CN110302257A - 阿尔泰金莲花提取物的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医药领域，具体涉及阿尔泰金莲花提取物的新应用，尤其涉及阿尔泰金莲花提取物在制备变异链球菌抑制剂的应用。实验表明阿尔泰金莲花提取物具有变异链球菌抑制活性，可以抑制浮游状态变异链球菌的生长，抑制变异链球菌生物膜状态的形成。因此阿尔泰金莲花提取物可用于制备变异链球菌抑制剂，以及制备预防和/或治疗龋病的药物和改善龋病的口腔护理用品，具有较高的应用价值和开发前景。而且阿尔泰金莲花提取物取材天然，可避免传统抗生素类、氟化物等产品对人体造成的副作用。

Description

阿尔泰金莲花提取物的新应用

技术领域

本发明涉及中医药领域，具体涉及阿尔泰金莲花提取物的新应用，尤其涉及阿尔泰金莲花提取物在制备变异链球菌抑制剂的应用。

背景技术

龋病俗称虫牙、蛀牙，是一种常见的口腔内多因素细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。龋病病程发展较为缓慢，但发病率高，分布广，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。目前公认的龋病病因学说是四联因素学说，主要与细菌、空腔环境、宿主和时间。而细菌是龋病发生的必要条件，一般认为致龋菌为产酸菌属和革兰阳性球菌，产酸菌属中主要为变异链球菌(Streptococcus mutans)，变异链球菌能在牙面上形成水不溶性的多糖类，牢固地黏着在牙面、牙间或修复体表面，细菌进一步粘附和共聚形成复杂的牙菌斑生物膜结构，这就是其致龋的前提和基础。目前，用于预防龋病的主要药物有抗生素、氟化物以及免疫性药物等，虽然具有一定的防龋效果，但长期使用还具有明显的局限性及不足，如引起口腔及肠道菌群失调而导致其他疾病。近年来，防龋天然药物研究成为了研究开发的热点。

阿尔泰金莲花(Trollius altaicus C.A.Mey)为毛茛科，金莲花属多年生草本植物，分布于中国新疆的阿尔泰山脉和准噶尔西部山地，在内蒙古西部亦有分布。阿尔泰金莲花中含有生物碱、黄酮苷、香豆素、叶黄素、挥发油、糖类、有机酸及甾类化合物等成分。具有清热解毒，止血止咳，抑菌排脓、降血压、安神的功效，主要用于治疗上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎扁、中耳炎等疾病。迄今为止还未发现阿尔泰金莲花关于变异链球菌的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种阿尔泰金莲花提取物在制备变异链球菌抑制剂的应用。

在某一实施方案中，本发明测定阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌生长抑制活性。结果显示，本发明制备的阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌表现出明显的抑制作用，在某一浓度下的抑制效果优于复方氯己定含漱液。

在某一实施方案中，本发明测定阿尔泰金莲花提取物对生物膜结构的变异链球菌生长抑制活性。结果显示，本发明制备的阿尔泰金莲花提取物对生物膜结构的变异链球菌生长表现出明显的抑制作用，可以在一定程度上破坏变异链球菌的生物膜结构，抑制变异链球菌生物膜状态的形成。因此，本发明提供了阿尔泰金莲花提取物在制备变异链球菌抑制剂的应用。

进一步的，本发明还提供了阿尔泰金莲花提取物在制备预防和/或治疗龋病的药物中的应用。

此外，阿尔泰金莲花提取物还可以制备用于改善龋病的口腔护理用品。

其中，所述的阿尔泰金莲花提取物为毛茛科金莲花属阿尔泰金莲花的干燥花提取物。

进一步的，所阿尔泰金莲花提取物的提取方法为将干燥后的阿尔泰金莲花粉碎，加10倍量的70％乙醇回流提取2h后过滤，提取物冷冻干燥得阿尔泰金莲花提取物。

本领域技术人员可将所述有效剂量的阿尔泰金莲花提取物直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，以常规药物制剂方法，制成常用制剂。

优选的，所述药物为片剂、散剂、含潄剂、喷雾剂、凝胶剂。

进一步优选的，所述片剂为口腔用片剂。

本领域技术人员还可将所述阿尔泰金莲花提取物直接或间接加入制备不同口腔护理用品时所需的口腔护理用品中可接受的各种常用辅料，以常规制剂方法，制成常用口腔护理用品。

优选的，所述口腔护理用品为牙膏、口香糖或漱口水。

由上述技术方案可知，本发明提供了阿尔泰金莲花提取物的新应用，尤其是阿尔泰金莲花提取物在制备变异链球菌抑制剂中的应用。实验表明阿尔泰金莲花提取物具有变异链球菌抑制活性，可以抑制浮游状态变异链球菌的生长，抑制变异链球菌生物膜状态的形成。因此阿尔泰金莲花提取物可用于制备变异链球菌抑制剂，以及制备预防和/或治疗龋病的药物和改善龋病的口腔护理用品，具有较高的应用价值和开发前景。而且阿尔泰金莲花提取物取材天然，可避免传统抗生素类、氟化物等产品对人体造成的副作用。

