CN107427033A - 风味组合物及包含该组合物的宠物食品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种风味组合物，其包含至少一种核苷酸衍生物和/或至少一种跨膜化合物，其调节、增加和/或增强鲜味受体的活性，用于增强食品的鲜味味道和/或适口性。在某些非限制性实施方案中，该风味组合物包含至少一种核苷酸衍生物和/或至少一种跨膜化合物，任选地至少一种核苷酸、任选地至少一种第一氨基酸、任选地至少一种第二氨基酸。

Description

风味组合物及包含该组合物的宠物食品
交叉引用相关申请
本申请要求于2014年12月10日提交的美国临时申请序列号62/090,138的优先权，该申请的内容通过引用的方式全部并入，并要求其优先权。
技术领域
本文公开的主题涉及调节鲜味味觉受体的活性的化合物，并涉及包括至少一种这类化合物的风味组合物，以及涉及鉴别这类化合物的方法。风味组合物可用于增强或调节宠物食品的适口性、味道和/或风味。风味组合物可包括化合物的组合，并且可以各种递送系统形式添加到宠物食品中。调节鲜味味觉受体的活性的化合物可以包括一种或多种跨膜化合物、核苷酸衍生物、核苷酸、第一氨基酸、第二氨基酸或它们的组合。
背景技术
可食用组合物的味道特征(tasteprofile)包括基础味道如甜味、咸味、苦味、酸味、鲜味和厚味(kokumi)。味道特征也已经被描述为包括游离脂肪酸的味道。引发这些味道的化学化合物通常被称为促味剂。据推测，促味剂是由口腔和咽喉中的味觉受体感测，该味觉受体将信号传递到其中记录促味剂和产生味道特征的大脑。味觉受体包括T1R类味觉受体如T1R1、T1R2和T1R3，其作为异二聚体相互作用以发挥味觉受体的作用。例如，T1R2/T1R3响应于甜味刺激，以及T1R1/T1R3异二聚体识别鲜味味道。猫和猫科的成员未能表达功能T1R2单体，表明猫的主要功能T1R类味觉受体是鲜味受体T1R1/T1R3。此外，已经显示猫偏好于具有鲜味味道的食品组合物。
人T1R1/T1R3和猫T1R1/T1R3受体之间存在几个显著的差异。例如，人T1R1/T1R3响应于作为激动剂的氨基酸谷氨酸(glutamate)和作为正变构调节剂的核苷酸，特别是IMP和GMP。人T1R1/T1R3还响应于结合受体的跨膜结构域的化合物。例如，N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺)，它是受体的正变构调节剂，通过结构域交换实验(Zhang等人，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)，105(52)：20930-4，2008)显示出其结合人T1R1跨膜结构域。还已知结合跨膜结构域的变构调节剂调节III类GPCR的多个成员包括mGluR受体和CaSR受体的活性。然而，人和猫T1R1/T1R3均协同响应于核苷酸和氨基酸的组合。
宠物食品制造商长期希望提供具有高营养价值的宠物食品。此外，特别考虑到猫与犬食品，宠物食品制造商希望高度的适口性，使宠物可以从它们的食物得到充分的营养益处。家养动物，尤其是猫，对它们的食物偏好是出名地善变，常常拒绝食用已经接受了一段时间的宠物食品或拒绝食用仅仅最小量的宠物食品。结果是，宠物主人经常改变宠物食品的类型和品牌，以保持他们的宠物处于健康和满足的状态。
虽然最近在口感和风味技术方面存在进展，但仍需要通过增强或改变宠物食品的味道特征、质地特征(texture profile)和/或风味特征(flavor profile)而增强或改变宠物食品的适口性的化合物。增强或改变可以是增加希望的属性的强度，取代宠物食品中不存在或不知何故丢失的希望的属性，或降低不希望的属性的强度。特别地，期望增加宠物食品中促味剂的强度。因此，本领域中仍然需要增强宠物食品的适口性和/或鲜味味道的组合物。
发明内容
本文公开的主题涉及风味组合物以及跨各种宠物食品制备和改良这类组合物方法。具体而言，本发明涉及包含一种或多种增强、增加和/或调节鲜味受体T1R1/T1R3的活性的跨膜化合物和/或核苷酸衍生物的组合物。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包含式Nt-1的核苷酸衍生物：
其中X、R1、R2、R4、R5、R14和R15在下文中描述。本发明提供了式Nt-1的化合物的盐和立体异构体。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包含如本文所述的式Nt-2至Nt-55的一种或多种核苷酸衍生物。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物还包含如本文所述的式Tm-1至Tm-104的一种或多种跨膜化合物。
在某些实施方案中，风味组合物还包含一种或多种第一氨基酸和/或一种或多种第二个氨基酸。在某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第一氨基酸和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第二氨基酸。在某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种第一氨基酸和/或至少一种第二氨基酸。在某些实施方案中，风味组合物包含至少两种第一氨基酸和/或至少一种第二氨基酸。在某些实施方案中，风味组合物还包含至少一种第一氨基酸和/或至少两种第二氨基酸。在某些实施方案中，风味组合物还包含至少两种第一氨基酸和/或至少两种第二氨基酸。
第一氨基酸的非限制性实例包括色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、亮氨酸以及它们的组合。
第二氨基酸的非限制性实例包括天冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、羟基脯氨酸、精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、谷氨酸一钠、牛磺酸以及它们的组合。
在某些实施方案中，风味组合物还包含丙氨酸。
在某些实施方案中，风味组合物还包含甘氨酸。
在某些实施方案中，风味组合物还包含组氨酸。
在某些实施方案中，风味组合物还可包含至少一种核苷酸或核苷酸衍生物。核苷酸的非限制性实例包括鸟苷单磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、腺苷单磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胞苷单磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、肌苷单磷酸(IMP)、肌苷二磷酸(IDP)、肌苷三磷酸(ITP)、尿苷单磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胸苷单磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、黄苷单磷酸(XMP)、黄苷二磷酸(XDP)、黄苷三磷酸(XTP)以及它们的组合。
在一个实施方案中，风味组合物可以进一步包含选自由鸟苷单磷酸(GMP)、肌苷单磷酸(IMP)以及它们的组合组成的组的核苷酸。
在其它实施方案中，风味组合物还包含丙氨酸和鸟苷单磷酸(GMP)。
在其它实施方案中，风味组合物还包含甘氨酸和鸟苷单磷酸(GMP)。
在其它实施方案中，风味组合物还包含组氨酸和鸟苷单磷酸(GMP)。
在其它实施方案中，风味组合物还包含丙氨酸和肌苷单磷酸(IMP)。
在其它实施方案中，风味组合物还包含甘氨酸和肌苷单磷酸(IMP)。
在其它实施方案中，风味组合物还包含组氨酸和肌苷单磷酸(IMP)。
在其它实施方案中，风味组合物还包含脯氨酸和选自由组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组的的氨基酸。
在其它实施方案中，风味组合物还包含苏氨酸和选自由组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸。
在某些实施方案中，风味组合物还包含谷氨酸和选自由组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸。
在某些实施方案中，本发明提供了一种包含如本文所述的风味组合物的食品，其中所述风味组合物以食品的约0.0001重量％至约10重量％的浓度存在。在其它实施方案中，风味组合物以食品的约0.001ppm至约1000ppm的浓度存在。在另外的其它实施方案中，风味组合物以食品的约1pM至约1M、或约1μM至约1M的浓度存在。
在某些实施方案中，风味组合物以增加食品的适口性的有效量存在，正如通过味道测试者小组所确定的。
在其它实施方案中，本发明提供了一种用于增加食品鲜味味道强度的方法，其包括将食品与本文所述的风味组合物混合，其中所述风味组合物以混合物的约0.0001重量％至约10重量％的浓度存在。在其它实施方案中，风味组合物以混合物的约0.001ppm至约1000ppm的浓度存在。在另外的其它实施方案中，风味组合物以混合物的约1pM至约1M、或约1μM至约1M的浓度存在。
在其它实施方案中，本发明提供了一种用于增加食品鲜味味道强度的方法，其包括将食品与本文所述的风味组合物混合，其中所述风味组合物以增加食品的适口性的有效量存在，正如通过味道测试者小组所确定的。在某些实施方案中，鲜味味道强度的增加包括鲜味回味的增加。
本发明还提供了用于制备包含本文所述的风味组合物的食品的方法，其中该方法包括热处理食品前体，其中热处理期间产生所述风味组合物。热处理的实例包括，例如杀菌、干馏(retorting)、挤压、注射成型或它们的组合。
在某些实施方案中，本文所述的食品包括宠物食品，例如猫科动物宠物食品，如湿的和/或干的猫科动物宠物食品。在其它实例中，宠物食品包括犬宠物食品，如湿的和/或干的犬宠物食品。
在其它实施方案中，本文所述的食品包括人类的食品。
前述内容已相当广泛地概述了本申请的特征和技术优点，以便可以更好地理解下面的详细描述。下文中将描述本申请的其它特征和优点，这构成本申请的权利要求的主题。本领域技术人员应当理解，所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计其它结构以执行本申请的相同目的基础。本领域技术人员还应当认识到，这样的等效结构并不背离如所附权利要求阐述的本申请的精神和范围。通过下面的描述可以更好地理解关于其组织和操作方法被视为本申请的特点的新特征以及进一步的目的和优点。
附图说明
图1示出鸟苷单磷酸(GMP)作为测试化合物用于体外激活猫T1R1/T1R3鲜味受体的的剂量响应曲线。在本图中(以及在图2-12、14和38-45中，示出了四条曲线：在缓冲液中的测试化合物，在缓冲液中的测试化合物与20mM丙氨酸，在缓冲液中的测试化合物与0.2mMIMP，在20mM丙氨酸中的测试化合物和0.2mM IMP。横轴是为mM的测试化合物浓度。纵轴是在荧光测定法中测定为ΔF/F或在发光测定法中测定为Lum的受体响应。
图2示出对于2′-脱氧腺苷-3′，5′-O-二磷酸的剂量响应曲线。
图3示出对于肌苷5′-二磷酸(IDP)钠盐的剂量响应曲线。
图4示出对于2′-/3′-O-(2-氨基乙基氨基甲酰基)腺苷-5′O-单磷酸的剂量响应曲线。
图5示出2′-/3′-O-(2-氨基乙基氨基甲酰基)鸟苷-5′-O-单磷酸的剂量响应曲线。
图6示出对于肌苷三磷酸(ITP)三钠盐的剂量响应曲线。
图7示出对于N6-苯甲酰腺苷-5′-O-单磷酸的剂量响应曲线。
图8示出对于腺苷5′-O-硫代单磷酸二锂盐的剂量响应曲线。
图9示出对于腺苷3′，5′二磷酸钠盐和丙氨酸(1∶1000)的剂量响应曲线。
图10示出对于腺苷3′，5′二磷酸钠盐和丙氨酸(1∶100)的剂量响应曲线。
图11示出对于腺苷3′，5′二磷酸钠盐和丙氨酸(1∶10)的剂量响应曲线。
图12示出对于腺苷3′，5′二磷酸钠盐的剂量响应曲线。
图13示出肌苷单磷酸(IMP)用于激活猫T1R1/T1R3的剂量响应曲线。IMP用作由图1-13和38-45所描述的实验的对照。
图14示出结合IMP和L-丙氨酸的猫T1R1/T1R3的VFT结构域的总体结构模型。示出L-丙氨酸和IMP结合在VFT结构域的上叶和下叶(upper and lower globes)之间的活性位点。
图15示出结合L-丙氨酸的猫T1R1 VFT的模型。L-丙氨酸结合VFT结构域的铰链区。示出L-丙氨酸和下面的T1R1氨基酸之间的推定的氢键、盐桥和Pi-阳离子相互作用：Thr149、Ser172、Tyr220、Thr148、Glu170和Asp302。相互作用被示出为虚线。Glu170和Asp302协调结合的氨基酸的两性离子氮，同时静电地不支持L-谷氨酸和L-天冬氨酸(其为人类鲜味受体的天然配体)的结合。
图16示出了猫T1R1 VFT结合GMP的计算机模型。GMP的磷酸与His47、His71、Arg277和Asn69之间的、GMP的糖与Asp302和Ser306之间的以及GMP碱基与Ser384、His308和Ala380之间的推定的氢键和盐桥相互作用被示为虚线。
图17示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1的Asp302可同时协调结合的氨基酸(L-丙氨酸，图左)的两性离子骨架氮和结合的核苷酸(GMP，图右)的糖分子。
图18示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1和结合的3′5′二磷酸之间推定的相互作用。
图19示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1和结合的XMP之间推定的相互作用。
图20示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1和结合的N-乙酰基-5′-GMP之间推定的相互作用。
图21示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1和结合的2′-3′AEC-5′-AMP之间推定的相互作用。
图22示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1和结合的5′d-GMPS之间推定的相互作用。
图23示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1和结合的5′-O-2-硫代二磷酸之间推定的相互作用。
图24示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1和结合的6-硫代鸟苷-5′-O-单磷酸之间推定的相互作用。
图25示出猫T1R1 VFT的计算机模型，表明T1R1和结合的CMP之间推定的相互作用。
图26示出结合腺苷3′5′二磷酸的猫T1R1 VFT的计算机模型。腺苷3′5′二磷酸的磷酸与His71、His47、Asn69、Arg281、Arg277、His308和Ile309之间的、腺苷3′5′二磷酸的糖与Asp302和Ser306之间的以及腺苷3′5′二磷酸碱基和Ser384之间的推定的氢键和盐桥相互作用被示出为虚线。
图27示出猫T1R1跨膜结构域的计算机模型。示出跨膜化合物N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯对接进入T1R1的跨膜区域内。
图28示出N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机模型。
图29示出2-氨基-N-苯乙基苯甲酰胺对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机模型。
图30示出N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)烟酰胺对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机模型。
图31示出在1-苄基-3-(2-(5-氯噻吩-2-基)-2-氧代乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机模型。
图32示出(2，2-二苯基乙酰基)氨基甲酸乙酯对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机模型。
图33示出为2-((3，5-二氯苯基)氨基甲酰基)环己烷羧酸对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机模型。
图34示出N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机模型。
图35示出在1-苄基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图36示出1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2(3H)-酮衍生物化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图37示出对于1-苄基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮的剂量响应曲线。
图38示出1-(2-溴苯基)-3-((1R，2S)-2-羟基-2，3-二氢-1H-茚-1-基)脲的剂量响应曲线。
图39示出对于N-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-丙基戊酰胺的剂量响应曲线。
图40示出对于N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的剂量响应曲线。
图41示出对于N-(2-氨基-2-氧代-1-苯基乙基)-3-氯-4，5-二甲氧基苯甲酰胺的剂量响应曲线。
图42示出对于(E)-3-(4-甲氧基苯基)-N-(戊-3-基)丙烯酰胺的剂量响应曲线。
图43示出对于2-((5-(4-(甲硫基)苯基)-2H-四唑-2-基)甲基)吡啶的剂量响应曲线。
图44示出在GMP和苯丙氨酸的存在下对于N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的剂量响应曲线。
图45示出绘制在GMP和苯丙氨酸的存在下对于N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的ΔF/F0值的曲线图。
图46示出通过用于图1-14和38-45所描述的实验的激活猫T1R1/T1R3的阳性和阴性对照的剂量响应曲线。在0.2mM的IMP的存在下测定对于氨基酸的剂量响应曲线。在20mM丙氨酸的存在下测定对于核苷酸的剂量响应曲线。
图47示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图48示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图49示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图50示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图51示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图52示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图53示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图54示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图55示出根据所公开的主题的一个示例性实施方案的跨膜化合物对接进入T1R1的跨膜区域内的计算机建模。
图56A-B示出(A)1，3-二苄基嘧啶-2，4，6(1H，3H，5H)-三酮在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)1，3-二苄基嘧啶-2，4，6(1H，3H，5H)-三酮单独在缓冲液中，或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图57A-B示出(A)4-苄基-3-丁基-1-(2-氧代-2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-1，2，4-三唑-5(4H)-酮在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)4-苄基-3-丁基-1-(2-氧代2-(吡咯烷-1-基)乙基)-1H-1，2，4-三唑-5(4H)-酮单独在缓冲液中或在20mML-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图58A-B示出(A)2-((3，5-二氯苯基)氨基甲酰基)环己烷羧酸在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)2-((3，5-二氯苯基)氨甲酰基)环己烷羧酸单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图59A-B示出(A)4-乙酰氨基-N-(1-(2-羟乙基)-3-苯基-1H-吡唑-5-基)苯甲酰胺在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)4-乙酰氨基-N-(1-(2-羟乙基)-3-苯基-1H-吡唑-5-基)苯甲酰胺单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图60A-B示出(A)(二苯基乙酰基)-氨基甲酸乙酯在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)(二苯基乙酰基)-氨基甲酸乙酯单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图61A-B示出(A)N，N′-(丁烷-1，4-二基)二烟酰胺在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)N，N′-(丁烷-1，4-二基)二烟酰胺单独在缓冲液中或在20mML-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图62A-B示出(A)N-苯乙基烟酰胺在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)N-苯乙基烟酰胺单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mML-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图63A-B示出(A)2-氨基-N-苯乙基苯甲酰胺在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)2-氨基-N-苯乙基苯甲酰胺单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图64A-B示出(A)N-苯乙基苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)N-苯乙基苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图65A-B示出(A)N-苯乙基苯甲酰胺在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)N-苯乙基苯甲酰胺单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图66A-B示出(A)N-苯甲酰基-DL-亮氨酰胺在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)N-苯甲酰基-DL-亮氨酰胺单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图67A-B示出(A)N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)烟酰胺在20mM L-丙氨酸或0.2mMIMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)烟酰胺单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图68A-B示出(A)N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图69A-B示出(A)6-硫代鸟嘌呤核苷-5＇-O-二磷酸(6-T-GDP)在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)6-硫代鸟嘌呤核苷-5＇-O-二磷酸(6-T-GDP)单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图70A-B示出(A)6-氯嘌呤核苷-5＇-O-三磷酸(6-C1-PuTP)在20mM L-丙氨酸或0.2mM IMP的存在下激活T1R1/T1R3，和(B)6-氯嘌呤核苷-5＇-O-三磷酸(6-C1-PuTP)单独在缓冲液中或在20mM L-丙氨酸、0.2mM IMP或20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP两者的存在下激活T1R1/T1R3的剂量响应曲线。
