117.24,79.42,68.48,53.22,52.83,40.43,39.54,28.44.LCMS 411.45(M+H).
(3)二氨基乙基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐的合成
将3-(2-((2-((叔丁氧基羰基)氨基))乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸酯(0.39g，0.970mmol，1当量)溶于EtOH(9.7mL，0.1M)中。加入3M NaOH(0.97mL，2.91mmol，3当量)并将混合物加热至80℃3小时。将混合物冷却至室温，用50mL DCM、5mL 1M HCl和20mL水稀释。分层，有机层用20mL水洗涤。然后将合并的水层用50mL氯仿萃取3次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以得到黄色固体(0.226g)，其未经进一步纯化即可继续使用。LCMS 383.36.
将所得黄色固体(0.226g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.102g，0.6197mmol，1当量)溶于吡啶(6.2mL，0.1M)中并加热至110℃16小时。将混合物冷却至室温并减压浓缩以得到2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯，为难溶的黑色焦油(0.663g)，其未经进一步纯化即使用。LCMS 475.42(M+H).
将粗的2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯溶于TFA(10mL)中并加热至50℃3.5小时，然后减压浓缩。通过制备型HPLC纯化得到红色油状物(176.7mg，0.362mmol，3步骤后37％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.85–7.76(m,1H),7.57–7.50(m,1H),7.48–7.41(m,1H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.81(s,2H),3.62(td,J＝5.6,1.8Hz,2H),3.14(t,J＝5.8Hz,2H),2.97(s,1H),2.80–2.66(m,2H),2.15(dddd,J＝10.1,8.0,5.8,2.8Hz,1H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ173.09,170.00,169.99,166.78,166.62,154.93,136.88,133.46,120.71,117.93,116.77,68.29,49.17,39.37,38.60,30.73,22.19.LCMS 375.30(M+H for free base).
实例69：二氨基丁基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐的合成
根据Fischer等Nature,2014,512,49–53的方法制备二氨基丁基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐。
实例70：二氨基己基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐的合成
(1)(6-(2-氯乙酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯(0.224mL，1.0mmol，1当量)溶于THF(10ml，0.1M)中。加入DIPEA(0.17mL，1.0mmol，1当量)并将混合物冷却至0℃。加入氯乙酰氯(88微升，1.1mmol，1.1当量)并将混合物升温至室温并搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。.将有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩以得到白色固体(0.2691g，0.919mmol，92％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.60(s,1H),4.51(s,1H),4.05(s,2H),3.30(q,J＝6.9Hz,2H),3.11(d,J＝6.7Hz,2H),1.57–1.46(m,4H),1.44(s,9H),1.38–1.32(m,4H).LCMS 293.39(M+H).
(2)(2-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯的合成
将(6-(2-氯乙酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(0.2691g，0.919mmol，1当量)溶于MeCN(9.2mL，0.1M)中。加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯(0.212g，1.01mmol，1.1当量)和碳酸铯(0.823g，2.53mmol，2.75当量)。烧瓶装有回流冷凝器并加热至80℃14小时。将混合物冷却至室温，用EtOAc稀释并用水洗涤三次并用EtOAc反萃取一次。将合并的有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。粗物质通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0至15％MeOH/DCM 15分钟梯度)纯化以得到黄色油状物(0.304g，0.651mmol，71％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.66–7.58(m,1H),7.44(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),7.15–7.08(m,1H),6.96(s,1H),4.56(s,2H),3.92(t,J＝1.6Hz,3H),3.88(t,J＝1.6Hz,3H),3.27(q,J＝6.9Hz,2H),3.10–3.00(m,2H),1.41(s,13H),1.33–1.22(m,4H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ167.97,167.37,165.58,155.95,154.37,130.97,129.74,124.94,123.26,116.81,78.96,68.04,52.89,52.87,52.69,52.67,40.41,38.96,29.88,29.13,28.39,26.33,26.30.LCMS 467.49.
(3)二氨基己基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐的合成
将(2-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯(0.304g，0.651mmol，1当量)溶于EtOH(6.5mL，0.1M)中。加入3M NaOH水溶液(0.65mL，1.953mmol，3当量)并将混合物加热至80℃18小时。将混合物冷却至室温并用50mL DCM和10mL 0.5M HCl稀释。分层，有机层用20mL水洗涤。然后将合并的水层用氯仿萃取3次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以得到黄色泡沫(0.290g)，其未经进一步纯化即可继续使用。LCMS 439.47.
将所得黄色固体(0.290g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.113g，0.69mmol，1当量)溶于吡啶(6.9mL，0.1M)中并加热至110℃17分钟。将混合物冷却至室温并减压浓缩以得到(6-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯，为黑色固体(0.4216g)，其未经纯化即可继续使用(由于溶解性差)。LCMS531.41(M+H).
将粗的(6-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(0.4216g)溶液TFA(10mL)中并加热至50℃2小时。将混合物减压浓缩，然后减压浓缩。通过制备型HPLC纯化得到棕色固体(379.2mg)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.79(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.52(d,J＝7.2Hz,1H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),3.32(t,J＝7.6Hz,2H),2.96–2.89(m,2H),2.89–2.65(m,3H),2.16(ddt,J＝10.4,5.4,2.9Hz,1H),1.63(dp,J＝20.6,7.1Hz,4H),1.51–1.34(m,4H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.57,171.42,169.90,168.24,167.79,156.23,138.23,134.87,121.69,119.22,117.98,69.36,50.53,40.64,39.91,32.14,30.01,28.44,27.23,26.96,23.63.LCMS431.37(M+H).
实例71：二氨基乙基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐的合成
(1)(8-(2-氯乙酰氨基)辛基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将辛烷-1,8-二胺(1.65g，11.45mmol，5当量)溶于氯仿(50mL)中。在室温下将二碳酸二叔丁酯(0.54g，2.291mmol，1当量)的氯仿(10mL)溶液缓慢加入并搅拌16小时，然后减压浓缩。将固体物质重悬于DCM、MeOH、EtOAc和0.5N NH3(MeOH)的混合物中，通过硅藻土过滤并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM，15分钟梯度)纯化得到期望产物和原料的混合物(1.75g)，其未经纯化即可继续使用。
将混合物溶于THF(72mL)和DIPEA(1.25mL，7.16mmol)并冷却至0℃。加入氯乙酰氯(0.63mL，7.88mmol)并将混合物升温至室温。16小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。所得混合物通过柱色谱(ISCO，在二氧化硅上干燥负载，24g柱，0-100％EtOAc/己烷，21分钟梯度)纯化以得到白色固体(0.56g，1.745mmol，2步骤后76％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ6.55(s,1H),4.48(s,1H),4.05(s,2H),3.30(q,J＝6.9Hz,2H),3.10(d,J＝6.2Hz,2H),1.44(s,12H),1.31(s,9H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ165.86,156.14,77.36,42.86,40.73,40.00,30.18,29.44,29.26,28.59,26.86,26.82.LCMS 321.34(M+H).
(2)(2-((8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯的合成
将(8-(2-氯乙酰氨基)辛基)氨基甲酸叔丁酯(0.468g，1.46mmol，1当量)溶于MeCN(15mL，0.1M)中。加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯(0.337g，1.60mmol，1.1当量)和碳酸铯(1.308g，4.02mmol，2.75当量)。烧瓶装有回流冷凝器并加热至80℃18小时。将混合物冷却至室温并用水稀释，用氯仿萃取一次并用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。
粗物质通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM20分钟梯度)纯化以得到黄色油状物(0.434g，0.878mmol，60％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.57(dd,J＝7.9,0.8Hz,1H),7.40(t,J＝8.1Hz,1H),7.07(dd,J＝8.4,0.7Hz,1H),6.89(t,J＝5.3Hz,1H),4.63(s,1H),4.52(s,2H),3.88(s,3H),3.83(s,3H),3.22(q,J＝6.9Hz,2H),3.01(q,J＝6.4Hz,2H),1.36(s,12H),1.20(s,9H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ167.89,167.29,165.54,155.97,154.38,130.95,129.69,124.96,123.23,116.86,78.82,68.05,52.83,52.82,52.66,52.64,40.54,39.06,29.97,29.19,29.10,29.06,28.40,26.66,26.61.LCMS 495.42(M+H).
