CN103550282A - 一种制备西瓜霜的方法及其抗感染的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种发酵、冷冻干燥法制备西瓜霜的方法，以及制备的西瓜霜用作抗感染的医药用途。所发明西瓜霜的制备方法特征在于：取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐或容器中，加入一定量浓度的芒硝，混合均匀，利用耐高盐菌种或通过生物技术方法分离获得的发酵菌种，在+5℃～+25℃条件下，发酵7～20天，期间需要定期搅拌，增加溶氧；发酵结束后，离心取上清液，对上清液冷冻干燥，而制成。此发明制备西瓜霜的方法与传统生产方式明显不同，具有诸多优点。制备的西瓜霜及提取物具有明显抗菌活性，可制成适宜的各种制剂，用于治疗口腔、黏膜及皮肤感染性疾病，如：口腔炎、口腔溃疡、急慢性咽喉炎、扁桃体炎及中耳炎的医药用途。

Description

一种制备西瓜霜的方法及其抗感染的医药用途

技术领域

本发明涉及一种发酵制备西瓜霜的方法，以及将该西瓜霜及其95％乙醇(或其他低分子醇)提取物用作抗菌活性的医药用途，用于治疗口腔、黏膜及皮肤感染性疾病：口腔炎、口腔溃疡、咽喉炎、扁桃体炎及中耳炎等。

背景技术

中医传统理论认为，西瓜霜为葫芦科植物西瓜Citrullus lanatus(Thunb.)Matsumu.et Nakai的成熟新鲜果实与皮硝(芒硝粗品)经渗析制霜法加工得到的芒硝的细小结晶。传统炮制方法为：取新鲜西瓜切碎，放入不带釉的瓦罐内，一层西瓜一层芒硝，将口封严，悬挂于阴凉通风处，数日后即自瓦罐外面析出白色结晶物，随析随收集，至无结晶析出为止。也可以直接用西瓜加入芒硝悬吊于阴凉通风处制作。西瓜霜具有清热解毒，消肿止痛的功效，用于咽喉肿痛，喉痹，口疮。西瓜霜药用历史悠久，被历代医家视为咽喉和口腔的良药，有“喉科圣药”之称。

传统观念认为西瓜霜清热泻火，消肿止痛的功效是因为西瓜能清热解暑，芒硝能清热泻火，两药合制，性味增强，起到协同作用而发挥药效。目前，对于西瓜霜的研究主要集中在西瓜霜复方药物的临床疗效观察及新用途方面，临床上多用西瓜霜复方进行治疗，如桂林西瓜霜(喷剂)、西瓜霜润喉片、西瓜霜清咽含片和桂林西瓜霜胶囊等中成药。

由于西瓜霜传统制备方法存在各地加工随意性较大，工艺不统一，污染严重，生产时间长、效率低，工艺繁杂，生产中常见人体致病菌的污染，而且机制不清，质量不稳定、不适应现代化生产的需要，使得大多数西瓜霜生产厂家在20世纪70年代相继停产，古药濒临绝境。本发明采用发酵法制备西瓜霜，明确了发酵菌种为耐高盐的天然菌种，确定了最佳发酵时间，生产周期缩短，减少了污染，阐明了西瓜霜的药效机制和药效作用。所发明的方法中采用冷冻干燥技术，与传统制备方法一样在低温条件下制备，防止对有效成分的加热破坏。本发明创新提出西瓜霜发酵过程中微生物产生的生物转化及次生代谢产物是主要的药效物质，而不是传统上认为的药效物质是芒硝的细小结晶。本发明进行的抑菌、杀菌实验表明：所制备的西瓜霜对引起咽喉肿痛，口舌热疮等疾病的常见致病菌产生较强的抑制、杀灭作用，从而发挥疗效。本发明亦对西瓜霜抗菌有效部位进行了化学研究、菌种的分离鉴定研究。本发明所制备西瓜霜提取物可以治疗感染性疾病：口腔炎、口腔溃疡、急慢性咽喉炎、扁桃体炎及中耳炎等。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种发酵制备西瓜霜的方法。

本发明的目的之二是提供上述西瓜霜抗感染有效部位的制备方法。

本发明的目的之三是将上述西瓜霜分离制成抗感染有效部位，将有效部位提取物制成各种剂型的抗感染药物，用于治疗口腔、黏膜及皮肤感染性疾病，如：口腔炎、口腔溃疡、急慢性咽喉炎、扁桃体炎及中耳炎的医药用途。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种西瓜霜的制备方法，其特征在于采用发酵、冷冻干燥法制备而成。其发酵方法为：以西瓜为培养基，在一定量浓度的Na₂SO₄·10H₂O存在的情况下，即高盐状态下，温度为+5℃～+25℃，发酵7～20天，搅拌增加溶氧；发酵结束后，离心取上清液，冷冻干燥，而制成。