图71示出通过用于图57-75所描述的实验的激活猫T1R1/T1R3的阳性和阴性对照的响应曲线。在0.2mM的IMP的存在下测定对于氨基酸的剂量响应曲线。在20mM丙氨酸的存在下测定对于核苷酸的剂量响应曲线。
图72A-D示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物1-苄基-3-(2-(3，4-二氢-2H-苯并[b][1，4]二氧杂环庚烯-7-基)-2-氧代乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮(激动剂特征评估)，和(B)和(C)在GMP和丙氨酸的存在下(PAM特征评估)。(D)示出来自(A)和(B)的数据的图形表示。跨膜化合物显示出PAM活性。
图73A-F示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物1-苄基-3-(2-(5-氯噻吩-2-基)-2-氧代乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮(激动剂特征评估)，(B)和(C)在GMP和丙氨酸的存在(PAM特征评估)下。(D)示出来自(A)和(B)的数据的图形表示。(E)和(F)示出当GMP浓度保持恒定且Ala浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线，以及当在表达T1R1/T1R3(诱导)的细胞和不表达T1R1(未诱导)的空白对照细胞(mock control cell)中Ala浓度保持恒定且GMP浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线。跨膜化合物显示出PAM活性。
图74A-E示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺(激动剂特征评价)，和(B)在GMP和丙氨酸的存在下(PAM特征评估)。(C)示出来自(A)和(B)的数据的图形表示。(D)和(E)示出当GMP浓度保持恒定且Ala浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线，以及当在表达T1R1/T1R3(诱导，(D))的细胞和不表达T1R1(未诱导，(E))的空白对照细胞中Ala浓度保持恒定且GMP浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线。跨膜化合物显示出激动剂和PAM活性。
图75A-E示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(激动剂特征评估)，和(B)在GMP和丙氨酸的存在下(PAM特征评估)。(C)示出来自(A)和(B)的数据的图形表示。(D)和(E)示出当GMP浓度保持恒定且Ala浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线，以及当在表达T1R1/T1R3(诱导，(D))的细胞和不表达T1R1(未诱导，(E))的空白对照细胞中Ala浓度保持恒定且GMP浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线。跨膜化合物显示出激动剂和PAM活性。
图76A-E示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物N-苄基-D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(激动剂特征评估)，和(B)在GMP和丙氨酸的存在下(PAM特征评估)。(C)示出来自(A)和(B)的数据的图形表示。(D)和(E)示出当GMP浓度保持恒定且Ala浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线，以及当在表达T1R1/T1R3(诱导，(D))的细胞和不表达T1R1(未诱导，(E))的空白对照细胞中Ala浓度保持恒定且GMP浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线。跨膜化合物显示出激动剂和PAM活性。
图77A-E示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物苄基-L-亮氨酸甲酯盐酸盐(激动剂特征评估)，和(B)在GMP和丙氨酸的存在下(PAM特征评估)。(C)示出来自(A)和(B)的数据的图形表示。(C)和(E)示出当GMP浓度保持恒定且Ala浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线，以及当在表达T1R1/T1R3(诱导，(D))的细胞和不表达T1R1(未诱导，(E))的空白对照细胞中Ala浓度保持恒定且GMP浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线。跨膜化合物显示出激动剂和PAM活性。
图78A-E示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物2-苄基氨基-2-苯基乙酸甲酯(激动剂特征评估)，和(B)在GMP和丙氨酸的存在下(PAM特征评估)。(C)示出来自(A)和(B)的数据的图形表示。(D)和(E)示出当GMP浓度保持恒定且Ala浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线，以及当在表达T1R1/T1R3(诱导，(D))的细胞和不表达T1R1(未诱导，(E))的空白对照细胞中Ala浓度保持恒定且GMP浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线。跨膜化合物显示出激动剂和PAM活性。
图79A-E示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物L-苯丙氨酸苄基酯盐酸盐(激动剂特征评估)，和(B)在GMP和丙氨酸的存在下(PAM特征评估)。(C)示出来自(A)和(B)的数据的图形表示。(D)和(E)示出当GMP浓度保持恒定且Ala浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线，以及当在表达T1R1/T1R3(诱导，(D))的细胞和不表达T1R1(未诱导，(E))的空白对照细胞中Ala浓度保持恒定且GMP浓度变化时跨膜化合物的剂量响应曲线。跨膜化合物显示出激动剂和PAM活性。
图80A-B示出T1R1/T1R3的激活：(A)通过单独的跨膜化合物1，3-二苄基嘧啶-2，4，6(1H，3H，5H)-三酮(激动剂特征评估)，和(B)在GMP和丙氨酸的存在下(PAM特征评估)。跨膜化合物显示出激动剂活性。
图81示出猫T1R1受体的核酸序列(SEQ ID NO：1)。
图82示出猫T1R1受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图83示出猫T1R3受体的核酸序列(SEQ ID NO：3)。
图84示出猫T1R3受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
具体实施方式
迄今为止，仍然需要一种风味改良剂，其可以提供期望的鲜味风味水平以增加和/或增强各种猫的宠物食品的适口性。本申请涉及包含至少一种核苷酸衍生物和/或跨膜化合物的风味组合物。该风味组合物可以用于增加适口性和/或增强或改良各种宠物食品的味道，如营养全面的宠物食品。在某些实施方案中，风味组合物可用于增加宠物食品的鲜味味道。风味组合物还可以包括化合物的组合，该化合物包括核苷酸和/或氨基酸，并且可以各种递送系统形式添加到宠物食品中。
1.定义
本说明书中使用的术语通常具有它们在本发明的上下文以及每个术语使用的特定上下文中本领域的通常含义。某些术语将在下面或说明书其它地方讨论，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们方面为从业者提供进一步的指导。
如本文所使用的，权利要求和/说明书中与术语“包含”结合使用的词语“一”或“一个”可以表示“一个”，但其也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的含义一致。进一步地，术语“具有”、“包括”“含有”和“包含”可互换，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放性术语。
术语“约”或“大约”意在本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围，这将部分地取决于如何测量或确定值，即测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可以在3个或多于3个标准偏差内。可选地，“约”可以表示给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％和仍更优选至多1％的范围。可选地，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示在一个值的一个数量级内，优选在5倍内，更优选在2倍内。
如本文所使用的，“味道”是指激活或抑制个体口腔的受体细胞所引起的感觉。在某些实施方案中，味道可以选自由甜味、酸味、咸味、苦味、厚味(kokumi)和鲜味组成的组。在某些实施方案中，“味道”可以包括游离脂肪酸味道。参见，例如Cartoni等人，神经科学杂志(J.of Neuroscience)，30(25)：8376-8382(2010)，其内容在此通过引用并入本文。在某些实施方案中，味道由个体中的“促味剂”引起。在某些实施方案中，促味剂是合成促味剂。在某些实施方案中，促味剂是从天然来源制备。
如本文所使用的，“味道特征”是指味道的组合，例如甜味、酸味、咸味、苦味、鲜味、厚味和游离脂肪酸味道的一种或多种。在某些实施方案中，味道特征是由以相同或不同浓度存在于组合物中的一种或多种促味剂产生。在某些实施方案中，味道特征是指味道或味道的组合的强度，例如由个体或本领域已知的任何测定法所检测的甜味、酸味、咸味、苦味、鲜味、厚味和游离脂肪酸味道。在某些实施方案，修改、改良或变化味道特征中促味剂的组合可以改变个体的感官体验。
在某些实施方案中，“回味”指的是食品从口或口腔移除之后被感知的食品的味道强度。
如本文所使用的，“风味”指的是一种或多种感官刺激，例如，味道(味觉)、气味(嗅觉)、触摸(触觉)和温度(热)刺激的一种或多种。在某些非限制性实施方案中，个体暴露于风味的感官体验可以被归类为对特定风味的特有体验。例如，风味可被个体被鉴别为，但不限于，花、柑橘、浆果、坚果、焦糖、巧克力、胡椒、烟熏、干酪、肉等的风味。如本文所用，风味组合物可以选自液体、溶液、干粉、喷雾剂、膏剂、悬浮液和它们的任何组合。风味剂可以是天然组合物、人造组合物、天然等同物或者它们的任意组合。
如本文可互换使用的，“芳香”和“气味”指的是对刺激的嗅觉反应。例如，而不是通过限制的方式，芳香可以通过由嗅觉系统的气味受体感知的芳香物质产生。
如本文所使用的，“风味特征”指的是感官刺激例如味道，诸如甜味、酸味、苦味、咸味、鲜味、厚味和和游离脂肪酸味道，和/或嗅觉、触觉和/或热刺激的组合。在某些实施方案中，风味特征包括有助于个体的感官体验的一种或多种风味。在某些实施方案种，修改、改良或变化风味特征种刺激的组合可以改变个体的感官体验。
如本文所使用的“混合”，例如，“将本申请的风味组合物或其组合与食品混合”，是指其中在产品形成过程中或这些步骤的一些组合中将风味组合物或风味组合物的各组分混合或添加到成品产品或与产品的一些或所有组分混合的过程。当在混合的上下文中使用时，术语“产品”指的是产品或其任何组分。此混合步骤可包括选自以下步骤的过程：将风味组合物添加到产品，在产品上喷雾风味组合物，在产品上涂布风味组合物，在风味组合物中悬浮产品，在产品上涂装风味组合物，在产品上粘合风味组合物，用风味组合物包封产品，将风味组合物与产品及它们的任何组合混合。风味组合物可以是溶液、液体、干粉、喷雾剂、膏剂、悬浮液和它们的任何组合。
在某些实施方案中，可以在宠物食品的热处理例如杀菌、干馏、注射成型和/或挤出的过程中，由宠物食品中存在的前体化合物产生风味组合物的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物。在某些实施方案中，可以在宠物食品和风味组合物的附加组分的加工过程中产生风味组合物的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物，附加组分例如核苷酸和/或氨基酸可以通过混合添加到宠物食品。
如本文所使用的，“ppm”是指百万分之一份，其是重量相对参数。百万分之一份为每克的微克数，使得以10ppm存在的组分为每1克集料混合物(aggregate mixture)10微克特定成分。
如本文所使用的，“适口性”可指人类或非人类动物例如伴侣动物食用某一食品的总体意愿。增加食品的“适口性”可导致人类或非人类动物对食品的享受和接受的增加，以确保人类和非人类动物食用“健康量”的食物。本文所用的术语食物的“健康量”是指能够使人类或非人类动物维持或实现有助于其全部总体健康的微量营养素、常量营养素和热量方面摄入的量，例如“马斯宠物护理必需营养素标准(Mars Petcare Essential NutrientStandards)”中所述的。在某些实施方案中，“适口性”可意指人类或非人类动物对一种食品较另一种的相对偏好。例如，当人类或非人类动物显示对两种或更多种食品的一种的偏好，所偏好的食品是更“可口的”，并且具有“增强的适口性”。在某些实施方案中，可以确定一种食品较一种或多种其它食品的相对偏好性，例如，与此同时，例如通过食品的相对消费或指示适口性的偏好的其它适当的测量进行的自由选择比较。适口性可以通过其中动物可以公平获取两种食品的标准测试方案确定，诸如所谓的“双碗试验”或“相对测试”的测试。这种偏好可以由动物的任何感觉引起，但可以与特别是味道、回味、气味、口感和/或质地有关。
术语“宠物食物”或“宠物食品”是指预期由伴侣动物如猫、犬、豚鼠、兔、鸟和马用于消费的产品或组合物。例如，而不是通过限制的方式，伴侣动物可以是“家养”猫如家猫(Felis domesticus)。在某些实施方案中，伴侣动物可以是“家养”犬，例如家犬(Canislupus familiaris)。“宠物食物”或“宠物食品”包括任何食品、饲料、小吃、食品补充剂、液体、饮料、零食、玩具(可咀嚼和/或可食用的玩具)、膳食替代品或膳食替代。
术语“人类食物”或“人类食品”指的是打算由人消费的产品或组合物。“人类食物”或“人类食品”包括任何食品、饲料、小吃、食品补充剂、液体、饮料、零食、玩具(可咀嚼和/或可食用的玩具)、膳食替代品或膳食替代。
在某些实施方案中，“食品”包括人类和/或宠物食品。
本文使用的“营养全面的”指的是包含对于食品的预期接受者而言的所有已知的必需营养物的食品，例如宠物食品，以基于伴侣动物营养领域公认的或者主管机关所推荐的适当的量和比例。此类食品因此能够作为维持生命的膳食摄入的唯一来源，无需添加补充营养源。
如本文所使用的，“风味组合物”是指至少一种化合物或其生物学上可接受的盐，其调节包括增强、增加、加强、降低、抑制或诱导动物或人中的天然或合成的促味剂、风味剂、味道特征、风味特征和/或质地特征的味道、气味、风味和/或质地。在某些实施方案中，风味组合物包含化合物或其生物上可接受的盐的组合。在某些实施方案中，风味组合物包含一种或多种赋形剂。
本文所使用的“激动剂”是指至少一种化合物或其生物学上可接受的盐，其调节包括增强、增加、加强或诱导其结合或以其它方式与受体相互作用的活性。在某些实施方案中，该术语被用于描述单独作用以激活受体的化合物或描述“正变构调节剂”(也称为“PAM”)的化合物，其积极地提高其它激动剂的作用。
如本文所用，“协同”、“协同地”或“协同效应”是指由两种或更多种单独的组分所产生的效果，其中总效果是由这些组分产生的，组合使用时的效果大于各组分单独作用的各效果的总和。如本文所用，术语“协同有效”指的是核苷酸衍生物和/或跨膜化合物和另外的化合物(例如，氨基酸、核苷酸或结合T1R1或T1R3跨膜结构域的化合物)的任何组合量(参见，例如Zhang等人，美国国家科学院院刊，2008年12月30日；105(52)：20930-4，电子版(Epub)2008年12月22日)，其表现出T1R1/T1R3受体的协同激活或宠物食品的适口性增加。
术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链C1-C20(优选C1-C6)烃基(不含有不饱和键)，其通过单键连接至分子的其余部分，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1，1-二甲基乙基(叔丁基)。
术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键并且可以是直链或支链的C2-C20(优选C2-C12)脂肪族烃基，例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)、异丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基。
术语“炔基”是指含有至少一个碳-碳三键并且可以是直链或支链的C2-C20(优选C2-C12)脂肪族烃基，例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基。
术语“环烷基”指不饱和的非芳族单环或多环烃环系统(包含，例如C3-C6)，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基。多环环烷基(包含，例如C6-C15)的实例包括桥连环基或螺二环基的全氢萘基、金刚烷基和降冰片基，例如螺(4，4)壬-2-基。
术语“环烷基烷基”是指如上所定义的环烷基直接连接到如上所定义的烷基，结果产生稳定的结构，如环丙基甲基、环丁基乙基或环戊基乙基。
术语“醚”是指并入到烷基链中的如上定义的具有至少一个氧的烷基或环烷基，例如甲基乙基醚、二乙醚、四氢呋喃。这些基团也可以被描述为烷氧基烷基或烷氧基环烷基。
术语“氨基烷基”是指如上所定义的具有至少一个氮原子的烷基或环烷基，例如正丁基胺和四氢嗪。
术语“芳基”是指具有约6至约14个碳原子的芳族基团，例如苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基。
术语“芳烷基”是指如上所定义的芳基直接键合至如上所定义的烷基，例如，-CH2C6H5和-C2H4C6H5。
术语“杂环的”是指稳定的3元至15元环基团，其由碳原子和一个或多个例如一个至五个选自由氮、氧和硫组成的组中的杂原子组成。出于本申请的目的，杂环基可以是单环或双环环系统，其可以包括稠合或桥环系统，并且该杂环基团中的氮、碳、氧或硫原子可以任选地被氧化成各种氧化态。此外，氮原子可任选地被季铵化；环基团可以部分或完全饱和，或环基团可以是完全不饱和的(即，芳香杂环或杂芳基芳族)。杂环基可以在导致产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接至主结构。
术语“杂芳基”是指其中环为芳族的杂环。
术语“杂芳基烷基”是指直接键合到烷基的如上定义的杂芳基。杂芳基烷基可在导致产生稳定结构的烷基的任何碳原子处连接至主结构。
术语“杂环基”是指如上定义的杂环基环基团。杂环基环基团可在导致产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接至主结构。
在某些实施方案中，术语“鲜味受体”是指G蛋白偶联受体(GPCR)，例如T1R1/T1R3GPCR。鲜味受体可以是例如猫、犬、人类或非人类哺乳动物的鲜味受体。
在某些实施方案中，猫T1R1是包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源(同源性，如该术语在本文中使用的，可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA测量)的序列的蛋白，并且其被包含如SEQ ID NO：1所示的序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源(同源性，如该术语在本文中使用的，可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA测量)的序列的核酸编码。
在某些实施方案中，猫T1R3是包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源(同源性，如该术语在本文中使用的，可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA测量)的序列的蛋白，并且其被包含如SEQ ID NO：3所示的序列或与其至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同源(同源性，如该术语在本文中使用的，可以使用标准软件诸如BLAST或FASTA测量)的序列的核酸编码。
2.核苷酸衍生物
本发明涉及包含至少一种核苷酸衍生物的风味组合物。在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物是鲜味味道增强化合物。本文所公开的核苷酸衍生物通过核苷酸衍生物在猫科T1R1/T1R3受体(“鲜味受体”)的结合口袋中的计算机建模来鉴别。风味组合物可用于增强或改良宠物食品的适口性、味道或风味。风味组合物可以包括化合物的组合，例如一种或多种核苷酸衍生物和/或一种或多种氨基酸和/或一种或多种核苷酸和/或一种或多种跨膜化合物的组合，如本文所描述的，并且可以各种递送系统形式添加到宠物食品组合物中。
在某些实施方案中，核苷酸衍生物可以是在以下的表2和表5-13中列出的化合物。
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-1的化合物：
其中R1选自由取代的或未取代的嘌呤或取代的或未取代的嘧啶组成的组；
其中R2选自单磷酸、二磷酸、三磷酸、OP(W)(OH)2、-OP(W)(OH)OP(W)(OH)2、-OP(W)(OH)OP(W)(OH)OP(W)(OH)2、-OS(O)2芳基(H)、-OS(O)2芳基(CH3)、-P(W)(OH)2、-OP(W)(OH)OS(O)2(OH)、-OP(W)(OH)Z、-P(W)(OH)OP(W)(OH)2、-O(CH2)1-4OP(W)(OH)2、-OS(W)(OH)2、-OP(W)(OH)CH2OP(W)(OH)2、-OP(W)(OH)OP(W)O(CH2)1-4R18、-(CH2)0-4COOH、-(CH2)0-4S(O)(OH)2-(CH2)0-4C(O)NHOH和-(CH2)0-4B(OH)2；
其中X选自O、S、N(R3)和CH2；
其中W选自O和S；
其中R3选自H和CH3；
其中R4、R5、R14、R15、R18独立地选自H、OH、SH、CH2、CH3、OR6、SR6、CH2CH3、低级烷基支链和无支链(C1-C6)、XC(O)低级烷基、-XC(O)CH2Ph、-P(W)(OH)2、-XC(O)PhR11、-OP(O)(OH)O、OCH3、N(R11，R17)、-O(C)n R11、R17O-、N(H或独立的低级烷基)2-3和COOR11、-OC(W)NH(CH2)1- 6NH2、-OC(W)NH(CH2)1-6R44；
其中R44是H、OH、SH、CH2、CH3、OR6、SR6、CH2CH3、低级垸基支链和无支链(C1-C6)、XC(O)低级烷基、-XC(O)CH2Ph、-P(W)(OH)2、-XC(O)PhR11、-OP(O)(OH)O、OCH3、N(R11，R17)、-O(C)n R11、R17O-、N(H或独立的低级烷基)2-3或COOR11、-OC(W)NH(CH2)1-6NH2；
其中Z选自哌啶、吗啉、哌嗪、N-甲基哌嗪、N(R16)(R17)；和
其中R6、R11、R16和R17独立地选自H、OH、SH、CH2、CH3、OCH3、COOR、N(R12)(R13)、CH2CH3、低级烷基支链和无支链(C1-C6)、XC(O)低级垸基、-XC(O)CH2Ph、-P(W)(OH)2、-XC(O)PhR12、-OP(O)(OH)O、OCH3、N(R12，R13)、-O(C)n R12、R13O-、N(H或独立的低级烷基)2-3和COOR12；和
其中R12和R13独立地选自H、OH、SH、CH2、CH3、OCH3和CH2CH3。
