CN105998141A - 一种制备西瓜霜的纯种发酵方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备西瓜霜的纯种发酵法及其制备工艺和用作治疗感染性、炎性相关疾病的药物、保健品及化妆品中的应用。所述方法将西瓜和芒硝(Na2SO4·10H2O)按一定比例混合作为培养基，以单一菌种产红青霉菌(Penicillium rubens)为发酵菌种，在一定温度条件下经过发酵而制成西瓜霜。此发明制备西瓜霜的方法与传统生产方式明显不同，具有诸多优点。制备的西瓜霜及提取物具有明显抗菌、抗炎活性，可制成适宜的各种制剂和产品，用于治疗口腔、黏膜及皮肤感染性疾病，如口腔炎、牙周病、舌炎、鼻炎、咽喉炎、皮炎及中耳炎的医药、保健品及化妆品的用途。

Description

一种制备西瓜霜的纯种发酵方法及其用途
技术领域
本发明涉及生物工程领域和中药材生产领域，特别涉及一种采用单一菌株—产红青霉菌(Penicillium rubens)纯种发酵制备中药西瓜霜的方法。
背景技术
中药西瓜霜为葫芦科植物西瓜的Citrullus lanatus(Thunb.)Matsumu.et Nakai成熟新鲜果实与芒硝经加工而成的白色结晶粉末，传统制备方法为：取新鲜西瓜，沿蒂头切一厚片作顶盖，挖去部分瓜瓤及种子，将芒硝填入瓜内，盖上顶盖，用竹签插牢，放入瓦盆内，盖好，置阴凉通风处，待析出白霜时，随时刷下，直至无白霜析出为度。西瓜霜具有清热解毒，消肿止痛的功效，用于咽喉肿痛，喉痹，口疮，其药用历史悠久，被历代医家视为咽喉和口腔的良药，有“喉科圣药”之称。中医传统理论认为，西瓜霜清热泻火，消肿止痛的功效是因为西瓜能清热解暑，芒硝能清热泻火，两药合制，性味增强，起到协同作用而发挥药效。目前，对于西瓜霜的研究主要集中在西瓜霜复方药物的临床疗效观察及新用途方面，临床上多用西瓜霜复方进行治疗，如桂林西瓜霜(喷剂)、西瓜霜润喉片、西瓜霜清咽含片和桂林西瓜霜胶囊等中成药。
由于西瓜霜传统制备方法存在各地加工随意性较大，工艺不统一，污染严重，生产时间长、效率低，工艺繁杂，生产中常见人体致病菌的污染，而且机制不清，质量不稳定、不适应现代化生产的需要，使得大多数西瓜霜生产厂家在20世纪70年代相继停产。
本发明前期研究发现传统西瓜霜的制备过程实质为微生物参与的发酵过程，其药效物质基础为微生物的次生代谢产物，该研究结果区别于传统认为的芒硝的细小结晶和少量的西瓜氨基酸等为药效物质的认识，基于此，本发明将采用发酵法制备西瓜霜，通过明确参与西瓜霜发酵的天然菌种，确定了最佳发酵工艺，从而使其生产周期缩短，药品污染减少，质量稳定。本发明还通过抗菌实验证明所制备的西瓜霜对引起咽喉肿痛、口舌热疮等疾病的常见致病菌产生较强的抑制和杀灭作用，从而发挥疗效。本发明所制备西瓜霜提取物可以用于制备治疗感染性、炎性相关疾病的药物、保健品、化妆品，感染性、炎性相关疾病包括口腔炎、牙周病、舌炎、鼻炎、咽喉炎、皮炎及中耳炎。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种用于西瓜霜纯种发酵的菌株产红青霉菌(Penicillium rubens)，所述产红青霉菌来源于以下方法：
采用平板划线法和菌丝顶端纯化法从传统发酵西瓜霜分离得到1株真菌，并委托中国科学院微生物研究所进行鉴定，出具鉴定报告【(2016)微鉴字第032号】，鉴定该真菌为产红青霉菌(Penicilliumrubens)。其菌落形态及显微鉴定结果见说明书附图1，分子生物学鉴定结果见说明书附图2。
另一方面，本发明提供了一种采用所述产红青霉菌制备西瓜霜的纯种发酵方法，具体步骤如下：
取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，按西瓜和芒硝的质量比100:50-100:1加入芒硝，混合均匀，121℃，15psi高压蒸汽灭菌20min，然后接入单一菌种产红青霉菌，在19-27℃条件下，发酵10～20天，发酵期间溶氧，发酵结束后，4000r/min离心10～20min，取上清液，在温度为-40℃、真空度<13Pa条件下干燥，即得西瓜霜。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述方法中西瓜和芒硝的质量比为20:3。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述方法中发酵温度是25℃。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述方法中发酵天数是15-17天。