(3)二氨基乙基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐的合成
将(2-((8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯(0.434g，0.878mmol，1当量)溶于EtOH(8.8mL，0.1M)中。加入3M NaOH(0.88mL，2.63mmol，3当量)水溶液并将混合物加热至80℃24小时。将混合物冷却至室温并用50mL DCM和10mL0.5M HCl稀释。分层，有机层用20mL水洗涤。然后将合并的水层用氯仿萃取3次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以得到黄色固体(0.329g)，其未经进一步纯化即可继续使用。LCMS 467.41.
将所得黄色固体(0.329g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.121g，0.734mmol，1当量)溶于吡啶(7.3mL，0.1M)中并加热至110℃20小时。将混合物冷却至室温并减压浓缩以得到(8-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)辛基)氨基甲酸叔丁酯，为黑焦油(0.293g)，其未经纯化即可继续使用(由于溶解性差)。LCMS559.45(M+H).
将粗的(8-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺基)辛基)氨基甲酸叔丁酯(0.293g)溶于TFA(10mL)中并加热至50℃4小时。将混合物减压浓缩，然后减压浓缩。通过制备型HPLC纯化得到棕色残留物(114.69mg，3步骤后23％)。1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.84–7.78(m,1H),7.54(d,J＝7.3Hz,1H),7.43(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),4.76(s,2H),3.32(d,J＝4.1Hz,1H),3.30(d,J＝3.3Hz,1H),2.94–2.84(m,3H),2.80–2.70(m,2H),2.19–2.12(m,1H),1.67–1.55(m,4H),1.40–1.34(m,8H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ174.57,171.37,169.85,168.26,167.78,156.26,138.22,134.91,121.70,119.28,117.97,69.37,50.57,40.76,40.08,32.17,30.19,30.05,30.01,28.52,27.68,27.33,23.63.LCMS 459.41(M+H).
实例72：N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成
(1)(1-氯-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g，3.12mmol，1当量)溶于THF(31mL，0.1M)中。加入DIPEA(0.543mL，3.12mmol，1当量)并将溶液冷却至0℃。加入氯乙酰氯(0.273mL，3.43mmol，1.1当量)并将混合物缓慢升温至室温。24小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到黄色油状物(1.416g)，其未经进一步纯化即可继续使用。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.24(s,1H),5.00(s,1H),3.98–3.89(m,2H),3.54(dddt,J＝17.0,11.2,5.9,2.2Hz,10H),3.47–3.40(m,2H),3.37–3.31(m,2H),3.17–3.07(m,2H),1.79–1.70(m,2H),1.67(p,J＝6.1Hz,2H),1.35(s,9H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ165.83,155.97,78.75,70.49,70.47,70.38,70.30,70.14,69.48,42.61,38.62,38.44,29.62,28.59,28.40.LCMS397.37(M+H).
(2)3-((2,2-二甲基-4,20-二氧代-3,9,12,15-四氧杂-5,19-二氮杂二十一烷-2-基)氧代)邻苯二甲酸二甲酯的合成
将(1-氯-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(1.41g，3.12mmol，1当量)溶于MeCN(32mL，0.1M)中。加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯(0.721g，3.43mmol，1.1当量)和碳酸铯(2.80g，8.58mmol，2.75当量)。烧瓶装有回流冷凝器并加热至80℃19小时。将混合物冷却至室温并用水稀释，用氯仿萃取一次并用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用硫酸铵干燥，过滤并减压浓缩。粗物质通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0-15％MeOH/DCM 25分钟梯度)纯化以得到黄色油状物(1.5892mg，2.78mmol，两个步骤后89％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.52(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(t,J＝8.1Hz,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),7.00(t,J＝5.3Hz,1H),5.06(s,1H),4.46(s,2H),3.83(s,3H),3.78(s,3H),3.47(ddd,J＝14.9,5.5,2.8Hz,8H),3.39(dt,J＝9.4,6.0Hz,4H),3.29(q,J＝6.5Hz,2H),3.09(d,J＝6.0Hz,2H),1.70(p,J＝6.5Hz,2H),1.63(p,J＝6.3Hz,2H),1.31(s,9H).13CNMR(100MHz,cdcl3)δ167.68,167.36,165.45,155.93,154.41,130.87,129.60,125.01,123.20,117.06,78.60,70.40,70.17,70.06,69.39,68.67,68.25,52.77,52.57,38.38,36.58,29.55,29.20,28.34.LCMS 571.47(M+H).
(3)N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成
将3-((2,2-二甲基-4,20-二氧代-3,9,12,15-四氧杂-5,19-二氮杂二十一烷-2-基)氧代)邻苯二甲酸二甲酯(1.589g，2.78mmol，1当量)溶于EtOH(14mL，0.2M)中。加入3MNaOH(2.8mL，8.34mmol，3当量)并将混合物加热至80℃22小时。然后将混合物冷却至室温，用50mL DCM和20mL 0.5M HCl稀释。分层，有机层用25mL水洗涤。将水层合并并用50mL氯仿萃取三次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩以得到1.53g物质，其未经进一步纯化即继续使用。LCMS 553.44.
将所得物质(1.53g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.480g，2.92mmol，1当量)溶于吡啶(11.7mL，0.25M)中并加热至110℃17分钟。将混合物冷却至室温并减压浓缩以得到粗的(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸，为黑色污泥(3.1491g)，其未经进一步纯化即使用。LCMS 635.47.
将粗的(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸(3.15g)溶于TFA(20mL)中并加热至50℃2.5小时。将混合物冷却至室温，用MeOH稀释，并减压浓缩。将该物质通过制备型HPLC纯化以得到N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐(1.2439g，1.9598mmol，3个步骤71％)，为深红色油状物。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.77(dd,J＝8.3,7.5Hz,1H),7.49(d,J＝7.3Hz,1H),7.40(d,J＝8.5Hz,1H),5.12(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),3.68–3.51(m,12H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),3.10(t,J＝6.4Hz,2H),2.94–2.68(m,3H),2.16(dtd,J＝12.6,5.4,2.5Hz,1H),1.92(p,J＝6.1Hz,2H),1.86–1.77(m,2H).13C NMR(100MHz,cd3od)δ173.17,169.97,168.48,166.87,166.30,154.82,136.89,133.41,120.29,117.67,116.58,69.96,69.68,69.60,68.87,68.12,67.92,49.19,38.62,36.14,30.80,28.92,26.63,22.22.LCMS 536.41(M+H).
实例73：N-(6-氨基己基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺的合成
(1)2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-羧酸的合成
将1,3-二氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸(0.192g，1mmol，1当量)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.165g，1mmol，1当量)溶于DMF(2.5mL)中并加热至80℃24小时。然后将混合物减压蒸馏并用EtOH稀释，从中缓慢形成沉淀。将沉淀用EtOH洗涤两次以得到白色固体(84.8mg，0.28mmol，28％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.74(s,1H),11.12(s,1H),8.39(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),8.26(s,1H),8.04(d,J＝7.8Hz,1H),5.18(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),2.93–2.88(m,1H),2.84(d,J＝4.7Hz,0H),2.66–2.50(m,2H),2.12–1.99(m,1H).LCMS303.19(M+H).