附图说明

图1为本发明实施例5中阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌的生长曲线影响示意图；

图2为本发明实施例6中阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌生物膜生长存活率影响示意图；

图3为本发明实施例7中阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌生物膜结构的影响示意图。

具体实施方式

本发明公开了阿尔泰金莲花提取物在制备变异链球菌抑制剂中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实验所用材料和试剂：BHI平板/液体培养基(北京索莱宝科技有限公司)；复方氯己定含漱液(江苏晨牌邦德药业有限公司)；刃天青无菌液(北京索莱宝科技有限公司)；LIVE/DEAD Bacterial Viability Kit(L-7012活/死细菌活力试剂盒,赛默飞世尔生物化学制品有限公司)；培养箱(311二氧化碳培养箱，美国Thermo公司)；酶标仪(SMP500，德国Spectro Max公司)；激光扫描共聚焦显微镜(C2，日本Nikon公司)。

实施例1、阿尔泰金莲花提取物的制备

取干燥后的阿尔泰金莲花，粉碎，加10倍量的70％乙醇回流提取2h后过滤，将得到的提取物冷冻干燥后备用。本发明所用阿尔泰金莲花提取物为均为本实施例制备得到的阿尔泰金莲花提取物。需要说明的是，本实施例仅是示例性提供一种阿尔泰金莲花提取物的制备方法，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下通过现有技术获得的所有阿尔泰金莲花的提取物均能实现本发明。

实施例2、变异链球菌菌悬液的制备

取常规复苏的变异链球菌(ATCC 700610，购买于中国普通微生物菌种保藏中心)标准菌株接种于BHI液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24h后，在BHI平板上划线培养24h，挑取单菌落在BHI液体培养基中37℃恒温培养箱中纯培养；取对数生长期的菌细胞用紫外分光光度计于波长630nm下调整吸光度(OD)为0.2，得到浓度约为10⁶cfu·mL^-1的变异链球菌菌悬液，备用。

实施例3、阿尔泰金莲花提取物抑菌圈药敏试验

将阿尔泰金莲花提取物用10％二甲基亚砜(DMSO)溶解后制成终浓度为40mg/mL的母液；取母液稀释，稀释后的浓度分别为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL。

取100μL实施例2制备得到的菌悬液均匀涂布在BHI平板中，打孔器打孔；设置多组试验，每孔内添加20μL药液，试验组药液分别为不同浓度(40、20、10、5、2.5、1.25mg/mL)的阿尔泰金莲花提取物，阴性对照组药液为10％DMSO，阳性对照组药液为复方氯己定含漱液。BHI平板放入37℃恒温培养箱中培养24h，以十字交叉法测定抑菌圈直径，每个浓度平行3个孔，求其平均值。培养结果发现浓度为5～40mg/mL的阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌均产生了抑菌圈,且随着提取物浓度的增大，抑菌圈直径增大，当阿尔泰金莲花提取物浓度40mg/mL时具有比阳性对照组(复方氯己定含漱液)更为优异的抑菌效果。结果见表1。

表1.本发明阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌的影响

由表1可以看出，阿尔泰金莲花提取物的浓度在5～40mg/mL时对浮游状态下的变异链球菌具有生长抑制作用，随着药物浓度增加作用越明显。

实施例4最小抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)测定试验

在96孔细胞培养板每孔中加入100μL实施例2制备得到的菌悬液；设置多组试验，每组试验孔板加入相同体积的药液，试验组药液分别为不同浓度(40、20、10、5、2.5、1.25mg/mL)的阿尔泰金莲花提取物，阴性对照组药液为10％DMSO，阳性对照组药液为复方氯己定含漱液，每个浓度平行3个孔，求其平均值。将96孔细胞培养板放入37℃恒温培养箱中培养18h，滴加20μL刃天青无菌液(1mg·mL^-1)，4h后观察孔板内颜色变化；因活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青(蓝色)转化为荧光物质(粉色)，孔板内颜色由蓝色变为粉色对应的最低药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。根据MIC值测定结果，选择药液浓度大于等于MIC值的各孔分别划线于BHI平板上，37℃恒温培养24h，肉眼观察无可见菌落形成的最低浓度为最低杀菌浓度(MBC)。结果发现，阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌的最小抑菌浓度为5mg/mL，最低杀菌浓度为10mg/mL。可见，阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌具有很好的抑菌及杀菌效果。

实施例5对变异链球菌生长曲线测定试验

在96孔细胞培养板每孔中加入100μL实施例2制备得到的菌悬液和相同体积的1/2MIC浓度的阿尔泰金莲花提取物，放入37℃恒温培养箱中培养，酶标仪波长600nm下分别测定培养0、2、4、6、8、10、12、24h后的OD值，以未加阿尔泰金莲花提取物的孔为空白对照组，绘制生长曲线。生长曲线如图1所示，相对于对照组，培养4小时以后1/2MIC浓度的下的阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌的生长具有显著抑制作用。

