CN111534599A - 一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法 - Google Patents

一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒，包括用于检测BRAF、HRAS、KRAS、NRAS和TERT基因的扩增引物及探针、内控基因ACTB引物及探针、外控基因BRAF引物及探针；所述引物具体检测的是BRAF基因的V600E位点、HRAS基因的Q61R位点、KRAS基因的G12C位点、KRAS基因的G12D位点、KRAS基因的G13R位点、KRAS基因的G13D位点、NRAS基因的Q61K位点、NRAS基因的Q61P位点、NRAS基因的Q61H1位点、NRAS基因的Q61H2位点、TERT基因的C228T位点和TERT基因的C250T位点。本发明还提供了一种一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒的使用方法。解决了现在甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒在灵敏度、成本、操作方便性等方面的问题。

Description

一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法
技术领域
本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法。
背景技术
甲状腺结节是普遍存在的一种甲状腺疾病，是甲状腺细胞局部异常生长所引发的病变。大多数情况下，甲状腺结节是良性的，可以采取保守治疗的方式，但也有5％-10％的甲状腺结节是恶性的，需要早期手术治疗，才能获得良好的预后效果。细针穿刺细胞学检查(FNA)是评估甲状腺结节良恶性最可靠的手段。然而仍然有20％-30％的甲状腺结节无法通过FNA诊断良恶性。临床上对此类结节缺乏可靠的诊断手段，大部分患者接受诊断性手术来确定结节的病理。如癌灶大于1cm，需要二次手术完成甲状腺全切术。如果给予大量不需要手术的甲状腺良性结节患者手术治疗，将会产生巨大的医保负担；反之，如果不能从大量甲状腺良性结节中识别鉴定真正的恶性肿瘤，则延缓对这些患者的治疗，危及患者的生命健康。因此，及时准确的检测甲状腺结节的良恶性是至关重要的。
随着分子生物学的突飞猛进，分子标志物在甲状腺结节的良恶性鉴别方面发挥了越来越重要的作用，逐渐成为研究者和临床医生的关注热点。由于目前仅有甲状腺髓样癌(MTC)可以通过血液中的肿瘤标志物降钙素(CT)进行识别，而对于最常见的分化型甲状腺癌(DTC)以及其他类型，血液标本中均缺乏有诊断意义的肿瘤标志物。因此，分子标志物的诊断尚不能通过血液标本完成。超声引导下甲状腺细针抽吸活检(FNA)获得的甲状腺组织细胞，才是分子标志物检测的主要应用标本。虽然分子标志物检测有助于甲状腺结节的良恶性诊断以，但并不意味着所有的标本均应该进行分子检测。对于细胞学判读就可以得到明确诊断的标本，没有必要再行分子标志物检测。最新版的甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统(TBSRTC)明确指出，分子标志物检测应在细胞学被判定为“不确定诊断”(主要指BethesdaⅢ类和Ⅳ类)的甲状腺结节FNA样本中应用；并且，分子标志物检测也不是这类结节临床处理意见的唯一选项。因此，盲目扩大甲状腺结节的分子标志物检测可能导致过度医疗，造成医疗资源的浪费。因此，在开发和验证基于分子标志物的诊断工具，分析和比较有关分子诊断的文献时，要明确研究设计是否合理，有无提供上述指标。同时，这些诊断效能指标也是医生向患者解析分子诊断结果的重要依据。
目前甲状腺结节分子标志物检测应用较多的包括基于检测RNA改变的基因表达分类器(GEC)、基于检测DNA改变的7基因突变检测芯片和ThyroSeq二代基因测序(NGS)多基因分类器、基于检测miRNA改变的Rosetta GX Reveal，以及联合多检测平台的组合式诊断工具ThyGen
Figure BDA0002545663990000021
NGS芯片联合Thyra
Figure BDA0002545663990000022
miRNA分类器。上述分子标志物检测工具均是主要应用于BethesdaⅢ、Ⅳ类FNA样本中，NPV相对较好(91％～97％)，但PPV最高不足80％，提示该检测工具的价值更倾向于在待检甲状腺结节中排除甲状腺癌，然而结果阳性的结节中，至少有20％并不是甲状腺癌。
目前基于分子生物学和高通量测序技术，国内有相关辅助诊断产品用于甲状腺癌分子诊断。BRAF V600E突变是迄今为止在DTC中发生频率最高的基因突变。由于单基因突变检测相对方便，加上近年来出现了很多商用BRAF(V600E)突变检测试剂盒，国内很多医疗机构已将BRAF(V600E)突变检测列入甲状腺结节术前鉴别诊断的辅助项目。根据研究的数据，单独检测这一突变，尽管特异度和PPV表现尚可，但敏感度和NPV很低。这意味着在FNA细胞学“不确定诊断”的样本中，BRAF(V600E)突变阳性支持结节非常有可能是DTC，但突变阴性并不能除外DTC的可能性。其他基于高通测序技术的检测PANEL，虽然包含了大部分的已知分子标记，但是检测周期长，费用昂贵，目前还不能大规模普及。
ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从引物的3’末端开始，而引物3’末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行：若这个碱基与模板正常互补配对(A-T，G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。常规的ARMS-PCR技术操作简便，检测时间较短，检测灵敏度一般在1％左右，如果结合荧光定量技术检测效率可以达到0.5％。
发明内容
本发明针对目前检测方法在灵敏度、成本、操作方便性等方面存在的不足，在ARMS-PCR技术的基础上，结合荧光定量和多重PCR技术，通过对反应体系、扩增引物和探针的优化，提供一种高灵敏、低成本、操作简单的甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法，为鉴别甲状腺结节的良恶性提供良好的辅助作用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒，包括用于检测BRAF、HRAS、KRAS、NRAS和TERT基因的扩增引物及探针、内控基因ACTB引物及探针、外控基因BRAF引物及探针；所述引物具体检测的是BRAF基因的V600E位点、HRAS基因的Q61R位点、KRAS基因的G12C位点、KRAS基因的G12D位点、KRAS基因的G13R位点、KRAS基因的G13D位点、NRAS基因的Q61K位点、NRAS基因的Q61P位点、NRAS基因的Q61H1位点、NRAS基因的Q61H2位点、TERT基因的C228T位点和TERT基因的C250T位点。