(2)(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯的合成
将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-羧酸(22.7mg，0.0751mmol，1当量)和HATU(31.4mg，0.0826mmol，1.1当量)溶于DMF(0.75mL)中。5分钟后，加入DIPA(39.2微升，0.225mmol，3当量)。再过5分钟后，加入(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯(19.6mg，0.0901mmol，1.2当量)作为DMF(0.75mL)。将混合物搅拌20小时，然后用EtOAc稀释。将有机层用盐水洗涤三次，用硫酸钠干燥并减压浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化得到黄色油状物(17.18mg，0.03432mmol，46％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.29(d,J＝6.2Hz,2H),8.16(s,1H),7.94(d,J＝8.4Hz,1H),6.91(s,1H),5.00(dd,J＝12.4,5.3Hz,1H),4.58(s,1H),3.47(q,J＝6.7Hz,2H),3.14(q,J＝8.5,7.3Hz,2H),2.97–2.69(m,3H),2.17(ddd,J＝10.4,4.8,2.6Hz,1H),1.65(p,J＝6.9Hz,2H),1.53–1.32(m,15H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ174.69,170.77,167.86,166.67,165.27,156.49,141.06,133.95,133.71,132.13,124.21,122.27,77.36,49.71,39.75,31.54,30.27,29.22,28.57,25.70,25.37,22.73.LCMS 501.28(M+H).
(3)N-(6-氨基己基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺的合成
将(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(17.18mg，0.343mmol，1当量)溶于TFA(1mL)中并加热至50℃2小时。将混合物减压浓缩以得到黄色油状物(13.29mg)，其未经进一步纯化被认为是足够纯的。1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.27(dd,J＝9.3,1.3Hz,2H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),5.18(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),3.48–3.40(m,2H),2.96–2.84(m,3H),2.76(ddd,J＝17.7,8.1,3.7Hz,2H),2.20–2.12(m,1H),1.75–1.63(m,4H),1.53–1.43(m,4H).LCMS 401.31(M+H).
实例74：2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸的合成
(1)2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮的合成
将4-羟基异苯并呋喃-1,3-二酮(0.773g，4.71mmol，1当量)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.775g，4.71mmol，1当量)溶于吡啶(19mL)中并加热至110℃16小时。将混合物减压浓缩并通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0-10％MeOH/DCM 25分钟梯度)纯化以得到灰白色固体(1.14g，4.16mmol，88％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.19(s,1H),11.07(s,1H),7.65(dd,J＝8.3,7.3Hz,1H),7.31(d,J＝7.2Hz,1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),5.07(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),2.88(ddd,J＝17.7,14.2,5.4Hz,1H),2.63–2.50(m,2H),2.11–1.95(m,1H).LCMS 275.11(M+H).
(2)2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁酯的合成
将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(218.8mg，0.798mmol，1当量)溶于DMF(8mL)中。加入碳酸钾(165.9mg，1.20mmol，1.5当量)，随后加入溴乙酸叔丁酯(118微升，0.798mmol，1当量)并将混合物在室温下搅拌3小时。将混合物用EtOAc稀释并用水洗一次以及用盐水洗两次。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0-100％EtOAc/己烷，17分钟梯度)纯化得到白色固体(0.26g，0.669mmol，84％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.74(s,1H),7.61(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),7.46–7.41(m,1H),7.06(d,J＝8.3Hz,1H),4.98–4.92(m,1H),4.74(s,2H),2.83–2.69(m,3H),2.12–2.04(m,1H),1.43(s,9H).13C NMR(100MHz,cdcl3)δ171.58,168.37,166.96,166.87,165.49,155.45,136.27,133.89,119.78,117.55,116.83,83.05,66.52,49.20,31.37,28.03,22.55.LCMS 411.23(M+Na).
(3)2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸的合成
在室温下将2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁酯(47.5mg，0.122mmol，1当量)溶于TFA(1.3mL)。3小时后，将混合物用DCM稀释并减压浓缩以得到白色固体(42.27mg)，其未经进一步纯化被认为是足够纯的。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.76(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.34(d,J＝8.5Hz,1H),5.11(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),4.96(s,2H),2.87(ddd,J＝17.8,14.2,5.0Hz,1H),2.80–2.65(m,2H),2.18–2.09(m,1H).LCMS 333.15(M+H).
异型双功能化合物药物组合物
本申请的另一个方面，提供了药物组合物，其包含本文所述的任何一种异型双功能化合物(或其前药、药学上可接受的盐或其他药学上可接受的衍生物)，和任选地包含药学上可接受的载体。还应理解的是本申请的某些异型双功能化合物可以以游离形式存在用于治疗，或者在适当的情况下作为其药学上可接受的衍生物存在。根据本申请，药学上可接受的衍生物包括但不限于本申请化合物的药学上可接受的盐、酯、这样的酯的盐、或前药或其他加合物或衍生物，其在施用于有需要的患者时能够直接或间接提供如本文另外描述的异型双功能化合物或其代谢物或残余物。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指在合理的医学判断范围内适用于与人和低等动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。胺、羧酸和其他类型化合物的药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge等在J Pharmaceutical Sciences 66(1977):1-19中详细描述了药学上可接受的盐，其通过引入并入本文。盐可以在本申请的异型双功能化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱或游离酸功能与合适的试剂反应而分别地制备，如下文一般描述。例如，游离碱功能可以与合适的酸反应。此外，在本申请的异型双功能化合物携带酸性部分地情况下，其合适的药学上可接受的盐可以包括金属盐，例如碱金属盐，如钠或钾盐；和碱土金属盐，例如钙盐和镁盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或与有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸或通过使用本领域中使用的其他方法如离子交换形成的氨基的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、盐酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。另外的药学上可接受的盐包括，当适当时，使用抗衡离子例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。
此外，如本文所使用，术语“药学上可接受的酯”指在体内水解的酯，并且包括容易在人体中分解而留下母体异型双功能化合物或其盐的那些酯。合适的酯基团包括例如衍生自药学上可接受的脂族羧酸的那些，特别是烷酸、烯酸、环烷酸和烷二酸，其中每个烷基或烯基有利地具有不多于6个碳原子。特定酯的实例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。
