CN107530341A - 治疗与ras突变相关的癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了治疗以表达RAS蛋白的突变形式为特征的癌症的方法。一些实施方案涉及通过将普那布林施用于有需要的对象来治疗癌症。

Description

治疗与RAS突变相关的癌症的方法
通过引用并入任何优先权申请
本申请要求2015年3月6日递交的美国临时申请第62/129654号和2015年11月2日递交的美国临时申请第62/249788号的权益，将其公开内容通过引用整体并入本文。
发明背景
领域
本发明涉及化学和医药领域。更具体地，本发明涉及使用普那布林(Plinabulin)治疗与RAS突变相关的癌症的方法。
相关技术描述
RAS蛋白作为控制细胞内信号传导网络的二元分子开关发挥作用。RAS调节的信号通路控制诸如肌动蛋白细胞骨架完整性、增殖、分化、细胞粘附、细胞凋亡和细胞迁移等过程。RAS亚家族包括至少21个成员，如KRAS、NRAS和HRAS。RAS或RAS相关的蛋白将来自细胞外部的信号传递到细胞核。这些信号指示细胞生长和分裂或成熟并承担专门的功能(分化)。RAS蛋白属于一类被称为GTP酶的蛋白，这意味着它将称为GTP的分子转化为另一种称为GDP的分子。RAS蛋白表现得像一个开关，它通过GTP和GDP分子来打开和关闭。为了传输信号，RAS蛋白必须通过连接(结合)到GTP分子来打开。当RAS蛋白将GTP转换为GDP时，所述RAS蛋白被关闭(灭活)。当所述蛋白与GDP结合时，它不会将信号传递到细胞核。当RAS蛋白在某些密码子突变时，RAS蛋白被卡在其GTP结合状态，所以它保持发送信号到细胞核，并且该细胞不能停止分裂，这就是不受控制的细胞生长或癌症。
RAS基因属于一类被称为致癌基因的基因。RAS基因的突变形式具有引起正常细胞癌变的潜力。由这些RAS基因产生的蛋白是GTP酶。这些蛋白在细胞分裂、细胞分化和细胞凋亡中起重要作用。然而，致癌RAS协调代谢转移以维持肿瘤生长(特别是在肿瘤微环境中)的机制，以及特定的代谢途径对于RAS介导的肿瘤维持是否为必不可少的，仍然是积极研究的领域。使用已知疗法难以治疗以RAS突变为特征的癌症，并且还没有药物被批准用于治疗这些癌症。RAS突变是癌症患者生存的阴性预测因子；当癌症患者的癌症有RAS突变时，所述患者具有更差的预后结果(或更短的总生存期)。因此，人们亟需与致癌RAS基因突变相关的癌症的更有效的治疗。
发明概述
一些实施方案涉及治疗以表达RAS蛋白的突变形式为特征的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
一些实施方案涉及治疗以表达KRAS蛋白的突变形式为特征的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
一些实施方案涉及治疗以表达NRAS蛋白的突变形式为特征的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
一些实施方案涉及抑制具有RAS突变的细胞增殖的方法，其包括使所述细胞与普那布林接触。
一些实施方案涉及诱导具有RAS突变的细胞凋亡的方法，其包括使所述细胞与普那布林接触。
一些实施方案涉及抑制对象中以表达RAS蛋白的突变形式为特征的癌症的进展的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
附图说明
图1a-1d显示模拟人类病理学的成胶质细胞瘤(GBM)的原神经基因工程鼠模型(GEMM)。图1a显示了展现肿瘤周围水肿的人GBM的T2MRI图像；图1b显示了显示了展现肿瘤周围水肿的小鼠GBM的T2MRI图像；图1c显示了GBM的H&E染色的人显微照片图像，显示标志性假性栅栏样坏死和微血管增生；图1d显示了GBM的H&E染色的小鼠显微照片图像，显示标志性假性栅栏样坏死和微血管增生。
图2显示用媒介物、替莫唑胺或分级辐射处理的患有PDGF诱导的神经胶质瘤的小鼠的肿瘤大小。
图3显示了对仅用媒介物、仅用多西紫杉醇以及用普那布林和多西紫杉醇的组合处理的小鼠进行尸检时的肿瘤重量。
图4显示了用对照和普那布林处理的患有以表达KRAS突变为特征的PDGF诱导的神经胶质瘤的小鼠的存活率。
图5显示了用普那布林、替莫唑胺和辐射的组合以及替莫唑胺和辐射的组合处理的患有以表达KRAS突变为特征的PDGF诱导的神经胶质瘤的小鼠的存活率。
图6显示在用媒介物对照、普那布林、伊立替康或普那布林和伊立替康的组合处理的小鼠的整个研究过程中，具有HCT-15(Kras突变G13D)人结肠肿瘤异种移植物的小鼠的肿瘤体积变化。
图7显示在用媒介物对照、普那布林、伊立替康或普那布林和伊立替康的组合处理的小鼠的整个研究过程中，具有Lovo(Kras突变,p.G13D)人结肠肿瘤异种移植物的小鼠的肿瘤体积变化。
优选实施方式详述
普那布林，即(3Z,6Z)-3-苯亚甲基-6-{[5-(2-甲基-2-丙基)-1H-咪唑-4-基]亚甲基}-2,5-哌嗪二酮，是天然化合物Phenylahistin的合成类似物。可根据美国专利第7,064,201号和第7,919,497号(将其通过引用整体并入本文)中详细描述的方法和步骤容易地制备普那布林。一些实施方案涉及普那布林在治疗与致癌的RAS突变相关的癌症中的用途。一些实施方案涉及普那布林在治疗对象中以表达RAS蛋白的突变形式为特征的癌症中的用途。一些实施方案涉及普那布林在抑制具有RAS突变的细胞的增殖中的用途。一些实施方案涉及普那布林在诱导具有RAS突变的细胞的凋亡中的用途。一些实施方案涉及普那布林在抑制对象中以表达RAS蛋白的突变形式为特征的癌症的进展中的用途。在一些实施方案中，所述RAS蛋白是KRAS蛋白。在一些实施方案中，所述RAS蛋白是NRAS蛋白。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。所有专利、申请、公开的申请和其它出版物均通过引用整体并入本文。如果本文中有一个术语的多个定义，除非另有说明，否则以本节中的定义为准。
如本文所用，“对象”意指人或非人哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物或鸟如鸡，以及任何其它脊椎动物或无脊椎动物。
术语“哺乳动物”以其通常的生物学意义使用。因此，其具体包括但不限于：灵长类动物(包括类人猿(黑猩猩、猿、猴)和人)、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、啮齿动物、大鼠、小鼠、豚鼠等。
如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是指治疗剂的量，其在一定程度上有效地缓解或降低疾病或病况的一种或多种症状发作的可能性，并且包括治愈疾病或病况。
如本文所用，“治疗”(treat/treatment/treating)是指向对象施用化合物或药物组合物以用于预防和/或治疗目的。术语“预防性治疗”是指治疗尚未表现出疾病或病况的症状但是易患或以其它方式具有特定疾病或病况风险的对象，从而该治疗降低患者将来发展疾病或病况的可能性。术语“治疗性治疗”是指对已经罹患疾病或病况的对象进行治疗。
术语“药学可接受的盐”是指这样的盐，其保留了化合物的生物学效力和性质，并且不是生物学上或在其它方面不期望用于药物中。在许多情况下，由于氨基和/或羧基或与其相似的基团的存在，本文公开的化合物能够形成酸式盐和/或碱式盐。可以用无机酸和有机酸形成药学可接受的酸加成盐。可以衍生出盐的无机酸包括，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生出盐的有机酸包括，例如醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。也可以使用无机碱和有机碱形成药学可接受的盐。可以衍生出盐的无机碱包括，例如含有钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等的碱；特别优选为铵、钾、钠、钙和镁盐。在一些实施方案中，用无机碱处理本文公开的化合物导致来自化合物的不稳定氢的丢失以提供包括无机阳离子，如Li+、Na+、K+、Mg2+和Ca2+等的盐形式。可以衍生出盐的有机碱包括，例如伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然产生的取代的胺)、环胺、碱离子交换树脂等，具体地如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。许多此类盐为本领域已知的，如1987年9月11日公开的Johnston等的WO 87/05297中所述(通过引用整体并入本文中)。