一种采用发酵、冷冻干燥法制备西瓜霜的方法，其包括以下具体步骤：

取新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐或容器中，加入芒硝(西瓜：芒硝=100：10～25kg)，混合均匀，接入菌种或直接用耐高盐自然菌种，在+5℃～+25℃条件下，发酵7～20天，期间需要定期搅拌，以增加溶氧。发酵结束后，4000r离心10～20min，取上清液。将上清液在温度为—40℃、真空度<13Pa条件下，冷冻干燥2天，制得西瓜霜。

本发明中西瓜霜的制备方法，与传统西瓜霜的制备存在明显不同，本方法中采用直接发酵法，以西瓜和芒硝的混合物作为培养基，置于发酵罐或容器中，利用耐高盐的自然菌种及通过生物技术分离得到的菌种接种进行发酵，规定了确切的发酵时间、发酵温度，成霜不需要从瓦罐或西瓜流出液中刷取，减少了污染环节，简化了操作。再采用冷冻干燥技术，使发酵液最终除去水分成疏散的粉末。该方法保存了传统西瓜霜加工上需要在低温条件下成霜的特点，能排除95％～99％以上的水分，不破坏西瓜霜的化学成分，适合工业化的大生产。

按照上述方法制备的西瓜霜的抗菌有效部位的获得，其特征在于：将所得西瓜霜用6～10倍量的95％乙醇冷浸提取1～3次，搅拌，滤过，合并滤液，减压回收乙醇得到西瓜霜提取物。

芒硝为可溶性盐类，无论古法还是所发明的发酵、冻干法制备的西瓜霜中均含有大量的Na₂SO₄，纯品Na₂SO₄虽有一定的药理作用，但是经过活性筛选对感染性疾病并无作用，所以需要把西瓜霜中大量的Na₂SO₄除去，以制取真正的抗菌有效成分。西瓜霜抗菌有效部位提取物的制备方法，包括以下具体步骤：

将所得的西瓜霜用6～10倍量的95％乙醇(或其他低分子醇)在20℃条件下冷浸提取1～3次，充分搅拌，将不溶性的Na₂SO₄滤过，合并滤液，30℃～50℃温度下减压回收乙醇，制得西瓜霜提取物。

本发明发酵时采用的菌种为耐高盐的自然菌种及通过生物技术分离得到的菌种，包括：镰孢霉属、青霉属、毛霉属、交链孢霉属的6种菌种，详细见实验例。

所述西瓜霜提取物，对常见人体致病菌具有显著地抑菌、杀菌活性，为西瓜霜抗菌有效部位。该提取物对常见致病菌具有明显的抑菌、杀菌作用，所选菌种是常见的口腔、呼吸道、消化道致病菌，包括：金黄色葡萄球菌、柠檬葡萄球菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型副伤寒杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏痢疾杆菌和大肠杆菌，详见实验例。

西瓜霜抗菌有效部位提取物，其医药用途为具有抗菌活性，用于制备治疗感染性疾病的药物中的应用。用于治疗口腔炎、口腔溃疡、急慢性咽喉炎、扁桃体炎及中耳炎等。

本发明西瓜霜提取物可以加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂后，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是口腔凝胶剂、膜剂、气雾剂、粉雾剂和滴耳剂等，而用于医药用途。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例一：西瓜霜的制备

取10kg新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，加入1.5kg芒硝，混合均匀，在20℃条件下，发酵15天，期间定期搅拌。发酵结束后，4000r离心10min，得上清液7kg，冷冻干燥，得到西瓜霜1.57kg。

实施例二：西瓜霜的制备：

取30kg新鲜西瓜，切碎后放入发酵罐中，加入5kg芒硝，混合均匀，接入菌种，在20℃条件下，发酵20天，期间定期搅拌，发酵结束后，4000r离心15min，得上清液24kg，冷冻干燥，得到西瓜霜5.52kg。

