CN105833268A - 治疗性犬免疫球蛋白及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了制备适用于治疗犬的犬抗体的方法。特别是，提供了可以对其结合靶抗原时是否介导下游补体介导的免疫激活的特性进行选择的免疫球蛋白。本发明提供了包含特定重链同种型的犬衍生抗体。本发明延伸至本发明的免疫球蛋白在治疗犬的诸如疼痛、炎性病症和癌性病症的方法中的用途。
Description
本申请是申请日为2012年5月8日、申请号为201280033531.X且发明名称为“治疗性犬免疫球蛋白及其使用方法”的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及用作可溶性细胞外介质和/或细胞表面受体拮抗剂的犬抗体或犬衍生抗体，其具有特定的重链恒定结构域。本发明延伸至所述抗体或其片段在用于选择性治疗犬个体的诸如炎症、疼痛、癌症或感染等病症的方法中的治疗用途。
发明背景
使用免疫球蛋白的恒定结构域片段(constant domain fragment)构建的重组免疫球蛋白和融合蛋白用于治疗许多人类疾病，包括炎性疾病(例如风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病)、过敏(例如哮喘)、癌症(例如淋巴癌、乳腺癌、肠癌)、感染性疾病(例如RSV感染)、疼痛(例如骨关节炎疼痛、癌性疼痛、下背痛)和眼病(例如老年性黄斑变性)。
用于治疗的分子靶标包括细胞因子和趋化因子(例如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-5(IL-5)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、生长因子(例如神经生长因子(NGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF))、细胞表面受体(例如HER-2、VEGFR、EGFR、CD20)、细胞表面结合生长因子(例如未加工的肿瘤坏死因子)、病毒(例如RSV)和补体级联成分(例如C5)。有证据表明参与疾病过程的许多其它靶标是已知的(例如，如2011年12月14日的1.3.1版IMGT/MAb-DB数据库中所述(URL:www.imgt.org/mAb-DB/query)，其内容通过引用并入本文)。
天然免疫球蛋白产生不同的主要亚型，包括免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)或免疫球蛋白E(IgE)，为了应对感染，这些免疫球蛋白在通过结合靶抗原的病原体识别、中和、破坏和消除中起到各种作用。免疫球蛋白G产生几种不同的同种型(也称为亚型)，例如(在人类中)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。这些抗体同种型在结构上、尤其在恒定结构域的氨基酸序列方面有差异，特别是在C1域和C2域之间的恒定结构域(Fc)的铰链区附近有差异。
不同的抗体同种型在抗体介导的下游效应子功能方面也存在不同。例如，抗体的恒定区序列可以在抗体的例如效应子功能(ADCC，补体募集固定和激活)、药代动力学和物理性质的特性上介导强大的影响。具有不同同种型的抗体在结合免疫细胞上的IgG Fc受体的能力上也存在不同。对于人类来说，IgG1和IgG3积极参与募集补体以通过血液中补体酶的级联来帮助靶标破坏(CDC：补体依赖性细胞毒性作用)，类似地，IgG1和IgG3结合以结合抗原作为靶标的免疫细胞上的Fc受体，通过抗体介导细胞毒性作用(ADCC)破坏结合抗原。相比之下，IgG2和IgG4不募集补体或激活ADCC介导的攻击，仅以高亲合力简单地结合到抗原以抑制或抵消其活性。
当考虑用于疾病干预的靶标时，设计重组免疫球蛋白及由其制成的融合蛋白以考虑Fc同种型的活性。例如，当考虑旨在使用靶向杀死人癌细胞的抗体的治疗途径时，优选由IgG1或IgG3同种型Fc域构建重组免疫球蛋白，因为这些同种型的使用会驱动免疫介导破坏机制，例如CDC和ADCC。相比之下，当将敏感人体组织情况下的可溶性介质作为靶标时，Fc域被省略(例如，在人老年性黄斑变性的治疗中，优选靶向VEGF的Fab片段)，或者使用IgG2或IgG4 Fc域进行构建(例如，靶向神经病理性疼痛或炎症性疼痛情况下的神经生长因子，或肾炎、银屑病或风湿性关节炎病症下的补体C5)。这些考虑也适用于免疫球蛋白融合蛋白，例如基于人IgG1 Fc疗法，在例如风湿性关节炎的病症的治疗中的可溶性TNF受体Fc融合蛋白。
在犬和例如鼠和马的其它物种中，免疫球蛋白亚型同样存在，但相互之间不具有足够的同源性以通过推理确定哪条序列在引发例如CDC或ADCC的下游效应子功能方面是活跃的或不活跃的。而且，免疫球蛋白的数量随物种的不同而变化(例如，犬中有四个IgG免疫球蛋白，为caIgG-A、caIgG-B、caIgG-C和caIgG-D(Tang et al.,2001)。在马中有七个IgG同种型(Wagner,2006))。