在某些实施方案中，式Nt-1中的R1选自
在某些实施方案中，式Nt-1中的R1选自表1所列的化合物。
表1.式Nt-1的核苷酸衍生物的R1基团
本文所描述的取代基团中的取代基，例如“取代的烷基”、“取代的芳基”、“取代的呋喃”、“取代的噻吩”、“取代的烷基”、“取代的苯基”、“取代的嘧啶”或“取代的萘“可以与选自本申请所描述的以下基团的一种或多种相同或不同：氢、卤素、甲基、酰氨基、乙酰基、硝基(-NO2)、羟基(-OH)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、OCH3、亚甲二氧基、CN、NO2、COOH、SO3H、S(O)1- 2CH3、S(O)1-2芳基、SCH3、OH、N(R)1-2、COOCH3、OC(O)CH3、SH、磺酰基、亚磺酰氨基、硫酸根、氰基、叠氮基、三氟甲基(-CF3)、甲氧基(-OCH3)、氨基甲酸叔丁酯(-Boc)，或者选自以下的任选地取代的基团：烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷基、醚、羧基、羟基、杂芳基、杂芳基烷基、磺酰基和杂环。“取代”的官能可具有一个或一个以上的取代基。
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-2的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-3的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-4的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-5的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-6的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-7的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-8的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-9的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-10的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-11的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-12的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-13的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-14的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-15的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-16的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-17的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-18的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-19的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-20的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-21的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-22的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-23的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-24的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-25的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-26的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-27的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-28的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-29的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-30的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-31的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-32的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-33的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-34的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-35的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-36的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-37的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-38的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-39的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-40的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-41的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-42的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-43的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-44的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-45的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-46的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-47的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-48的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-49的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-50的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-51的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-52的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-53的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-54的化合物：
在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物包括具有以下结构的式Nt-55的化合物：
在某些实施方案中，核苷酸衍生物可以是式NT-1至Nt-55的化合物的盐、立体异构体或可食用形式和/或表2和表6-14所列的化合物。
表2：核苷酸衍生物
在某些实施方案中，本发明的核苷酸衍生物包括核苷酸衍生物的盐，例如但不限于乙酸盐或甲酸盐。在某些实施方案中，所述核苷酸衍生物的盐包括经由离子键与阳离子(+)(例如，但不限于，Al3+、Ca2+、Na+、K+、Cu2+、H+、Fe3+、Mg2+、NH4 +和H3O+)键合的阴离子(-)(例如，但不限于，Cl-、O2-、CO3 2-、HCO3 -、OH-、NO3 -、PO4 3-、SO4 2-、CH3COO-、HCOO-和C2O4 2-)。在其它实施方案中，核苷酸衍生物的盐包括经由离子键与阴离子(-)键合的阳离子(+)。
在某些实施方案中，本申请的核苷酸衍生物可通过猫科T1R1/T1R3受体(“鲜味受体”)的计算机建模来鉴别，其中本申请的核苷酸衍生物包含装配到猫T1R1/T1R3受体的结合位点内的结构。
在某些实施方案中，本申请的核苷酸衍生物通过体外测定来鉴别，其中所述核苷酸衍生物激活在体外由细胞表达的猫科T1R1/T1R3受体。在某些实施方案中，核苷酸衍生物单独激活该受体，或与其它T1R1/T1R3结合剂如本文所描述的核苷酸、氨基酸和跨膜化合物组合激活，和/或与本文描述的结合一种或多种其它受体的氨基酸组合激活。在某些实施方案中，体外测定包括本申请的实施例部分所描述的体外测定法。
2.1 T1R1核苷酸结合位点
本申请还提供了用于调节鲜味受体例如T1 R1/T1R3受体的组合物，其中所述组合物与一种或多种氨基酸在鲜味受体的捕蝇草结构域中相互作用。在某些实施方案中，捕蝇草结构域(Venus Flytrap，VFT)存在于T1R1中。在某些实施方案中，与组合物相互作用的氨基酸包括Thr449、Ser172、Glu170、Glu301、His71、His47、Arg277、His308、Asn69、Asn302、Ser306、Ser384、Asp302、Ser306和Ala380的一种或多种。
在一个非限制性实施方案中，所述组合物包含核苷酸和/或核苷酸衍生物，其中核苷酸和/或核苷酸衍生物与T1R1的His71、Arg277、His308、Ser306、Ser384、Ala380、His47、Asn69和Asp302的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种相互作用。
在另一个非限制性实施方案中，所述组合物包含核苷酸和/或核苷酸衍生物，其中核苷酸和/或核苷酸衍生物与T1R1的Met383、Ser385、Ile309、Ser107和Asp49的一种、两种、三种、四种或更多种相互作用。
当结合核苷酸和/或核苷酸衍生物时，该VFT的氨基酸残基可以协调核苷酸和/或核苷酸衍生物的磷酸、二磷酸、三磷酸、双磷酸、磷酸模拟物(例如，酸性官能团如COOH、SO3H、NHOH等)，并且包括T1R1的His71、His47、Arg277、His308、Ile309、Asn69、Ser107和Asp49的一种或多种。
在某些实施方案中，核苷酸和/或核苷酸衍生物的至少一种磷酸与T1R1的His71、His47、Arg277、His308和Asn69的一种、两种、三种、四种或更多种相互作用。在一个非限制性实例中，核苷酸和/或核苷酸衍生物与VFT的结合涉及VFT的磷酸结合区域中氨基酸的带负电荷的基团与核苷酸和/或核苷酸衍生物的磷酸之间的相互作用。
所述VFT的氨基酸残基可以协调核苷酸和/或核苷酸衍生物的糖原子(或，例如经修饰的糖或糖替代)，并且可以包括T1R1的Asp302和/或Ser306。
在某些实施方案中，核苷酸和/或核苷酸衍生物的至少一个糖分子与T1R1的氨基酸Asp302和/或Ser306相互作用。
所述VFT的氨基酸残基可以协调核苷酸和/或核苷酸衍生物的含氮碱基，并且可以包括T1R1的Ser384、Ser385、Ala380、Met383、Glu170和Asp302的一种或多种。
在某些实施方案中，核苷酸和/或核苷酸衍生物的含氮碱基与T1R1的Ser384、His308和Ala380的一种、两种或更多种相互作用。
在其它非限制性实施方案中，核苷酸和/或核苷酸衍生物的糖分子与VFT的Asp302相互作用，其中Asp302被调整为同时协调结合的氨基酸的两性离子骨架氮和核苷酸或核苷酸衍生物的糖。
在某些实施方案中，根据本文描述的相互作用的任何组合，例如一种、两种、三种或更多种相互作用，组合物与鲜味捕蝇草结构域(VFT)相互作用。核苷酸和/或核苷酸衍生物与VFT之间的相互作用还可以包括添加至该核苷酸和/或核苷酸衍生物与VFT的相互作用能的附加的疏水相互作用。
在某些实施方案中，组合物和一种或多种氨基酸之间的相互作用包括一个或多个氢键、共价键、非共价键、盐桥、物理相互作用以及它们的组合。相互作用也可以是本领域中已知的配体受体相互作用的任何相互作用特性。这种相互作用可通过例如定点诱变、X射线晶体学、X射线或其它光谱学方法、核磁共振(NMR)、交联评估、质谱法或电泳、基于已知激动剂的位移测定、结构确定和它们的组合测定。在某些实施方案中，相互作用经由计算机确定，例如通过理论方法，如使用分子对接、分子建模、分子模拟或本领域普通技术人员已知的其它手段将化合物对接进入VFT结构域。
本申请还提供了用于鉴别调节鲜味受体的活性例如T1R1的化合物的方法，其中所述化合物是基于其与本文所述的存在于T1R1的VFT结构域的一种或多种氨基酸相互作用的能力来鉴别。
在某些实施方案中，该方法包括使测试剂与猫科T1R1鲜味受体接触，检测在猫科T1R1鲜味受体的VFT相互作用位点中测试剂与又一种氨基酸之间的相互作用，以及选择与一种或多种氨基酸相互作用的测试剂作为所述化合物。
3.跨膜化合物
本发明涉及包含至少一种跨膜化合物的风味组合物。在某些实施方案中，跨膜化合物是鲜味味道增强化合物。本文所公开的跨膜化合物通过推定的激动剂在猫科T1R1/T1R3受体(“鲜味受体”)的T1R1的跨膜区域内的计算机建模来鉴别。因此，在某些实施方案中，跨膜化合物是与包括T1R1的跨膜结构域的T1R1的区域相互作用(例如，结合)的组合物。在某些实施方案中，与T1R1的跨膜结构域的这种相互作用激动T1R1/T1R3或鲜味受体。在其它实施方案中，跨膜化合物与其它T1R1激动剂或调节剂协同作用以调节T1R1/T1R3或鲜味受体的活性。
风味组合物可用于增强或改良宠物食品的适口性、味道或风味。风味组合物可以包括化合物的组合，例如跨膜化合物和/或核苷酸和/或核苷酸衍生物和/或氨基酸的组合，并且可以各种递送系统形式添加到宠物食品组合物中。
3.1胺衍生物I
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-1的化合物：
其中X1选自由O和S组成的组；
其中n1为1-3；
其中n2为0-4(其中当n为0时，存在化学键)；
其中n4为0-3；
其中R1、R2和R3独立地选自由H、＝O、＝S、支链或无支链的和取代或未取代的低级烷基(C1-C8)和R5组成的组；
其中R4选自由以下组成的组：H、支链或无支链的低级烷基(C1-C8)和(CH2)n2芳基；
其中R5选自由以下组成的组：H、CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、CH(CH3)CH2CH3、CH2CH2SCH3、CH2SH、CH2SeH、CH2OH、CH(OH)CH3、CH2C(O)NH2、CH2CH2C(O)NH2、CH2CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2(1H-咪唑-基)(CH2(1H-imadazole-y1))、CH2(CH2)2CH2NH2、CH2COOH、CH2CH2COOH、CH2C6H5、CH2(4-羟基苯基)、CH2[3-基-(1H-吲哚)]、CH2(环戊基)、CH2(环己基)、CH2(茚满基)、独立的支链或无支链的低级烷基(C1-C10)、(CH2)0-4PH、c-C3H5、c-C4H7、c-C5H9、c-C6H10、苯基、联芳基、(CH2)n2芳基、吡啶、噻吩(thiophine)、CH2Ph、CH2吡啶和CH2噻吩；
芳基和烷基(支链和无支链)基团可任选地被以下取代：甲基、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n4R1、C(O)R11、C(O)NR11R12、CN、NR11R12、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(F、Cl、Br、I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2、OP(＝X1)(OR1)2；
其中R5和R6可以连接以形成环状环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基(即螺环)；
其中R6选自由H和支链或无支链的低级烷基(C1-C4)组成的组；
其中R7选自由以下组成的组：H、AA、OH、O、支链或无支链的低级烷基(C1-C6)、O(CH2)n1芳基、NR11R12、N(R14)OH、C(R8)(R9)、芳基和杂芳基；
其中R8和R9独立地选自下组：H、支链或无支链的低级烷基(C1-C6)、芳基、烷基芳基和烷基杂芳基；
其中R11和R12独立地选自由以下组成的组：H、CH3、支链或无支链的低级烷基(C1-C6)、苯基、芳基和(CH2)n1芳基；
其中R13选自由H、CH3、CH2CH3、CH2芳基和叔丁基组成的组；
其中R14选自由H和CH3组成的组；和
其中AA选自由天然存在的α氨基酸或(R)或(S)-构型(即，蛋白氨基酸)组成的组。
在一个非限制性实施方案中，所有的不对称构型被考虑用于本发明公开的制剂。
在某些实施方案中，芳基具有其标准化学含义，并且可以包括以下但不限于：苯(Ph)、吡啶、噻吩、呋喃、萘基、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、喹诺酮、异喹啉、吡咯、N-(甲基)吡咯基、咪唑、噻唑、嘧啶、异唑、唑(oxazole)、异吲哚、吲嗪、嘌呤、吡嗪和哒嗪(pyrieazine)。
在某些实施方案中，芳基的连接可以位于不同的碳中心，如将被本领域普通技术人员所理解的。
在其它非限制性实施方案中，当该化合物包含两个芳环(例如，苯基)时，一个或两个环可以被联芳基环系统取代。这种联芳基环系统包括，例如苯基-苯基、苯基-吡啶基、苯基-噻吩、噻吩-噻吩和苯基-呋喃。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-2的化合物：
其中R4、R5、R6、R7、X1和n1如式Tm-1中所定义。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-20的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-21的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-22的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-23的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-24的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-25的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-26的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-27的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-28的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-29的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-30的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-31的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-32的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-33的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-34的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-35的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-36的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-37的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-38的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-39的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-40的化合物：
3.2胺衍生物II
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-3的化合物：
其中X1选自由O和S组成的组；
其中n1和n2为0-4(其中，当n1和/或n2为0时，存在化学键)；
其中R1选自由以下组成的组：支链或无支链的低级烷基(C1-C10)、(CH2)n2Ph、c-C3H5、c-C4H7、c-C5H9、c-C6H10、苯基、(CH2)n2芳基、Ph、吡啶、噻吩(thiophine)、CH2Ph、CH2吡啶、CH2噻吩、O-芳基、Ph、吡啶、噻吩(thiophene)、呋喃、萘基、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、喹诺酮、异喹啉、吡咯、N-(甲基)吡咯基、咪唑、噻唑、嘧啶、异唑、唑、异吲哚、吲嗪、嘌呤、吡嗪、哒嗪(pyrieazine)、O-烷基(C1-C6)、联芳基和OR1(例如，氨基甲酸酯)，
芳基和烷基(支链和无支链的)基团可任选地被以下取代：甲基、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n4R1、C(O)R11、C(O)NR11R12、CN、NR11R12、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(F、Cl、Br、I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2或OP(＝X1)(OR1)2；
其中R2选自由H、CH3、(CH2)和芳基组成的组；
其中R3、R4和R5独立地选自由以下组成的组：H、支链或无支链的低级烷基(C1-C8)、(CH2)n2芳基和R1；
其中R11和R12独立地选自由H、CH3、支链或无支链的低级烷基(C1-C6)、苯基、芳基和(CH2)n1芳基组成的组；
其中R13选自由H、CH3、CH2CH3、CH2芳基和叔丁基组成的组。
在某些实施方案中，芳基具有其标准化学含义，并且可以包括以下但不限于：苯(Ph)、吡啶、噻吩、呋喃、萘基、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、喹诺酮、异喹啉、吡咯、N-(甲基)吡咯基、咪唑、噻唑、嘧啶、异唑、唑、异吲哚、吲嗪、嘌呤、吡嗪和哒嗪(pyrieazine)。
在某些实施方案中，芳基的连接可以位于不同的碳中心，如将被本领域普通技术人员所理解的。
在某些实施方案中，不对称中心可以是(R)或(S)构型，如将被本领域普通技术人员所理解的。
在一个非限制性实施方案中，所有的不对称构型被考虑用于本发明公开的制剂。
在其它非限制性实施方案中，当该化合物包含两个芳环(例如，苯基)时，一个或两个环可以被联芳基环系统取代。这种联芳基环系统包括，例如苯基-苯基、苯基-吡啶基、苯基-噻吩、噻吩-噻吩和苯基-呋喃。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-4的化合物：
其中R1和R2独立地选自由以下组成的组：芳基，环烷基(例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基)，和杂芳基(例如但不限于Ph、吡啶、噻吩、呋喃、萘基、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、喹诺酮、异喹啉、吡咯、N-(甲基)吡咯基、咪唑、噻唑、嘧啶、异唑、唑、异吲哚、吲嗪、嘌呤、吡嗪和哒嗪(pyrieazine)；