进一步的，所述用于检测BFAR基因V600E的扩增引物对和探针序列如SEQ IDNO.1-3所示，所述用于检测HRAS基因Q61R的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.4-6所示，所述用于检测KRAS基因G12C的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.7-9所示，所述用于检测KRAS基因G12D的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.10-12所示，所述用于检测KRAS基因G13R的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.13-15所示，所述用于检测KRAS基因G13D的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.16-18所示，所述用于检测NRAS基因Q61K的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.19-21所示，所述用于检测NRAS基因Q61P的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.22-24所示，所述用于检测NRAS基因Q61H1的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.25-27所示，所述用于检测NRAS基因Q61H2的扩增引物对和探针序列如SEQ IDNO.28-30所示，所述用于检测TERT基因C228T的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.31-33所示，所述用于检测TERT基因C250T的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.34-36所示。
进一步的，所述内控基因ACTB引物及探针序列如SEQ ID NO.37-39所示，所述外控基因BRAF引物及探针序列如SEQ ID NO.40-42所示。
进一步的，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品的获取方法为：将所述检测位点的序列信息通过人工合成，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，即为所述阳性质控品，所述阳性质控品的序列如SEQ IDNO.43-56所示。
进一步的，所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包含pH8.3的Tris-HCl20mM，KCl 100mM，Mg2+2mM，dNTPs 0.4mM，热启动Taq DNA聚合酶0.2U/μL。
一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)样本制备：取待测样本甲状腺进行DNA提取，并调整DNA浓度到10ng/uL备用；
2)反应体系配置：分别由所述检测位点的基因检测试剂和内控检测试剂形成PCR反应液1-11，同时形成外控检测试剂的PCR反应液12，共同组成PCR反应体系；
3)PCR反应：PCR反应条件为：
预变性：95℃，2分钟；
第一阶段：由5个扩增循环构成，
变性：95℃，15秒；
退火：60℃，20秒；
延伸：72℃，20秒；
第二阶段：由40个扩增循环构成，
变性：95℃，15秒；
退火：60℃，20秒，设置荧光信号采集；
延伸：72℃，20秒；
4)结果判读。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明可以同时检测BRAF、KRAS、HRAS、NRAS和TERT 5个基因上的12种突变位点，这些基因突变与甲状腺的良恶性有关，其检测结果可以用来协助医生对细胞学无法明确诊断的甲状腺结节进行良恶性鉴别，可以提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性。
(2)本发明基于多重荧光定量ARMS-PCR技术，其引物组合、试剂盒及检测方法具有检测灵敏度高、特异性好、重复性好的特点。
附图说明
图1为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品1的检测曲线。
图2为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品2的检测曲线。
图3为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品3的检测曲线。
图4为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品4的检测曲线。
图5为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品5的检测曲线。
图6为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品6的检测曲线。
图7为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品7的检测曲线。
图8为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品8的检测曲线。
图9为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品9的检测曲线。
图10为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品10的检测曲线。
图11为本发明一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法中样品11的检测曲线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。
实施例1：引物和探针组合设计及使用
本发明收集BRAF(p.V600E)、HRAS(p.Q61R)、KRAS(p.G13D)、KRAS(p.G13R)、KRAS(p.G12D)、KRAS(p.G12C)、NRAS(p.Q61H)、NRAS(p.Q61P)、NRAS(p.Q61K)、TERT(C228T)和TERT(C250T)5个基因上的12种突变位点序列信息，经过大规模的实验晒筛选，优选的引物和探针如下：