在一些实施方案中，组合物还可以包含一种或多种药学可接受的稀释剂。在一些实施方案中，药学可接受的稀释剂可以包括(聚乙二醇(15)-羟基硬脂酸酯)。在一些实施方案中，药学可接受的稀释剂可以包括丙二醇。在一些实施方案中，药学可接受的稀释剂可以包括kolliphor和丙二醇。在一些实施方案中，药学可接受的稀释剂可以包括kolliphor和丙二醇，其中基于稀释剂的总重量，kolliphor为约40重量％，并且丙二醇为约60重量％。在一些实施方案中，组合物还可以包含一种或多种其它药学可接受的赋形剂。
可以使用标准的药物制剂技术，如Remington's The Science and Practice ofPharmacy,21st Ed.,Lippincott Williams&Wilkins(2005)中公开的那些(将其通过引用整体并入本文)制备本文所述的药物组合物。因此，一些实施方案包括药物组合物，其包含：(a)安全和治疗有效量的普那布林或其药学可接受的盐；以及(b)药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合。
其它实施方案包括在分别的组合物或同一组合物中共同施用普那布林和另外的治疗剂。因此，一些实施方案包括第一药物组合物以及第二药物组合物，所述第一药物组合物包含：(a)安全和治疗有效量的普那布林或其药学可接受的盐，以及(b)药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合；所述第二药物组合物包含：(a)安全和治疗有效量的另外的治疗剂，以及(b)药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合。一些实施方案包括药物组合物，其包含：(a)安全和治疗有效量的普那布林或其药学可接受的盐；(b)安全和治疗有效量的另外的治疗剂；以及(c)药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或它们的组合。
可以经由任何一种可以接受的适用于类似用途的试剂的施用模式施用本文所述的药物组合物，所述施用模式包括但不限于：口服、舌下、口腔、皮下、静脉内、鼻内、局部、经皮、皮内、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道、直肠或眼内。在治疗适应症(其为优选实施方案的对象)中，口服和肠胃外施用是常用的。
术语“药学可接受的载体”或“药学可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性成分不相容的情形之外，本文预期其在治疗组合物中的用途。此外，可以包括例如本领域常用的各种佐剂。以下描述了将各种组分包含于药物组合物的考虑，例如，Gilman等(Eds.)(1990)；Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Basis of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press，将其通过引用整体并入本文。
可以作为药学可接受的载体或其组分的物质的一些实例为：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如TWEENS；润湿剂，如十二烷基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水和磷酸盐缓冲溶液。
本文所述的组合物优选以单位剂型提供。如本文所用，“单位剂型”是根据良好医疗实践(good medical practice)的以下组合物：其包含的化合物或组合物的量适于以单一剂量向动物、优选哺乳动物对象施用。然而，单一或单位剂型的制剂并不意味着该剂型每天施用一次或每个疗程施用一次。预期这种剂型以每天一次、两次、三次或更多次施用，和可以以输注一段时间施用(例如，约30分钟至约2-6小时)，或作为连续输注施用，以及可以在治疗过程期间给药不止一次，尽管没有特别排除单一施用。本领域技术人员应认识到，该制剂没有具体预期整个治疗过程，并且将这些决定留给治疗领域而不是制剂领域的技术人员。
如上所述有用的组合物可以是用于多种施用途径的多种合适形式中的任何一种，例如用于口服、舌下、口腔、鼻、直肠、局部(包括透皮和皮内)、眼、脑内、颅内、鞘内、动脉内、静脉内、肌肉内施用，或其它肠胃外施用途径。本领域技术人员应理解，口服和鼻用组合物包括通过吸入施用并以可用的方法制备的组合物。根据所需的特定施用途径，可以使用本领域众所周知的多种药学可接受的载体。药学可接受的载体包括例如，固体或液体填充剂、稀释剂、水溶助剂、表面活性剂和封装物质。可以包括任选的药物活性物质，其不会实质上干扰化合物或组合物的活性。与化合物或组合物结合使用的载体的量足以提供用于每单位剂量的化合物施用的实际量的材料。制备可用于本文所述方法的剂型的技术和组合物描述于以下文献(将其全部通过引用并入本文)：Modern Pharmaceutics,4th Ed.,Chapters9and 10(Banker&Rhodes,editors,2002)；Lieberman等,Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets(1989)；和Ansel,Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 8th Edition(2004)。
可以使用各种口服剂型，包括诸如片剂、胶囊(例如液体凝胶胶囊和固体凝胶胶囊)、颗粒剂和散装粉末的固体形式。片剂可以为压缩的、研磨片剂、包有肠溶衣、糖衣、薄膜包衣或多次压缩的，其含有合适的粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、调味剂、流动诱导剂和熔化剂。液体口服剂型包括水溶液、乳液、悬浮液、由非泡腾颗粒重新构成的溶液和/或悬浮液，以及由泡腾颗粒重新构成的泡腾制剂，该剂型中含有合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、熔化剂、着色剂和调味剂。
适于制备经口施用的单位剂型的药学可接受的载体为本领域众所周知的。片剂通常包含作为惰性稀释剂的常规药学上相容的佐剂，如碳酸钙、碳酸钠、甘露糖醇、乳糖和纤维素；粘合剂，如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂，如淀粉、海藻酸和交联羧甲纤维素；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。诸如二氧化硅的助流剂可以用于改善粉末混合物的流动特性。为了外观，可以添加着色剂，如FD&C染料。甜味剂和调味剂，如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷和水果香料是咀嚼片的有用的佐剂。胶囊通常包含一种或多种上文公开的固体稀释剂。载体组分的选择取决于次要考虑因素，如味道、成本和贮存稳定性，这不是关键的并且可以由本领域技术人员容易地进行。
口服组合物还可以包含液体溶液、乳剂、悬浮液等。适于制备此类组合物的药学可接受的载体为本领域众所周知的。用于糖浆、酏剂、乳剂和悬浮液的载体的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于悬浮液，典型的悬浮剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、AVICEL RC-591、黄蓍胶和海藻酸钠；典型的润湿剂包括卵磷脂和聚山梨醇酯80；典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。口服液体组合物还可以含有诸如上文公开的甜味剂、调味剂和着色剂中的一种或多种组分。
此类组合物也可以通过常规方法进行包衣，通常使用pH或时间依赖性包衣，使得主题组合物在期望的局部应用附近的胃肠道中释放，或者在不同时间释放以延长期望的作用。这种剂型通常包括但不限于以下的一种或多种：乙酸邻苯二甲酸纤维素、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙基纤维素、Eudragit包衣、蜡和虫胶。
本文描述的组合物可以任选地包括其它药物活性物质。
用于实现全身递送主题化合物的其它组合物包括舌下、口腔和鼻用剂型。此类组合物通常包含一种或多种可溶性填料物质，如蔗糖、山梨糖醇和甘露糖醇；以及粘合剂，如阿拉伯树胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。也可以包括上文公开的助流剂、润滑剂、甜味剂、着色剂、抗氧化剂和调味剂。