实施例三：西瓜霜甲醇提取物的制备

取自制西瓜霜3kg，用8倍量的甲醇在20℃条件下冷浸提取2次，每次8h，搅拌，滤过不溶性的Na₂SO₄，合并滤液，35℃减压回收甲醇，得西瓜霜提取物206g。

实施例四：西瓜霜乙醇提取物的制备

取西瓜霜2kg，用10倍量的95％乙醇在20℃条件下冷浸提取2次，每次24h，滤过不溶性的Na₂SO₄，合并滤液，40℃减压回收乙醇得西瓜霜提取物120g。

实施例五：制成口腔凝胶剂

称取卡波姆凝胶基质至研钵中，加入甘油，研磨使湿润，加适量纯化水研磨使充分溶胀，加三乙醇胺研磨成透明凝胶基质。另称取适量西瓜霜提取物，尼泊金乙酯，加纯化水加热溶解，趁热将溶液与上述基质混合，充分研磨均匀，放冷，即得西瓜霜凝胶剂。

实施例六：制成口腔膜剂

先将聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠分别用适量纯化水浸泡，充分膨胀后水浴使之完全溶解，混匀二者，备用。取西瓜霜提取物适量溶于少量热纯化水中，加入糖精钠、甘油搅拌溶解，再将此药液与上述备用的聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠胶浆液混合，加适量纯化水至规定量，混匀。静置，待气泡除尽后涂膜，干燥，脱膜，分割成所需大小的膜片，在紫外灯下照射15min灭菌，密封包装，制得西瓜霜膜剂。

实施例七：西瓜霜提取物的临床疗效观察—治疗口腔溃疡

药物：西瓜霜凝胶剂

患者选择：40例门诊患者，男性患者23例，女性患者17例，年龄18～62岁。排除内源性病因患者。

给药方法：取西瓜霜凝胶剂适量，均匀涂于患处，每日4～6次，连续给药5天。

疗效标准：①显效：疼痛消失，口腔溃疡基本愈合；②有效：疼痛减轻，口腔溃疡面积缩小，红肿减轻，未愈合；③无效：疼痛无减轻或加重，口腔溃疡仍旧。

临床治疗结果：共40名患者，总有效率为92.5％。治疗结果见表1。

表1.西瓜霜提取物治疗口腔溃疡结果

口腔溃疡属中医“口疮”范畴，多因过食辛辣，心脾积热，复感风、火、燥邪所致。西瓜霜具有清热泻火，消肿止痛的功效，治疗口腔溃疡疗效显著，且无明显副作用，用药方便。

实施例八：西瓜霜提取物的临床疗效观察—治疗急慢性咽喉炎

药物：西瓜霜抗菌有效部位提取物

患者选择：32例门诊患者，男性患者18例，女性患者14例，年龄18～56岁。排除内源性病因患者。

给药方法：取适量西瓜霜提取物，含化药物，每日2～5次，疗程7天。

疗效标准：①临床治愈：用药7天以内咽喉肿痛及咳嗽症状消失；②显效：用药7天以内咽喉肿痛及咳嗽症状基本消失；③有效：用药7天以内咽喉肿痛及咳嗽症状减轻50％以上；④无效：用药7天以内咽喉肿痛及咳嗽症状减轻未达到50％或加重。

临床治疗结果：共32名患者，总有效率为93.75％。治疗结果见表2。

表2.西瓜霜提取物治疗急慢性咽喉炎结果

西瓜霜对于治疗急慢性咽喉炎有较好的止痛、消肿之功效，用药简便，无不良反应。

实验例一：西瓜霜抗感染有效部位化学成分研究

将自制西瓜霜3kg，以MeOH超声提取3次，每次30分钟，滤过，合并滤液，减压回收，得甲醇提取物。得到的甲醇提取物进行大孔吸附树脂柱色谱，依次用H₂O和95％EtOH洗脱，分别得到各自的洗脱物。采用硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱以及HPLC等现代分离技术与方法对95％EtOH树脂洗脱部位进行分离，共分离得到8个单体化合物(化合物1～8)，见分离流程图下表。

化合物1为无色结晶，溶于甲醇，其UV(MeOH)光谱在286nm，275nm，267nm处有最大吸收，碘化铋钾反应呈阳性，负性ESI-MS谱中，m/z229处出现[M-H]^-离子峰，结合¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT等波谱对化合物1的全部碳氢信号进行了准确归属，确定化合物1为(1S，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸。

化合物2为无色结晶，溶于甲醇，其UV(MeOH)光谱在286nm，275nm，267nm处有最大吸收，碘化铋钾反应呈阳性，负性ESI-MS谱中，m/z215处出现［M-H］^-离子峰，结合¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT等波谱对化合物1的全部碳氢信号进行了准确归属，确定化合物2为(3S)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸。