(1)检测BRAF基因V600E的扩增引物对和探针
BRAF-F：GTGATTTTGGTCCAGCCAGAAA
BRAF-R：TCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGG
BRAF-P：FAM-ACTGATGGGACCCACTCCATCGA-TAMRA
(2)检测HRAS基因Q61R的扩增引物对和探针
HQ61R-F5:CATCCTGGATACCGCCGTCAG
HQ61R-R:CTTGGTGTTGTTGATGGCAAAC
HQ61R-P:FAM-AGGAGTACAGCGCCATGCGGGA-TARMA
(3)用于检测KRAS基因G12C的扩增引物对和探针
KG12C-F3:TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCT
K1213-R1:CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
K1213-P1:FAM-CTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-TAMRA
(4)检测KRAS基因G12D的扩增引物对和探针
KG12D-F2:TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAA
K1213-R1:CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
K1213-P1:FAM-CTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-TAMRA
(5)检测KRAS基因G13R的扩增引物对和探针
KG13R-F5:TTGTGGTAGTTGGAGCTAGCC
K1213-R1:CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
K1213-P1:FAM-CTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-TAMRA
(6)检测KRAS基因G13D的扩增引物对和探针
KG13D-F3:GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA
K1213-R1:CATATTCGTCCACAAAATGATTCTG
K1213-P1:FAM-CTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-TAMRA
(7)检测NRAS基因Q61K的扩增引物对和探针：
NQ61K-F2:GACATACTGGATACAGCTGGCA
N61-R1:CTGTAGAGGTTAATATCCGCAA
N61-P1:FAM-AAGAGTACAGTGCCATGAGAGACCAAT-TAMRA
(8)检测NRAS基因Q61P的扩增引物对和探针：
NQ61P-F2:GACATACTGGATACAGCTGGTCC
N61-R1:CTGTAGAGGTTAATATCCGCAA
N61-P1:FAM-AAGAGTACAGTGCCATGAGAGACCAAT-TAMRA
(9)检测NRAS基因Q61H1的扩增引物对和探针：
NQ61H1-F3:GACATACTGGATACAGCTGGACCT
N61-R1:CTGTAGAGGTTAATATCCGCAA
N61-P1:FAM-AAGAGTACAGTGCCATGAGAGACCAAT-TAMRA
(10)检测NRAS基因Q61H2的扩增引物对和探针：
NQ61H2-F3:GACATACTGGATACAGCTGGAAAC
N61-R1:CTGTAGAGGTTAATATCCGCAA
N61-P1:FAM-AAGAGTACAGTGCCATGAGAGACCAAT-TAMRA
(11)检测TERT基因C228T的扩增引物对和探针：
TC228T-F2:GGCTGGGAGGGCCCGGTA
TC228T-R:GGCTCCCAGTGGATTCG
TC228T-P:FAM-CACAGACGCCCAGGACCGCGCT-TAMRA
(12)检测TERT基因C250T的扩增引物对和探针：
TC250T-F2:GCTGGGCCGGGGACCCGTA
TC228T-R:GGCTCCCAGTGGATTCG
TC228T-P:FAM-CACAGACGCCCAGGACCGCGCT-TAMRA
上述引物及探针根据人类BRAF、HRAS、KRAS、NRAS和TERT基因序列设计。
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1,更优选的方案为检测探针5’端荧光基团为FAM，检测探针3’端荧光淬灭基团为TAMRA。
(13)内控基因引物和探针
本发明根据人类ACTB基因保守序列设计了内控引物及探针，优选的序列如下所示：
ACTB-F：TGGAGAAGATCTGGCACCACACCT
ACTB-R：GGTGTTGAAGGTCTCAAACATAA
ACTB-P：VIC-CTGAACCCCAAGGCCAACAGAGAGAA-TARMA
上述检测内控荧光探针及外控荧光探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1,更优选的方案为检测内控荧光探针5’端荧光基团为VIC，内控荧光探针3’端荧光淬灭基团为TAMRA。
(14)外控基因引物和探针
本发明根据人类BRAF基因非突变区保守序列设计了内控引物及探针，优选的序列如下所示：
OUTB-F：TAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG
OUTB-R：TAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAAT
OUTB-P：FAM-ACTGATGGGACCCACTCCATCGA-TARMA
上述检测内控荧光探针及外控荧光探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1,更优选的方案为检测外控荧光探针5’端荧光基团为FAM，检测外控荧光探针3’端荧光淬灭基团为TAMRA。
实施例2：阳性质控品的获取