另一方面，本发明提供了所述纯种发酵方法制备的西瓜霜在制备治疗感染性相关疾病的药物中的应用，其中将所述纯种发酵方法制备的西瓜霜用8-12倍量的95％乙醇在20-25℃条件下冷浸提取2-4次，充分搅拌，将不溶性的Na2SO4滤过，合并滤液，40-50℃下减压回收乙醇，制得西瓜霜提取物，将所述西瓜霜提取物加入药学、保健品、化妆品上可接受的赋形剂或辅料，以常规的方法制备成任何一种适宜的产品。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述感染性、炎性相关疾病选自口腔炎、牙周病、舌炎、鼻炎、咽喉炎、皮炎及中耳炎。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述药物、保健品、化妆品的产品形式选自口腔凝胶剂、膜剂、膏剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂和滴耳剂。
本发明对制备方法中不同发酵原料比例、不同发酵温度及不同发酵时间进行优化，确定最佳工艺参数，制备得到西瓜霜，并对所述西瓜霜进行提取。采用体外抗菌实验对西瓜霜提取物进行活性研究发现，所述西瓜霜提取物对常见人体致病菌，如金黄色葡萄球菌、柠檬葡萄球菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型副伤寒杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏痢疾杆菌和大肠杆菌等，具有显著地体外抑制和杀灭活性，因此该提取物为西瓜霜抗菌有效部位。
附图说明
附图1.西瓜霜发酵菌种的菌落形态及显微鉴定结果。
附图2.西瓜霜发酵菌种的分子生物学鉴定—rRNA基因序列测定结果。
具体实施方式
通过以下实施方式进一步详细说明本发明的技术方案。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1西瓜霜发酵菌种—产红青霉菌的分离纯化
1.取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，加入15％西瓜质量的芒硝，混合均匀，常温发酵15天，取发酵液10mL，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL锥形瓶中，用手或在摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20s～30s即成10：1稀释液。然后连续稀释制成10-2～10-9浓度的稀释菌液备用。取0.2mL各浓度的稀释液，采用常规平板涂抹法，将个梯度的稀释液涂布在4种分离培养基中，将PDA、CZA和Sabourand培养基置于25℃恒温培养箱中培养，将牛肉膏蛋白胨培养基置于37℃恒温培养箱中培养。挑取平板上长出的单菌落作纯培养。
2.用接菌环直接蘸取西瓜霜发酵液表面及内部接种于四种不同的培养基中，每日进行一次，将PDA、CZA和Sabourand培养基置于25℃恒温培养箱中培养，将牛肉膏蛋白胨培养基置于25℃恒温培养箱中培养。挑取平板上长出的单菌落作纯培养。
3.每日观察各平板培养基，待长出菌丝或有单菌落形成后，及时挑取前端菌丝或单菌落，转接至相应新鲜的培养基中培养，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别接于新的平板上进行分离培养，并逐步纯化。对于真菌采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。将纯化后的菌种编号，转入PDA或牛肉膏蛋白胨斜面，置于4℃保存。
4.实验结果：从西瓜霜发酵液中分离得到1株发酵真菌，根据形态鉴定方法进行了初步鉴定，为青霉菌属。
5.西瓜霜发酵菌的菌落形态、显微鉴定及分子生物学鉴定
对所述发酵真菌的菌落形态进行观察并进行显微鉴定：送检菌种在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长较慢，25℃黑暗条件下培养5天，菌落直径15～17mm，质地绒状；产孢结构大量形成，孢子面青灰色；菌落背面浅褐色，无水溶性色素。分生孢子梗特化不明显，宽3.0～5.0μm，壁光滑；帚状枝2～4轮生，松散，瓶梗7.4～13.9×2.6～3.4μm；分生孢子近球形、宽椭圆形，浅绿色，表面光滑，3.0～5.0×2.5～4.0μm。未见有性孢子。参见附图1。
委托中国科学院微生物研究所进行鉴定，出具鉴定报告【(2016)微鉴字第032号】，所述真菌中包括18S rRNA片段，ITS1、5.8S rRNA、ITS2的全部序列及28S rRNA序列片段。鉴定该真菌为产红青霉菌(Penicillium rubens)。参见附图2。
实施例2不同发酵原料比例纯种发酵西瓜霜的制备
取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，分别按西瓜和芒硝的质量比为2:1、10:3、5:1、20:3、10:1、20:1加入芒硝，混合均匀，121℃，15psi高压蒸汽灭菌20min，然后分别接入单一菌种产红青霉菌，在25℃条件下，均发酵15天，发酵期间溶氧，发酵结束后，4000r/min离心10～20min，取上清液，在温度为-40℃、真空度<13Pa条件下干燥，从而制得西瓜霜。