化合物3为白色无定形粉末，易溶于甲醇。三氯化铁反应阳性，Molish反应呈紫色环，

酸水解薄层检出D-葡萄糖。UV(MeOH)显示其最大吸收为260nm，ESI-MS给出m／z358[M]^＋离子峰。结合¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT等波谱对化合物1的全部碳氢信号进行了准确归属，确定化合物3为丁香苷。

化合物为4白色无定形粉末，易溶于氯仿和甲醇，三氯化铁反应阳性，Molish反应呈紫色环，酸水解薄层检出D-葡萄糖，UV(MeOH)显示其最大吸收为260nm，ESI-MS给出m／z342[M]⁺离子峰，结合¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT等波谱对化合物1的全部碳氢信号进行了准确归属，确定化合物4为松柏苷。

化合物5为无色片状结晶，溶于甲醇和二氯甲烷的混合溶剂，Liebermann-burchard和Molish反应均呈阳性，酸水解薄层检出D-葡萄糖，结合¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT等波谱对化合物1的全部碳氢信号进行了准确归属，确定化合物5为豆甾-7-烯-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物6为白色针状结晶，易溶于氯仿。Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应显阴性。与已知β-谷甾醇对照品进行共薄层，经3种展开系统(石油醚-乙酸乙酯8：2；石油醚-丙酮8：2；三氯甲烷-丙酮9：1)检测，R_f值均一致，且显色过程相同，故鉴定此化合物为β-谷甾醇(β-sitosterol)。

化合物7为白色无定形粉末，UV光谱(MeOH)在260nm处有最大吸收，Molish反应呈紫色环，酸水解薄层色谱检出D-核糖，在ESI-MS谱中，m／z267处出现[M]⁺离子峰。结合¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT等波谱对化合物1的全部碳氢信号进行了准确归属，确定化合物7为腺苷。

化合物8为白色无定形粉末(二氯甲烷-甲醇)，溶于甲醇、二氯甲烷的混合溶剂，难溶于单一溶剂，Molish反应显阴性，正性ESI-MS给出m／z682[M+H]⁺。结合¹H-NMR，¹³C-NMR(DEPT)谱等数据推测化合物8可能为神经酰胺类化合物

这8个化合物在西瓜霜中均为首次发现。

实验例二：西瓜霜抑菌作用及最佳发酵时间的确定

菌株：痢疾杆菌、福氏痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、柠檬葡萄球菌、伤寒杆菌、乙型溶血性链球菌、乙型副伤寒杆菌和大肠杆菌，由黑龙江中医药大学微生物免疫教研室提供。

菌种的复苏：将供试菌株接种于5ml无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于孵箱中37℃培养18小h；再将培养18h后的细菌接种于另一5ml无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基中，再于孵箱中37℃培养6h，作为试验菌液。

菌液稀释：吸取试验菌液0.5ml，加牛肉膏蛋白胨液体培养基至5ml，重复稀释3次，制成1／1000稀释浓度的试验菌液。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，NaC10.5g，加100ml蒸馏水，在沸水中加热使之完全溶解；冷至40～45℃时，以0.1mol／LNaOH溶液调pH7.6，再煮沸10min，使培养基再次充分溶解，用滤纸滤过，补足失水；重新校正pH一次。根据需要分装于试管或烧瓶内。放高压灭菌器内103.4kPa，121℃，灭菌15～20min。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：按液体培养基配制方法，校正pH后，加入1.5％的营养琼脂，加热溶解，滤过，装入锥形瓶中，按上法灭菌，并在无菌条件下，分装于无菌表面皿中，放凉，在孵箱中37℃培养24h，如无细菌生长，即可应用。

实验方法：采用连续稀释法和平板划线法分别进行体外抑菌实验和杀菌实验，对发酵不同天数的西瓜霜体外抗菌实验研究，最终确定西瓜霜的最佳发酵时间。实验结果见表3和表4。

表3.不同发酵时间西瓜霜的MIC

表4.不同发酵时间西瓜霜的MBC

实验结果表明，发酵15天和22天的西瓜霜对各种菌株的MIC和MBC均最低，7天和30天次之，50天最差。通过和芒硝对比可知，西瓜霜的抑菌杀菌效果明显优于芒硝，说明虽然西瓜霜95％以上的成分都是芒硝的主要成分NaSO₄，但其除此之外的成分有很强的抑菌作用，同时为进一步的药效物质基础研究奠定了基础。