阳性质控品的获取方法为：按照NCBI上公布的BRAF(p.V600E)、HRAS(p.Q61R)、KRAS(p.G13D)、KRAS(p.G13R)、KRAS(p.G12D)、KRAS(p.G12C)、NRAS(p.Q61H)、NRAS(p.Q61P)、NRAS(p.Q61K)、TERT(C228T)、TERT(C250T)和ACTB基因序列信息，分别通过人工合成核酸片段，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，nanodrop 2000测定浓度和纯度，以此质粒等体积混合后作为本发明试剂盒的阳性质控品。
BRAF(p.V600E)质控品序列如SEQ ID NO.43所示，HRAS(p.Q61R)质控品序列如SEQID NO.44所示，KRAS(p.G13D)质控品序列如SEQ ID NO.45所示，KRAS(p.G13R)质控品序列如SEQ ID NO.46所示，KRAS(p.G12D)质控品序列如SEQ ID NO.47所示，KRAS(p.G12C)质控品序列如SEQ ID NO.48所示，NRAS(p.Q61H1)质控品序列如SEQ ID NO.49所示，NRAS(p.Q61H2)质控品序列如SEQ ID NO.50所示，NRAS(p.Q61P)质控品序列如SEQ ID NO.51所示，NRAS(p.Q61K)质控品序列如SEQ ID NO.52所示，TERT(C228T)质控品序列如SEQ IDNO.53所示，TERT(C250T)质控品序列如SEQ ID NO.54所示，内控基因片段ACTB质控品序列如SEQ ID NO.55所示，外控基因片段(BRAF-O)质控品序列如SEQ ID NO.56所示。
阴性质控品为DEPC处理过的去离子水，经过高压蒸汽灭菌后使用。
实施例3：PCR反应体系的配置
本发明中PCR反应液包含了PCR反应所需要的热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTPs等物质。具体为：pH8.3的Tris-HCl 20mM，KCl 100mM，Mg2+2mM，dNTPs 0.4mM，热启动Taq DNA聚合酶0.2U/μL。
本发明试剂盒采用12联PCR反应条设计，1-11号管由基因检测试剂和内控检测试剂组成，分别指示BRAF、HRAS、KRAS、NRAS和TERT的5基因12突变位点，基因检测试剂由FAM信号指示，内控检测试剂用于监控样本DNA质量及加入情况，由VIC信号指示；12号管由BRAF非突变区外控检测试剂组成，用来质控DNA的提取质量，亦由FAM信号指示。每一个样本检测需要1条12联PCR反应条,每管对应的检测位点见表1。1-12号管的反应液分别对应PCR反应液1-12，PCR反应液1-12的组成如表2。
表1基因检测位点
Figure BDA0002545663990000071
Figure BDA0002545663990000081
表2 PCR反应液
Figure BDA0002545663990000082
Figure BDA0002545663990000091
Figure BDA0002545663990000101
Figure BDA0002545663990000111
实施例4：诊断试剂盒的使用
一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)模拟样本的制备：
从重庆市第九人民医院收集甲状腺穿刺组织11例，利用Magen基因组小量提取试剂盒进行基因组DNA的提取，Qubit 3调整DNA浓度到10ng/uL备用。DNA样本经高通量测确定BRAF、HRAS、KRAS、NRAS和TERT无突变。将含12种点突变的阳性质粒分别溶解在甲状腺组织基因组DNA水溶液中，混合成M:WT＝1:99的10ng/uL含有1％突变体的阳性模拟样本备用。将11个样本打乱后重新编号样本1-样本11。
2)反应体系配置：按照实施例3方案配置反应液，分别由所述检测位点的基因检测试剂和内控检测试剂形成PCR反应液1-11，同时形成外控检测试剂的PCR反应液12，并将样本1-样本11的阳性模拟样本加入1-11号反应液，共同组成PCR反应体系，瞬离待上机。每次反应需要加入阴性对照组和阳性对照组同时操作。
3)使用仪器ABI 7500进行PCR反应，荧光通道选择为FAM和VIC，PCR反应条件为：
预变性：95℃，2分钟；
第一阶段：由5个扩增循环构成，
变性：95℃，15秒；
退火：60℃，20秒；
延伸：72℃，20秒；
第二阶段：由40个扩增循环构成，
变性：95℃，15秒；
退火：60℃，20秒，设置荧光信号采集；
延伸：72℃，20秒；
3)结果判读。
结果判读的方法为：设置阳性对照组和阴性对照组，
1)阴性对照组中，FAM/VIC信号均应无Ct值或无典型的S型扩增曲线升起；若阴性对照管有典型的S型扩增曲线升起，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，需排除污染源后重新检测；
2)阳性对照组中，FAM/VIC信号均应有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值在12～25间；若对照品有至少一个通道无典型的S型扩增曲线升起或Ct值≤12或Ct值≥25，该批次样本需重新检测；
3)若满足1)和2)要求，表明此次实验成功，对样品管进行分析：
外控检测试剂管的FAM信号应有明显的扩增曲线，且Ct值应在15-25之间；
内控检测试剂管(VIC通道)应有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值15-25之间，表明所加样本DNA质量正常，若Ct值≤15，表明所加样本过量，将样本稀释后再次检测；若Ct≥25或无扩增(无Ct)，表明所加样本DNA含有PCR抑制剂或DNA量不够，可能影响低突变率样本的检测结果，重新提取DNA后检测；
确认未选择校正荧光参照，同时选择样本单一检测反应管、阳性对照组、阴性对照组进行分析，确认各位点检测Ct值。由于样本中突变百分含量各不相同，所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值区分检测结果的阴/阳性。具体结果判定见下表：
Figure BDA0002545663990000121
样本1-样本11的检测结果判读见表3，检测结果曲线见附图。
表3样本检测结果判读
Figure BDA0002545663990000131
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司
<120> 一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒及使用方法