此外，如本文所用的术语"药学上可接受的前药"指本申请的异型双功能化合物的那些前药，其在合理的医学判断范围内适用于与人类和低等动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等，与合理的效益/风险比相称，并且对于它们的预期用途有效，以及在可能的情况下，本申请的化合物的两性离子形式。术语"前药"指在体内快速地转化以产生上式的母体化合物的化合物，例如通过在血液中水解。在T.Higuchi和V.Stella，Pro-drugs as Novel Delivery Systems,Vol.14of the A.C.S.Symposium Series中和在Edward B.Roche,ed.,Bioreversible Carriers in Drug Design,AmercianPharmaceutical Association and Pergamon Press,(1987)中提供了彻底的讨论，其两者通过引用并入本文。
如上所述，本申请的药物异型双功能化合物组合物另外包含药学上可接受的载体，如本文所用，其包括任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑油等，如适合于期望的特定剂型。Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,(1980))公开了用于配制药物组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。除非任何常规载体介质与本申请化合物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学效应或在其他方面以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，其使用被预期是在本申请的范围内。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；明胶；滑石；赋形剂例如可可油和栓剂蜡；油例如花生油、棉籽油；红花油、芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；乙二醇例如丙二醇；酯例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；Ringer's溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他非毒性相容润滑剂如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和香料、防腐剂和抗氧化剂也可以根据配制者的判断存在于组合物中。
用于口服施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶液，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物也可以包含佐剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质悬浮液可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和乳剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中可以使用的是水、Ringer's溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，其包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸用于可注射剂的制备。
可注射制剂可通过例如通过细菌截留过滤器过滤或通过引入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。
为了延长药物的作用，经常期望的是减缓来自皮下或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的液体悬浮液或晶体或无定型材料而完成。药物的吸收速率取决于其溶解速率，其进而取决于晶体大小和晶型。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮于油载体中完成。可注射的储库形式是通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备。取决于药物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库可注射制剂也可以通过将药物陷入在与身体组织相容的脂质体或微乳中制备。
用于直肠或阴道施用的组合物优选地为栓剂，其可以通过将本申请的化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体(例如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)混合制备，其在环境温度下为固体但在体温下为液体，并因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填料和填充剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，b)粘合剂例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)润湿剂例如甘油，d)崩解剂例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂例如石蜡，f)吸收促进剂例如季铵化合物，g)润湿剂例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
类似类型的固体组合物也可用作使用诸如乳糖或奶糖的赋形剂以及高分子聚乙二醇等的软和硬填充明胶胶囊中的填料。片剂、糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳制备，例如药物配制领域公知的肠溶衣和其他包衣。它们可以任选地含有遮光剂并且还可以具有它们任选地以延迟方式仅仅或优先在肠道的某个部分释放活性成分的组成。
可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物也可用作使用诸如乳糖或奶糖的赋形剂以及高分子聚乙二醇等的软和硬填充明胶胶囊中的填料。
活性异型双功能化合物也可以是具有如上所述的一种或多种赋形剂的微包封形式。片剂、糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳制备，例如肠溶衣，释放控制包衣和药物配置领域中公知的其他包衣。在这样的固体剂型中，活性异型双功能化合物可以与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖和淀粉混合。如在正常实践中，这样的剂型还可以包含除惰性稀释剂以外的另外的物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂并且还可以具有任选地以延迟方式仅仅或优先在肠道的某个部分释放活性成分的组成。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
本申请包括本发明化合物的药学上可接受的局部制剂。如本文所用术语"药学上可接受的局部制剂"指药学上可接受用于通过将制剂应用于表皮而皮内施用本申请化合物的任何制剂。在本申请的某些实施方式中，局部制剂包含载体系统。药学上有效的载体包括但不限于溶剂(例如醇、聚醇、水)、乳膏、洗剂、软膏、油、膏药、脂质体、粉末、乳剂、微乳剂和缓冲溶液(例如低渗或缓冲盐水)或本领域已知用于局部施用药物的任何其他载体。本领域中标准的参考文献提供了本领域已知载体的更完整列表，所述参考文献例如由Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Edition,(1980)和17th Edition,(1985)，其公开内容通过引用整体并入本文。在某些其他实施方式中，本申请的局部制剂可以包含赋形剂。本领域已知的任何药学上可接受的赋形剂可用于制备本发明的药学上可接受的局部制剂。可以包含在本申请的局部制剂中的赋形剂的实例包括但不限于防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、润肤剂、缓冲剂、增溶剂、其他渗透剂、皮肤保护剂、表面活性剂和推进剂、和/或与本发明化合物组合使用的另外的治疗剂。合适的防腐剂包括但不限于醇、季胺、有机酸、对羟基苯甲酸酯和酚。合适的抗氧化剂包括但不限于抗坏血酸及其酯、亚硫酸氢钠、丁羟甲苯、丁羟茴醚、生育酚和螯合剂例如EDTA和柠檬酸。合适的保湿剂包括但不限于甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、尿素和丙二醇。用于本申请的合适的缓冲剂包括但不限于柠檬酸、盐酸和乳酸缓冲剂。合适的增溶剂包括但不限于季铵氯化物、环糊精、苯甲酸苄酯、卵磷脂和聚山梨醇酯。可用于本申请的局部制剂中的合适的皮肤保护剂包括但不限于维生素E油、阿拉托宁、聚二甲基硅氧烷、甘油、凡士林和氧化锌。
在某些实施方式中，本申请的药学上可接受的局部制剂包含至少一种本申请的化合物和渗透增强剂。局部制剂的选择取决于多种因素，其包括待治疗的病症、存在的本发明化合物和其他赋形剂的物理化学特性、它们在制剂中的稳定性、可用的制造设备和成本限制。如本文所用，术语"渗透增强剂"指能够将药理活性化合物输送通过角质层并且输送到表皮或真皮中的试剂，优选地具有很少或没有全身吸收。已经评估了各种化合物在提高药物穿透皮肤的速率方面的有效性。参见，例如，Maibach H.I.和Smith H.E.(eds.),Percutaneous Penetration Enhancers,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.(1995)，其中调查了各种皮肤渗透促进剂的使用和测试，以及Buyuktimkin等,Chemical Means ofTransdermal Drug Permeation Enhancement in Transdermal and Topical DrugDelivery Systems,Gosh T.K.,Pfister W.R.,Yum S.I.(eds.),Interpharm Press Inc.,Buffalo Grove,Ill.(1997)。在某些示例性实施方式中，与本申请一起使用的渗透剂包括但不限于甘油三酯(例如大豆油)、芦荟组合物(例如芦荟凝胶)、乙醇、异丙醇、八聚苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-二癸甲基亚砜、脂肪酸酯(例如肉豆蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、甘油单油酸酯和丙二醇单油酸酯)和N-甲基吡咯烷酮。