实施例6对变异链球菌生物膜生长活性影响试验

采用结晶紫染色法检测对变异链球菌细菌生物膜生长活性的影响。在96孔细胞培养板每孔中加入100μL实施例2制备得到的菌悬液和等量BHI液体培养基，置于培养箱中37℃恒温培养24h后将上清液吸出，用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤两次，待干燥后加入相同体积的药液，试验组药液分别为不同浓度(40、20、10、5、2.5、1.25mg/mL)的阿尔泰金莲花提取物，阴性对照组药液为10％DMSO，继续培养；每个浓度重复3个孔。培养24h后将上清液吸出，用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤两次后形成生物膜；每孔加入100μL 0.1％的结晶紫染色液对形成的生物膜染色15min。多余未结合的结晶紫染色液用无菌PBS缓冲液冲洗去除，待干燥后各孔加入100μL 95％乙醇溶液，以洗脱与生物膜结合的结晶紫，静置后于酶标仪检测540nm处各孔的OD值。按照以下方式计算抑制率：

抑制率计算公式为：抑制率＝(1-OD实验组/OD对照组)*100％；

生物膜存活率＝100％-抑制率。

试验结果如图2所示，当阿尔泰金莲花提取物浓度为2.5mg/mL时，变异链球菌生物膜的存活率为20.80％±5.57，与对照组相比，阿尔泰金莲花提取物对生物膜的抑制作用显著(*P<0.05)，且随着提取物浓度的升高，生物膜的存活率降低。可见，阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌生物膜的生长存在明显抑制作用。

实施例7对变异链球菌生物膜结构影响的试验

在激光共聚焦专用培养皿中加入200μL实施例2制备得到的菌悬液和等量的BHI液体培养基，置于培养箱中37℃恒温培养24h后将上清液吸出，用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤两次，干燥后加入同体积的1/2MIC浓度的阿尔泰金莲花提取物，继续培养24h后去除上清液，无菌PBS缓冲液洗去悬浮菌，2％甲基纤维素固定后加入LIVE/DEAD Bacterial ViabilityKit荧光染料20μL，室温下避光孵育15min，立即在激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)下观察，以不加阿尔泰金莲花提取物的BHI培养基为对照，绿色荧光表示为活菌，红色荧光表示为死菌，细菌呈团聚状表明形成生物膜。试验结果如图3所示。图3中可见，对照组中变异链球菌绿色荧光多而强烈，呈团聚状，而红色荧光稀少；与对照组相比，添加有阿尔泰金莲花提取物的实验组中变异链球菌菌群分散，呈团聚状较少，绿色荧光强度降低，而红色荧光显著增多。表明阿尔泰金莲花提取物对变异链球菌生物膜的形成产生明显的抑制作用，生物膜结构被破坏。

实施例8阿尔泰金莲花提取物的药物剂型

本发明的阿尔泰金莲花提取物在变异链球菌引起的龋病方面的应用，可以将阿尔泰金莲花提取物制成不同剂型的药物使用。具体来说，可以将阿尔泰金莲花提取物制成包括片剂、散剂、含潄剂、喷雾剂、凝胶剂等剂型。具体的药物可包括阿尔泰金莲花提取物和其它药学上可接受的载体，对于药物中各成分的用量可以按照药物制剂中对于成分的配比要求进行调整即可，对于阿尔泰金莲花提取物的有效含量也可以按照不同剂型等常规的剂型要求添加，本发明并不作具体的限定。

实施例9阿尔泰金莲花提取物的口腔护理用品

本发明的阿尔泰金莲花提取物在变异链球菌引起的龋病方面的应用，可以将阿尔泰金莲花提取物直接或间接加入制备不同口腔护理用品时所需的口腔护理用品中可接受的各种常用辅料，以常规制剂方法，制成常用口腔护理用品。所述口腔护理用品包括但不限于牙膏、口香糖以及漱口水。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (10)

1.阿尔泰金莲花提取物在制备变异链球菌抑制剂中的应用。

2.阿尔泰金莲花提取物在制备用于预防和/或治疗龋病的药物中的应用。

3.阿尔泰金莲花提取物在制备用于改善龋病的口腔护理用品中的应用。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的应用，其特征在于，所述阿尔泰金莲花提取物为毛茛科金莲花属阿尔泰金莲花的干燥花提取物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述干燥花提取物为阿尔泰金莲花粉碎，加10倍量的70％乙醇回流提取2h后过滤，提取物冷冻干燥得阿尔泰金莲花提取物。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为含有效剂量的阿尔泰金莲花提取物和药学上可接受的辅料。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为片剂、散剂、含潄剂、喷雾剂、凝胶剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述片剂为口腔用片剂。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述口腔护理用品含有阿尔泰金莲花提取物以及口腔护理用品上可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述口腔护理用品为牙膏、口香糖或漱口水。