其中芳基或环烷基可任选地被以下取代：甲基、OH、SH、OCH3、SCH3、COOH、COOR13、S(O)n4R1、C(O)R11、C(O)NR11、R12、CN、NR11C(O)R12、芳基、亚甲二氧基、烷基(C1-C5)、CH2SSCH2CH(COOH)(NH2)、卤素(F、Cl、Br、I)、NO2、NHC(＝NH)NH2、CHO、CF3、P(＝X1)(OR1)2或OP(＝X1)(OR1)2；
其中环烷基可任选地包含在环中的杂原子(例如，O、N和/或S)，例如哌啶、哌嗪、四氢噻吩、吡喃、吡咯烷或四氢呋喃；
其中n1＝0-4；
其中R11、R12、R13和X1如本文所定义；和
其中n4＝0-4。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-41的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-42的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-43的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-44的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-45的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-46的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-47的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-48的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-49的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-50的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-51的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-52的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-53的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-54的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式的Tm-55的化合物：
3.3仲班酸衍生物
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-6的化合物：
其中R1或R2独立地选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、羟基、氢、取代或未取代的醚、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的茚基、或取代或未取代的茚满基。
在某些实施方案中，R1或R2可以包含以下结构：
其中R3、R4、R5、R6和R7独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、氰基、叠氮基、羟基、取代或未取代的磺酰基、取代或未取代的亚磺酰氨基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的酰氨基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的醚、取代或未取代的羧基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的喹啉基、或取代或未取代的杂芳烃基(heteroarenyl)、或取代或未取代的茚、或取代或未取代的茚满基。在某些实施方案中，R3、R4、R5、R6和R7的两种或更多种可以一起形成环，该环可以是杂环(即，含有一个或多个杂原子)或它可以是完全的碳环，并且可独立地为饱和或不饱和的。
本文所述的取代基团中的取代基，例如“取代的醚”、“取代的羧基”、“取代的酰基”、“取代的磺酰基”、“取代的烷基”、“取代的烯基”、“取代环烷基”、“取代的环烷基烷基”、“取代的芳烷基”、“取代的芳基”、“取代的杂环”、“取代的杂芳基烷基”、“取代的杂芳基”、“取代的萘基”、“取代的苯基”、“取代的噻吩基”、“取代的苯并噻吩基”、“取代的吡啶基”、“取代的吲哚基”、“取代的异喹啉基”、“取代的喹啉基”、“取代的苯并噻唑基”、“取代的杂芳基”、“取代的茚基”或“取代茚满基”，可以与选自本申请所描述的以下基团的一种或多种相同或不同：氢、卤素、酰氨基、乙酰基、硝基(-NO2)、羟基(-OH)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、磺酰基、亚磺酰氨基、硫酸根、巯基、氰基、叠氮基、三氟甲基(-CF3)、甲氧基(-OCH3)、氨基甲酸叔丁酯(-Boc)，或者选自以下任选地被取代的基团：烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳基烷基、醚、羧基、羟基、杂芳基、磺酰基和杂环。“取代”的官能可具有一个或一个以上取代基。
在一个非限制性实施方案中，R1和R2是未取代的苯基。
在一个非限制性实施方案中，R1是未取代的苯基并且R2为取代的苯基。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-7的化合物：
其中R1和R2如上对于式Tm-6所定义。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-5的化合物：
其中X1选自由O、N(R3)、S组成的组；
其中X2和X3独立地选自由O和S组成的组；
其中R3选自由以下组成的组：H和支链或无支链的低级烷基(C1-C4)；和
其中R1和R2如上对于式Tm-6所定义，并且还可以是(CH2)nC(＝X1)R1，(CH2)nC(＝X1)R2，其中X1是O或S，n为0-4。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-9的化合物：
其中X1-5独立地选自由O和S组成的组；和其中R1和R2如上对于式Tm-6所定义。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-10的化合物：
其中X1-5独立地选自由O和S组成的组；和其中R1和R2如上对于式Tm-6所定义。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-11的化合物：
其中X1-3独立地选自由O和S组成的组；和其中R1和R2如上对于式Tm-6所定义。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-56的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-57的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-58的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-59的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-60的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-61的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-62的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-63的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-64的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-65的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-66的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-67的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-68的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-69的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-70的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-71的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-72的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-73的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-74的化合物：
3.4咪唑并吡啶酮衍生物
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-19的化合物：
其中R1或R2独立地选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、羟基、氢、取代或未取代的醚、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的茚基、或取代未取代的茚满基。
在某些实施方案中，R1或R2可以包含以下结构：
其中R3、R4、R5、R6和R7独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、氰基、叠氮基、羟基、取代或未取代的磺酰基、取代或未取代的亚磺酰氨基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的酰氨基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的醚、取代或未取代的羧基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的喹啉基、或取代或未取代的杂芳烃基(heteroarenyl)、或取代或未取代的茚、或取代或未取代的茚满基。在某些实施方案中，R3、R4、R5、R6和R7的两种或更多种可以一起形成环，该环可以是杂环(即，含有一个或多个杂原子)或它可以是完全的碳环，并且可独立地为饱和或不饱和的。
本文所述的取代基团中的取代基，例如“取代的醚”、“取代的羧基”、“取代的酰基”、“取代的磺酰基”、“取代的烷基”、“取代的烯基”、“取代环烷基”、“取代的环烷基烷基”、“取代的芳烷基”、“取代的芳基”、“取代的杂环”、“取代的杂芳基烷基”、“取代的杂芳基”、“取代的萘基”、“取代的苯基”、“取代的噻吩基”、“取代的苯并噻吩基”、“取代的吡啶基”、“取代的吲哚基”、“取代的异喹啉基”、“取代的喹啉基”、“取代的苯并噻唑基”、“取代的杂芳基”、“取代的茚基”或“取代茚满基”，可以与选自本申请所描述的以下基团的一种或多种相同或不同：氢、卤素、酰氨基、乙酰基、硝基(-NO2)、羟基(-OH)、氧代(＝O)、硫代(＝S)、磺酰基、亚磺酰氨基、硫酸根、巯基、氰基、叠氮基、三氟甲基(-CF3)、甲氧基(-OCH3)、氨基甲酸叔丁酯(-Boc)，或者选自以下任选地被取代的基团：烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳基烷基、醚、羧基、羟基、杂芳基、磺酰基和杂环。“取代”的官能可具有一个或一个以上取代基。
在一个非限制性实施方案中，R1和R2是未取代的苯基。
在一个非限制性实施方案中，R1是未取代的苯基并且R2为取代的苯基。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-12的化合物：
其中Y选自由O、S和N(R4)组成的组；
其中X1-3是独立地选自由C、O、N和S组成的组；
其中R3是取代或未取代的芳族取代基，其中取代基是例如：H、OR4、S(O)nR4、N(R4)(R5)、CN、COOH、COOR、C(O)N(R4)(R5)、SO2N(R4)(R5)、卤素(例如Cl、Br、F、I)、支链或无支链的取代或未取代的低级烷基(C1-C8)、芳基，联芳基、P(O)(OH)2、NHOH、B(OH)2、C(＝NH)NH2、NHC(＝NH)NH2、NO2、CF3、-OCH2O-(即，亚甲基二氧基)、支链或无支链的取代或未取代的低级炔烃(C2-C6)、支链或无支链取代或未取代的低级烯烃(C2-C6)、(CH2)n芳基；
其中R4和R5独立地为H、支链或无支链的取代或未取代的低级烷基(C1-C8)、支链或无支链的取代或未取代的低级炔烃(C2-C6)、支链或无支链的取代或未取代的低级烯烃(C2-C6)、芳基、(CH2)n芳基；
其中n为0-4；和
其中R1和R2为对于式Tm-19所描述的。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-13的化合物：
其中Y选自由O、S和N(R4)组成的组；
其中X1-4是独立地选自由C、O、N和S组成的组；
其中R3是取代或未取代的芳族取代基，其中取代基是例如：H、OR4、S(O)nR4、N(R4)(R5)、CN、COOH、COOR、C(O)N(R4)(R5)、SO2N(R4)(R5)、卤素(例如Cl、Br、Fl、I)、H、支链或无支链的取代或未取代的低级烷基(C1-C8)、芳基，联芳基、P(O)(OH)2、NHOH、B(OH)2、C(＝NH)NH2、NHC(＝NH)NH2、NO2、CF3、-OCH2O-(即，亚甲基二氧基)、支链或无支链的取代或未取代的低级炔烃(C2-C6)、支链或无支链取代或未取代的低级烯烃(C2-C6)、(CH2)n芳基；
其中R4和R5独立地为H、支链或无支链的取代或未取代的低级烷基(C1-C8)、支链或无支链的取代或未取代的低级炔烃(C2-C6)、支链或无支链的取代或未取代的低级烯烃(C2-C6)、芳基、(CH2)n芳基；
其中n为0-4；和
其中R1和R2为对于式Tm-19所描述的。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-14的化合物：
其中X选自由C、O、N和S组成的组；和
其中R1-3为如上对于式Tm-19、Tm-12和Tm-13所描述的。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-15的化合物：
其中R1-2为如上对于式Tm-19、Tm-12和Tm-13所描述的。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-16的化合物：
其中X选自由C、O、N和S组成的组；和
其中R1-2为如上对于式Tm-19、Tm-12和Tm-13所描述的。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-17的化合物：
其中R1-2为如上对于式Tm-19、Tm-12和Tm-13所描述的。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-18的化合物：
其中R2为如上对于式Tm-19、Tm-12和Tm-13所描述的。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-75的化合物：
3.5嘧啶-2，4，6-三酮衍生物
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-8的化合物：
其中X1选自由O、N(R12)和S组成的组；
其中X2和X3独立地选自由O和S组成的组；
其中X4选自由NH、N(R7)和C(R8，R9)组成的组；
其中n1为0-1，并且当n1为0时，则带有X2和X3的两个碳之间是化学键；
其中R7、R8和R9独立地选自由以下组成的组：H、取代或未取代的支链或无支链的低级烷基(C1-C20)、芳基、杂芳基、环烷基(C3-C7)、和取代的、未取代的、支链或无支链的C(CH2)n2芳基，
烷基和芳基基团上的取代包括适于本领域技术人员的官能团，如OH、NH2、卤素、SH、硝基、芳基、烯烃、COOH、COOR、C(O)N(R4)(R5)、SO2N(R4)(R5)、NO2、P(O)(OH)2、NHOH、B(OH)2、C(＝NH)NH2、NHC(＝NH)NH2、NO2和CF3；
其中R4和R5独立地为：H、支链或无支链的取代或未取代的低级烷基(C1-C8)、支链或无支链的取代或未取代的低级炔烃(C2-C6)、支链的或无支链的取代或未取代的低级烯烃(C2-C6)、芳基、(CH2)n芳基；
其中n2为0-10；
其中R12选自由以下组成的组：H、支链或无支链的低级烷基(C1-C4)；和
其中R1和R2独立地选自由以下组成的组：取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、羟基、氢、取代或未取代的醚、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的茚基、或取代或未取代的茚满基。
在某些实施方案中，R1和/或R2可以包含以下结构：
其中R3、R4、R5、R6和R7独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、氰基、叠氮基、羟基、取代或未取代的磺酰基、取代或未取代的亚磺酰氨基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的酰氨基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的醚、取代或未取代的羧基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的苯并噻唑基、取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的噻吩基、取代或未取代的苯并噻吩基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的异喹啉基、取代或未取代的喹啉基、或取代或未取代的杂芳烃基(heteroarenyl)、或取代或未取代的茚、或取代或未取代的茚满基。在某些实施方案中，R3、R4、R5、R6和R7的两种或更多种可以一起形成环，该环可以是杂环(即，含有一个或多个杂原子)或它可以是完全的碳环，并且可独立地为饱和或不饱和的。
在一个非限制性实施方案中，R1和R2是未取代的苯基。
在一个非限制性实施方案中，R1是未取代的苯基并且R2为取代的苯基。
在一个非限制性实施方案中，R1和R2是如上对于式Tm-6、Tm-19、Tm-12和Tm-13所定义的，并且还可以是(CH2)nC(＝X1)R1、(CH2)nC(＝X1)R2，其中X1为O或S，并且n为0-4。
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-76的化合物：
3.6其它跨膜化合物
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-77的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-78的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式的Tm-79的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-80的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-81的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-82的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-83的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-84的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-85的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-86的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-87的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-88的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-89的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-90的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-91的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-92的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-93的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-94的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-95的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-96的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-97的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-98的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式的Tm-99的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-100的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-101的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-102的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-103的化合物：
在某些实施方案中，跨膜化合物包括具有以下结构的式Tm-104的化合物：
在本发明的某些实施方案中，跨膜化合物包括下表3中描述的化合物。
表3.跨膜化合物
3.7跨膜化合物盐
在某些实施方案中，本发明的跨膜化合物包含跨膜化合物的盐，例如但不限于乙酸盐、三氟乙酸盐或甲酸盐。在某些实施方案中，跨膜化合物盐包含经由离子键与阳离子(+)(例如但不限于Al3+、Ca2+、Na+、K+、Cu2+、H+、Fe3+、Mg2+、Ag+、NH4 +、H3O+、Hg2 2+)键合的阴离子(-)(例如但不限于Cl-、F-、Br-、O2-、CO3 2-、HCO3 -、OH-、NO3 -、PO4 3-、8O4 2-、CH3COO-、HCOO-、C2O4 2-和CN-)。在其它实施方案中，跨膜化合物盐包括经由离子键与阴离子(-)键合的阳离子(+)。
在某些实施方案中，跨膜化合物可以是本文所述的跨膜化合物的盐、立体异构体或可食用形式，例如式Tm-1至Tm-104的化合物。
3.8 T1R1跨膜化合物结合位点
本申请提供了用于调节鲜味受体例如T1R1/T1R3受体的活性的组合物，其中在鲜味受体的跨膜结构域中所述组合物与一种或多种氨基酸的相互作用，例如T1R1的七个跨膜结构域(7TM)。在某些实施方案中，与组合物相互作用的氨基酸包括Ala795、Ala796、Asn792、Trp773、Phe776、Ala731、Phe728、Leu730、Phe732、Asn735、Ala689、Ser686、Gln690、Ile693、Cys694、Leu695、Arg634、Gln635、Phe642、Ala639、Ala643和Leu638的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种。
在一个具体的非限制性实施方案中，与组合物相互作用的氨基酸包括Asn735和/或Ser686。
在其它非限制性实施方案中，与组合物相互作用的氨基酸包括Trp773、Phe776、Phe732、Phe728、Leu730、Leu695、Leu638和Phe642的1、2、3、4、5、6、7或更多种。