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgattttgg tccagccaga aa 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctagtaact cagcagcatc tcagg 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actgatggga cccactccat cga 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catcctggat accgccgtca g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttggtgttg ttgatggcaa ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggagtacag cgccatgcgg ga 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tataaacttg tggtagttgg agcct 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catattcgtc cacaaaatga ttctg 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgtatcgtc aaggcactct tgc 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taaacttgtg gtagttggag ctaa 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catattcgtc cacaaaatga ttctg 25
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgtatcgtc aaggcactct tgc 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgtggtagt tggagctagc c 21
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catattcgtc cacaaaatga ttctg 25
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgtatcgtc aaggcactct tgc 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtggtagttg gagctggtaa 20
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
catattcgtc cacaaaatga ttctg 25
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctgtatcgtc aaggcactct tgc 23
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gacatactgg atacagctgg ca 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctgtagaggt taatatccgc aa 22
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aagagtacag tgccatgaga gaccaat 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gacatactgg atacagctgg tcc 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgtagaggt taatatccgc aa 22
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aagagtacag tgccatgaga gaccaat 27
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gacatactgg atacagctgg acct 24
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctgtagaggt taatatccgc aa 22
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aagagtacag tgccatgaga gaccaat 27
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gacatactgg atacagctgg aaac 24
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctgtagaggt taatatccgc aa 22
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagagtacag tgccatgaga gaccaat 27
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggctgggagg gcccggta 18
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggctcccagt ggattcg 17
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cacagacgcc caggaccgcg ct 22
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gctgggccgg ggacccgta 19
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggctcccagt ggattcg 17
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cacagacgcc caggaccgcg ct 22
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tggagaagat ctggcaccac acct 24
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggtgttgaag gtctcaaaca taa 23