配制液体组合物(将其配制为用于局部眼科应用)使得其可以向眼睛局部施用。应当尽可能使舒适感最大化，但有时出于配制考虑(例如药物稳定性)可能无法达到最佳舒适感。在不能将舒适感最大化的情况下，可以将其配制成液体，这样液体对局部眼科应用的患者而言是可容忍的。另外，眼科可接受的液体可以被包装成单次使用，或含有防腐剂以预防经多次使用污染。
对于眼科应用，通常用生理盐水溶液作为主要媒介物制备溶液或药物。可以优选用适当的缓冲系统使眼科溶液保持舒适的pH。制剂还可以含有常规的药学可接受的防腐剂、稳定剂和表面活性剂。
可以用于本文公开的药物组合物的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、PHMB、氯丁醇、硫柳汞、醋酸苯汞和硝酸苯汞。有用的表面活性剂为例如Tween 80。同样地，多种有用的媒介物可以用于本文所公开的眼科制剂中。这些媒介物包括但不限于聚乙烯醇、聚维酮、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和纯化水。
可以根据需要或便利添加张力调节剂。它们包括但不限于盐(尤其是氯化钠、氯化钾)、甘露糖醇和甘油，或任何其它合适的眼科可接受的张力调节剂。
可以使用多种用于调节pH的缓冲液和方法，只要所得的制剂是眼科可接受的。对于许多组合物，pH为4至9。因此，缓冲液包括醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液。根据需要，可以用酸或碱调节这些制剂的pH。
眼科可接受的抗氧化剂包括但不限于焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基羟基茴香醚和丁羟甲苯。
可以包含在眼科制剂中的其它赋形剂组分为螯合剂。有用的螯合剂为依地酸二钠(EDTA)，但是还可以用其它螯合试剂代替它或与其结合。
对于局部应用，可以使用包含本文所公开的组合物的乳膏剂、软膏剂、凝胶、溶液或悬浮液等。局部制剂可以通常由药物载体、共溶剂、乳化剂、渗透促进剂、防腐剂系统和软化剂组成。
对于静脉内施用，可以将本文所述的组合物溶解或分散在药学可接受的稀释剂(如盐水或葡萄糖溶液)中。还可以包含合适的赋形剂以达到期望的pH，其包括但不限于NaOH、碳酸钠、醋酸钠、HCl和柠檬酸。在多种实施方案中，最终组合物的pH为2至8，或优选4至7。抗氧化剂赋形剂可以包括亚硫酸氢钠、丙酮合亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、硫脲和EDTA。可见于最终静脉内组合物中的合适的赋形剂的其它非限制性实例可以包括磷酸钠或磷酸钾、柠檬酸、酒石酸、明胶和诸如葡萄糖、甘露糖醇和葡聚糖的碳水化合物。其它可接受的赋形剂在以下中有所描述：Powell等，Compendium of Excipients for ParenteralFormulations,PDA J Pharm Sci and Tech 1998,52 238-311和Nema等，Excipients andTheir Role in Approved Injectable Products:Current Usage and FutureDirections,PDA J Pharm Sci and Tech 2011,65 287-332，两者通过引用整体并入本文中。还可以包含抗微生物试剂以获得抑制细菌的或抑制真菌的溶液，其包括但不限于硝酸苯汞、硫柳汞、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯酚、甲酚和氯丁醇。
可以以一种或多种固体形式向护理人员提供用于静脉内施用的组合物，在施用之前可以立即用合适的稀释剂如无菌水、盐水或葡萄糖水溶液复水。在其它实施方案中，以准备好的溶液形式提供组合物以进行肠胃外施用。在其它实施方案中，以在施用之前需进一步稀释的溶液形式提供组合物。在包括施用本文所述的化合物与其它试剂的组合的实施方案中，作为混合物向护理人员提供该组合，或护理人员在施用之前混合两种试剂，或可以单独地施用两种试剂。
本文所述活性化合物的实际剂量取决于具体化合物和待治疗的病况；适当剂量的选择完全在本领域技术人员的知识范围之内。在一些实施方案中，普那布林或其它治疗剂的单次剂量可以为：约5mg/m2至约150mg/m2体表面积、约5mg/m2至约100mg/m2体表面积、约10mg/m2至约100mg/m2体表面积、约10mg/m2至约80mg/m2体表面积、约10mg/m2至约50mg/m2体表面积、约10mg/m2至约40mg/m2体表面积、约10mg/m2至约30mg/m2体表面积、约13.5mg/m2至约100mg/m2的体表面积、约13.5mg/m2至约80mg/m2体表面积、约13.5mg/m2至约50mg/m2体表面积、约13.5mg/m2至约40mg/m2体表面积、约13.5mg/m2至约30mg/m2体表面积、约15mg/m2至约80mg/m2体表面积、约15mg/m2至约50mg/m2体表面积、或约15mg/m2至约30mg/m2体表面积。在一些实施方案中，普那布林或其它治疗剂的单次剂量可以为：约13.5mg/m2至约30mg/m2体表面积。在一些实施方案中，普那布林或其它治疗剂的单次剂量可以为：约5mg/m2、约10mg/m2、约12.5mg/m2、约13.5mg/m2、约15mg/m2、约17.5mg/m2、约20mg/m2、约22.5mg/m2、约25mg/m2、约27.5mg/m2、约30mg/m2、约40mg/m2、约50mg/m2、约60mg/m2、约70mg/m2、约80mg/m2、约90mg/m2或约100mg/m2体表面积。
在一些实施方案中，普那布林或其它治疗剂的单次剂量可以为：约5mg至约300mg、约5mg至约200mg、约7.5mg至约200mg、约10mg至约100mg、约15mg至约100mg、约20mg至约100mg、约30mg至约100mg、约40mg至约100mg、约10mg至约80mg、约15mg至约80mg、约20mg至约80mg、约30mg至约80mg、约40mg至约80mg、约10mg至约60mg、约15mg至约60mg、约20mg至约60mg、约30mg至约60mg、或约40mg至约60mg。在一些实施方案中，普那布林或其它治疗剂的单次剂量可以为：约20mg至约60mg、约27mg至约60mg、约20mg至约45mg，或约27mg至约45mg。在一些实施方案中，普那布林或其它治疗剂的单次剂量可以为：约5mg、约10mg、约12.5mg、约13.5mg、约15mg、约17.5mg、约20mg、约22.5mg、约25mg、约27mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约125mg、约150mg，或约200mg。
只要肿瘤保持在控制之下并且方案是临床上耐受的，施用周期可以是多周治疗周期。在一些实施方案中，单剂量的普那布林或其它治疗剂可以每周施用一次，优选在三周(21天)治疗周期的每个第1天和第8天施用一次。在一些实施方案中，单剂量的普那布林或其它治疗剂可以在一周、两周、三周、四周或五周治疗周期期间以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天进行施用。可以在治疗周期的每周中的同一天或不同天施用。。
只要方案为临床上耐受的，就可以重复治疗周期。在一些实施方案中，重复n次治疗周期，其中n为2至30的整数。在一些实施方案中，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，新的治疗周期可以在先前的治疗周期完成之后立即发生。在一些实施方案中，新的治疗周期可以在先前的治疗周期完成之后的一段时间内发生。
在一些实施方案中，本文所述的组合物可以与其它治疗剂组合使用。在一些实施方案中，本文所述的组合物可以与诸如化学疗法、放射疗法和生物疗法的治疗组合施用或使用。
治疗方法
一些实施方案涉及治疗以表达RAS蛋白的突变形式为特征的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。一些实施方案涉及治疗与致癌的RAS突变相关的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
在一些实施方案中，所述RAS蛋白的突变形式是KRAS、NRAS或HRAS蛋白的突变形式。在一些实施方案中，所述RAS蛋白是KRAS、NRAS或HRAS蛋白。在一些实施方案中，所述RAS的突变形式是KRAS蛋白的突变形式。在一些实施方案中，所述RAS的突变形式是NRAS蛋白的突变形式。在一些实施方案中，所述RAS基因突变是KRAS基因突变。在一些实施方案中，所述RAS基因突变是NRAS基因突变。