在又一些其它非限制性实施方案中，与组合物相互作用的氨基酸包括Trp773、Phe776、Phe732、Phe728和Phe642的1、2、3、4或更多种。在一个非限制性实例中，与组合物相互作用的氨基酸经历与结合的组合物的环堆积相互作用。
在某些实施方案中，根据本文描述的相互作用的任何组合，例如一种、两种、三种或更多种相互作用，组合物与鲜味7TM结构域相互作用。组合物与7TM之间的相互作用还可以包括添加至该组合物与7TM的相互作用能的附加的疏水相互作用。
在某些实施方案中，组合物与一种或多种T1R17TM结构域氨基酸之间的相互作用包括一个或多个氢键、共价键、非共价键、盐桥、物理相互作用以及它们的组合。相互作用也可以是本领域中已知的配体-受体相互作用的任何相互作用特性。这种相互作用可通过例如定点诱变、X射线晶体学、X射线或其它光谱学方法、核磁共振(NMR)、交联评估、质谱法或电泳、低温显微(cryo-microscopy)、基于已知激动剂的位移测定、结构确定和它们的组合测定。在某些实施方案中，相互作用经由计算机确定，例如通过理论方法，如使用分子对接、分子建模、分子模拟或本领域已普通技术人员知的其它手段将化合物对接进入T1R1 7TM结构域。
本申请还提供了用于鉴别调节鲜味受体的活性例如T1R1的化合物的方法，其中所述化合物是基于其与本文所述的存在于T1R1的7TM结构域的一种或多种氨基酸相互作用的能力来鉴别。
在某些实施方案中，该方法包括使测试剂与猫科T1R1鲜味受体接触，检测在猫科T1R1鲜味受体的7TM相互作用位点中测试剂与又一种氨基酸之间的相互作用，以及选择与一种或多种氨基酸相互作用的测试剂作为所述化合物。
4.风味组合物
在某些实施方案中，本发明的风味组合物可用于增强宠物食品如猫食品的鲜味味道和/或增加其的适口性。风味组合物可以包括化合物的组合，并且可以各种递送系统添加到宠物食品中。
在某些实施方案中，本发明涉及用于调节宠物食品的鲜味味道的方法，其包括：a)提供至少一种宠物食品或其前体，和b)将所述宠物食品或其前体与至少鲜味味道调节量的至少一种风味组合物结合，以便形成增强的宠物食品，风味组合物例如包含一种或多种核苷酸衍生物和/或一种或多种跨膜化合物或其食品上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明的风味组合物可以增强宠物食品的鲜味味道和/或适口性，例如，宠物食品包括湿宠物食品、干宠物食品、微湿的宠物食品、宠物饮料产品和/或小吃宠物食品。
在某些实施方案中，可将本发明的一种或多种风味组合物以调节、增强或以其它方式改变宠物食品的味道或味道特征的有效量添加到宠物食品中。调节可以包括例如增加或增强宠物食品的鲜味味道，如通过动物例如猫和/或犬确定的，或在制剂测试的情况下，如通过动物例如猫和/或犬的味道测试者的小组，借助本领域已知的程序确定的。
在本发明的某些实施方案中，可以制备包含本文描述的足够量的至少一种风味组合物的宠物食品，风味组合物例如包含核苷酸衍生物，例如式Nt-1的化合物，以生产具有所希望的味道例如鲜味的宠物食品。
在本发明的某些实施方案中，可以制备包含本文描述的足够量的至少一种风味组合物的宠物食品，风味组合物例如包含跨膜化合物，例如式Tm-1至Tm-19的化合物，以生产具有所希望的味道例如鲜味的宠物食品。
在本发明的某些实施方案中，可以制备包含足够量的风味组合物的宠物食品，该风味组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种核苷酸衍生物。
在本发明的某些实施方案中，可以制备包含足够量的风味组合物的宠物食品，该风味组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种跨膜化合物。
在某些实施方案中，可以将调节量的本发明的一种或多种风味组合物中添加到宠物食品，从而使宠物食品相比于没有风味组合物制备的宠物食品具有增强的适口性，如通过动物例如猫和/或犬确定的，或者在制剂测试的情况下，如通过动物例如猫和/或犬的味道测试者的小组，借助本领域已知的程序确定的。
在本发明的某些实施方案中，将风味组合物以增加、增强和/或改良宠物食品的适口性的有效量添加到宠物食品中。
与宠物食品混合以调节和/或改善宠物食品的适口性和/或鲜味味道的风味组合物的浓度可以根据以下变量而变化：诸如例如特定类型的宠物食品、宠物食品中存在的何种鲜味化合物及其浓度以及具体的风味组合物对这种鲜味化合物的增强效果。
宽范围浓度的风味组合物可以被用来提供这样的鲜味味道和/或适口性改良。在本申请的某些实施方案中，将风味组合物与宠物食品混合，其中风味组合物的存在量为约0.001ppm至约1000ppm。例如，但不是通过限制的方式，所述风味组合物可以存在的量为约0.001ppm至约750ppm，约0.001ppm至约500ppm，约0.001ppm至约250ppm，约0.001ppm至约150ppm，约0.001ppm至约100ppm，约0.001ppm至约75ppm，约0.001ppm至约50ppm，约0.001ppm至约25ppm，约0.001ppm至约15ppm，约0.001ppm至约10ppm，约0.001ppm至约5ppm，约0.001ppm至约4ppm，约0.001ppm至约3ppm，约0.001ppm至约2ppm，约0.001ppm至约1ppm，约0.01ppm至约1000ppm，约0.1ppm至1000ppm，约1ppm至1000ppm，约2ppm至约1000ppm，约3ppm至约1000ppm，约4ppm至约1000ppm，约5ppm至约1000ppm，约10ppm至约1000ppm，约15ppm至约1000ppm，约25ppm至约1000ppm，约50ppm至约1000ppm，约75ppm至约1000ppm，约100ppm至约1000ppm，约150ppm至约1000ppm，约250ppm至约1000ppm，约250ppm至约1000ppm，约500ppm至约1000ppm或约750ppm至约1000ppm，和它们之间的值。
在某些实施方案中，风味组合物是存在于宠物食品的量大于约0.001ppm，大于约0.01ppm，大于约0.1ppm，大于约1ppm，大于约2ppm，大于约3ppm，大于约4ppm，大于约5ppm，大于约10ppm，大于约25ppm，大于约50ppm，大于约75ppm，大于约100ppm，大于约250ppm，大于约500ppm，大于约750ppm或大于约1000ppm，和它们之间的值。
在某些实施方案中，本发明的核苷酸衍生物以足以调节、激活和/或增强鲜味受体例如T1R1/T1R3受体的量存在于食品中。例如，但不是通过限制的方式，核苷酸衍生物可以存在于食品中的量为约1pM至约1M，约1nM至约1M，约1μM至约1M，约1mM至约1M，约10mM至约1M，约100mM至约1M，约250mM至约1M，约500mM至约1M，约750mM至约1M，约0.001μM至约1M，约0.001μM至约750mM，约0.001μM至约500mM，约0.001μM至约250mM，约0.001μM至约100mM，约0.001μM至约50mM，约0.001μM至约25mM，约0.001μM至约10mM，约0.001μM至约1mM，约0.001μM至约100μM或约0.001μM至约10μM，和它们之间的值。
在某些实施方案中，本发明的跨膜化合物以足以调节、激活和/或增强鲜味受体例如猫科T1R1/T1R3受体的量存在于食品中。例如，但不是通过限制的方式，跨膜化合物可以存在于食品中的量为约1pM至约10M，约1pM至约1M，约1nM至约1M，约1μM至约1M，约1mM至约1M，约10mM至约1M，约100mM至约1M，约250mM至约1M，约500mM至约1M，约750mM至约1M，约1μM至约1M，约1μM至约750mM，约1μM至约500mM，约1μM至约250mM，约1μM至约100mM，约1μM至约50mM，约1μM至约25mM，约1μM至约10mM，约1μM至约1mM，约1μM至约100μM或约1μM至约10μM，和它们的之间值。
在本申请的某些实施方案中，风味组合物与食品混合，其中风味组合物的存在量为食品的约0.0001％至约10％重量/重量(w/w)之间。例如，但不是通过限制的方式，该风味组合物可以存在的量为约0.0001％至约10％，约0.0001％至约1％，约0.0001％至约0.1％，约0.0001％至约0.01％，约0.0001％至约0.001％，约0.001％至约10％，约0.001％至约1％，约0.01％至约1％，或约0.1％至约1％，和它们之间的值。
在某些实施方案中，本申请的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物以各种比例混合在一起或与其它化合物例如核苷酸和/或氨基酸和/或呋喃酮混合在一起，以形成各种风味组合物。核苷酸、氨基酸和呋喃酮的非限制性实例公开于专利申请号PCT/EP2013/072788、PCT/EP2013/072789、PCT/EP2013/072790和PCT/EP2013/072794，其通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中，与其它化合物混合的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物是式Nt-1至Nt-55的一种或多种化合物和/或式Tm-1至Tm-104的一种或多种化合物。
在某些实施方案中，与其它化合物混合的核苷酸衍生物包括式Nt-1至Nt-55与表2和表6-14的核苷酸衍生物。
在某些实施方案中，与其它化合物混合的跨膜化合物包括式Tm-1至Tm-104的跨膜化合物。
4.1核苷酸
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种核苷酸衍生物和/或至少一种跨膜化合物，以及本文所述的至少一种核苷酸。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包含本文所述的至少两种、三种、四种、五种或更多种核苷酸。核苷酸的非限制性实例包括鸟苷单磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、腺苷单磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胞苷单磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、肌苷单磷酸(IMP)、肌苷二磷酸(IDP)、肌苷三磷酸(ITP)、尿苷单磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胸苷单磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、以及黄苷单磷酸(XMP)、黄苷二磷酸(XDP)和黄苷三磷酸(XTP)、或如式Nt-1描述的任何核苷酸衍生物。
在某些实施方案中，风味组合物可包括食品中存在的核苷酸，其可以存在的量为约1pM至约1M，约1nM至约1M，约1μM至约1M，约1mM至约1M，约10mM至约1M，约100mM至约1M，约250mM至约1M，约500mM至约1M，约750mM至约1M，约1μM至约1M，约1μM至约750mM，约1μM至约500mM，约1μM至约250mM，约1μM至约100mM，约1μM至约50mM，约1μM至约25mM，约1μM至约10mM，约1μM至约1mM，约1μM至约100μM或约1μM至约10μm，和它们之间的值。
在某些实施方案中，核苷酸可以存在的量大于宠物食品的约1mM或大于宠物食品的约2.5mM。在某些非限制性实施方案中，核苷酸和/或核苷酸衍生物可以存在的量小于宠物食品的约100mM、小于宠物食品的约50mM、小于宠物食品的约20mM、或小于宠物食品的约10mM。在某些非限制性实施方案中，核苷酸以宠物食品的约5mM的量存在。
在某些实施方案中，风味组合物包含至少一种跨膜化合物和至少一种核苷酸和/或核苷酸衍生物，其可以是IMP、GMP或它们的混合物。在某些实施方案中，至少一种核苷酸可以是GMP和IMP的组合，其包含约1％至约99％的GMP和约1％至约99％的IMP、或约20％至约80％的GMP和约20％至约80％的IMP、或约50％的GMP和约50％的IMP、或约10％的GMP和约90％的IMP、或约20％的GMP和约80％的IMP、或约30％的GMP和约70％的IMP、或约40％的GMP和约60％的IMP、或约60％的GMP和约40％的IMP、或约70％的GMP和约30％的IMP、或约80％的GMP和约20％的IMP、或约10％的GMP和约90％的IMP。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物还包含本文所述的至少一种氨基酸。
4.2氨基酸
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种核苷酸衍生物和/或至少一种跨膜化合物，以及本文所述的至少一种氨基酸。在某些实施方案中，风味组合物包含本文所述的至少两种、三种、四种、五种或更多种氨基酸。
在某些实施方案中，风味组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第一氨基酸和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第二氨基酸。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种第一氨基酸和至少一种第二氨基酸。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包括至少两种第一氨基酸和至少一种第二种氨基酸。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包含至少一种第一氨基酸和至少两种第二氨基酸。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物包括至少两种第一氨基酸和至少两种第二氨基酸。
在本发明的某些实施方案中，风味组合物还包含本文所述的至少一种核苷酸。
第一氨基酸的非限制性实例包括色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和它们的组合。
第二氨基酸的非限制性实例包括天冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、羟基脯氨酸、精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、牛磺酸、谷氨酸一钠(MSG)和它们的组合。
在某些实施方案中，至少一种第一氨基酸和/或第二氨基酸单独或组合可存在的量为宠物食品的约1mM至约1M、或约250mM至约1M、或约5mM至约500mM、或约10mM至约100mM、或约15mM至约50mM、或约20mM至约40mM。在某些实施方案中，一种或多种氨基酸可以存在的量小于宠物食品的约1M，小于宠物食品的约200mM、小于宠物食品的约100mM、小于宠物食品的约50mM、小于宠物食品的约20mM、或小于宠物食品的约10mM。在某些实施方案中，第一氨基酸和/或第二氨基酸单独或组合可存在的量为宠物食品的约25mM。
4.2.1 T1R1氨基酸结合位点
本文所述的调节鲜味受体例如T1R1/T1R3受体的组合物的氨基酸可以与鲜味受体的捕蝇草结构域中的一种或多种氨基酸相互作用。在某些实施方案中，捕蝇草结构域(VFT)存在于T1R1。在某些实施方案中，与组合物相互作用的VFT氨基酸包括Thr149、Tyr220、Thr148、Thr449、Ser172、Glu170、Glu301、His71、His47、Arg277、His308、Asn69、Asn302、Ser306、Ser384、Asp302、Ser306和Ala380的一种或多种。
在一个非限制性实施方案中，组合物包含氨基酸，其中所述氨基酸与T1R1的Ser172、Thr149、Thr148、Glu301、Tyr220、Glu170和Asp302的一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种相互作用。
在其它非限制性实施方案中，组合物与Thr149、Ser172、Tyr220、Thr148、Glu170和/或Asp302的一种、两种、三种、四种、五种或更多种相互作用、其中所述相互作用可以包括例如氢键、盐桥和/或Pi-阳离子相互作用。
在一个非限制性实例中，组合物与VFT结构域的Glu170和/或Asp302相互作用，其中所述组合物不包含L-谷氨酸或L-天冬氨酸。在一个实施方案中，Glu170和Asp302帮助协调适合T1R1的活性位点的组合物的氨基酸配体的两性离子氮，同时建立一种不适合结合L-谷氨酸和L-天冬氨酸的静电环境。
在某些实施方案中，根据本文描述的相互作用的任何组合，例如相互作用的一种、两种、三种或更多种，组合物与VFT相互作用。氨基酸和VFT之间的相互作用还可以包括添加至该氨基酸与VFT的相互作用能的附加的疏水相互作用。
在某些实施方案中，组合物和一种或多种VFT氨基酸之间的相互作用包括一个或多个氢键、共价键、非共价键、盐桥、物理相互作用以及它们的组合。相互作用也可以是本领域中已知的配体受体相互作用的任何相互作用特性。这种相互作用可通过例如定点诱变、X射线晶体学、X射线或其它光谱学方法、核磁共振(NMR)、交联评估、质谱法或电泳、基于已知激动剂的位移测定、结构确定和它们的组合确定。在某些实施方案中，相互作用经由计算机确定，例如通过理论方法，如使用分子对接、分子建模、分子模拟或本领域已普通技术人员知的其它手段将化合物对接进入进入VFT结构域。
本申请还提供了用于鉴别调节鲜味受体的活性例如T1R1的化合物的方法，其中所述化合物是基于其与本文所述的存在于T1R1的VFT结构域的一种或多种氨基酸相互作用的能力来鉴别。
在某些实施方案中，该方法包括使测试剂与猫科T1R1鲜味受体接触，检测在猫科T1R1鲜味受体的VFT相互作用位点中测试剂与又一种氨基酸之间的相互作用，以及选择与一种或多种氨基酸相互作用的测试剂作为所述化合物。
5.递送系统
在某些实施方案中，本申请的风味组合物可以掺入到用于宠物食品的递送系统。递送系统可以是液体或固体、水性或非水性的。递送系统通常被调整为适应风味组合物和/或其中将掺入风味组合物的宠物食品的需求。
风味组合物可以以液体形式、干燥形式和/或固体形式使用。当以干燥形式使用时，可以使用合适的干燥方式例如喷雾干燥。可选地，风味组合物可以被包封或吸收到水溶性材料中，包括但不限于诸如纤维素、淀粉、糖、麦芽糖糊精、阿拉伯树胶等的材料。制备这种干燥形式的实际技术是本领域公知的，并且可适用于本文公开的主题。
本发明公开的主题的风味组合物可以以本领域熟知的许多独特的物理形式使用，以提供味道、风味和/或质地的初始突释；和/或味道、风味和/或质地的持续感觉。但不限于此，这样的物理形式包括游离形式，例如喷雾干燥形式、粉状形式和珠状形式以及包封形式和它们的混合物。
在某些实施方案中，可以在宠物食品的加工过程中产生风味组合物的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物。例如，而不是通过限制的方式，核苷酸衍生物和/或跨膜化合物可在宠物食物的热处理例如干馏、挤压和/或杀菌的过程中由前体化合物产生。
在某些实施方案中，如上所述，包封技术可用于改良风味系统。在某些实施方案中，可以完全或部分地包封风味化合物、风味成分或整个风味组合物。可以选择包封材料和/或技术以确定风味系统的改良类型。
在某些实施方案中，选择包封材料和/或技术以改善风味化合物、风味成分或风味组合物的稳定性；而在其它实施方案中，选择包封材料和/或技术以改良风味组合物的释放曲线。
适合的包封材料可以包括但不限于：水胶体，例如海藻酸盐、果胶、琼脂、瓜尔胶、纤维素等，蛋白质，聚乙酸乙烯酯、聚乙烯、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸、聚羟基烷酸酯、乙基纤维素、聚醋酸乙烯苯二甲酸酯、聚乙二醇酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)共聚物等，以及它们的组合。适合的包封技术可以包括但不限于：喷涂、喷雾干燥、喷雾冷却、吸收、吸附、包合络合(例如，产生一种风味/环糊精络合物)、凝聚、流化床涂覆、或可用来用包封材料包封成分的其它方法。
用于风味剂或甜味剂的包封的递送系统可以含有包围甜味剂或风味剂芯的脂肪或蜡的疏水基质。脂肪可以选自以下任何数目的常规材料，例如脂肪酸、甘油酯或聚甘油酯、山梨糖醇酯以及它们的混合物。脂肪酸的实例包括但不限于氢化的和部分氢化的植物油，例如棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、稻糠油、大豆油、棉籽油、葵花籽油、红花油和它们的组合。甘油酯的实例包括但不限于甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。
蜡可以选自由天然蜡和合成蜡以及它们的混合物组成的组。非限制性的实例包括石蜡、凡士林、碳蜡、微晶蜡、蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、羊毛脂、杨梅蜡、甘蔗蜡、鲸蜡、稻糠蜡以及它们的混合物。
脂肪和蜡可以单独或组合使用，其量为包封系统的重量的约10％至约70％，可选地为约30％至约60％的量。当组合使用时，脂肪和蜡可分别以从约70∶10至85∶15的比率存在。
典型的包封的风味组合物、风味剂或甜味剂递送系统在美国专利号4,597,970和4,722,845中公开，其通过引用以其整体并入本文。
液体递送系统可以包括但不限于具有本申请的风味组合物的分散体的系统，如在碳水化合物糖浆和/或乳剂中。液体递送系统还可以包括其中核苷酸衍生物、跨膜化合物和/或风味组合物在溶剂中溶解的提取物。固体递送系统可通过喷雾干燥、喷涂、喷雾冷却、流化床干燥、吸收、吸附、凝聚、络合或任何其它标准技术来创建。在一些实施方案中，递送系统可以被选择为与可食用组合物兼容或在可食用组合物中发挥作用。在某些实施方案中，递送系统将包括油质材料，如脂肪或油。在某些实施方案中，递送系统将包括糖食脂肪，如可可脂、可可脂代用品、可可脂替代物或可可脂等效物。
当以干燥形式使用时，可以使用合适的干燥方式诸如喷雾干燥。可选地，风味组合物可被吸附或吸收到基底，如水溶性物质，诸如纤维素、淀粉、糖、麦芽糖糊精、阿拉伯树胶等，或可以被包封。制备这种干燥形式的实际技术是本领域公知的。
6.宠物食品
本发明的主题的风味组合物可用于各种各样的宠物食品中。合适的宠物食品的非限制性实例包括湿食品、干食品、微湿的食品、宠物食品补剂(例如维生素)，宠物饮料产品、小吃和零食以及本文所述的宠物食品类别。
当需要时，本发明的主题的一种或多种风味组合物与宠物食品和任选的成分一起的组合，提供了具有意料不到的味道并赋予例如鲜味和/或咸味的感官体验的风味剂。本文所公开的风味组合物可在宠物食品的制剂加工或包装之前、期间或之后添加，风味组合物的组分可以顺序加入或同时加入。在某些实施方案中，本文所公开的风味组合物的一种或多种组分可以在宠物食品的生产过程中例如热处理过程中由前体化合物产生。例如，而不是通过限制的方式，风味组合物的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物可以在宠物食品和风味组合物的附加组分的生产过程中产生，并且可在宠物食品制剂加工或包装之前、期间或之后加入。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面的干食品。营养全面的干或含有低水分宠物食品可包含小于约15％的水分，并且包含约10％至约60％的脂肪、约10％至约70％的蛋白质、和约30％至约80％的碳水化合物，例如膳食纤维和灰分。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面的湿食品。营养全面的湿或含有高水分宠物食品可包含大于约50％的水分。在某些实施方案中，湿宠物食品包含约40％的脂肪、约50％的蛋白质、和约10％的碳水化合物，例如膳食纤维和灰分。
在某些实施方案中，宠物食品是营养全面的微湿的食品。微湿的(例如半微湿或半干或干软或微湿软或含中间或中等水分)的营养全面的宠物食品包含约15％至约50％的水分。
在某些实施方案中，宠物食品是宠物食品小吃产品。宠物食品小吃产品的非限制性实例包括小吃棒、宠物咀嚼物、脆脆的零食、压缩干粮、小吃、饼干和甜品。
在某些实施方案中，蛋白质源可以来自植物来源，如羽扇豆蛋白、小麦蛋白、大豆蛋白及它们的组合。可选地或另外地，蛋白质源可以来自各种动物来源。动物蛋白的非限制性实例包括牛肉、猪肉、禽肉、羊肉或鱼肉，包括例如肌肉肉类、肉副产品、肉粉或鱼粉。
7.测量味道属性的方法
在本发明的某些实施方案中，宠物食品的味道、风味和/或适口性属性可通过将风味组合物与食品混合进行改良，或在食品制备条件下产生，如本文所述。在某些实施方案中，一种或多种属性可通过增加或降低与食品混合或产生的风味组合物的浓度来增强或减弱。在某些实施方案中，经改良的食品的味道属性可以如本文所述进行评估，可以基于评估结果增加或降低与食品混合或产生的风味组合物的浓度。