在某些实施方式中，组合物可以是软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂的形式。在某些示例性实施方式中，根据本申请的组合物的制剂是乳膏剂，其可以进一步包含饱和或不饱和脂肪酸，例如硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈酸-油酸、鲸蜡醇或油醇，并且特别优选硬脂酸。本发明的乳膏还可以包含非离子表面活性剂，例如聚氧-40-硬脂酸酯。在某些实施方式中，活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或缓冲剂按需混合。眼科制剂、滴耳剂和滴眼剂也被认为在本申请的范围内。此外，本申请预期透皮贴剂的使用，其具有向身体提供化合物的受控递送的附加优点。这种剂型通过将化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。如上所述，渗透增强剂也可以用于增加化合物穿过皮肤的通量。速率可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制。
还应理解的是本申请的某些异型双功能化合物可以以游离形式存在用于治疗，或者在适当的情况下作为其药学上可接受的衍生物存在。根据本申请，药学上可接受的衍生物包括但不限于药学上可接受的盐、酯、这样的酯的盐、或前药或本申请的化合物的其他加合物或衍生物，其在施用于有需要的患者时能够直接或间接提供如本文另外描述的化合物或其代谢物或残余物。
调节CAR表达细胞活性的方法
通常，如本申请中所述，使用异型双功能化合物调节CAR表达细胞的活性的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本申请的异型双功能化合物，其中所述异型双功能化合物以足以诱导CAR降解的量施用。
在某些实施方式中，异型双功能化合物可用于调节或下调CAR表达细胞的激活，例如CAR T细胞，例如通过降解CAR的细胞内信号传导途径并因此减少例如CAR T细胞由于其激活状态释放细胞因子。在某些实施方式中，根据本申请的治疗方法，如本文所述，CAR表达细胞中的CAR的水平是通过使CAR表达细胞与异型双功能化合物接触而调节。
因此，在本申请的另一个方面中，提供了用于调节CAR表达细胞的活性的方法，例如CAR T细胞，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的异型双功能化合物。在某些实施方式中，提供了用于调节CAR表达细胞的活性的方法，例如CAR T细胞，其包括以达到期望结果所必须的数量和时间，向有需要的受试者施用治疗有效量的异型双功能化合物或包含异型双功能化合物的药物组合物。优选地，异型双功能化合物经口或静脉内施用。在本申请的某些实施方式中，异型双功能化合物的“治疗有效量”是有效降低CAR表达细胞的活性，从而调节或减少不利的炎症或免疫应答的量。根据本申请的方法，异型双功能化合物可以使用有效调节CAR表达细胞的活性的任何量和任何施用途径施用。所需的确切量将从受试者到受试者不同，取决于受试者的种族、年龄和一般状况、CAR表达细胞的活性、具体的CAR表达细胞等。在本申请的某些实施方式中，异型双功能化合物的"治疗有效量"是有效降低CAR表达细胞中CAR水平的量。
本申请的异型双功能化合物优选地以剂量单位形式配制以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用，表述"剂量单位形式"指适合于待治疗的患者的治疗剂的物理离散单位。然而，将理解的是本申请的异型双功能化合物和组合物的总日用量将由主治医生在合理的医学判断的范围内决定。任何特定患者或生物体的具体治疗有效量水平取决于多种因素，其包括待治疗的病症和不良CAR表达细胞炎症反应的严重程度；所用特定异型双功能化合物的活性；使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用特定异型双功能化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所用特定异型双功能化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素(参见，例如Goodman和Gilman's,"The Pharmacological Basis of Therapeutics",Tenth Edition,A.Gilman,J.Hardman和L.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press,(2001):155-173，其全部内容通过引用并入此文)。
此外，在用合适的药学上可接受的载体以期望剂量配制后，本申请的药物组合物可以口服、直肠、肠胃外、池内、阴道内、腹膜内、局部施用(例如通过粉剂、软膏剂、乳膏剂或滴剂)、口服或鼻喷雾剂等施用于人和其他动物，取决于待治疗的感染的严重程度。在某些实施方式中，异型双功能化合物可以以约0.001mg/kg至约50mg/kg、约0.01mg/kg至约25mg/kg或约0.1mg/kg至约10mg/kg受试者体重/天的剂量水平施用，每天一次或多次，以获得期望的治疗效果。还应理解可以将小于0.001mg/kg或大于50mg/kg(例如50-100mg/kg)的剂量施用于受试者。在某些实施方式中，异型双功能化合物经口服或肠胃外施用。
一旦制备，异型双功能化合物(例如双功能化合物)可以使用本领域技术人员已知的各种测定来表征以确定化合物是否具有期望的生物学活性。例如，可以通过常规测定来表征分子，包括但不限于以下所述的测定法(例如，用测试化合物处理感兴趣的细胞，例如MV4-11细胞，人类细胞系MM1S或cereblon缺陷型人类细胞系MM1S，然后对指示蛋白质如BRD2，BRD3和BRD4进行免疫印迹，或者用测试化合物处理某些感兴趣的细胞，然后通过qRT-PCR测量BRD4转录物水平)，以确定它们是否具有预测的活性，结合活性和/或结合特异性。
本领域技术人员可以参考一般参考文献关于本文讨论的已知技术或等效技术的详细描述。这些文本包括Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley and Sons,Inc.(2005)；Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rdedition),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York(2000)；Coligan等,Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,N.Y.；Enna等,CurrentProtocols in Pharmacology,John Wiley&Sons,N.Y.；Fingl等,The PharmacologicalBasis of Therapeutics(1975)；Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,PA,18th edition(1990)。当然，这些文本也可以在进行或使用本申请的一个方面时参考。
实施例
提供了具有能够被异型双功能化合物结合或者能够结合至异型双功能化合物的细胞内dTAG的示例性嵌合抗原受体(CAR)分子的实施例，其当暴露于异型双功能化合物时，被泛素蛋白酶体途径(UPP)降解。这些实施例仅是示例性的，并非意在限制，而是用作引入能够被异型双功能化合物结合并随后降解的dTAG的CAR结构的说明。
实施例1：CD19-CAR-dTAG
图4是靶向肿瘤抗原CD19的示例性CAR的示意图。如图所示，CAR具有包含针对CD19的scFv的细胞外靶向配体结构域。例如，CD19scFv具有氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:10)：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS，
其中GMCSF信号肽是由氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:11)MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP构成。
针对CD19的scFv具有由氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:12)DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT构成的可变轻链(VL)。
scFv可变轻链(VL)和可变重链(VH)通过具有氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:13)：GSTSGSGKPGSGEGSTKG的Whitlow接头连接。
针对CD19的scFv具有由氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:14)：EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS构成的可变重链(VH)。
针对CD19的scFv与具有氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:15)：ALSNSIYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD的修饰的CD8α链铰链区在框内融合。
效应结构域由与1个或多个细胞质信号传导结构域框内克隆的跨膜结构域构成。
如本文所示例的，跨膜结构域(TM)可以是包含CD28TM和细胞质结构域的共刺激CD28蛋白的片段。片段由以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:16)：KPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYA PPRDFAAYRS构成。