一些实施方案涉及治疗以表达KRAS蛋白的突变形式为特征的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。一些实施方案涉及治疗与致癌的KRAS突变相关的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
一些实施方案涉及治疗以表达NRAS蛋白的突变形式为特征的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。一些实施方案涉及治疗与致癌的NRAS突变相关的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
本发明的一些实施方案包括用本文所述的普那布林和包含普那布林的组合物治疗癌症的方法。一些方法包括向有需要的对象施用本文所述的化合物、组合物、药物组合物。在一些实施方案中，对象可以为动物，例如哺乳动物、人。
在一些实施方案中，所述癌症选自：结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃肠癌、腹膜癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、脑转移瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴瘤、骨髓瘤和头颈癌。在一些实施方案中，所述癌症选自：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌、结肠癌、子宫内膜癌和肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症选自：结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肾癌和成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自：非小细胞肺癌、胰腺癌和成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，KRAS包括在选自密码子12、13、59和61的一个或多个位置处的突变。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式在选自G12、G13、S17、P34、A59和Q61的一个或多个氨基酸位置处具有突变。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、A59E、A59G、A59T、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式在选自G12、G13、A59、Q61、K117和A146的一个或多个氨基酸位置处具有突变。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、A59E、A59G、A59T、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、K117R、K117E、A146P、A146T和A146V。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式在选自G12、G13、A59和Q61的一个或多个氨基酸位置处具有突变。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、A59E、A59G、A59T、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式在选自G12、G13和D153的一个或多个氨基酸位置处具有突变。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12A、G12C、G12D、G12V、G12S、G13D和D153V。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12S和D153V。
在一些实施方案中，NRAS包括在选自密码子12、13、59、61和146的一个或多个位置处的突变。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式在选自G12、G13、A59、Q61、K117和A146的一个或多个氨基酸位置处具有突变。在一些实施方案中，所述KRAS蛋白的突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、A59D、A59T、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、K117R、K117E、A146P、A146T和A146V。在一些实施方案中，所述NRAS蛋白的突变形式在Q61或A146的一个或多个氨基酸位置具有突变。在一些实施方案中，所述NRAS蛋白的突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：Q61K、Q61H、Q61R、Q61L、Q61N、Q61E、Q61P、A146T、A146P、A146V，以及它们的任意组合。在一些实施方案中，所述NRAS蛋白的突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：Q61H、Q61R、Q61L，以及它们的任意组合。
一些实施方案涉及抑制具有RAS突变的细胞增殖的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。一些实施方案涉及诱导具有RAS突变的细胞凋亡的方法，其包括使所述细胞与普那布林接触。在一些实施方案中，接触包括将普那布林施用于有需要的对象。一些实施方案涉及抑制对象中以表达RAS的突变形式为特征的癌症进展的方法，其包括使细胞与普那布林接触。在一些实施方案中，接触包括将普那布林施用于有需要的对象。
一些实施方案涉及抑制具有KRAS突变的细胞增殖的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。一些实施方案涉及诱导具有KRAS突变的细胞凋亡的方法，其包括使所述细胞与普那布林接触。一些实施方案涉及抑制对象中以表达KRAS的突变形式为特征的癌症进展的方法，其包括使细胞与普那布林接触。
一些实施方案涉及抑制具有NRAS突变的细胞增殖的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。一些实施方案涉及诱导具有NRAS突变的细胞凋亡的方法，其包括使所述细胞与普那布林接触。一些实施方案涉及抑制对象中以表达NRAS的突变形式为特征的癌症进展的方法，其包括使细胞与普那布林接触。
在一些实施方案中，所述对象是人。
其它实施方案包括向有需要的对象施用化合物的组合。组合可包括本文所述的化合物、组合物、药物组合物与另外的药物。
一些实施方案包括共同施用本文所述的化合物、组合物和/或药物组合物以及另外的药物。“共同施用”意指可同时在患者血液中存在两种或更多种试剂，不管它们实际上是何时或怎样被施用。在一个实施方案中，所述试剂是同时施用的。在一个这样的实施方案中，通过将所述试剂组合在单一剂型中来实现组合施用。在另一实施方案中，所述试剂是依次施用的。在一个实施方案中，所述试剂通过相同的途径如口服来施用。在另一实施方案中，所述试剂通过不同的途径施用，如一种口服施用，另一种静脉内施用。
本文所述的治疗方法可包括与另外的活性剂共同施用普那布林。在一些实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是多西紫杉醇，且所述癌症是人非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是贝伐单抗，且所述癌症是人非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是伊立替康，且所述癌症是结肠癌。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是替莫唑胺，且所述癌症是成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是伊立替康，且所述癌症是结肠癌。