在本发明的某些实施方案中，可以使用体外测定法测定味道和/或适口性属性，其中在体外测定不同浓度下化合物激活由细胞表达的猫科鲜味受体的能力。在某些实施方案中，受体激活的增加与化合物的味道和/或适口性属性的增强相关。在某些实施方案中，单独或与其它化合物组合测定组合物。在某些实施方案中，体外测定法包括本申请的实施例部分中描述的体外测定法。在一些实施方案中，体外测定包括表达由引入细胞的核酸(例如，外源核酸)编码的鲜味受体的重组细胞。在其它非限制性实施方案中，体外测定包括表达源于细胞的鲜味受体的细胞。表达天然鲜味受体的这类细胞的实例包括，例如但不限于，猫和/或犬味觉细胞。在某些实施方案中，表达鲜味受体的猫和/或犬味觉细胞分离自猫和/或犬并在体外培养。
在本发明的某些实施方案中，可使用味道测试者小组(panelist of tastetester)测定味道和/或适口性属性。例如，而不是通过限制的方式，该小组可包含猫小组成员。在某些实施方案中，该小组可包括犬小组成员。在某些实施方案中，宠物食品的适口性可以通过消耗仅含有风味组合物的宠物食品来确定(例如，单碗试验，一元归类(monadicranking))。在某些实施方案中，宠物食品的适口性可以通过相对于不含风味组合物或另一风味组合物的宠物食品优先消耗本发明的含有风味组合物的宠物食品来确定(例如，用于测试偏好的双碗试验、差异和/或选择)。
在某些实施方案中，风味组合物的适口性和/或鲜味味道可以通过相对于不含风味组合物或含有另一风味组合物的宠物食品优先消耗本发明的含有风味组合物的宠物食品来确定(例如，双碗试验)。例如，溶液小组可用于比较单一暴露下一定浓度范围的化合物的适口性。在某些实施方案中，所述溶液可以包含适口性增强剂，例如L-组氨酸，作为摄食/正促味剂以增加基线溶液摄入，因此使得能够识别测试化合物的潜在负面影响。
每种宠物食品或水溶液的摄入比可以通过测量消耗的定量除以总消耗量来确定。然后可以计算消耗比(consumption ratio，CR)以比较一种定量相对于另一种定量的消耗，从而确定一种食品或水溶液相对于另一种的优先消耗。可选地或另外地，摄入量(g)的差异可用来评估双碗试验中两种溶液或双碗试验中两种宠物食品在选定的显著性水平例如5％的显著性水平下测定的平均差异，以确定摄入量的平均差异，置信区间为95％。然而，可以使用任何显著性水平，例如1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、2％0、25％或50％的显著性水平。在某些实施方案中，也可以计算百分比偏好分数，例如，动物对一种溶液或食品的百分比偏好是测试过程中摄取的溶液或食品占总液体或食品的百分比。
8.生成方法
在某些实施方案中，可以使用标准的化学合成方法来生产本发明的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物。在某些实施方案中，化学合成方法提供了具有至少99.999％、或至少99％、或至少95％、或至少90％、或至少85％或至少80％的纯度的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物。在某些实施方案中，可以使用标准的水解方法如使用酸、酶或酸和酶的组合的那些方法，制备核苷酸衍生物和/或跨膜化合物。
本发明的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物也可以在食物制备条件下生产，例如生产宠物食品的过程中。例如，而不是通过限制的方式，可以在热食物处理过程例如、杀菌、干馏和/或挤压中，由宠物食物中存在的前体化合物生产本发明的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物。在某些实施方案中，也可加入液体和/或粉末增味剂(palatant)，以改善宠物食品的味道，例如加入到干宠物食品中，以增加宠物食品的适口性。增味剂可以是肉的消化产物(例如，肝脏)和/或蔬菜的消化产物，并且可以任选地包括本领域已知的其它增味剂。在某些实施方案中，核苷酸衍生物和/或跨膜化合物可在加入到宠物食品之前与液体和/或粉末增味剂混合或在液体和/或粉末增味剂中生成。可选地或另外地，核苷酸衍生物和/或跨膜化合物可在加入到宠物食品之后与液体和/或粉末增味剂混合或在液体和/或粉末增味剂中生成。
在某些实施方案中，本发明的风味组合物包含式Tm-1至Tm-104的一种或多种跨膜化合物。在某些实施方案中，这样的化合物可以但不限于通过本领域中已知的任何方法合成。在某些实施方案中，可以根据以下合成方案来合成仲班酸衍生物和跨膜化合物：
9.本发明的风味组合物的非限制性实例
如本文所述，在猫科T1R1/T1R3受体(即，鲜味受体)上存在至少三个不同的结合位点，其允许小分子和/或化合物的结合。猫科T1R1/T1R3受体上存在的结合位点之一可结合本文所述的核苷酸和/或核苷酸衍生物。猫科T1R1/T1R3受体上存在的第二结合位点可结合本文所述的第一组氨基酸，猫科T1R1/T1R3受体上存在的第三结合位点(即，T1R17TM结构域)可结合本文所述的跨膜化合物。不受任何特定理论的束缚，本文所公开的第一组氨基酸的结合可改变猫科T1R1/T1R3受体的构象，以允许与结合的核苷酸和/或核苷酸衍生物更大的接触，并导致鲜味受体的协同激活。本文所公开的第二组氨基酸可与一种或多种其它受体相互作用，并不与第一氨基酸竞争结合鲜味受体。第二组氨基酸到风味组合物的加入可以增强该组合物的风味感觉。如本文所描述的，跨膜化合物与受体的结合进一步激活受体，从而增强或改良包含这种化合物的食品的适口性。
在某些实施方案中，本发明提供了风味组合物，其包含结合于鲜味受体上的第一结合位点的至少一种核苷酸和/或核苷酸衍生物，和/或结合于鲜味受体上的第二结合位点的至少一种第一组氨基酸，和/或结合于鲜味受体上的第三结合位点(例如在鲜味受体的7TM结构域内)的至少一种跨膜化合物，和/或结合于不同受体的至少一种第二组氨基酸。
本发明的主题提供了风味组合物，其包含至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种核苷酸衍生物和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种核苷酸和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种跨膜化合物和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第一组氨基酸和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第二组氨基酸。
在某些实施方案中，本发明提供了风味组合物，其包含至少一种核苷酸衍生物和至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第一组氨基酸和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种选自表4的第二组氨基酸。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物和选自表4的至少一种第一组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物和选自表4的至少一种第二组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物以及选自表4的至少一种第一组氨基酸和至少一种第二组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物以及选自表4的至少两种第一组氨基酸和至少一种第二组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物以及选自表4的至少一种第一组氨基酸和至少两种第二组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物以及选自表4的至少两种第一组氨基酸和至少两种第二组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、至少一种核苷酸和选自表4的至少一种第一组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、至少一种核苷酸和选自表4的至少一种第二组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、至少一种核苷酸和选自表4的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第一组氨基酸和/或至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种第二组氨基酸的风味组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、至少一种核苷酸以及选自表4的至少一种第一组氨基酸和至少一种第二组氨基酸的风味组合物。
表4.氨基酸
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、组氨酸和脯氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、丙氨酸和脯氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、甘氨酸和脯氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、苯丙氨酸和脯氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、色氨酸和脯氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、酪氨酸和脯氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、组氨酸和苏氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、丙氨酸和苏氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、甘氨酸和苏氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、苯丙氨酸和苏氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、色氨酸和苏氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、酪氨酸和苏氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、组氨酸和谷氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、丙氨酸和谷氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、甘氨酸和谷氨酸风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、苯丙氨酸和谷氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、色氨酸和谷氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含至少一种核苷酸衍生物、酪氨酸和谷氨酸的风味组合物。
在某些实施方案中，以上所公开的任何风味组合物还可以包含本文所述的至少一种核苷酸和/或至少一种跨膜化合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含腺苷3′，5′-二磷酸和丙氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含6-硫代鸟苷-5′-O-单磷酸和丙氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含2′-，3′-O-(N′-甲基邻氨基苯甲酰基)鸟苷5′-O-单磷酸和丙氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷-5′-O-单磷酸和丙氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含6-氯嘌呤核糖苷-5′-O-单磷酸和丙氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含肌苷三磷酸(ITP)和丙氨酸的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含肌苷三磷酸(ITP)、丙氨酸和IMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含1-(2-溴苯基)-3-((1R，2S)-2-羟基-2，3-二氢-1H-茚-1-基)脲、丙氨酸和IMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含N-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-丙基戊酰胺、丙氨酸和IMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺、丙氨酸和IMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含N-(2-氨基-2-氧代-1-苯基乙基)-3-氯-4，5-二甲氧基苯甲酰胺、丙氨酸和IMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含(E)-3-(4-甲氧基苯基)-N-(戊-3-基)丙烯酰胺、丙氨酸和IMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含1-苄基-3-(2-氧代-2-苯基乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮、丙氨酸和IMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2(3H)-酮、丙氨酸和IMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺、苯丙氨酸和GMP的风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了包含N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺与第一氨基酸(A组氨基酸)、第二氨基酸(B组氨基酸)和一种或多种核苷酸的组合的风味组合物，如下面所述。
表5.包含跨膜化合物、第一氨基酸(A组)、第二氨基酸(B组)和核苷酸风味组合物。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种包含本文所述的风味组合物的宠物食品，其中所述风味组合物的存在量为约0.001ppm至约1000ppm。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种包含本文所述的风味组合物的宠物食品，其中所述风味组合物存在的浓度为宠物食品的约0.0001重量％至约10重量％。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种包含本文所述的风味组合物的宠物食品，其中所述风味组合物存在的量大于约1ppm。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种包含本文所述的风味组合物的宠物食品，其中所述风味组合物存在的量大于约10ppm。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种包含本文所述的风味组合物的宠物食品，其中所述风味组合物存在的量大于约100ppm。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种包含本文所述的核苷酸衍生物的宠物食品，其中所述核苷酸衍生物的存在量为约1pM至约1M。
10.本发明的方法的非限制实例
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了用于提高宠物食品的适口性的方法，其包括将宠物食品与包含本文所述的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物的风味组合物混合，其中所述核苷酸衍生物和/或跨膜化合物存在的浓度为该混合物的约1pM至约10M，或约1pM至约1M。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了用于提高宠物食品的适口性的方法，其包括将宠物食品与包含本文所述的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物的风味组合物混合，其中所述核苷酸衍生物和/或跨膜化合物存在的浓度为该产品的约1pM至约10M，或约1pM至约1M。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种用于提高宠物食品的鲜味味道的方法，其包括将宠物食品与包含本文所述的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物的风味组合物混合，其中所述核苷酸衍生物存在于混合物的浓度为0.001ppm至1000ppm。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种用于提高宠物食品的适口性的方法，其包括将宠物食品与包含本文所述的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物的风味组合物混合，其中所述风味组合物存在于混合物的浓度为约0.001ppm至1000ppm。
在某些非限制性实施方案中，本发明提供了一种用于提高的宠物食品鲜味味道的方法，其包含将宠物食品与包含本文所述的核苷酸衍生物和/或跨膜化合物的风味组合物混合，其中所述风味组合物存在于混合物的浓度为约0.0001重量％的浓度至约10重量％。
11.实施例
通过参考以下实施例将更好地理解本公开的主题，其作为本发明的示例而不是通过限制的方式提供。
实施例1-通过核苷酸衍生物激活T1R1/T1R3受体
本实施例描述了通过核苷酸衍生物体外激活猫T1R1/T1R3受体。
可作为T1R1/T1R3激活剂起作用的核苷酸衍生物通过用猫鲜味受体T1R1/T1R3的计算机建模来确定，并被选择用于在体外进一步测试。所选的核苷酸衍生物的体外功能表征用来评价核苷酸衍生物单独激活和与氨基酸和/或核苷酸组合激活T1R1/T1R3受体的有效性。
方法：稳定表达T1R3和诱导性表达T1R1的HEK293细胞暴露于单独的核苷酸衍生物以激活鲜味受体。使用钙敏感性荧光染料通过细胞内钙水平的变化来检测T1R1/T1R3受体的激活。表达T1R3但不表达T1R1的细胞用作对照。Tetra或用于数据捕获。
对于每种核苷酸衍生物，生成剂量响应曲线并测定以下性能：核苷酸衍生物单独的EC50；核苷酸衍生物与20mM丙氨酸的EC50；核苷酸衍生物与0.2mM IMP的EC50；核苷酸衍生物与20mM丙氨酸和0.2mM IMP的EC50。
术语半数最大有效浓度(EC50)是指在指定的曝光时间后诱导基线和最大值之间的一半反应的化合物浓度。在每个实验中，将至多0.1mM、1mM或10mM的核苷酸衍生物的系列稀释液加入到T1R1/T1R3表达细胞中。
结果：用2′-脱氧腺苷-3′，5′-O-二磷酸单独(例如，在缓冲液中)或与20mM丙氨酸组合处理表达T1R1/T1R3受体的HEK293细胞，导致T1R1/T1R3受体的激活，如通过细胞内钙水平的变化(ΔF/F0)所指示的。在丙氨酸或在缓冲液存在下，2′-脱氧腺苷-3′，5′-O-二磷酸导致观测值为0.02mM的的EC50(表6和图2)。这些结果表明，2′-脱氧腺苷-3′，5′-O-二磷酸是T1R1/T1R3受体的正性激活剂。
观察到核苷酸衍生物腺苷5′-O-硫代单磷酸二锂盐单独用作T1R1/T1R3的激活剂(图8和表6)。在20mM丙氨酸的存在下，其单独具有13.6mM的EC50值，腺苷5′-O-硫代单磷酸二锂盐形式的EC50从大于1mM减小到0.06mM，而ΔF/F0显著更高地扩展(图8和表6)。这些结果表明，丙氨酸和核苷酸衍生物例如腺苷5′-O-硫代单磷酸协同作用以激活T1R1/T1R3。
不受特定的理论束缚，这些结果表明，核苷酸衍生物单独或与氨基酸例如丙氨酸组合可作为T1R1/T1R3受体的正性调节剂起作用。
实施例2-通过核苷酸衍生物化合物与氨基酸的组合激活T1R1/T1R3受体
本实施例描述了在体外通过核苷酸衍生物化合物与氨基酸的组合激活猫T1R1/T1R3受体。
评价核苷酸衍生物以确定核苷酸衍生物与一种或多种核苷酸和/或一种或多种氨基酸的组合激活T1R1/T1R3受体的的有效性。
方法：稳定表达T1R3和诱导性表达T1R1的HEK293细胞暴露于单独的核苷酸衍生物或其与一种或多种氨基酸和/或一种或多种核苷酸的组合，以激活鲜味受体。使用钙敏感性荧光染料和/或发光报告系统通过细胞内钙水平的变化来检测T1R1/T1R3受体的激活。表达T1R3但不表达T1R1的细胞用作对照。Tetra或3用于数据捕获。
对于每种核苷酸衍生物，生成剂量响应曲线并测定存在20mM丙氨酸的以下性能：核苷酸衍生物的EC50；核苷酸衍生物存在下受体的最大响应，相对于IMP存在下受体的响应核苷酸衍生物存在下受体的最大响应，导致T1R1/T1R3受体激活的核苷酸衍生物的阈值量。所使用的阳性和阴性对照的EC50值总结在表16中。
结果：表15示出测试的所有核苷酸衍生物激活T1R1/T1R3的效果。用核苷酸衍生物、腺苷3′，5′-二磷酸钠盐(ADP)与20mM丙氨酸的组合处理表达T1R1/T1R3受体的HEK293细胞，导致T1R1/T1R3受体的激活，如通过细胞内钙水平的最大变化(ΔF/F0)和观察的0.001mM的EC50值所指示的。与此相反，在20mM丙氨酸的存在下核苷酸腺苷单磷酸(AMP)导致观察的为0.011mM的EC50值(表7)。这些结果表明，基于腺苷的核苷酸衍生物与衍生它的标准核苷酸相比在激活T1R1/T1R3受体方面表现出改善的活性。对于2′-/3′-O-(N′-邻氨基苯甲酰基)腺苷-5′-O-单磷酸钠盐，观察到相似的结果(表7)。此外，基于腺苷的核苷酸衍生物相比AMP也可表现出用于激活所述受体的较低阈值(表7)。
观察到基于鸟苷的核苷酸衍生物，6-硫代鸟苷-5′-O-单磷酸、2′-脱氧鸟苷-5′-O-单硫逐磷酸(钠盐)、2′-，3′-O-(N′-甲基邻氨基苯甲酰基)鸟苷-5′-O-单磷酸、鸟苷-5′-单硫逐磷酸(钠盐)、2′-脱氧-3′-O-(N′-甲基邻氨基苯甲酰基)鸟苷-5′-O-单磷酸、鸟苷-5′-O-(2-硫代二磷酸)、2′-脱氧鸟苷-3′，5′-O-二磷酸和2′-脱氧鸟苷-5′-O-单硫逐磷酸，在丙氨酸的存在下作为T1R1/T1R3的激活剂(表8)。如表8所示，相比于标准核苷酸鸟苷酸(GMP)，这些基于鸟苷的核苷酸衍生物表现出改善的活性。例如，6-硫代鸟苷-5′-O-单磷酸在丙氨酸的存在下显示0.0009mM的EC50值和0.0002mM的阈值；而GMP显示0.02mM的EC50值和0.008mM的阈值(表8和图1)。
还观察到基于嘌呤的核苷酸衍生物，2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷-5′-O-单磷酸(2-NH2-6-Cl-5′-PuMP)和6-氯嘌呤核糖苷-5′-O-单磷酸，作为T1R1/T1R3受体的激活剂(表9)。例如，2-氨基-6-氯嘌呤核糖苷-5′-O-单磷酸在丙氨酸的存在下显示出0.0005mM的EC50值和0.00013mM的阈值，6-氯嘌呤核糖苷-5′-O-单磷酸在丙氨酸的存在下显示出0.002mM的EC50值和0.0005mM的阈值(表9)。与此相反，嘌呤核糖苷-5′-O-单磷酸(5′-PuMP)在丙氨酸的存在下显示出0.02mM的EC50值和0.005mM的阈值，表明基于嘌呤的核苷酸相比于标准核苷酸5′-PuMP以较低的浓度激活猫鲜味受体(表9)。
观察到基于肌苷的核苷酸衍生物在丙氨酸的存在下激活受体(表11)。6-硫代肌苷磷酸在丙氨酸的存在下显示出0.02mM的EC50值，肌苷三磷酸(ITP)在丙氨酸的存在下显示出0.08mM的EC50值(表11和图6)。标准核苷酸肌苷单磷酸(IMP)显示出0.07mM的EC50值，这表明6-硫代肌苷磷酸相比IMP表现出增加的活性。对于基于尿苷的核苷酸衍生物，观察到类似的结果，其中所述核苷酸衍生物相比尿苷单磷酸(UMP)显示出改善的活性。例如，基于尿苷的核苷酸衍生物，尿苷5′-单磷酸吗啉酯4-吗啉-N，N′-二环己基甲脒，相比于UMP(EC50值大于30mM)显示出大于3mM的EC50值(表12)。
不受特定理论的束缚，这些结果表明，核苷酸衍生物作为T1R1/T1R3受体的正性调节剂起作用，并且相比于标准核苷酸表现出改善的活性。
表16.阳性和阴性对照：在0.2mM IMP的存在下测定氨基酸的EC50.