CD28细胞质结构域与细胞内CD3-ζ结构域在框内中克隆。CD3-ζ结构域由以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:17)：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR构成。
功能性CAR序列然后与由以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:18)：GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFVLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPNATLIFDVELLKLE构成的dTAG通过三重甘氨酸接头(GGG)连接并框内克隆。
dTAG氨基酸序列是具有F36V突变的FKBP12的衍生物。
如所表达的，示例性CD19-CAR-dTAG的完整氨基酸序列是(SEQ.ID.NO.:19)：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSALSNSIYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFVLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPNATLIFDVELLKLE。
如上面更详细地描述的，将表达所述CAR氨基酸序列的合成DNA构建体引入来自患有病症例如癌症(例如在这种情况下为ALL)的受试者的T细胞群中。自体T细胞通过机采从受试者的血液中分离，并使用上述任何方法或本领域已知的方法离体繁殖。然后通过包括但不限于质粒转染、病毒转导、使用转座因子的非病毒电穿孔的机制将合成的CAR质粒DNA，例如编码图5中所示的Cd19-CAR-dTAG的质粒，引入至自体T细胞群中。所得CAR T细胞离体扩增并然后通过输注引入至供体患者。
接受CAR T细胞后，监测受试者的CRS和其他相关毒性的发生。患有CRS或其他CART细胞相关毒性的受试者被施用有效量的异型双功能化合物，例如靶向SEQ.ID.NO.:19的示例性CD19-CAR-dTAG的dTAG的dFKBP*。CAR降解和T细胞负荷可以通过流式细胞术确定。
在逆转CRS和/或其他相关毒性后，dFKBP*的施用可以被撤销，并通过流式细胞术检测CAR在T细胞上的再表达。
实施例2：ErbB2-CAR-dTAG
作为替代性实施例，CAR具有包含针对Erb-B2的scFv的细胞外靶向配体结构域。Erb-B2scFv与C8α链接头、CD28TM和细胞质结构域、CD3-ζ细胞质结构域和dTAG序列在框内克隆以形成功能性ErbB2-CAR-dTAG。例如，ERB2scFv具有由氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:20)：DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE构成的可变轻链(VL)，
其中GMCSF信号肽由氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:11)：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP构成。
针对ERB2的scFv具有由氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:21)：DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT构成的可变重链(VH)。
scFv可变轻链(VL)和可变重链(VH)通过具有氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:13)：GSTSGSGKPGSGEGSTKG的Whitlow接头连接。
针对Erb-B2的scFv具有由氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:22)：QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS构成的可变重链(VH)。
针对Erb-B2的scFv与具有氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:15)：ALSNSIYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD的修饰的CD8α链铰链区在框内融合。
效应结构域由与1个或多个细胞质信号传导结构域框内克隆的跨膜结构域构成。
如本文所示例的，跨膜结构域(TM)可以是包含CD28TM和细胞质结构域的共刺激CD28蛋白的片段。片段由以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:16)：KPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYA PPRDFAAYRS构成。
CD28细胞质结构域与细胞内CD3-ζ结构域框内克隆。CD3-ζ结构域由以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:17)：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR构成。
功能性CAR序列然后与由以下氨基酸序列(SEQ.ID.NO.:18)：GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFVLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPNATLIFDVELLKLE构成的dTAG通过三重甘氨酸接头(GGG)连接并框内克隆。
dTAG氨基酸序列是具有F36V突变的FKBP12的衍生物。
如所表达的，示例性ERB2-CAR-dTAG的完整氨基酸序列是(SEQ.ID.NO.:23)：DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITALSNSIYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDKPFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGGGGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFVLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPNATLIFDVELLKLE。
如上文更详细地描述的，将表达所述CAR氨基酸序列的合成DNA构建体引入来自患有病症例如癌症(例如在这种情况下为实体乳腺癌)的受试者的T细胞群中。自体T细胞通过机采从受试者的血液中分离，并使用上述任何方法离体繁殖。然后通过包括但不限于质粒转染、病毒转导、使用转座因子的非病毒电穿孔的机制将合成的CAR质粒DNA引入至自体T细胞群中。所得CAR T细胞离体扩增并然后通过输注引入至供体患者。
接受CAR T细胞后，监测受试者的CRS和其他相关毒性的发生。患有CRS或其他CART细胞相关毒性的受试者被施用有效量的异型双功能化合物，例如靶向SEQ.ID.NO.:22的示例性ERB2-CAR-dTAG的dTAG的dFKBP*。CAR降解和T细胞负荷可以通过流式细胞术确定。
在逆转CRS和/或其他相关毒性后，dFKBP*的施用可以被撤销，并通过流式细胞术检测CAR在T细胞上的再表达。
实施例3：
图6说明了确认用dFKBP7进行的FKBP*融合蛋白的选择性降解的实施例。
该dTAG是基于FKBP*特异性配体相对于内源性野生型FKBP的选择性。在表达野生型FKBP12或FKBP*的293T细胞中，dFKBP7仅在FKBP*表达细胞中诱导靶向降解。进行用本发明中描述的双功能分子处理的细胞的免疫印迹。用指定浓度的dFKBP7处理表达HA标记的FKBP12WT或FKBP*的293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)4小时。FKBP*而非FKBPWT的CRBN依赖性降解证实了dFKBP7对突变FKBP*的选择性活性。
实施例4：
图7A-B说明了用于测量不同降解活性的一组dFKBP异型双功能化合物的剖析的实施例。
为了识别有效和选择性的dFKPB异型双功能化合物，被靶向的FKBP*的降解的高通量测量通过荧光素酶的替代水平测量。这里，FKBP*被外源地表达为具有两种类型的荧光素酶：纳米荧光素酶(NLuc)和萤火虫荧光素酶(FLuc)的多顺反子转录物，其允许FKBP*蛋白质水平的细胞标准化定量。FKBP*的降解被测量为用指定浓度的dFKBP处理4小时的野生型(图7A)或CRBN-/-(图7B)293FT细胞中的信号比(Nluc/Fluc)。信号比的降低指示FKBP*(Nluc)降解，并且观察到以cereblon依赖性方式有效降解FKBP*的分子(例如dFKBP7)。
实施例5：
图8说明了用异型双功能化合物dFKBP7和dFKBP13选择性降解FKBP*融合蛋白的实施例。
在表达野生型FKBP12或FKBP*的293T细胞中，用dFKBP7和dFKBP13进行的处理仅在FKBP*表达细胞中诱导靶向降解。将等基因293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)工程化以表达FKBP12WT或FKBP*。将细胞用100nM的dFKBP7或dFKBP13处理4小时，然后制备裂解物用于蛋白免疫印迹分析。FKBP*而非FKBP12WT或内源性FKBP12的CRBN依赖性降解证实了dFKBP7和dFKBP13对突变FKBP*的选择性。
实施例6：
图9说明了采用异型双功能化合物dFKBP13的HA标记的FKBP*的剂量依赖性降解的实施例。
为了确定dFKB13异型双功能化合物诱导FKBP*的降解的最佳浓度，在用渐增浓度的dFKBP13处理后测量降解。将等基因293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)工程化以表达HA标记的FKBP*。将细胞用指定剂量的dFKBP13处理4小时，然后制备裂解物用于蛋白免疫印迹分析。这些数据证实了dFKBP13对HA标记的FKBP*的剂量和CRBN依赖性降解。
实施例7：
图10说明了HA标记的FKBP*的dFKBP13依赖性降解的动力学控制。