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以为替莫唑胺、贝伐单抗、依维莫司、卡莫司汀、洛莫司汀、丙卡巴肼、长春新碱、伊立替康、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、依托泊苷、长春花碱、博来霉素、放线菌素、环磷酰胺或异环磷酰胺。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自：贝伐单抗、多西紫杉醇、伊立替康和替莫唑胺。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是多西紫杉醇。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是伊立替康。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是贝伐单抗。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是替莫唑胺。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是吉西他滨。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是卡莫司汀。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是洛莫司汀。
本文所述的治疗方法还可与放射疗法组合使用。
本文所述的方法还可以包括鉴定患有以表达突变型RAS蛋白为特征的癌症的患者。在一些实施方案中，鉴定患者可以包括确定患者是否具有RAS突变。一些实施方案涉及治疗被鉴定为具有RAS突变的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用药学有效量的普那布林，其中已经通过以下步骤鉴定了患者：(i)从患者收集样品；(ii)从所述样品中分离DNA；(iii)扩增分离的DNA中的RAS基因或其片段；和(iv)检测扩增的RAS基因中是否存在突变，从而确定患者是否具有以RAS突变为特征的癌症。用于检测RAS突变的方法的实例，包括但不限于：扩增阻滞突变系统(ARMS)PCR、BEAMing测定、数字PCR以及用于测序或PCR的其它合适的引物和探针。
本文所述的方法还可以包括鉴定患有以表达突变型KRAS为特征的癌症的患者。在一些实施方案中，鉴定患者可以包括确定患者是否具有KRAS突变。一些实施方案涉及治疗被鉴定为具有KRAS突变的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用药学有效量的普那布林，其中已经通过以下步骤鉴定了患者：(i)从患者收集样品；(ii)从所述样品中分离DNA；(iii)扩增分离的DNA中的KRAS基因或其片段；和(iv)检测扩增的KRAS基因中是否存在突变，从而确定患者是否具有以KRAS突变为特征的癌症。
本文所述的方法还可包括检测KRAS突变。在一些实施方案中，可从取自患者的病理学样品来检测例如在密码子12、13、59、61和/或146处的KRAS突变。在此类检测的一些实施方案中，从所述样品中取出DNA并利用PCR针对标记的寡核苷酸探针对其进行检测，以扩增靶向的突变DNA以允许检测。在一些实施方案中，商业性检测中心可进行该检测。在一些实施方案中，可使用检测试剂盒如TheraScreen:K-RAS突变试剂盒(DxS Ltd,48GraftonStreet,Manchester Ml 3 9XX,UK)。例如，TheraScreen试剂盒可检测到在K-RAS致癌基因的密码子12和13的突变：
GIy 12Asp(GGT>GAT)GIy 12Arg(GG1>CGT)
GIy 12Ala(GGT>GCT)GIy 12Cys(GGT>TGT)
GIy 12VaI(GGT>GTT)GIy 13Asp(GGOGAC)Glyl2Ser(GGT>AGT)
本文所述的方法还可以包括鉴定患有以表达突变型NRAS蛋白为特征的癌症的患者。在一些实施方案中，鉴定患者可以包括确定患者是否具有NRAS突变。一些实施方案涉及治疗被鉴定为具有NRAS突变的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用药学有效量的普那布林，其中已经通过以下步骤鉴定了患者：(i)从患者收集样品；(ii)从所述样品中分离DNA；(iii)扩增分离的DNA中的NRAS基因或其片段；和(iv)检测扩增的NRAS基因中是否存在突变，从而确定患者是否具有以NRAS突变为特征的癌症。
本文所述的方法还可包括检测NRAS突变。在一些实施方案中，可从取自患者的病理学样品来检测例如在密码子12、13、59、61和/或146处的NRAS突变。在此类检测的一些实施方案中，从所述样品中取出DNA并采用PCR针对标记的寡核苷酸探针对其进行检测，以扩增靶向的突变DNA以允许检测。可基于NRAS的密码子突变，设计一些用于测序或PCR的可商购试剂盒(参见Dxs Diagnostic Innovations,Applied Biosystems,and Questdiagnostics)、引物和探针。
本文所述的方法还可以包括鉴定患有以表达突变型HRAS蛋白为特征的癌症的患者。在一些实施方案中，鉴定患者可以包括确定患者是否具有HRAS突变。一些实施方案涉及治疗被鉴定为具有HRAS突变的患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者施用药学有效量的普那布林，其中已经通过以下步骤鉴定了患者：(i)从患者收集样品；(ii)从所述样品中分离DNA；(iii)扩增分离的DNA中的HRAS基因或其片段；和(iv)检测扩增的HRAS基因中是否存在突变，从而确定患者是否具有以HRAS突变为特征的癌症。
为了进一步说明本发明，包括以下实施例。这些实施例当然不应被解释为具体限制本发明。在权利要求范围内的这些实施例的变化在本领域技术人员的范围内，并且被视为落入本文所述和所要求保护的本发明范围内。读者会认识到借助本公开的技术人员和本领域技术人员能够准备和使用本发明而无需详尽的实例。
实施例
实施例1
所有细胞系在其各自适当的补充有2-10％FBS的生长培养基中生长，并于37℃放置在5％CO2的气氛中。
将细胞接种到96孔微量滴定板中的100μL体积的生长培养基中。然后将细胞于37℃湿润培养箱中孵育24小时。使用HP D300数字分配器实现了测试剂(普那布林)的剂量。简而言之，数字分配器将在DMSO溶剂中的测试剂(普那布林)以精确的体积添加到容纳有培养基的孔中。对照孔接受与测试剂(普那布林)孔所接受的等量的DMSO。加入测试剂后，将细胞以表1所示的浓度和稀释度暴露于37℃湿润培养箱中72小时。在暴露72小时后，除去普那布林和对照培养基，并向每个孔中加入200μl培养基和试剂的1:1混合物。将板于37℃湿润培养箱中孵育60分钟。孵育后，使用光度计记录发光。
表1：单个试剂细胞活力检测
1初步筛选后可改变浓度和稀释因子以优化曲线拟合。
2基于各自SOC的期望的活性选择高浓度。
数据表示为根据发光信号计算的未处理(媒介物)对照的细胞生长百分比。通过将用普那布林处理的样品的平均发光值，除以未处理的对照的平均发光值，来确定细胞的存活分数。使用Prism 6软件(GraphPad Software，Inc.)，通过使用非线性回归分析曲线拟合数据来估计普那布林处理的样品和对照的抑制浓度(IC50)值。
表2：具有RAS突变体的各种癌细胞系的普那布林IC50结果概要
如表2所示，作为单一活性剂的普那布林在低IC50浓度下对具有RAS突变(包括KRAS和NRAS突变)的各种肿瘤细胞系具有细胞毒性作用。
实施例2
在A549(KRAS G12S)人肺肿瘤异种移植模型中，测定了普那布林与多西紫杉醇的组合，并将其活性与标准化疗多西紫杉醇相比较。实验数据确定了普那布林与多西紫杉醇组合在A549模型中的潜在累加效应或协同效应。
A549人肺肿瘤异种移植模型
从Harlan公司(Madison,WI)获得重量约20g的5-6周龄的雌性裸鼠(nu/nu)。A549人肺肿瘤细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。A549人肺肿瘤细胞系在KRAS G12S有突变。肿瘤源于58岁的白种人男性的肺癌组织的外植体培养。将动物用套管针皮下(s.c.)植入从裸鼠宿主中皮下生长的肿瘤收获的A549人肿瘤癌的片段。当肿瘤大小约为46mg(接种后18天)时，将动物匹配成治疗组和对照组。阴性对照组含有8只肿瘤小鼠，其余各组均含有9只肿瘤小鼠。每只小鼠被耳标标记，并在整个实验中对其分别追踪。该研究是在非GLP设置下进行的。在匹配后的第1天给予初始剂量。以两种不同的计划腹膜内给药7.5mg/kg普那布林—第1、4、8、11和15天以及qdx5(每天一次剂量，持续5天)。合并12.5％二甲基亚砜(DMSO)、5％聚氧乙烯蓖麻油(cremophor)和82.5％花生油并腹膜内给药；按qdx5方案施用作为阴性对照。将多西紫杉醇(Aventis)在第1、3和5天以12.5mg/kg静脉内给药，腹膜内给药；100mg/kg wklyx3作为阳性对照。也将使用qdx5计划的7.5mg/kg普那布林以与单一药剂相同的剂量、途径和计划与多西紫杉醇组合施用。在普那布林和多西紫杉醇组合的组中，多西紫杉醇在普那布林前15-30分钟施用。