实施例3-T1R1核苷酸和氨基酸相互作用结构域的鉴定
本实施例描述了在计算机芯片上鉴定与结合T1R1的核苷酸和氨基酸相互作用的T1R1内的氨基酸。
方法：猫T1R1是C组G蛋白偶联受体(GPCR)，其与T1R3络合以形成鲜味味觉受体异源二聚体。使用另一种C组GPCR代谢型谷氨酸受体1EWT的晶体结构构建猫T1R1捕蝇草结构域(VFT结构域)的模型(Kunishima等人，自然(Nature)407：971-977(2000))，其可从蛋白质数据库(Berman等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)，28：235-242(2000))获得。C组GPCR包括代谢型谷氨酸受体mGluR1、mGluR3、mGluR5和mGluR7的VFT的晶体结构，显示出结合VFT的活性位点裂口的配体的非常相似的模式。这些配体结合模式用于手动比对猫T1R1VFT序列与代谢型谷氨酸受体的序列分布。随后，该比对使用由Modeller软件包(Eswar等人，即生物信息学现行协议(Curr Protoc Bioinformatics)，John Wiley&Sons公司，增刊(Supplement)15，5.6.1-5.6.30(2006))执行同源建模。
将氨基酸建模到T1R1的活性位点：在将谷氨酸(glutamate)的两性离子骨架放置在mGluR晶体结构中之后，首先将丙氨酸(L-丙氨酸)定位在猫T1R1 VFT模型的活性位点。利用分子动力学和能量最小化对得到的络合物进行细化。使用对于水的连续模型，通过计算络合物的计算的能量和分离的配体和载脂蛋白的计算的能量之间的差，来估计结合能。使用发现工作室(Discovery Studio)(达索系统(Dassault Systemes)，BIOVIA公司(BIOVIACorp)，圣地亚哥，CA，USA)将其它氨基酸构建到结合的丙氨酸支架，并且使用分子动力学和能量最小化(Brooks等人，计算机化学杂志(J Comput Chem.)30(10)：545-614(2009))细化。最终模型被选择为计算结合能与丙氨酸相当的那些氨基酸，而且其还保留了与mGluR晶体结构中观察到的铰链的保守的相互作用。
将核苷酸建模到T1R1的活性位点：在将先前公布的IMP建模到人T1R1中后，首先将IMP和GMP定位到猫T1R1VFT活性位点，如Zhang等人(Zhang等人，美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci U S A.)105(52)：20930-4(2008))描述的。改变核苷酸扭键并且利用分子动力学和能量最小化对由此产生的模型细化。最终模型被选择为结合能与GMP相当的那些，而且其还表现出与被确立为对于IMP通过定点诱变结合人T1R1重要的保守残基的核苷酸相互作用(Zhang等人，美国国家科学院院刊105(52)：20930-4(2008))。首先将其它核苷酸和核苷酸类似物与IMP和GMP模型重叠，然后进行对IMP和GMP描述的同样的细化、评估和选择程序。
结果：如图14所示，猫T1R1 VFT结构域由两个叶组成。通过被称为铰链的三股蛋白连接上叶(upper lobe)和下叶(lower lobe)。在图14中，上叶在图的顶部；下叶在图的底部。铰链向左。激动剂结合后捕蝇草结构域从打开的构象转变为闭合的构象。活性氨基酸和核苷酸结合到两个叶之间的VFT结构域(参见图14)。氨基酸结合到铰链附近的区域(参见图14：丙氨酸示于CPK空间填充，其渲染到图的左侧)。核苷酸结合到铰链更远侧但仍位于捕蝇草的叶之间的区域(参见图14：IMP示于CPK空间填充，其渲染到图的右侧)。
氨基酸结合：如图14所示，氨基酸配体结合到VFT的铰链区，并通过铰链附近的相互作用良好协调。图15示出了L-丙氨酸的示例性结合模式，说明与Thr149、Ser172、Tyr220、Thr148、Glu170和Asp302的可能氢键、盐桥相互作用和Pi-阳离子相互作用。这些相互作用被示出为虚线。
通过位点定向诱变，Thr149、Ser172和Tyr220残基被确定为对人鲜味受体中与L-谷氨酸(L-glutamate)的结合是重要的(Zhang等人，美国国家科学院院刊105(52)：20930-4(2008))。小鼠Asn149，其对应于猫的Thr148，显示出对小鼠中氨基酸的结合是重要的(Toda等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem)288：36863-36877(2013))。Glu170和Asp302存在于猫和老鼠T1R1，但不存在于人类。在人类中，这些位置的氨基酸是丙氨酸。人T1R1/T1R3对于L-谷氨酸和L-天冬氨酸具有高度选择性。与此相反，猫和小鼠T1R1/T1R3响应宽范围的氨基酸。在本实施例所描述的模型中，Glu170和Asp302帮助协调适合T1R1的活性位点的氨基酸配体的两性离子的氮，同时建立一种不适合结合L-谷氨酸和L-天冬氨酸的静电环境。利用位点定向诱变，Toda等人表明Glu170和Asp302负责观察到的猫和人类之间氨基酸配体偏好的差异(Toda等人，生物化学杂志288：36863-36877(2013))。
核苷酸结合：核苷酸结合比规定氨基酸在铰链更远侧的位置，如图14所示。图16示出了GMP的示例性结合模式，与GMP的磷酸和T1R1 His47、His71、Arg277和Asn69、GMP的糖和T1R1Asn302和Ser306、以及GMP碱基和T1R1 Ser384、His308和Ala380的可能氢键和盐桥相互作用。这些相互作用被示出为虚线。
显示His308协调GMP的碱基，但也可以摆动以协调GMP的磷酸。还存在添加到配体与VFT的相互作用能的附加疏水性相互作用，并且不同结合位点的灵活性可以变化(数据未显示)。不同的核苷酸可显示出与T1R1的不同相互作用，但可以与本文中所述的对GMP的相互作用重叠。构效关系(SAR)和T1R1模型表明，T1R1的磷酸结合区域中带负电荷的基团的存在对核苷酸与T1R1的结合是重要的。SAR和模型表明，核苷酸碱基、扩展的碱基、取代的碱基、或核苷酸碱基的其它生物电子等排取代的存在可形成T1R1的核苷酸碱基结合区域中的相互作用，这对于结合同样重要(对于碱基的实例，参见Limbach等人，核酸研究(NucleicAcids Research)22(12)：2183-2196(1994))。
同样，SAR和建模表明，核苷酸糖(或糖替代分子)之间的相互作用对于核苷酸与T1R1的成功结合是重要的。该糖可以定向适当的负电荷基团，以同样帮助建立T1R1与核苷酸的磷酸区域(phosphate region)和核苷酸碱基区域之间的相互作用。
虽然不同的核苷酸可表现出与T1R1的不同相互作用，但这种相互作用在很大程度上将可能符合这一组可能的相互作用。
氨基酸和核苷酸结合之间的桥接相互作用：Asp302存在于多种物种包括猫和小鼠中T1R1的VFT中的残基。但是，在人类中该位置的氨基酸是丙氨酸。Asp302具有柔性侧链，其可定向成协调结合的氨基酸配体的两性离子氮或侧链(图15)或可替代地定向以协调结合的核苷酸的糖(图16)。此外，Asp302也可被定向以同时协调结合的氨基酸的两性离子骨架氮和核苷酸的糖(图17)。此桥接相互作用可以增强结合的氨基酸和结合的核苷酸之间的协同效应。因为在人类中该位置的氨基酸是丙氨酸，这样的桥接相互作用在人类中是不可能的。核苷酸碱基的替代构象可建立Glu170和所选择的核苷酸碱基之间的进一步桥接相互作用(数据未显示)。
实施例4-跨膜化合物的计算机鉴定
本实施例描述了T1R1/T1R3受体的计算建模以鉴定推定的跨膜化合物。
计算方法被用来分析T1R1的三维结构，以确定可被利用以选择性地激活T1R1/T1R3受体的跨膜区。虽然猫T1R1的晶体结构还未确定，基于人GPCR代谢型谷氨酸受体1(Metabotropic Glutamate Receptor 1，mGluR1)(Wu等人，2014科学(Science)，卷344，第58-64页)和人GPCR代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)(Dore等人，自然(Nature)，2014年7月31日；511(7511)：557-62；电子版(Epub)2014年7月6日)的晶体结构，生成T1R1的跨膜区的结构模型。然后“计算机”建模用于鉴定可潜在地与T1R1/T1R3受体的T1R1单体的跨膜结构域相互作用的小化学化合物。
图28示出了N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯与T1R1的相互作用。可以看到T1R1跨膜结构域的天冬酰胺(ASN)735与配体的酯相互作用。芳基残基簇被定位在活性位点，其可以通过形成与图右侧的配体的苯基的环堆积相互作用与配体协调。图35示出了1-苄基-3-(2-氧代-2-苯乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮在T1R1的跨膜区内的建模。螺旋6的Phe642和螺旋2的Phe776与1-苄基-3-(2-氧代-2-苯乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮的苯环相互作用，并且螺旋6的Asn792通过氢键与羰基相互作用(图35)。1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2(3H)-酮在T1R1跨膜区内的建模显示了T1R1跨膜区的Asn735与1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2(3H)-酮之间的氢键(图36)。
实施例5-通过跨膜化合物激活T1R1/T1R3受体
本实施例描述了跨膜化合物体外激活T1R1/T1R3受体。
基于实施例4中所述的计算机建模，鉴定并选择推定的T1R1/T1R3跨膜化合物用于体外进一步测试。体外选择的化合物的功能性表征用来评价推定的跨膜化合物单独激活或与一种或多种核苷酸和/或一种或多种氨基酸组合激活T1R1/T1R3受体的有效性。
方法：稳定表达T1R3和诱导性地表达T1R1的HEK293细胞暴露于单独的跨膜化合物或跨膜化合物与一种或多种氨基酸和/或一种或多种核苷酸的组合以激活鲜味受体。使用钙敏感性荧光染料通过细胞内钙水平的变化来检测T1R1/T1R3受体的激活。表达T1R3但不表达T1R1的细胞用作对照。Tetra或用于数据捕获。
对于每种跨膜化合物，生成剂量响应曲线并测定以下性能：跨膜化合物单独的EC50；跨膜化合物与20mM丙氨酸的EC50；跨膜化合物与0.2mM IMP的EC50；跨膜化合物与20mM丙氨酸和0.2mM IMP的EC50。术语半数最大有效浓度(EC50)是指在指定的曝光时间后诱导基线和最大值之间的一半反应的化合物浓度。在每个实验中，将至多10mM的跨膜化合物的系列稀释液加入到T1R1/T1R3表达细胞中。
结果：用1-苄基-3-(2-氧代-2-苯乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮(例如，在缓冲液中)单独或与20mM丙氨酸组合处理表达T1R1/T1R3受体的HEK293细胞，导致T1R1/T1R3受体的激活，如通过细胞内钙水平的变化(ΔF/F0)所指示的，并导致观察的大于1mM的EC50值。与此相反，在0.2mM IMP或20mM丙氨酸和0.2mM IMP的存在下，1-苄基-3-(2-氧代-2-苯乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮导致EC50值分别降低至0.32±0.05mM和0.33±0.04(图37和表17)。这些结果表明，IMP是跨膜化合物1-苄基-3-(2-氧代-2-苯乙基)咪唑啉-2，4，5-三酮的正变构调节剂，即该化合物在T1R1/T1R3上是效果协同的。
观察到化合物N-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-丙基戊酰胺作为T1R1/T1R3单独的激动剂起作用(图39和表17)。在IMP或IMP和丙氨酸的存在下，N-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-丙基戊酰胺的EC50降低，ΔF/F0显著更高地扩展(图39和表17)。这些结果表明，丙氨酸和IMP与N-(苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-丙基戊酰胺协同作用以激活T1R1/T1R3。观察到对于跨膜化合物N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的类似结果(图40和表17)。IMP作为N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的正变构调节剂起作用。
推定的跨膜化合物N-(2-氨基-2-氧代-1-苯乙基)-3-氯-4，5-二甲氧基苯甲酰胺未能单独激活T1R1/T1R3；然而，在IMP或IMP和丙氨酸的存在下，N-(2-氨基-2-氧代-1-苯乙基)-3-氯-4，5-二甲氧基苯甲酰胺激活T1R1/T1R3，如通过在较低浓度下ΔF/F0的增加和EC50的降低所指示的(图41和表17)。观察到与2-((5-(4-(甲硫基)苯基)-2H-四唑-2-基)甲基)吡啶类似的结果(图43和表17)。
化合物(E)-3-(4-甲氧基苯基)-N-(戊-3-基)丙烯酰胺作为T1R1/T1R3的跨膜化合物起作用，EC50为0.45±0.01。在IMP或IMP和丙氨酸的存在下，(E)-3-(4-甲氧基苯基)-N-(戊-3-基)丙烯酰胺的活性大大增强，导致EC50分别为0.15±0.02和0.08±0.01，这表明IMP和丙氨酸作为(E)-3-(4-甲氧基苯基)-N-(戊-3-基)丙烯酰胺的变构调节剂起作用(图42和表17)。
进一步分析跨膜化合物N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺。图44示出在GMP和苯丙氨酸；GMP、苯丙氨酸和丙氨酸；GMP、苯丙氨酸和IMP；或GMP、苯丙氨酸、丙氨酸和IMP的存在下N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的剂量响应曲线。相比N-(庚-4-基)苯并并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的EC50值在苯丙氨酸和GMP存在下或在IMP单独存在下，丙氨酸和IMP的存在显著降低N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的EC50值(表19)。如上所示，IMP作为N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺的激动剂活性的变构调节剂；然而，这些结果表明IMP和丙氨酸的组合导致相比单独的IMP较低的EC50值并表现出ΔF/F0的更高位移，这表明该组合显示与N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺激活T1R1/T1R3的协同效应(图44和表19)。另外，相比于激动剂不存在下苯丙氨酸和GMP的组合，在N-(庚-4-基)苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺、苯丙氨酸和GMP的三元混合物的存在下ΔF/F0高约10X(图45)。
图46示出了对于所用的阳性和阴性对照的剂量响应曲线，活性化合物的结果总结在表17中。表18示出了测试的所有化合物的结果。对于阳性和阴性对照，在0.2mM IMP的存在确定氨基酸的剂量响应曲线。在20mM丙氨酸的存在下确定核苷酸的剂量响应曲线。
不受特定理论的束缚，这些结果表明，单独的核苷酸例如IMP，或核苷酸和氨基酸的组合例如IMP和丙氨酸，作为所公开的跨膜化合物的正性调节剂起作用，从而导致充分激活T1R1/T1R3受体所必需的激动剂的量降低。
表19.通过核苷酸、氨基酸和跨膜化合物激活T1R1/T1R3
表20.用0.2mM IMP测定阳性和阴性对照.
实施例6-通过跨膜化合物激活T1R1/T1R3受体
本实施例描述了跨膜化合物体外激活T1R1/T1R3受体。
基于实施例4所述的计算机建模，鉴定并选择推定的T1R1/T1R3跨膜化合物用于体外进一步测试。所选的化合物的体外功能性表征用来评价推定的跨膜化合物单独激活或与一种或多种核苷酸和/或一种或多种氨基酸组合激活T1R1/T1R3受体的有效性。
方法：如实施例5所述，进行所选的化合物的体外功能表征。
结果：如表21所示，用N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯HCl(例如，在缓冲液中)单独处理表达T1R1/T1R3受体的HEK293细胞，导致T1R1/T1R3受体的激活，EC50为0.03±0.002mM。该化合物与20mM L-丙氨酸的组合增加EC50至0.05±0.001mM。该化合物与0.2mM IMP的组合降低EC50至0.02±0.001mM，并且该化合物与20mML-丙氨酸和0.2mM IMP的组合降低EC50至0.02±0.021mM。
表21.N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯HCl激活T1R1/T1R3的EC50
如表22所示，用N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)烟酰胺(例如，在缓冲液中)单独处理表达T1R1/T1R3受体的HEK293细胞，导致T1R1/T1R3受体的激活，EC50为0.15±0.03mM。该化合物与20mM L-丙氨酸的组合增加EC50至大于0.1mM。该化合物与0.2mM IMP的组合降低EC50至0.05±0.01mM，并且该化合物与20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP的组合降低EC50至0.04±0.01mM。
表22.N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)烟酰胺激活T1R1/T1R3的EC50
如表23所示，用2-氨基-N-苯乙基苯甲酰胺(例如，在缓冲液中)单独处理表达T1R1/T1R3受体的HEK293细胞，导致T1R1/T1R3受体的激活，EC50为0.42±0.01mM。该化合物与20mM L-丙氨酸的组合增加EC50至0.48±0.01mM。该化合物与0.2mM IMP的组合降低EC50至0.14±0.03mM，并且该化合物与20mM L-丙氨酸和0.2mM IMP的组合降低EC50至0.09±0.01mM。
表23. 2-氨基-N-苯乙基苯甲酰胺激活T1R1/T1R3的EC50
不受特定理论的束缚，这些结果表明，单独的核苷酸例如IMP，或核苷酸和氨基酸的组合例如IMP和丙氨酸，作为所公开的跨膜化合物的正性调节剂起作用，从而导致充分激活T1R1/T1R3受体所必需的激动剂的量降低。
实施例7-通过跨膜化合物和核苷酸衍生物激活T1R1/T1R3受体
本实施例描述了跨膜化合物和核苷酸衍生物体外激活T1R1/T1R3受体。
基于实施例4的计算机建模，鉴定并选择推定的T1R1/T1R3跨膜化合物用于体外进一步测试。所选的化合物的体外功能性表征用来评价推定的跨膜化合物单独激活或与一种或多种核苷酸和/或一种或多种氨基酸组合激活T1R1/T1R3受体的有效性。对所选的核苷酸衍生物单独测试或对所选的核苷酸衍生物与一种或多种核苷酸和/或一种或多种氨基酸的组合进行测试。
方法：如实施例1、2和5所述，对所选的化合物进行体外功能表征。
结果：表26示出测试的所有跨膜化合物和核苷酸衍生物激活T1R1/T1R3的效果。用在缓冲液中的几种跨膜化合物单独处理表达T1R1/T1R3受体的HEK293细胞，导致T1R1/T1R3的激活，如通过细胞内钙水平变化(ΔF/F0)所指示的，如表24A-O所示。当这些化合物与0.2mM IMP或与0.2mM IMP和20mM丙氨酸的混合物组合，跨膜化合物在激活T1R1/T1R3方面更有效，如通过跨膜化合物的EC50浓度降低所证明的(表24A-O和图58-75)。表24A-O示出了每种活性跨膜化合物单独(在缓冲液中)和在L-丙氨酸、IMP和L-丙氨酸+IMP存在下的EC50。表25和图71示出了对照化合物(在0.2mM IMP存在下20mM氨基酸)的EC50和剂量响应曲线。不受特定理论的束缚，这些结果表明，单独的核苷酸例如IMP，或核苷酸和氨基酸的组合例如IMP和丙氨酸，作为所公开的跨膜化合物的正性调节剂起作用，从而导致充分激活T1R1/T1R3受体所必需的跨膜化合物的量降低。
表24A-O.跨膜化合物激活T1R1/T1R3的EC50
表24A
1，3-二苄基嘧啶-2，4，6(1H，3H，5H)-三酮 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 0.26±0.01mM
+20mM L-丙氨酸 0.31±0.05mM
+0.2mM IMP 0.52±0.19mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP ＞0.3mM
表24B
表24C
表24D
表24E
(二苯基乙酰基)-氨基甲酸乙基酯 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 0.25±0.01mM
+20mM L-丙氨酸 0.38±0.01mM
+0.2mM IMP 0.12±0.02mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.10±0.01mM
表24F
N，N′-(丁烷-1，4-二基)二烟酰胺 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 N/A
+20mM L-丙氨酸 N/A
+0.2mM IMP 0.60±0.09mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.61±0.36mM
表24G
N-苯乙基烟酰胺 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 0.37±0.02mM
+20mM L-丙氨酸 ＞0.3mM
+0.2mM IMP 0.35±0.1mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.22±0.02mM
表24H
2-氨基-N-苯乙基苯甲酰胺 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 0.42±0.01mM
+20mM L-丙氨酸 0.48±0.01mM
+0.2mM IMP 0.14±0.02mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.09±0.01mM
表24I
N-苯乙基苯并[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-甲酰胺 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 0.12±0.07mM
+20mM L-丙氨酸 ＞1.0mM
+0.2mM IMP 0.04±0.01mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.03±0.01mM
表24J
N-苯乙基苯甲酰胺 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 0.33±0.01mM
+20mM L-丙氨酸 ＞1.0mM
+0.2mM IMP 0.12±0.03mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.09±0.02mM
表24K
N-苯甲酰基-DL-亮氨酰胺 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 ＞0.6mM
+20mM L-丙氨酸 ＞1.0mM
+0.2mM IMP 0.47±0.07mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.91±0.23mM
表24L
N-(2-(1H-吲哚-3-基)乙基)烟酰胺 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 0.15±0.03mM
+20mM L-丙氨酸 ＞0.1mM
+0.2mM IMP 0.05±0.01mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.04±0.10mM
表24M
N-苄基-L-苯丙氨酸甲基酯盐酸盐 T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 0.03±0.002mM
+20mM L-丙氨酸 0.05±0.001mM
+0.2mM IMP 0.02±0.001mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.02±0.002mM
表24N
6-硫代鸟苷-5’-O-二磷酸(6-T-GDP) T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 N/A
+20mM L-丙氨酸 0.18±0.02mM
+0.2mM IMP N/A
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP 0.28±0.05mM
表24O
6-氯代嘌呤核糖苷-5’-O-三磷酸(6-Cl-PuTP) T1R1/T1R3 EC50
单独在缓冲液中 ＞0.03mM
+20mM L-丙氨酸 ＞0.03mM
+0.2mM IMP ＞0.03mM
+20mM L-丙氨酸+0.2mM IMP ＞0.03mM
表25.跨膜化合物激活T1R1/T1R3的阳性和阴性对照
实施例8-通过跨膜化合物激活T1R1/T1R3受体
本实施例描述了跨膜化合物体外激活T1R1/T1R3受体，其中所述跨膜化合物用作受体激动剂和/或正变构调节剂(PAM)。当用作PAM时，跨膜化合物增加核苷酸和氨基酸对受体的活性的影响。
基于实施例4所述的计算机建模，鉴定并选择推定的T1R1/T1R3跨膜化合物用于作为体外受体激动剂和/或PAM的进一步测试。所选的化合物的体外功能性表征用来评价推定的跨膜化合物作为激动剂和/或PAM激活T1R1/T1R3受体的有效性。
激动剂筛选方法：稳定表达T1R3和诱导性地表达T1R1的HEK293细胞暴露于跨膜化合物。使用钙敏感性荧光染料和/或发光报告系统通过细胞内钙水平的变化来检测T1R1/T1R3受体的激活。不表达T1R1/T1R3受体的细胞用作对照。或用于数据捕获。
在0.01mM、0.1mM和1mM的浓度下测试每种跨膜化合物。对于激活T1R1/T1R3的每种跨膜化合物，生成剂量响应曲线。为了生成剂量响应曲线，在GMP和Ala的存在下，在0.0001mM至1.0mM之间的浓度测试跨膜化合物。创建剂量响应曲线，其中Ala在20mM保持恒定，GMP从0.001mM增加至1mM(即具体为0.001mM、0.003mM、0.01mM、0.03mM、0.1mM、0.3mM、0.6mM和1mM)。同样，GMP在1mM保持恒定，Ala的浓度在0.1mM和100mM(具体为0.1mM、0.3mM、1mM、3mM、10mM、30mM、60mM和100mM)之间变化。
PAM筛选方法：稳定表达T1R3和诱导性地表达T1R1的HEK293细胞暴露于单独的跨膜化合物或跨膜化合物与Ala和GMP的组合以激活鲜味受体。使用钙敏感性荧光染料和/或发光报告系统通过细胞内钙水平的变化来检测T1R1/T1R3受体的激活。不表达T1R1/T1R3受体的细胞用作对照。或用于数据捕获。