为了评估FKBP*的靶向降解的动力学控制，将dFKBP13通过增加的持续时间施用。将293FT细胞(CRBN-WT)工程化以表达HA标记的FKBP*。将细胞用100nM dFKBP13处理指定的时间。收集细胞并对蛋白裂解物进行免疫印迹以测量由dFKBP13诱导的HA标记的FKBP*降解的动力学。
实施例8：
图11说明了确认通过异型双功能化合物dFKBP13进行的FKBP*的CRBN-和蛋白酶体依赖性降解的实施例。
将293FT细胞(CRBN-WT)工程化以表达FKBP*。在用dFKBP13处理4小时之前，将细胞用1μM卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)、0.5μM MLN4924(neddylation抑制剂)和10μM来那度胺(CRBN结合配体)预处理2小时。制备裂解物并进行蛋白免疫印迹分析。通过蛋白酶体抑制剂卡非佐米拯救dFKBP13对HA标记的FKBP*的降解，确定了对蛋白酶体功能的需求。用NAE1抑制剂MLN4924进行的预处理拯救了HA标记的FKBP*，确定了对CRL活性的依赖性，如对进行性E3连接酶活性需要neddylation的基于cullin的泛素连接酶所预期的。用过量的来那度胺进行的预处理消除了dFKBP13依赖性FKBP*降解，确认了降解对CRBN参与的需求。
实施例9：
图12是说明CAR-dTAG的变阻器机制的示意图。
CAR-dTAG融合蛋白在T细胞的膜上表达以形成功能性CART-dTAG。本发明中描述的异型双功能化合物(dFKBP)的添加导致经由蛋白酶体的有效的和靶向的E3连接酶介导的CAR降解。dFKBP异型双功能化合物的去除导致CAR表达的再激活。该图说明了本发明中描述的化学地控制CAR水平而不影响T细胞的变阻器机制背后的原理。
实施例10：
图13说明了进行以确认人Jurkat T细胞中CD19-CAR-dTAG(SEQ.ID.NO.:19)的异位表达的实验。
Jurkat T细胞用表达CD19-CAR-dTAG的慢病毒转导。细胞用杀稻瘟素选择并扩增。Jurkat细胞中CD19-CAR-dTAG的稳定表达通过全细胞裂解物的抗HA蛋白免疫印迹证实。
实施例11：
图14A-B说明了采用异型双功能化合物(dFKBP7和dFKBP13)的Jurkat T细胞中CD19-CAR-dTAG的剂量依赖性降解的实施例。
为了确定双功能分子诱导CD19-CAR-dTAG的降解的最佳浓度，在用渐增浓度的dFKBP7和dFKBP13处理后测量降解。将Jurkat T细胞工程化以表达CD19-CAR-dTAG。将细胞用指定剂量的dFKBP7或dFKBP13处理4小时，然后制备裂解物用于蛋白免疫印迹分析。这些数据证实了Jurkat T细胞中CD19-CAR-dTAG的剂量依赖性降解。
实施例12：
图15A-B说明了Jurkat T细胞中通过异型双功能化合物dFKBP7和dFKBP13进行的CD19-CAR-dTAG降解的动力学控制。
为了评估CD19-CAR-dTAG的靶向降解的动力学控制，固定浓度的双功能分子dFKBP7和dFKBP13以固定浓度施用增加的持续时间。将Jurkat T细胞工程化以表达CD19-CAR-dTAG。将细胞用250nM dFKBP7或dFKBP13处理指定的时间，然后制备裂解物用于免疫印迹分析。这些数据证实了Jurkat T细胞中CD19-CAR-dTAG的时间依赖性降解。
实施例13：
图16说明了用dFKBP7处理后CD19-CAR-dTAG再表达的动力学。
免疫印迹说明了用dFKBP7靶向降解后CD19-CAR-dTAG蛋白的再表达的动力学。将工程化以表达CD19-CAR-dTAG的Jurkat T细胞用250nM的dFKBP7处理4小时。然后通过冲洗将dFKBP7从Jurkat细胞除去，并在指定时间点通过免疫印迹分析监测CD19-CAR-dTAG的再表达。数据表明在dFKBP7去除之后，CD19-CAR-dTAG蛋白水平恢复。
实施例14：
图17A-B说明了T细胞中CD19-CAR-dTAG表达的变阻器化学控制。
图17A说明了测量添加和除去dFKBP7后控制T细胞中CD19-CAR-dTAG表达的能力的实验设计。将工程化以表达CD19-CAR-dTAG的Jurkat细胞在指定的时间点(0和8小时)用250nM的dFKBP7处理。在4和12小时，将dFKBP7从Jurkat细胞中洗出。在每个指定的时间点，收集Jurkat细胞以通过免疫印迹分析监测CD19-CAR-dTAG表达水平。
图17B是说明如图17A中所述启动和关闭CD19-CAR-dTAG的表达的能力的免疫印迹。异型双功能化合物dFKBP7分子允许CD19-CAR-dTAG蛋白水平的灵敏化学控制，允许在若干小时内的调节。这些数据支持本发明中描述的变阻器机制。
实施例15：
图18A-B证实了当与dTAG融合时，感兴趣的蛋白的靶向降解。
为了测试dTAG技术在多种蛋白质类型中的普遍效用，在MV4；11白血病细胞中表达与dTAG融合的指定细胞。用指定dFKBP双功能分子(dFKBP7和dFKBP13)处理后，观察到如通过蛋白质印迹法测量的靶向蛋白降解。将细胞用指定浓度的FKBP*选择性异型双功能化合物处理16小时，并在纳摩尔浓度下观察到降解。
实施例16：
图19说明了证实N端dTAG-KRAS的降解的实施例。
在N端dTAG-KRAS中，dFKBP7处理导致有效降解以及p-AKT信号的下游减少，表明过表达的dTAG融合蛋白的生物相关性。将细胞用500nM dFKBP7处理指定的时间。收集细胞并免疫印迹以测量FKBP*-KRAS和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。dTAGKRAS的过表达导致相关下游信号传导途径的激活，作为如通过蛋白质印迹法测量的观察到的p-AKT信号的增加。
实施例17：
图20说明了dFKBP异型双功能化合物诱导dTAG-KRAS的降解的剖析。
为了识别表现最好的dFKBP分子，将dTAG-KRAS降解在一系列dFKBP分子上进行分析。对用1μM的指定dFKBP异型双功能化合物处理24小时的表达dTAG-KRASG12V的NIH3T3细胞进行蛋白质印迹。收集细胞并免疫印迹以测量FKBP*-KRAS和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据表明dFKBP9、dFKBP12和dFKBP13诱导FKBP*-KRAS的有效降解和下游信号传导的抑制。
实施例18：
图21说明了证实采用dFKBP13的dTAG-KRAS的靶向降解的实施例。
dFKBP13双功能分子以纳摩尔浓度有效地降解dTAG-KRAS。对用指示浓度的dFKBP13处理24小时的表达与KRAS的N端融合的FKBP*的NIH3T3细胞进行蛋白质印迹。收集细胞并免疫印迹以测量FKBP*-KRAS和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据表明dFKBP13诱导FKBP*-KRAS的有效降解，并且以IC50>100nM有效地抑制下游信号传导。
实施例19：
图22说明了采用dFKBP13的dTAG-KRAS的靶向降解的动力学控制的实施例。
为了评价dTAG-KRAS的靶向降解的动力学控制，将dFKBP13通过增加的持续时间施用。对用1μM dFKBP13处理指定时间的表达与KRAS的N端融合的FKBP*的NIH3T3细胞进行蛋白质印迹。收集细胞并免疫印迹以测量FKBP*-KRAS和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据表明dFKBP13早在处理后1小时就诱导FKBP*-KRAS的有效降解和下游信号传导的抑制。
实施例20：
图23A-D说明了进行以确认dTAG-KRAS降解后引起的表型变化的实验。
如相位对比成像所示，在dTAG-KRAS过表达后在NIH3T3中观察到形态学变化。在用dFKBP13处理24小时后，细胞在形态学上回到野生型(DMSO对照)状态。
实施例21：
图24A-D说明了dTAG-KRAS降解对NIH3T3细胞活力的表型结果。
ATPlite一步发光测定法基于由ATP与添加的荧光素酶和D-荧光素的反应引起的光的产生测量细胞中的细胞增殖和细胞毒性。信号减少表明细胞数量减少。为了评估dFKBP13对表达dTAG-KRAS的NIH3T3细胞中的增殖的影响，通过ATP水平的替代测量评估活力。将细胞用指定浓度的dFKBP处理72小时，并使用ATPlite测定法测量细胞活力。
已经参照本发明的实施方式描述了该说明书。然而，本领域的普通技术人员认识到，可以在不脱离本发明的范围的情况下进行各种修改和改变。说明书应被认为是说明性而非限制性意义，并且所有这样的修改意图被包括在本发明的范围内。

Claims (66)

1.一种免疫效应细胞，其包含嵌合抗原受体多肽，其中所述嵌合抗原受体多肽包含：
a.细胞外配体结合结构域；
b.跨膜结构域；
c.包含至少一个细胞内信号传导结构域的细胞质结构域；和
d.能够被异型双功能化合物结合的异型双功能化合物靶向蛋白(dTAG)，
其中所述异型双功能化合物能够以使所述嵌合抗原受体多肽接近泛素连接酶的方式：a)通过所述dTAG结合至所述嵌合受体抗原多肽和b)结合至所述泛素连接酶，其中所述嵌合抗原受体多肽当被所述异型双功能化合物结合时能够被泛素化，然后被蛋白酶体降解。
2.权利要求1所述的免疫效应细胞，其中所述细胞是自体人细胞。
3.权利要求2所述的免疫效应细胞，其中所述细胞是T细胞。
4.权利要求2所述的免疫效应细胞，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。
5.权利要求1所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含来自非内源肽的氨基酸序列或其片段。
6.权利要求1所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含选自SEQ.ID.No.1-9或24-58的氨基酸序列或其片段。
7.权利要求6所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含细胞溶质信号传导蛋白FKBP12的氨基酸序列或其片段。
8.权利要求7所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.1的氨基酸序列或其片段。
9.权利要求7所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.2的氨基酸序列或其片段。
10.权利要求8所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被选自dFKBP-1-dFKBP-5的异型双功能化合物结合。