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctgaacccca aggccaacag agagaa 26
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
taggtgattt tggtctagct acag 24
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
taatcagtgg aaaaatagcc tcaat 25
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
actgatggga cccactccat cga 23
<210> 43
<211> 275
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cttacctaaa ctcttcataa tgcttgctct gataggaaaa tgagatctac tgttttcctt 60
tacttactac acctcagata tatttcttca tgaagacctc acagtaaaaa taggtgattt 120
tggtctagct acagagaaat ctcgatggag tgggtcccat cagtttgaac agttgtctgg 180
atccattttg tggatggtaa gaattgaggc tatttttcca ctgattaaat ttttggccct 240
gagatgctgc tgagttacta gaaagtcatt gaagg 275
<210> 44
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gggggcatga ggggcatgag aggtaccagg gagaggctgg ctgtgtgaac tccccccacg 60
gaaggtcctg agggggtccc tgagccctgt cctcctgcag gattcctacc ggaagcaggt 120
ggtcattgat ggggagacgt gcctgttgga catcctggat accgccggcc gggaggagta 180
cagcgccatg cgggaccagt acatgcgcac cggggagggc ttcctgtgtg tgtttgccat 240
caacaacacc aagtcttttg aggacatcca ccagtacagg tgaaccccgt gaggctggcc 300
cgggagccca cgccgcacag gtggggccag gccggctgcg tccag 345
<210> 45
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ggtattttga aataattttt catataaagg tgagtttgta ttaaaaggta ctggtggagt 60
atttgatagt gtattaacct tatgtgtgac atgttctaat atagtcacat tttcattatt 120
tttattataa ggcctgctga aaatgactga atataaactt gtggtagttg gagcttgtgg 180
cgtaggcaag agtgccttga cgatacagct aattcagaat cattttgtgg acgaatatga 240
tccaacaata gaggtaaatc ttgttttaat atgcatatta ctggtgcagg accattcttt 300
gatacagata aaggtttctc tgaccatttt catgagtact tattacaa 348
<210> 46
<211> 298
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aaaggtgagt ttgtattaaa aggtactggt ggagtatttg atagtgtatt aaccttatgt 60
gtgacatgtt ctaatatagt cacattttca ttatttttat tataaggcct gctgaaaatg 120
actgaatata aacttgtggt agttggagct gatggcgtag gcaagagtgc cttgacgata 180
cagctaattc agaatcattt tgtggacgaa tatgatccaa caatagaggt aaatcttgtt 240
ttaatatgca tattactggt gcaggaccat tctttgatac agataaaggt ttctctga 298
<210> 47
<211> 302
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
taaaggtgag tttgtattaa aaggtactgg tggagtattt gatagtgtat taaccttatg 60
tgtgacatgt tctaatatag tcacattttc attattttta ttataaggcc tgctgaaaat 120
gactgaatat aaacttgtgg tagttggagc tggtcgcgta ggcaagagtg ccttgacgat 180
acagctaatt cagaatcatt ttgtggacga atatgatcca acaatagagg taaatcttgt 240
tttaatatgc atattactgg tgcaggacca ttctttgata cagataaagg tttctctgac 300
ca 302
<210> 48
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggtattttga aataattttt catataaagg tgagtttgta ttaaaaggta ctggtggagt 60
atttgatagt gtattaacct tatgtgtgac atgttctaat atagtcacat tttcattatt 120
tttattataa ggcctgctga aaatgactga atataaactt gtggtagttg gagctggtga 180
cgtaggcaag agtgccttga cgatacagct aattcagaat cattttgtgg acgaatatga 240
tccaacaata gaggtaaatc ttgttttaat atgcatatta ctggtgcagg accattcttt 300