生成0(仅有缓冲液)、0.01mM、0.1mM和1mM的浓度下各跨膜化合物的剂量响应曲线，其中测试三种浓度的跨膜化合物与0.03mM GMP+100mM Ala(T1)、0.6mMGMP+10mM Ala(T2)、0.1mM GMP+60mM Ala(T3)和0.3mMGMP+60mM Ala(T4)的组合。还以2倍稀释系列(T4(×)浓度)测试混合物。在这些实验中，第一测试浓度为2×(2倍)的T4浓度。后续的测试浓度是对其(1×，0.5×等)的2倍稀释。在有或没有加入0.3mM恒定浓度的测试化合物测试此稀释系列。
还确定在1mM GMP+100mM Ala的存在下鲜味受体的激活，以产生“最大的”鲜味受体激活水平。如果对化合物+Ala+GMP的任何组合的响应超过了对单独化合物和单独GMP+丙氨酸的响应的总和，则将化合物归类为PAM。
结果：如表27所示，对24种不同的化合物的跨膜进行了测试，九种被鉴定为T1R1/T1R3激动剂、PAM或两者。
表27.作为T1R1/T1R3激动剂、PAM或两者的跨膜化合物
如表28所述，所测试的九种化合物作为T1R1/T1R3激动剂和/或PAM是有活性的。图72-80示出了用于被鉴定为T1R1/T1R3激动剂和/或PAM的每种化合物的激动剂特征和PAM特征的剂量响应曲线。
不受特定理论的束缚，这些结果表明，跨膜化合物可作为激动剂单独激活T1R1/T1R3，并且也可以作为T1R1/T1R3的GMP和Ala激活正变构调节剂起作用，从而减少充分激活T1R1/T1R3受体所需的激动剂的量。
实施例9-T1R1跨膜化合物相互作用残基的鉴定
本实施例描述了T1R1内与结合T1R1的跨膜化合物相互作用的氨基酸的计算机鉴定。
方法：猫T1R1是C组G蛋白偶联受体(GPCR)，如为T1R2、T1R3、CaSR、GabaB和mGlu的。C组GPCR包含(1)大的外部结构域，称为捕蝇草结构域(VFT)，(2)7跨膜结构域(7TM)，和(3)富含半胱氨酸的结构域，其连接VFT和7TM。基于来自蛋白质数据库(Berman等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)，28：235-242(2000))的晶体结构4OR2和4OO9构建猫T1R17TM结构域的同源模型。4OR2和4OO9是C组GPCR的两种代谢型谷氨酸受体的部分的晶体结构。4OR2是mGluR1的具有结合的负变构调节剂(NAM)的跨膜结构域的晶体结构(Wu等人，科学(Science)，2014年4月4日，344(6179)：58-64；电子版(Epub)2014年3月6日)。4OO9是mGluR5的具有结合的NAM的跨膜结构域的晶体结构(Dore等人，自然(Nature)，2014年7月31日；511(7511)：557-62；电子版2014年7月6日)。使用I-TASSER程序套件(Yang等人，自然方法(Nature Methods)，12：7-8(2015))和Modeller软件包(Eswar等人，即生物信息学实验指南(Curr Protoc Bioinformatics)，John Wiley&Sons公司，增刊(Supplement)15，5.6.1-5.6.30(2006))(其是来自达索系统(Dassault Systemes)，BIOVIA公司(BIOVIA Corp)，圣地亚哥，CA，USA)的程序套件的一部分)构建模型。mGluR1和猫T1R1 7TM结构域之间有约25％的序列同一性。使用来自BioPredict公司的对接程序BioDock(奥拉德尔，NJ，USA)，将N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯对接进入T1R1模型中猫T1R1 7TM的变构位点。对于VFT结构域的对接氨基酸和核苷酸，使用对于用VFT结构域对接的建模核苷酸所描述的类似方案。
结果：在对接模型中，N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯与猫T1R1的变构7TM结合位点的下列氨基酸相互作用：Ala795、Ala796和Asn792，它们在7TM的螺旋7；Trp773和Phe776，它们在7TM的螺旋6；Ala731、Phe728、Leu730、Phe732和Asn735，它们在7TM的螺旋5；Ala689、Ser686、Gln690、Ile693、Cys694和Leu695，它们在7TM的螺旋4；和Arg634、Gln635、Phe642、Ala639、Ala643和Leu638，它们在7TM的螺旋3(图28.N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯的酯基形成与Asn735的氢键)。其它跨膜化合物的模型说明了，配体可以形成与Asn735、Ser686或两者的氢键相互作用。
N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯和T1R1的7TM结构域之间的大多数疏水性相互作用发生在配体和Trp773、Phe776、Phe732、Phe728、Leu730、Leu695、Leu638和Phe642之间。这些氨基酸也为其它T1R1跨膜配体和T1R1跨膜结构域之间的疏水性相互作用而提供。
T1R1活性位点的显著特征是，可以与结合的配体进行环堆积相互作用的残基的数目。N-苄基-L-苯丙氨酸甲酯结合T1R1 7TM的模型示出了从苄基到跨膜结构域的环堆积相互作用。该特征对于结合T1R1 7TM的其它活性跨膜化合物的模型是共同的。这些可能有助于两者的结合和T1R1/T1R3活性构象的稳定化。可以形成这种相互作用的T1R1 7TM氨基酸包括Trp773、Phe776、Phe732、Phe728和Phe642。
***
尽管已经详细描述了本文公开的主题及其优点，但是应当理解，可在不脱离所附权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下作出各种变化、取代和更改。此外，本申请的范围并非旨在限于本说明书中所描述的物质的处理、加工、制造和组合物、装置、方法和步骤的具体实施方案。正如本领域普通技术人员从本发明公开的内容将容易地认识到，根据本文公开的主题，可以利用目前存在的或以后要开发的与本文描述的对应实施方案执行基本相同的功能或实现基本相同结果的物质的处理、加工、制造和组合物、装置、方法或步骤。因此，所附权利要求旨在包括在此类物质的处理、加工、制造、组何物、装置、方法或步骤的范围内。
本申请通篇引用专利、专利申请、出版物、产品说明和协议，其公开内容通过引用以其整体并入本文作为用于所有的目的。
序列表
<110> 马斯公司
<120> 风味组合物及包含该组合物的宠物食品
<130> 069269.0166
<150> US 62/090138
<151> 2014-12-10
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2526
<212> DNA
<213> 家猫(Felis catus)
<400> 1
atgtcactcc cggcggctca cctggtcggc ctgcagctct ccctctcctg ctgctgggct 60
ctcagctgcc acagcacaga gacgtctgcc gacttcagcc tccctgggga ttacctcctc 120
gcaggtctgt tccctctgca ctctgactgt ccgggcgtga ggcaccggcc cacggtgacc 180
ctctgtgaca ggcccgacag cttcaacggt cacggctacc acctcttcca ggccatgcgg 240
tttggcatcg aggagataaa caactccacg gccctcctgc cgaacgtcac cctgggatac 300
cagctgtacg acgtgtgctc ggagtctgcc aacgtgtatg ccacactaaa cgtgctctcc 360
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ctggctgtca ttgggcctga caccaccaac cacgcagcca ccactgcagc cctgctgagc 480
cccttcctgg tgcccctgat cagctacgag gccagcagcg tgacgctcgg agtgaagcgg 540
cattacccct cgtttctgcg caccatcccc agcgacaagc accaggtgga ggccatggtg 600
ctgctgctgc agagcttcgg gtgggtctgg atctcggtgg tcggcagcga cggcgactac 660
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ttcaaggaca tcatcccctt ctctgcccgg ccgggcgacg agaggatgca gggcatcatg 780
caccacctgg cccgagcgag gaccaccgtt gtggtcgttt tctccagcag gcagctggcc 840
agggtgttct ttgagtcggt ggtgctggcc aacctgactg ccaaggtgtg gatcgcctca 900
gaagactggg ccatctctag acacatcagc aatgtgcccg ggatccaggg cattggcaca 960
gtgctgggtg tggccatcca gcagaggctt gtccctggcc tgaaggagtt tgaagaggcc 1020
tatgtccagg cagataaggg ggcccctggg ccttgctcca ggacctccga gtgcagcagc 1080
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acttggcacg agaccatctc ttgggtgctg ctggcagcta atacgttgct gctgctgctg 1740
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aagttttctg ccaaggtacc caccttctac cgtgcctggg tccaaaacca cggtcctggc 2040
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acctga 2526
<210> 2
<211> 841
<212> PRT
<213> 家猫(Felis catus)
<400> 2
Met Ser Leu Pro Ala Ala His Leu Val Gly Leu Gln Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Cys Cys Trp Ala Leu Ser Cys His Ser Thr Glu Thr Ser Ala Asp Phe
20 25 30
Ser Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Phe Pro Leu His Ser
35 40 45
Asp Cys Pro Gly Val Arg His Arg Pro Thr Val Thr Leu Cys Asp Arg
50 55 60
Pro Asp Ser Phe Asn Gly His Gly Tyr His Leu Phe Gln Ala Met Arg
65 70 75 80
Phe Gly Ile Glu Glu Ile Asn Asn Ser Thr Ala Leu Leu Pro Asn Val
85 90 95
Thr Leu Gly Tyr Gln Leu Tyr Asp Val Cys Ser Glu Ser Ala Asn Val
100 105 110
Tyr Ala Thr Leu Asn Val Leu Ser Leu Leu Gly Thr His His Val Glu
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Ile Arg Ala Asp Pro Ser His Tyr Ser Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile
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Gly Pro Asp Thr Thr Asn His Ala Ala Thr Thr Ala Ala Leu Leu Ser
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Pro Phe Leu Val Pro Leu Ile Ser Tyr Glu Ala Ser Ser Val Thr Leu
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Gly Val Lys Arg His Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Ser Asp
180 185 190
Lys His Gln Val Glu Ala Met Val Leu Leu Leu Gln Ser Phe Gly Trp
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Val Trp Ile Ser Val Val Gly Ser Asp Gly Asp Tyr Gly Gln Leu Gly
210 215 220
Val Gln Ala Leu Glu Glu Gln Ala Thr Gln Gln Gly Ile Cys Val Ala
225 230 235 240
Phe Lys Asp Ile Ile Pro Phe Ser Ala Arg Pro Gly Asp Glu Arg Met
245 250 255
Gln Gly Ile Met His His Leu Ala Arg Ala Arg Thr Thr Val Val Val
260 265 270
Val Phe Ser Ser Arg Gln Leu Ala Arg Val Phe Phe Glu Ser Val Val
275 280 285
Leu Ala Asn Leu Thr Ala Lys Val Trp Ile Ala Ser Glu Asp Trp Ala
290 295 300
Ile Ser Arg His Ile Ser Asn Val Pro Gly Ile Gln Gly Ile Gly Thr
305 310 315 320
Val Leu Gly Val Ala Ile Gln Gln Arg Leu Val Pro Gly Leu Lys Glu
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Phe Glu Glu Ala Tyr Val Gln Ala Asp Lys Gly Ala Pro Gly Pro Cys
340 345 350
Ser Arg Thr Ser Glu Cys Ser Ser Asn Gln Leu Cys Arg Glu Cys Arg
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Ala Phe Thr Ala Glu Gln Met Pro Thr Leu Gly Ala Phe Ser Met Ser
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Ser Ala Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala Val Tyr Ala Val Ala His Gly Leu
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His Gln Leu Leu Gly Cys Ala Ser Gly Ala Cys Ser Arg Asp Arg Val
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His Lys Asp Thr Val Arg Phe Asn Asp Asn Gly Asp Pro Leu Ser Gly
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Tyr Asp Ile Ile Ala Trp Asp Trp Ser Gly Pro Lys Trp Asn Phe Arg
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Asp Thr Pro Val Val Lys Ser Ala Gly Gly Arg Leu Cys Phe Phe Met
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<210> 4
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<212> PRT
<213> 家猫(Felis catus)
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865

Claims (46)

1.一种风味组合物，所述组合物包含式Nt-1的化合物，所述式Nt-1包含如下结构：
其中R1选自由取代或未取代的嘌呤和取代或未取代的嘧啶组成的组；
其中R2选自单磷酸、二磷酸、三磷酸、-OP(W)(OH)2、-OP(W)(OH)OP(W)(OH)2、-OP(W)(OH)OP(W)(OH)OP(W)(OH)2、-OS(O)2芳基(H)、-OS(O)2芳基(CH3)、-P(W)(OH)2、-OP(W)(OH)OS(O)2(OH)、-OP(W)(OH)Z、-P(W)(OH)OP(W)(OH)2、-O(CH2)1-4OP(W)(OH)2、-OS(W)(OH)2、-OP(W)(OH)CH2OP(W)(OH)2、-OP(W)(OH)OP(W)O(CH2)1-4R18、-(CH2)0-4COOH、-(CH2)0-4S(O)(OH)2、-(CH2)0-4C(O)NHOH和-(CH2)0-4B(OH)2；
其中X选自O、S、N(R3)和CH2；
其中W选自O和S；
其中R3选自H和CH3；
其中R4、R5、R14、R15、R18独立地选自H、OH、SH、CH2、CH3、OR6、SR6、CH2CH3、支链和无支链的低级烷基(C1-C6)、XC(O)低级烷基、-XC(O)CH2Ph、-P(W)(OH)2、-XC(O)PhR11、-OP(O)(OH)O、OCH3、N(R11，R17)、-O(C)nR11、R17O-、N(H或独立的低级烷基)2-3、COOR11、-OC(W)NH(CH2)1-6NH2、-OC(W)NH(CH2)1-6R4；
其中Z选自哌啶、吗啉、哌嗪、N-甲基-哌嗪、N(R16)(R17)；
其中R6、R11、R16和R17独立地选自H、OH、SH、CH2、CH3、OCH3、COOR、N(R12)(R13)、CH2CH3、支链和无支链的低级烷基(C1-C6)、XC(O)低级烷基、-XC(O)CH2Ph、-P(W)(OH)2、-XC(O)PhR12、-OP(O)(OH)O、OCH3、N(R12，R13)、-O(C)nR12、R13O-、N(H或独立的低级烷基)2-3和COOR12；和
其中R12和R13独立地选自H、OH、SH、CH2、CH3、OCH3和CH2CH3。
2.根据权利要求1所述的风味组合物，其中所述式Nt-1的R1选自由组成的组。
3.根据权利要求1所述的风味组合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：
以及它们的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含化合物，所述化合物选自由以及它们的组合组成的组。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含化合物，所述化合物选自由以下组成的组：
以及它们的组合。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含具有以下结构的化合物：
7.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含具有以下结构的化合物：
8.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：
以及它们的组合。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含具有以下结构的化合物：
10.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：
以及它们的组合。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含具有以下结构的化合物：
12.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含具有以下结构的化合物：
13.根据权利要求1-3中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的化合物：
以及它们的组合。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的氨基酸：色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、亮氨酸以及它们的组合。
15.根据权利要求14所述的风味组合物，其中所述氨基酸是丙氨酸。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的氨基酸：天冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、羟基脯氨酸、精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、谷氨酸一钠、牛磺酸以及它们的组合。
17.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含权利要求14所述的第一氨基酸和权利要求16所述的第二氨基酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含选自由以下组成的组的核苷酸：鸟苷单磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、腺苷单磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胞苷单磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、肌苷单磷酸(IMP)、肌苷二磷酸(IDP)、肌苷三磷酸(ITP)、尿苷单磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胸苷单磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、黄苷单磷酸(XMP)、黄苷二磷酸(XDP)、黄苷三磷酸(XTP)以及它们的组合。
19.根据权利要求18所述的风味组合物，其中所述核苷酸选自由鸟苷单磷酸(GMP)、肌苷单磷酸(IMP)以及它们的组合组成的组。
20.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含丙氨酸和鸟苷单磷酸(GMP)。
21.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含甘氨酸和鸟苷单磷酸(GMP)。
22.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含组氨酸和鸟苷单磷酸(GMP)
23.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物包含丙氨酸和肌苷单磷酸(IMP)。
24.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含甘氨酸和肌苷单磷酸(IMP)。
25.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含组氨酸和肌苷单磷酸(IMP)。
26.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含脯氨酸和选自由组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸。
27.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含苏氨酸和选自由组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸。
28.根据权利要求1-13中任一项所述的风味组合物，所述组合物还包含谷氨酸和选自由组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸。
29.一种包含权利要求1-28中任一项所述的风味组合物的食品，其中所述风味组合物以所述食品的约0.0001重量％至约10重量％的浓度存在。
30.一种包含权利要求1-28中任一项所述的风味组合物的食品，其中所述风味组合物以所述食品的约0.001ppm至约1000ppm的浓度存在。
31.一种包含权利要求1-28中任一项所述的风味组合物的食品，其中所述风味组合物以所述食品的约1μM至约10M的浓度存在。
32.一种包含权利要求1-28中任一项所述的风味组合物的食品，其中所述风味组合物以增加所述食品的适口性的有效量存在，正如通过味道测试者小组所确定的。
33.一种用于增加食品鲜味味道强度的方法，所述方法包括将食品与权利要求1-28中任一项所述的风味组合物混合，其中所述风味组合物以混合物的约0.0001重量％至约10重量％的浓度存在。
34.一种用于增加食品鲜味味道强度的方法，所述方法包括将食品与权利要求1-28中任一项所述的风味组合物混合，其中所述风味组合物以混合物的约0.001ppm至约1000ppm的浓度存在。
35.一种用于增加食品鲜味味道强度的方法，所述方法包括将食品与权利要求1-28中任一项所述的风味组合物混合，其中所述风味组合物以混合物的约1μM至约1M的浓度存在。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中鲜味味道强度的增加包括鲜味回味的增加。
37.一种用于制备包含权利要求1-28中任一项所述的风味组合物的食品的方法，其中所述方法包括热处理食品前体，其中热处理期间产生所述风味组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述热处理杀菌、干馏、挤压、注射成型或它们的组合。
39.根据权利要求29-32中任一项所述的食品，其中所述食品包括宠物食品。
40.根据权利要求39所述的食品，其中所述宠物食品为猫科宠物食品。
41.根据权利要求40所述的食品，其中所述猫科宠物食品为湿的猫科宠物食品。
42.根据权利要求40所述的食品，其中所述猫科宠物食品为干的猫科宠物食品。
43.根据权利要求39所述的食品，其中所述宠物食品为犬科宠物食品。
44.根据权利要求43所述的食品，其中所述宠物食品为湿的犬科宠物食品。
45.根据权利要求43所述的食品，其中所述宠物食品为干的犬科宠物食品。
46.根据权利要求29-32中任一项所述的食品，其中所述食品包括人类的食品。
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