将普那布林称重，然后分别加入12.5％DMSO、5％聚氧乙烯蓖麻油和82.5％花生油。最后，将化合物通过涡旋混合并在1小时内注射。
每组包含八只小鼠。每周称重两次小鼠，从第1天开始，每周两次使用卡尺获得肿瘤测量值。将这些肿瘤测量值通过标准公式(W2×L)/2转化为mg肿瘤重量。当对照组肿瘤大小达到平均1克时，终止实验。终止后，称重小鼠，将其处死并切除其肿瘤。称重肿瘤，计算每组的平均肿瘤重量。在该模型中，从100％中减去平均治疗的肿瘤重量/平均对照肿瘤重量×100，获得了每组的肿瘤生长抑制(TGI)。使用GraphPad软件(Macintosh 3.0版)进行单尾t检验来计算p值。
在该肿瘤异种移植模型中，一些药剂可引起肿瘤的缩小。使用这些药剂，从第1天开始治疗时给定肿瘤的自身重量中减去该给定肿瘤的最终重量。将该差值除以初始肿瘤重量得到％消退。从经历肿瘤消退的组中的小鼠数据，计算平均％肿瘤消退。
阴性对照和阳性对照
阴性对照组在第56天的最终平均肿瘤重量为870.4mg±305.1。多西紫杉醇(12.5mg/kg；静脉内(i.v.)；第1、3、5天)作为研究的阳性对照，最终平均肿瘤重量分别为655.1mg±109.2和691.4±175.8。与媒介物对照组相比，这导致多西紫杉醇的TGI为26.1％，其处在过去进行的A549研究中观察到的预期活性范围内。在多西紫杉醇或伊立替康组中，没有观察到毒性死亡。
多西紫杉醇组中的动物经历了一些体重减轻。在第11天，初始平均体重减轻记录为2.7％。到第22天，动物恢复其体重，并显示出15.4％的阳性体重增加。在阳性对照组中，没有观察到毒性死亡。
普那布林和多西紫杉醇的组合
在第1-5天腹膜内给药7.5mg/kg普那布林导致1525.7mg±355.3的平均最终肿瘤重量。普那布林(7.5mg/kg；第1-5天)和多西紫杉醇(12.5mg/kg；静脉内；第1、3、5天)组合的组，在第56天具有265.8mg±113.1的最终平均肿瘤重量。这导致74.3％的TGI。该组合优于多西紫杉醇治疗组，其具有655.1mg±109的平均最终肿瘤重量，在组合的组与多西紫杉醇单一药剂组之间的差异具有统计学意义(p<0.05)。
在普那布林单一药剂组中的动物经历了体重增加。在第11天和第22天，平均体重增加分别记录为10.6％和21.8％。在该剂量组中没有观察到毒性死亡。在组合的组中的动物经历了体重减轻。在第11天，初始平均体重减轻记录为2.7％。到第22天，动物恢复其体重并显示出16％的体重增加。
在评估的剂量水平和给药计划上，以普那布林作为单一药剂的动物没有经历毒性。在所有5项研究中，以单一药剂施用时，普那布林组仅发生一例死亡。图3显示，当通过腹膜内途径组合使用普那布林(7.5mg/kg)与多西紫杉醇(12.5mg/kg)时，对小鼠进行尸检时的肿瘤重量。对于A549肺肿瘤模型，普那布林与多西紫杉醇的组合相比单独的多西紫杉醇(74.3％相对于26.1％)显示了具有统计学意义的(p<0.05)TGI的增加。结果表明，在A549(KRAS G12S)人肺肿瘤异种移植模型中，与多西紫杉醇作为单一药剂相比，普那布林与多西紫杉醇的组合具有强烈的肿瘤生长抑制作用，显示了普那布林与多西紫杉醇的组合具有潜在的累加效应或协同效应。
实施例3
所用的小鼠神经胶质瘤模型是PDGF驱动的神经胶质瘤的GEMM，其模拟成胶质细胞瘤(GBM)的原神经分子亚组。该模型基于体细胞特异性基因转移；具有复制能力的ALV-剪接受体(RCAS)逆转录病毒系统，允许以细胞类型特异性方式在紧密调节的分化窗口内滴注特定的遗传改变。RCAS/tv-a系统使用RCAS逆转录病毒载体来感染基因工程化的小鼠，以在特定细胞群体中表达RCAS受体(tv-a)。这里，通过RCAS介导的PDGF转移到脑中表达巢蛋白的细胞以产生神经胶质瘤。巢蛋白在脑中的干细胞/祖细胞群体中表达，并且已被证明是人和小鼠脑肿瘤中位于血管周围区域(PVN)的癌症干细胞的标志物。PDGF驱动的神经胶质瘤与Ink4a-arf-/-缺失组合时，在感染后4-5周后具有完全的外显率。这些肿瘤接近地模拟GBM的“原神经”亚型，其中在56％的“原神经”人神经胶质瘤中观察到CDKN2A(编码p16INK4A和p14ARF)的缺失。如图1a至1d所示，在该GEMM中重现了限定人神经胶质瘤的肿瘤细胞结构(如Scherer结构)、微血管增生和假性栅栏样坏死。此外，神经胶质瘤细胞沿着白质轨迹迁移，包围神经元和血管并在软膜下空间的脑部边缘积聚。在这方面，PDGF驱动的神经胶质瘤的GEMM与PN-GBM非常相似，代表了用于定义肿瘤微环境中的肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的相互作用的极好的实验系统。
如图2所示，使用PDGF诱导的神经胶质瘤模型确定对辐射和替莫唑胺的响应。通过症状鉴定神经胶质瘤小鼠，并通过T2加权的MRI验证。将这些小鼠每天用媒介物、25mg/kg的替莫唑胺处理持续12天，或者以每周5天每天2Gy的剂量进行分级辐射持续2周(总共20Gy)。图2中上部两个图像显示未经处理的(媒介物)肿瘤的生长；相比之下，替莫唑胺处理的和辐射的肿瘤在相同时间段内的体积缩小。这些肿瘤在治疗后复发，并且所有动物死于复发性肿瘤，如在这些相应的小鼠群组的存活曲线中可以看到的。用辐射和替莫唑胺处理的检测数据说明：1)在该小鼠模型中进行试验，2)这些处理对小鼠存活的影响反映了人的状况，3)所有小鼠死于疾病，以及4)这些鼠群组的相对均一的结果支持使用这种实验范例来检测该研究中的存活差异。
产生了使用上述程序制备的PDGF诱导的神经胶质瘤模型。小鼠为转基因的，用于从巢蛋白启动子表达RCAS受体(tv-a)并具有ink4a/arf-/-和lox-stop-lox荧光素酶背景，感染有RCAS-PDGF和表达G12D突变的KRAS的RCAS-KRAS。所产生的肿瘤在起初的3-4周出现。肿瘤具有GBM的组织学特征，可以通过嗜睡和差的理毛的症状、使用T2加权序列的MRI扫描或使用IVIS系统的生物发光成像进行鉴定。处理组(KRAS肿瘤)中的小鼠经腹膜内施用7.5mg/kg普那布林，每周2次持续10周；对照组中的小鼠仅施用普那布林稀释剂(40wt％Kolliphor和60wt％丙二醇)。这些处理的小鼠开始体重增加，并在几天内显示改善的症状。
用表达G12D突变的KRAS的PDGF诱导的神经胶质瘤小鼠测试了普那布林。用异氟烷麻醉4-6周龄的nestin-tv-a/ink4a-arf-/-小鼠，并向其注入转染了RCAS-PDGF-B-HA、RCAS-KRAS的Df-1细胞。使用立体定向框架，通过连接到汉密尔顿(Hamilton)注射器的26G针向小鼠注射1微升2X105的RCAS-PDGF-B-HA/RCAS-KRAS的1:1混合物。将细胞注射到右额叶皮质，坐标为前囱1.75mm，Lat-0.5mm，深度2mm。仔细监测小鼠的体重减轻，并在连续2天总共失去>0.3克或显示肿瘤的外部迹象时，对所述小鼠进行研究。小鼠进入研究组，并如上文所述用普那布林或普那布林稀释液进行处理，同时连续监测嗜睡、驼背姿势、食欲减少、肿瘤生长的外在迹象、躁动、体重减轻和总体未能茁壮成长。当小鼠失去超过20％的体重、失去可动性、不能进食或对于雄性，称重小于14克/对于雌性，称重小于12克时，处死小鼠。使用CO2处死小鼠；收获脑部并将其在10％中性缓冲福尔马林中储存O/N，然后用Flex 80代替并在4度储存。
图4显示了具有G12D Kras突变的成胶质细胞瘤的小鼠的存活率。如图4所示，与对照组相比，普那布林处理组中具有PDGF诱导的成胶质细胞瘤模型的小鼠具有显著较好的存活率(p＝0.001)。
实施例4
使用实施例3的程序制备表达G12D突变的KRAS的PDGF诱导的神经胶质瘤小鼠，并将其用于本实验中。用异氟烷麻醉4-6周龄的nestin-tv-a/ink4a-arf-/-小鼠，并向其注入转染了RCAS-PDGF-B-HA、RCAS-KRAS的Df-1细胞。使用立体定向框架，通过连接到汉密尔顿注射器的26G针向小鼠注射1微升的2X105的RCAS-PDGF-B-HA/RCAS-KRAS的1:1混合物。将细胞注射到右额叶皮质，坐标为前囱1.75mm，Lat-0.5mm，深度2mm。仔细监测小鼠的体重减轻，并在连续2天总共失去>0.3克或显示肿瘤的外部迹象时，对所述小鼠进行研究。