11.权利要求8所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被选自dFKBP-6-dFKBP-13的异型双功能化合物结合。
12.权利要求11所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被异型双功能化合物dFKBP7结合。
13.权利要求11所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被异型双功能化合物dFKBP13结合。
14.权利要求6所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.3的氨基酸序列或其片段。
15.权利要求14所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被选自dBET1-dBET18的异型双功能化合物结合。
16.权利要求6所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含衍生自SEQ.ID.No.9的氨基酸序列或其片段。
17.权利要求16所述的免疫效应细胞，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被选自dHalo1-dHalo2的异型双功能化合物结合。
18.一种嵌合抗原受体多肽，其包含：
a.细胞外配体结合蛋白；
b.跨膜蛋白；
c.包含至少一种细胞内信号传导蛋白的细胞质蛋白；和
d.能够被异型双功能化合物结合的异型双功能化合物靶向蛋白(dTAG)，
其中所述异型双功能化合物能够以使所述嵌合抗原受体多肽接近泛素连接酶的方式：a)通过所述dTAG结合至所述嵌合受体抗原多肽和b)结合至所述泛素连接酶，其中所述嵌合抗原受体多肽当被所述异型双功能化合物结合时能够被泛素化，然后被蛋白酶体降解。
19.权利要求18所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含来自非内源肽的氨基酸序列或其片段。
20.权利要求18所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含选自SEQ.ID.No.1-9或24-58的氨基酸序列或其片段。
21.权利要求20所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含细胞溶质信号传导蛋白FKBP12的氨基酸序列或其片段。
22.权利要求21所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.1的氨基酸序列或其片段。
23.权利要求21所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.2的氨基酸序列或其片段。
24.权利要求22所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被选自dFKBP-1-dFKBP-5的异型双功能化合物结合。
25.权利要求23所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被选自dFKBP-6-dFKBP-13的异型双功能化合物结合。
26.权利要求25所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被异型双功能化合物dFKBP7结合。
27.权利要求25所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被异型双功能化合物dFKBP13结合。
28.权利要求20所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.3的氨基酸序列或其片段。
29.权利要求28所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被选自dBET1-dBET18或dBromo1-dBromo34的异型双功能化合物结合。
30.权利要求20所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.9的氨基酸序列或其片段。
31.权利要求30所述的嵌合抗原受体多肽，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白能够被选自dHalo1-dHalo2的异型双功能化合物结合。
32.一种编码嵌合抗原受体的核酸序列，所述嵌合抗原受体包含：
a.细胞外配体结合蛋白；
b.跨膜蛋白；
c.包含至少一种细胞内信号传导蛋白的细胞质蛋白；和
d.能够被异型双功能化合物结合的异型双功能化合物靶向蛋白(dTAG)，
其中所述异型双功能化合物能够以使所述嵌合抗原受体多肽接近泛素连接酶的方式：a)通过所述dTAG结合至所述嵌合受体抗原多肽和b)结合至所述泛素连接酶，
其中所述嵌合抗原受体多肽当被所述异型双功能化合物结合时能够被泛素化，然后被蛋白酶体降解。
33.权利要求32所述的核酸序列，其中所述核酸编码包含来自非内源肽的氨基酸序列或其片段的异型双功能化合物靶向蛋白。
34.权利要求32所述的核酸序列，其中所述核酸编码包含选自SEQ.ID.No.1-9或24-58的氨基酸序列或其片段的异型双功能化合物靶向蛋白。
35.权利要求32所述的核酸序列，其中所述核酸编码包含细胞溶质信号传导蛋白FKBP12的氨基酸序列或其片段的异型双功能化合物靶向蛋白。
36.权利要求35所述的核酸序列，其中所述核酸编码包含SEQ.ID.No.1的氨基酸序列或其片段的异型双功能化合物靶向蛋白。
37.权利要求35所述的核酸序列，其中所述核酸编码包含SEQ.ID.No.2的氨基酸序列或其片段的异型双功能化合物靶向蛋白。
38.权利要求36所述的核酸序列，其中所述核酸编码能够被选自dFKBP-1-dFKBP-5的异型双功能化合物结合的异型双功能化合物靶向蛋白。
39.权利要求37所述的核酸序列，其中所述核酸编码能够被选自dFKBP-6-dFKBP-13的异型双功能化合物结合的异型双功能化合物靶向蛋白。
40.权利要求39所述的核酸序列，其中所述核酸编码能够被异型双功能化合物dFKBP7结合的异型双功能化合物靶向蛋白。
41.权利要求39所述的核酸序列，其中所述核酸编码能够被异型双功能化合物dFKBP13结合的异型双功能化合物靶向蛋白。
42.权利要求34所述的核酸序列，其中所述核酸编码包含SEQ.ID.No.3的氨基酸序列或其片段的异型双功能化合物靶向蛋白。
43.权利要求42所述的核酸序列，其中所述核酸编码能够被选自dBET1-dBET18的异型双功能化合物结合的异型双功能化合物靶向蛋白。
44.权利要求34所述的核酸序列，其中所述核酸编码包含SEQ.ID.No.9的氨基酸序列或其片段的异型双功能化合物靶向蛋白。
45.权利要求44所述的核酸序列，其中所述核酸编码能够被选自dHalo1-dHalo2的异型双功能化合物结合的异型双功能化合物靶向蛋白。
46.一种免疫效应细胞，其表达权利要求30所述的核酸序列。
47.一种减少由表达嵌合抗原受体多肽的激活的免疫效应细胞引起的受试者的不良免疫应答的方法，其包括：
a.向遭受不良免疫应答的所述受试者施用有效量的异型双功能化合物；
其中所述受试者先前已经被施用能够表达嵌合抗原受体多肽的免疫效应细胞，
其中所述嵌合抗原受体多肽包含
细胞外配体结合蛋白；
跨膜蛋白；
包含至少一种细胞内信号传导蛋白的细胞质蛋白；和，
能够被异型双功能化合物结合的异型双功能化合物靶向蛋白(dTAG)，
其中所施用的异型双功能化合物以使所述嵌合抗原受体多肽接近泛素连接酶的方式：a)通过所述dTAG结合至所述嵌合受体抗原多肽和b)结合至所述泛素连接酶，其中所述嵌合抗原受体多肽当被所述异型双功能化合物结合时被泛素化，然后被蛋白酶体降解。
48.权利要求47所述的方法，其中所述免疫效应细胞是自体人细胞。
49.权利要求48所述的方法，其中所述免疫效应细胞是T细胞。
50.权利要求48所述的方法，其中所述免疫效应细胞是自然杀伤(NK)细胞。
51.权利要求47所述的方法，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含来自非内源肽的氨基酸序列或其片段。
52.权利要求47所述的方法，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含选自SEQ.ID.No.1-9或24-58的氨基酸序列或其片段。
53.权利要求47所述的方法，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含细胞溶质信号传导蛋白FKBP12的氨基酸序列或其片段。
54.权利要求53所述的方法，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.1的氨基酸序列或其片段。
55.权利要求53所述的方法，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.2的氨基酸序列或其片段。
56.权利要求54所述的方法，其中施用于所述受试者的所述异型双功能化合物选自dFKBP-1-dFKBP-5。
57.权利要求55所述的方法，其中施用于所述受试者的所述异型双功能化合物选自dFKBP-6-dFKBP-13。
58.权利要求57所述的方法，其中施用于所述受试者的所述异型双功能化合物是dFKBP7。
59.权利要求57所述的方法，其中施用于所述受试者的所述异型双功能化合物是dFKBP13。
60.权利要求52所述的方法，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.3的氨基酸序列或其片段。
61.权利要求60所述的方法，其中施用的所述异型双功能化合物选自dBET1-dBET18。
62.权利要求52所述的方法，其中所述异型双功能化合物靶向蛋白包含SEQ.ID.No.9的氨基酸序列或其片段。
63.权利要求62所述的方法，其中施用的所述异型双功能化合物选自dHalo1-dHalo2。
64.权利要求47所述的方法，其中所述受试者具有白血病或淋巴瘤。
65.权利要求47所述的方法，其中所述细胞外配体结合蛋白能够结合肿瘤抗原。
66.权利要求65所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19或CD20。
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