表1.不同发酵原料比例(西瓜：芒硝)纯种发酵西瓜霜的抑菌活性
实施例3不同发酵温度纯种发酵西瓜霜的制备
取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，按西瓜和芒硝的质量比为20:3加入芒硝，混合均匀，121℃，15psi高压蒸汽灭菌20min，然后分别接入单一菌种产红青霉菌，分别在21℃、23℃、25℃、27℃、31℃条件下，均发酵15天，发酵期间溶氧，发酵结束后，4000r/min离心10～20min，取上清液，在温度为-40℃、真空度<13Pa条件下干燥，从而制得西瓜霜。
表2.不同发酵温度纯种发酵西瓜霜的抑菌活性
实施例4不同发酵时间纯种发酵西瓜霜的制备
取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，按西瓜和芒硝的质量比为20:3加入芒硝，混合均匀，121℃，15psi高压蒸汽灭菌20min，然后分别接入单一菌种产红青霉菌，在25℃条件下，分别发酵7、9、11、13、15、17、19、21天，发酵期间溶氧，发酵结束后，4000r/min离心10～20min，取上清液，在温度为-40℃、真空度<13Pa条件下干燥，从而制得西瓜霜。
表3.不同发酵时间纯种发酵西瓜霜的抑菌活性
实施例5西瓜霜最佳制备工艺的确定
根据以上实施例2-4的试验结果可知，不同发酵原料比例(西瓜：芒硝)纯种发酵西瓜霜的抑菌活性(见表1)表明西瓜霜纯种发酵的最佳原料比例为西瓜：芒硝＝20:3；不同发酵温度纯种发酵西瓜霜的抑菌活性(见表2)表明西瓜霜纯种发酵的最佳温度为25℃；不同发酵时间纯种发酵西瓜霜的的抑菌活性表明西瓜霜纯种发酵的最佳时间为15-17天，最终确定纯种发酵西瓜霜工艺为：取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，按西瓜和芒硝的质量比20:3加入芒硝，混合均匀，121℃，15psi高压蒸汽灭菌20min，然后接入单一菌种产红青霉菌，在25℃条件下，发酵15-17天，发酵期间溶氧，发酵结束后，4000r/min离心10～20min，取上清液，在温度为-40℃、真空度<13Pa条件下干燥，从而制得西瓜霜。
实施例6西瓜霜体外抗菌活性实验
将上述方法制备的西瓜霜用8倍量的95％乙醇在20℃条件下冷浸提取3次，充分搅拌，将不溶性的Na2SO4滤过，合并滤液，40℃减压回收乙醇，制得西瓜霜提取物。采用体外抗菌实验对西瓜霜提取物进行活性研究，所选菌种是常见的口腔、呼吸道、消化道致病菌，包括：金黄色葡萄球菌、柠檬葡萄球菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型副伤寒杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏痢疾杆菌和大肠杆菌。
最低抑菌浓度(MIC)测定：96孔板连续稀释法。向洁净无菌的96孔板加入如下溶液：于96孔板加入100μL营养肉汤培养基；向第1孔加入100μL样品，与培养基混匀后吸取100μL加入第2孔，以此类推加至第10孔，吸取其中100μL弃置废液75％乙醇中；向第11孔再加入100μL营养肉汤培养基；除第12孔外，向每孔中加入100μL实验用菌液混匀，以上过程为无菌操作。
此时，第n孔对应药液浓度为C0/2n+1(C0为初始浓度)，其中第11孔作为药液空白，第12孔作为菌液空白，每种样品平行三次。于37℃恒温培养18h后观察结果。
表4.西瓜霜提取物的体外抗菌活性实验(MIC)
实施例7西瓜霜口腔凝胶剂
称取卡波姆凝胶基质至研钵中，加入甘油，研磨使湿润，加适量纯化水研磨使充分溶胀，加三乙醇胺研磨成透明凝胶基质。另称取适量西瓜霜提取物，尼泊金乙酯，加纯化水加热溶解，趁热将溶液与上述基质混合，充分研磨均匀，放冷，即得西瓜霜口腔凝胶剂。
实施例8西瓜霜口腔膜剂
先将聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠分别用适量纯化水浸泡，充分膨胀后水浴使之完全溶解，混匀二者，备用。取西瓜霜提取物适量溶于少量热纯化水中，加入糖精钠、甘油搅拌溶解，再将此药液与上述备用的聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠胶浆液混合，加适量纯化水至规定量，混匀。静置，待气泡除尽后涂膜，干燥，脱膜，分割成所需大小的膜片，在紫外灯下照射15min灭菌，密封包装，制得西瓜霜口腔膜剂。
实施例9西瓜霜含片
西瓜霜提取物65g，葡萄糖70g，蔗糖、淀粉各75g，混匀，以95％乙醇制粒，干燥，压片。
实施例10西瓜霜牙膏化妆品