小鼠进入两个研究组。一组用替莫唑胺(TMZ)、辐射与普那布林的组合处理：辐射以10gy x1给予，TMZ和普那布林稀释液中的普那布林(7.5mg/kg)经腹膜内施用，周一和周四每周两次持续10周。另一组(对照组)用TMZ和辐射的组合处理：辐射以10gy x1给予，TMZ经腹膜内施用，周一和周四每周两次持续10周。监测小鼠的嗜睡、驼背姿势、食欲减少、肿瘤生长的外在迹象、躁动、体重减轻和总体未能茁壮成长。当小鼠失去超过20％的体重、失去可动性、不能进食或对于雄性，称重小于14克/对于雌性，称重小于12克时，处死小鼠。使用CO2处死小鼠；收获脑部并将其在10％中性缓冲福尔马林中储存O/N，然后用Flex 80代替并在4度储存。如图5所示，与接受TMZ和辐射的对照组相比，普那布林、TMZ和辐射处理组中具有PDGF诱导的成胶质细胞瘤模型的小鼠具有显著较好的存活率(p＝0.0149)。
实施例5
在HCT-15(KRAS突变G13D；P53突变S241F)人结肠肿瘤异种移植模型中，测定了普那布林和伊立替康的组合，并将其活性与标准化学治疗的伊立替康进行比较。实验数据确定了普那布林与伊立替康的组合在HCT-15模型中的协同效应。
HCT-15人结肠肿瘤异种移植模型
雌性无胸腺裸鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu)由Harlan(Indianapolis，IN)提供。在4周龄时接受小鼠。所有小鼠在处理前均使其适应新环境。从ATCC(Manassas，VA)接收HCT-15人结肠肿瘤细胞系。将培养物保持在补充有10％胎牛血清(FBS；Seradigm；Radnor,PA)的RPMI-1640(Lonza；Walkersville，MD)中，并置于5％CO2气氛中。在组织培养瓶中将培养物以1:10分流比扩增，直到收获足够量的细胞。HCT-15人结肠肿瘤细胞系在KRAS G13D和P53S241F具有突变。
将雌性小鼠用0.1ml含有HCT-15肿瘤细胞(5×106个细胞/小鼠)悬浮液的50％介质(Media)/50％基质胶(Matrigel)的混合物在皮下右侧腹部接种。
将普那布林(80mg/20mL，于40％Soltol:60％丙二醇中)在无菌的5％葡萄糖溶液中稀释至0.75mg/mL的浓度。将普那布林以7.5mg/kg经腹膜内施用，每周两次，直到研究结束。将普那布林媒介物(40％soltol:60％丙二醇)以与普那布林相同的比例稀释在无菌的5％葡萄糖溶液中，并用作阴性对照。将伊立替康(Teva Pharmaceuticals(Irvine，CA))在0.9％氯化钠溶液中稀释至10mg/ml的浓度，以10ml/kg剂量体积递送100mg/kg的剂量。伊立替康以100mg/kg的剂量经腹膜内给药，每周一次持续三周，作为阳性对照。普那布林也以与单一药剂相同的剂量、途径和计划与伊立替康组合施用。在普那布林和伊立替康组合的组中，伊立替康在普那布林前120分钟施用。
接种后7天，使用数字卡尺测量肿瘤。卡尺用于测量肿瘤的宽径和长径。使用动物研究管理软件(Study Director V.2.1.1)(研究日志)数字化地记录测量值。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(a×b2/2)，其中‘b’是最小直径，‘a’是最大直径1。通过使用Study Director软件随机平衡，将肿瘤大小为104-125mm3的40只小鼠随机分为四组，每组10只小鼠，每组具有约112mm3的平均肿瘤大小(第一天)。当小鼠被随机化时，此后每周取出两次，记录肿瘤体积和体重。每天进行临床观察。
当对照组肿瘤大小达到平均1克时，终止实验。终止后，称重小鼠，将其处死并切除其肿瘤。称重肿瘤，计算每组的平均肿瘤重量以及对肿瘤坏死进行视觉评估。
第27天(研究的最后一天)计算平均肿瘤生长抑制(TGI)。异种移植研究中的所有统计学分析采用Prismv6.00软件进行。使用方差分析(ANOVA)检验来确认第27天肿瘤体积的差异。
阴性对照和阳性对照
阴性对照组在第27天的最终平均肿瘤体积为1701.4mm3±178.0。伊立替康(100mg/kg；腹膜内；第1、8、15天)作为研究的阳性对照，最终平均肿瘤体积为1196.2mm3±121.7。与媒介物阴性对照组相比，这导致伊立替康的TGI为31.8％。在阴性对照组或阳性组中没有观察到毒性死亡。
用媒介物阴性对照、普那布林和伊立替康的处理均为良好耐受的。在研究的最后几天，媒介物对照组和普那布林组发生一些轻度的体重减轻，但体重减轻并不显著。临床观察主要由肿瘤坏死组成，这是该肿瘤模型的典型特征。用普那布林和伊立替康的组合处理为相当良好耐受的，观察到中度的体重减轻。
普那布林(7.5mg/kg；第1-5天)和伊立替康(100mg/kg，第1、8和15天)组合的组，在第27天具有766.8mm3±84.2的最终平均肿瘤体积。这导致TGI为58.8％。该组合优于伊立替康处理组，其平均最终肿瘤体积为1196.2mm3±121.7，该组合的组与伊立替康单一药剂组之间的差异有统计学意义(p<0.05)。
在评估的剂量水平和计划中，采用普那布林作为单一药剂时动物没有经历毒性。图6显示了当普那布林(7.5mg/kg)与伊立替康(100mg/kg)通过腹膜内途径联用时，在小鼠研究过程中的肿瘤体积。对于HCT-15结肠肿瘤模型，普那布林和伊立替康的组合相比单独的伊立替康(58.8％相对于31.8％)，显示了具有统计学意义的(p<0.05)TGI的增加。结果表明，与伊立替康作为单一药剂相比，普那布林和伊立替康的组合具有强烈的肿瘤生长抑制作用，显示了普那布林与伊立替康联用在HCT-15(KRAS G13D)人结肠肿瘤异种移植模型中具有潜在的累加效应或协同效应。
实施例6
在LoVo(KRAS突变p.G13D)人结肠肿瘤异种移植模型中，测试了普那布林和伊立替康的组合，并将其活性与单独的伊立替康进行了比较。实验数据确定了普那布林与伊立替康联用在LoVo模型中的潜在累加效应或协同效应。
LoVo人结肠肿瘤异种移植模型：雌性无胸腺裸鼠(Hsd：Athymic Nude-Foxn1nu)由Harlan(Indianapolis，IN)提供。在4周龄时接受小鼠。所有小鼠在处理前均使其适应新环境。从ATCC(Manassas，VA)接收LoVo人结肠肿瘤细胞系。将培养物保持在补充有10％胎牛血清(FBS；Seradigm；Radnor，PA)的F12-K(Corning/Cellgro，Manassas，VA)中，并置于5％CO2气氛中。在组织培养瓶中将培养物以1:3的分流比扩增，直到收获足够量的细胞。LoVo人结肠肿瘤细胞系在KRAS p.G13D具有突变。
将雌性小鼠用0.1ml含有LoVo肿瘤细胞(1×107个细胞/小鼠)悬浮液的50％介质/50％基质胶的混合物在皮下右侧腹部接种。
将普那布林(80mg/20mL，于40％Solutol：60％丙二醇中)在无菌的5％葡萄糖溶液中稀释至0.75mg/mL的浓度。将普那布林以7.5mg/kg经腹膜内施用，每周两次，直到研究结束。将普那布林媒介物(40％soltol：60％丙二醇)以与普那布林相同的比例稀释在无菌的5％葡萄糖溶液中，并用作阴性对照。伊立替康(Teva Pharmaceuticals(Irvine，CA))在0.9％氯化钠溶液中稀释至10mg/ml的浓度，以10ml/kg的剂量体积递送100mg/kg的剂量。伊立替康以80mg/kg的剂量经腹膜内给药，每周一次，持续三周，作为阳性对照。普那布林也以与各单一药剂相同的剂量、途径和计划与伊立替康组合施用。在普那布林和伊立替康组合的组中，伊立替康在普那布林前120分钟施用。
接种后7天，使用数字卡尺测量肿瘤。卡尺用于测量肿瘤的宽径和长径。使用动物研究管理软件(Study Director V.2.1.1)(研究日志)数字化地记录测量值。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(a×b2/2)，其中‘b’是最小直径，‘a’是最大直径1。通过使用Study Director软件(第一天)随机平衡，将肿瘤大小为104-125mm3的40只小鼠随机分为四组，每组10只小鼠，每组具有约112mm3的平均肿瘤大小。当小鼠被随机化时，此后每周取出两次，记录肿瘤体积和体重。每天进行临床观察。
如方案中所述，在第15天达到等于或大于1500mm3的平均肿瘤体积后，处死媒介物对照。当伊立替康组达到平均肿瘤体积为774mm3时，结束处理组，因为发现小鼠死亡或濒临死亡。在尸检时，切除肿瘤，记录测量的湿重以及对肿瘤坏死进行视觉评估。
在第27天计算平均肿瘤生长抑制(TGI)。在异种移植研究中的所有统计分析均采用Prism v6.00软件进行。使用方差分析(ANOVA)检验来确认第27天肿瘤体积的差异。还使用采用Welch校正的单尾学生T检验来验证每个组和媒介物对照之间的任何差异，并使用双尾学生T检验来验证组合的组与其各自的单一药剂之间的差异。
媒介物对照在第15天达到2078.1mm3的平均肿瘤体积。该组在整个研究中没有经历明显的平均体重减轻。在第12天首先观察到10只小鼠中有9只小鼠经历轻度至中度的肿瘤坏死。所有动物存活至终末期处死。