gatacagata aaggtttctc tgaccatttt catgagtact t 341
<210> 49
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tagatgctta tttaaccttg gcaatagcat tgcattccct gtggttttta ataaaaattg 60
aacttccctc cctccctgcc cccttaccct ccacaccccc aggattctta cagaaaacaa 120
gtggttatag atggtgaaac ctgtttgttg gacatactgg atacagctgg aaaagaagag 180
tacagtgcca tgagagacca atacatgagg acaggcgaag gcttcctctg tgtatttgcc 240
atcaataata gcaagtcatt tgcggatatt aacctctaca ggtactagga gcattatttt 300
ctctgaaagg atgatctttg tgttctgaat ctttatgggg aaat 344
<210> 50
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
agatgcttat ttaaccttgg caatagcatt gcattccctg tggtttttaa taaaaattga 60
acttccctcc ctccctgccc ccttaccctc cacaccccca ggattcttac agaaaacaag 120
tggttataga tggtgaaacc tgtttgttgg acatactgga tacagctgga ccagaagagt 180
acagtgccat gagagaccaa tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt gtatttgcca 240
tcaataatag caagtcattt gcggatatta acctctacag gtactaggag cattattttc 300
tctgaaagga tgatctttgt gttctgaatc tttatgggga aatg 344
<210> 51
<211> 302
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
accttggcaa tagcattgca ttccctgtgg tttttaataa aaattgaact tccctccctc 60
cctgccccct taccctccac acccccagga ttcttacaga aaacaagtgg ttatagatgg 120
tgaaacctgt ttgttggaca tactggatac agctggacat gaagagtaca gtgccatgag 180
agaccaatac atgaggacag gcgaaggctt cctctgtgta tttgccatca ataatagcaa 240
gtcatttgcg gatattaacc tctacaggta ctaggagcat tattttctct gaaaggatga 300
tc 302
<210> 52
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
accttggcaa tagcattgca ttccctgtgg tttttaataa aaattgaact tccctccctc 60
cctgccccct taccctccac acccccagga ttcttacaga aaacaagtgg ttatagatgg 120
tgaaacctgt ttgttggaca tactggatac agctggacac gaagagtaca gtgccatgag 180
agaccaatac atgaggacag gcgaaggctt cctctgtgta tttgccatca ataatagcaa 240
gtcatttgcg gatattaacc tctacaggta ctaggagcat tattttctct gaaaggatga 300
tctttgtgtt ct 312
<210> 53
<211> 341
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gcgcagcagg gagcgcacgg ctcggcagcg gggagcgcgc ggcatcgcgg gggtggccgg 60
ggccagggct tcccacgtgc gcagcaggac gcagcgctgc ctgaaactcg cgccgcgagg 120
agagggcggg gccgcggaaa ggaaggggag gggctgggag ggcccggaag gggctgggcc 180
ggggacccgg gaggggtcgg gacggggcgg ggtccgcgcg gaggaggcgg agctggaagg 240
tgaaggggca ggacgggtgc ccgggtcccc agtccctccg ccacgtggga agcgcggtcc 300
tgggcgtctg tgcccgcgaa tccactggga gcccggcctg g 341
<210> 54
<211> 347
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cggcagcggg gagcgcgcgg catcgcgggg gtggccgggg ccagggcttc ccacgtgcgc 60
agcaggacgc agcgctgcct gaaactcgcg ccgcgaggag agggcggggc cgcggaaagg 120
aaggggaggg gctgggaggg cccggagggg gctgggccgg ggacccggaa ggggtcggga 180
cggggcgggg tccgcgcgga ggaggcggag ctggaaggtg aaggggcagg acgggtgccc 240
gggtccccag tccctccgcc acgtgggaag cgcggtcctg ggcgtctgtg cccgcgaatc 300
cactgggagc ccggcctggc cccgacagcg cagctgctcc gggcgga 347
<210> 55
<211> 287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ccaactggga cgacatggag aagatctggc accacacctt ctacaacgag ctgcgcgtgg 60