西瓜霜提取物5.0g，加入水合硅酸摩擦剂、甘油湿润剂、月桂醇磺酸钠、羧甲基纤维素钠粘合剂、香料、甜味剂，分别称重计量，混合，置于制膏机中，研磨均匀，制成100.0g牙膏。用作口腔溃疡、牙周病、牙龈炎症的日常护理。
实施例11西瓜霜凝胶剂的临床疗效观察—治疗口腔溃疡
药物：西瓜霜凝胶剂
患者选择：50例门诊患者，男性患者28例，女性患者22例，年龄18～62岁。排除内源性病因患者。
给药方法：取西瓜霜凝胶剂适量，均匀涂于患处，每日4～6次，连续给药5天。
疗效标准：①显效：疼痛消失，口腔溃疡基本愈合；②有效：疼痛减轻，口腔溃疡面积缩小，红肿减轻，未愈合；③无效：疼痛无减轻或加重，口腔溃疡仍旧。
临床治疗结果：总有效率为94.2％，无不良反。
口腔溃疡属中医“口疮”范畴，多因过食辛辣，心脾积热，复感风、火、燥邪所致。西瓜霜具有清热泻火，消肿止痛的功效，治疗口腔溃疡疗效显著，且无明显副作用，用药方便。
实施例12西瓜霜提取物的临床疗效观察—治疗急慢性咽喉炎
药物：西瓜霜提取物
患者选择：43例门诊患者，男性患者23例，女性患者20例，年龄18～57岁。排除内源性病因患者。
给药方法：取适量西瓜霜提取物，含化药物，每日2～5次，疗程7天。
疗效标准：①临床治愈：用药7天以内咽喉肿痛及咳嗽症状消失；②显效：用药7天以内咽喉肿痛及咳嗽症状基本消失；③有效：用药7天以内咽喉肿痛及咳嗽症状减轻50％以上；④无效：用药7天以内咽喉肿痛及咳嗽症状减轻未达到50％或加重。
临床治疗结果：总有效率为92.25％，无不良反。
实施例13西瓜霜含片的临床疗效观察--治疗扁桃体炎
药物：西瓜霜含片
患者选择：60例门诊患者，男性患者28例，女性患者32例，年龄19～60岁。排除内源性病因患者。
给药方法：西瓜霜含片，每日3～5片，疗程7天。
疗效标准--细菌学评价标准为：清除，结束疗程后，病原菌完全消失，未出现新的病原菌。未清除，结束疗程后，病原菌并未发生变化。细菌替换：结束疗程后，原病原菌已经被清除，但有新病原菌出现，未出现感染表现，不需进行治疗。
临床治疗结果：细菌清除率87.8％，总有效率为91.66％，无不良反应。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原料的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种制备西瓜霜的纯种发酵方法，其特征在于，将西瓜和芒硝(Na2SO4·10H2O)按一定比例混合作为培养基，以单一菌种产红青霉菌(Penicillium rubens)为发酵菌种，在一定温度条件下经过发酵而制成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤包括：
取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，按西瓜和芒硝(Na2SO4·10H2O)的质量比100:50-100:1加入芒硝，混合均匀，121℃，15psi高压蒸汽灭菌20min，然后接入单一菌种产红青霉菌(Penicillium rubens)，在发酵温度为19-27℃的条件下，发酵10～20天，发酵期间溶氧，发酵结束后，4000r/min离心10～20min，取上清液，在温度为-40℃、真空度<13Pa条件下干燥，即得西瓜霜。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，西瓜和芒硝的质量比为20:3。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵温度是25℃。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵天数是15-17天。
6.如权利要求1-5中任一项所述方法制备的西瓜霜在制备治疗感染性、炎性相关疾病的药物、保健品、化妆品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，其中将制备得到的西瓜霜用8-12倍量的95％乙醇在20-25℃条件下冷浸提取2-4次，充分搅拌，将不溶性的Na2SO4滤过，合并滤液，40-50℃下减压回收乙醇，制得西瓜霜提取物，将所述西瓜霜提取物加入药学、保健品、化妆品上可接受的赋形剂或辅料，以常规的方法制备成任何一种适宜的产品。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述感染性、炎性相关疾病是口腔炎、牙周病、舌炎、鼻炎、咽喉炎、皮炎及中耳炎。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物、保健品、化妆品的产品形式可以是口腔凝胶剂、膜剂、膏剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂和滴耳剂。
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