用7.5mg/kg普那布林的处理在第15天使得平均肿瘤体积为1279.2mm3。该组在第15天产生的TGI为41.0％(n＝7)。当与第15天的媒介物对照组(学生T-检验)相比时，观察到平均肿瘤体积的明显减小(p<0.05)。该组在整个研究中没有经历平均体重减轻。10只小鼠中有9只在第12天首次观察到轻微至严重的肿瘤坏死。由于临床观察结果显示严重的肿瘤坏死发病，小鼠5在第19天处于濒死状态。研究期间，发现小鼠2、3、4、7、10死亡。由于技术错误，发现小鼠8死亡。10只小鼠中有3只存活到终末期处死。
用80mg/kg伊立替康的处理导致第15天的平均肿瘤体积为1156.7mm3。与第15天的媒介物对照相比，该组产生的TGI为47.2％(n＝10)。与第15天的媒介物对照(学生T检验)相比，观察到平均肿瘤体积明显减小(p<0.05)。该组在第20天(研究的最后一天)经历了中度体重减轻，最多7.4％。10只小鼠中有8只在第12天首次观察到轻微至严重的肿瘤坏死。由于临床观察结果显示严重的肿瘤坏死发病，小鼠3、4和5分别在第19、15和18天被处死。分别在第17天和第20天发现小鼠1和10死亡。10只小鼠中有5只存活到终末期处死。
用7.5mg/kg普那布林和80mg/kg伊立替康的处理导致第15天的平均肿瘤体积为468.4mm3。与第15天的媒介物对照相比，该组产生的TGI为82.4％(n＝10)。与第15天的媒介物对照(学生T检验)和单一药剂普那布林(学生T检验)相比，观察到平均肿瘤体积明显减小(p<0.05)。与第15天的单一药剂伊立替康相比，观察到平均肿瘤体积没有明显差异。该组在第20天(研究的最后一天)经历了中度体重减轻，最多5.8％。在第15天首先观察到10只小鼠中有5只经历轻度到中度的肿瘤坏死。所有10只小鼠存活到终末期处死。如图7所示，普那布林与伊立替康的组合优于伊立替康作为单一药剂。由于单独伊立替康的组中小鼠的损失，平均肿瘤体积从第15天的1157mm3下降到第20天的774mm3，导致感知到的性能变化。

Claims (34)

1.治疗以表达RAS蛋白的突变形式为特征的癌症的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述RAS蛋白是KRAS、NRAS或HRAS蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述RAS蛋白的突变形式是K-RAS蛋白的突变形式。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃肠癌、腹膜癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤、脑转移瘤、唾液腺癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴瘤、骨髓瘤和头颈癌。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌、结肠癌、子宫内膜癌和肝细胞癌。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肾癌和成胶质细胞瘤。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述癌症选自：非小细胞肺癌、胰腺癌和成胶质细胞瘤。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
9.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述KRAS蛋白包括在选自密码子12、13、59、61和146的一个或多个位置处的突变。
10.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括在选自G12、G13、S17、P34、A59和Q61的一个或多个氨基酸位置处的突变。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、A59E、A59G、A59T、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。
12.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括在选自G12、G13、A59、Q61、K117和A146的一个或多个氨基酸位置处的突变。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、A59E、A59G、A59T、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、A146P、A146T和A146V。
14.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括在选自G12、G13、A59和Q61的一个或多个氨基酸位置处的突变。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、A59E、A59G、A59T、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。
16.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括在选自G12、G13和D153的一个或多个氨基酸位置处的突变。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12A、G12C、G12D、G12V、G12S、G13D和D153V。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述KRAS蛋白的突变形式包括选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12S和D153V。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其包括确定所述对象是否具有KRAS突变。
20.如权利要求2所述的方法，其中所述RAS蛋白的突变形式是NRAS蛋白的突变形式。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述NRAS蛋白包括在选自密码子12、13、59、61和146的一个或多个位置处的突变。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述NRAS蛋白的突变形式包括在Q61或A146处的突变。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述NRAS蛋白的突变形式包括选自以下的一个或多个氨基酸取代：Q61K、Q61H、Q61R、Q61L、Q61N、Q61E、Q61P、A146T、A146P和A146V。
24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其包括确定所述对象是否具有NRAS突变。
25.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其包括确定所述对象是否具有HRAS突变。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其包括与另外的活性剂共同施用普那布林。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述另外的活性剂是另外的治疗剂。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述另外的治疗剂是多西紫杉醇，且所述癌症是人非小细胞肺癌。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述另外的治疗剂是伊立替康，且所述癌症是人结肠癌。
30.抑制具有RAS突变的细胞增殖的方法，其包括使所述细胞与普那布林接触。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述接触包括将普那布林施用于具有所述细胞的对象。
32.诱导具有RAS突变的细胞中凋亡的方法，其包括使所述细胞与普那布林接触。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述接触包括将普那布林施用于有需要的对象。
34.抑制对象中以表达RAS蛋白的突变形式为特征的癌症进展的方法，其包括将普那布林施用于有需要的对象。
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