ccccggagga gcacccagtg ctgctgaccg aggcccccct gaaccccaag gccaacagag 120
agaagatgac tcagattatg tttgagacct tcaacacccc ggccatgtac gtggccatcc 180
aggccgtgct gtccctctac gcctctgggc gcaccactgg cattgtcatg gactctggag 240
acggggtcac ccacacggtg cccatctacg agggctacgc cctcccc 287
<210> 56
<211> 308
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
agatctactg ttttccttta cttactacac ctcagatata tttcttcatg aagacctcac 60
agtaaaaata ggtgattttg gtctagctac agtgaaatct cgatggagtg ggtcccatca 120
gtttgaacag ttgtctggat ccattttgtg gatggtaaga attgaggcta tttttccact 180
gattaaattt ttggccctga gatgctgctg agttactaga aagtcattga aggtctcaac 240
tatagtattt tcatagttcc cagtattcac aaaaatcagt gttcttattt tttatgtaaa 300
tagatttt 308

Claims (6)

1.一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒，其特征在于：包括用于检测BRAF、HRAS、KRAS、NRAS和TERT基因的扩增引物及探针、内控基因ACTB引物及探针、外控基因BRAF引物及探针；所述引物具体检测的是BRAF基因的V600E位点、HRAS基因的Q61R位点、KRAS基因的G12C位点、KRAS基因的G12D位点、KRAS基因的G13R位点、KRAS基因的G13D位点、NRAS基因的Q61K位点、NRAS基因的Q61P位点、NRAS基因的Q61H1位点、NRAS基因的Q61H2位点、TERT基因的C228T位点和TERT基因的C250T位点。
2.如权利要求1所述一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒，其特征在于：所述用于检测BFAR基因V600E的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.1-3所示，所述用于检测HRAS基因Q61R的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.4-6所示，所述用于检测KRAS基因G12C的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.7-9所示，所述用于检测KRAS基因G12D的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.10-12所示，所述用于检测KRAS基因G13R的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.13-15所示，所述用于检测KRAS基因G13D的扩增引物对和探针序列如SEQ IDNO.16-18所示，所述用于检测NRAS基因Q61K的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.19-21所示，所述用于检测NRAS基因Q61P的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.22-24所示，所述用于检测NRAS基因Q61H1的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.25-27所示，所述用于检测NRAS基因Q61H2的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.28-30所示，所述用于检测TERT基因C228T的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.31-33所示，所述用于检测TERT基因C250T的扩增引物对和探针序列如SEQ ID NO.34-36所示。
3.如权利要求1所述一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒，其特征在于：所述内控基因ACTB引物及探针序列如SEQ ID NO.37-39所示，所述外控基因BRAF引物及探针序列如SEQID NO.40-42所示。
4.如权利要求1所述一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品的获取方法为：将所述检测位点的序列信息通过人工合成，然后把该片段插入到T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，即为所述阳性质控品，所述阳性质控品的序列如SEQ ID NO.43-56所示。
5.如权利要求1所述一种甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包含pH8.3的Tris-HCl 20mM，KCl 100mM，Mg2+2mM，dNTPs0.4mM，热启动Taq DNA聚合酶0.2U/μL。
6.一种根据权利要求1-5中任一项所述甲状腺癌辅助分子诊断试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)样本制备：取待测样本甲状腺进行DNA提取，并调整DNA浓度到10ng/uL备用；
2)反应体系配置：分别由所述检测位点的基因检测试剂和内控检测试剂形成PCR反应液1-11，同时形成外控检测试剂的PCR反应液12，共同组成PCR反应体系；
3)PCR反应：PCR反应条件为：
预变性：95℃，2分钟；
第一阶段：由5个扩增循环构成，
变性：95℃，15秒；
退火：60℃，20秒；
延伸：72℃，20秒；
第二阶段：由40个扩增循环构成，
变性：95℃，15秒；
退火：60℃，20秒，设置荧光信号采集；
延伸：72℃，20秒；
4)结果判读。
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