实验例三：西瓜霜发酵菌的分离纯化与鉴定

1.发酵菌的分离纯化

(1).取西瓜霜15天发酵液10ml，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml锥形瓶中，用手或在摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20s～30s即成10^-1稀释液。然后连续稀释制成10^-2～10^-9浓度的稀释菌液备用。取0.2ml各浓度的稀释液，采用常规平板涂抹法，将个梯度的稀释液涂布在4种分离培养基中，将PDA、CZA和Sabourand培养基置于28℃恒温培养箱中培养，将牛肉膏蛋白胨培养基置于37℃恒温培养箱中培养。挑取平板上长出的单菌落作纯培养。

(2).用接菌环直接蘸取西瓜霜发酵液表面及内部接种于四种不同的培养基中，每日进行一次，将PDA、CZA和Sabourand培养基置于28℃恒温培养箱中培养，将牛肉膏蛋白胨培养基置于37℃恒温培养箱中培养。挑取平板上长出的单菌落作纯培养。

(3).每日观察各平板培养基，待长出菌丝或有单菌落形成后，及时挑取前端菌丝或单菌落，转接至相应新鲜的培养基中培养，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别接于新的平板上进行分离培养，并逐步纯化。对于真菌采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。将纯化后的菌种编号，转入PDA或牛肉膏蛋白胨斜面，置于4℃保存。

2.西瓜霜发酵菌的形态学鉴定

(1).菌落形态观察

采用点植法：用接种针从斜面上蘸取极少量孢子，接种于PDA培养基平板中心，置于28℃培养，观察菌落形态与生长情况。因在查氏培养基、沙堡弱培养基中生长的菌种在PDA中都能生长，且形态相似，故只选取了各菌种在PDA培养基中的形态图片。

(2).显微结构观察

采用插片培养法：盖玻片经160℃干热灭菌2h后，以倾角40°插入已倒好的PDA平板中，每皿插5片。将待观察真菌接种于盖玻片与培养基交界处，使其菌丝在生长过程中能够附着在盖玻片上，自次日起每天用无菌镊子拔取盖玻片，经乳酸-棉兰染液染色，置显微镜下观察真菌结构。参考相应文献^[39，40]鉴定内生真菌所属分类地位。

实验结果：本实验共从西瓜霜发酵液中分离得到6株发酵真菌，2株发酵细菌，并根据形态鉴定方法鉴定了其中的6株发酵真菌，结果见表5。

表5.西瓜霜发酵菌的分离和鉴定结果

(3).西瓜霜发酵菌的分子鉴定

采用真菌鉴定通用引物V9D与LS266[117]，进行ITS序列扩增。循环参数：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取扩增产物5μL，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的条带与预期大小是否相符。

PCR扩增产物的序列测定与数据处理：将PCR扩增产物直接送至北京未明凯拓农业生物技术有限公司测序。将测序结果与Genbank中已知序列进行比较分析，从Genbank数据库中获得相关种属的ITS序列信息，应用DNAStar100软件进行多序列比对，将计算结果，构件系统进化树。

实验结果：本试验应用ITS序列测定法对西瓜霜发酵液中6株真菌进行了分子鉴定，确定了各菌株的种属，鉴定结果见表6。

表6.西瓜霜发酵菌的分子鉴定结果

Claims (6)

1.一种西瓜霜的制备方法，其特征在于采用发酵、冷冻干燥法制备而成。

2.一种西瓜霜的制备方法，其特征在于采用发酵法制备，其发酵方法为：以西瓜为培养基，在一定量浓度的Na₂SO₄·10H₂O存在的情况下，即高盐状态下，温度为+5℃～+25℃，发酵7～20天，搅拌增加溶氧；发酵结束后，离心取上清液，冷冻干燥，而制成西瓜霜。

3.按照权利要求1、2所述的制备方法，其特征在于：发酵法使用的菌种为耐高盐的自然菌种及通过生物技术分离得到的菌种，包括：镰孢霉属、青霉属、毛霉属、交链孢霉属的六种菌种。

4.按照权利要求1、2所述方法制备的西瓜霜，将其用6～10倍量的95％乙醇(或其他低分子醇)冷浸提取1～3次，搅拌，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，制得西瓜霜提取物。

5.按照权利要求1、2所述方法制备的西瓜霜及权利要求4所述的西瓜霜提取物，对常见致病菌具有显著地抑菌、杀菌活性。

6.按照权利要求1、2所述方法制备的西瓜霜及权利要求4所述的西瓜霜提取物，其医药用途为具有抗菌活性，用于制备治疗感染性疾病的药物中的应用。