单独由序列分析或序列同源性不可能确定非人类物种的特定免疫球蛋白同种型在介导受体结合和下游效应子功能方面是否为活跃或不活跃。但是，如果这些是已知的，将具有极大的价值，由于为了提供抗体或基于疗法的抗体的疗效，例如抗体结合片段或融合蛋白，用于抗体产生的同种型恒定结构域的选择可能是关键因素。
发明概述
经过大量实验，本发明人出人意料地发现，犬IgG免疫球蛋白的同种型具有在人IgG抗体中观察到的特性，即某些IgG抗体同种型在激活免疫效应子功能方面是活跃的，而其它的IgG抗体同种型不激活免疫效应子功能，因而是不活跃的。此外，对于四种已知的犬重链免疫球蛋白(被称为HCA(caIgG-A)、HCB(caIgG-B)、HCC(caIgG-C)和HCD(caIgG-D))，发明人出人意料地发现，当构建为靶向不同药靶的各种重组形式时，该四种犬重链免疫球蛋白中的两种(caIgG-B和caIgG-C)的重链恒定结构域令人吃惊地与补体结合，而其它两种(caIgG-A和caIgG-D)没有。
因此，本发明限定了某些重组犬免疫球蛋白或由其制成的融合蛋白，其可用于期望靶标破坏的犬治疗中(例如癌症或传染病的治疗)；以及某些其它同种型，其可以优选用于只为靶标中和(target neutralisation)而非靶标破坏的犬类治疗中(例如疼痛治疗)。
由此，本发明提供了重组犬免疫球蛋白，基于它们的重链恒定结构域的同种型，其可通过结合补体级联的第一组分的能力或其它而区分。因此，首次不管出于通过补体介导细胞毒性效应(CDC；例如用于杀死活体中的犬肿瘤)选择用于免疫介导破坏的预定靶标，还是出于在不存在不希望的免疫介导破坏(例如，在神经附近或在眼中)的情况下仅选择用于中和的靶标，重组犬免疫球蛋白都可以根据它们在犬疾病治疗中的预期用途来选择。
本发明的第一个方面提供了用于犬治疗的抗体、融合蛋白或其结合片段，其中所述抗体、融合蛋白或结合片段具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的重链恒定结构域，其中当所述抗体、融合蛋白或结合片段结合其靶抗原时，所述重链的氨基酸序列使下游免疫系统效应子功能的激活最小化。
在某些实施方式中，所述犬的治疗涉及疼痛或炎症或与其相关病症的治疗，例如关节炎或关节炎病症。
本发明的另一个方面提供了包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQID NO:11或SEQ ID NO:13的重链恒定结构域的抗体、融合蛋白或其结合片段在制备用于治疗犬个体中疼痛或炎症或与其相关的病症例如关节炎或关节炎病症的药物中的用途，个体当所述抗体、融合蛋白或结合片段结合其靶抗原时，所述重链的氨基酸序列使下游免疫系统效应子功能的激活最小化。
本发明的再一个方面提供了用于治疗、抑制或减轻需要其的犬个体中的疼痛或炎症或与其相关的病症例如关节炎或关节炎病症的方法，所述方法包括下列步骤：
提供特异性结合在治疗或预防疼痛或炎症中具有特定功能的靶抗原的抗体、融合蛋白或其结合片段，其中所述抗体、融合蛋白或其结合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的重链恒定结构域，且其中所述抗体、融合蛋白或其结合片段不激活下游免疫系统效应子功能；以及
将治疗有效量的所述抗体、融合蛋白或其结合片段施用至犬个体。
本发明的再一个方面提供了具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQID NO:11或SEQ ID NO:13的重链恒定结构域的犬衍生抗体、融合蛋白或其结合片段，用于制备治疗、抑制或减轻犬个体的疼痛或炎症的药物。
在某些实施方式中，所述疼痛为神经病理性疼痛。特别是，所述疼痛可以为围术期疼痛、术后(post-operative)疼痛或外科治疗后(post-surgical)疼痛。术后(post-operative)疼痛会导致下列任何手术过程，在犬中可以包括但不限于，矫形外科手术、软组织外科手术、卵巢子宫切除术或阉割手术等。在某些另外的实施方式中，所述疼痛为与癌症或癌性疾病状相关的慢性痛(肿瘤痛)。在某些另外的实施方式中，所述疼痛与风湿性关节炎、骨关节炎、发炎或瘙痒相关或由其导致。
本发明的再一个方面提供了治疗犬个体中关节炎或关节炎病症的方法，所述方法包括下列步骤：
提供特异性结合在治疗或预防疼痛或炎症中具有特定功能的靶抗原的抗体、融合蛋白或其结合片段，其中所述抗体、融合蛋白或其结合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的重链恒定结构域，且其中所述抗体、融合蛋白或其结合片段不激活下游免疫系统效应子功能；以及
将治疗有效量的所述抗体、融合蛋白或其结合片段施用至有需要的犬个体。
在某些实施方式中，本发明的前述方法进一步包括：共同施用至少另一种可以增强和/或补助本发明抗体效力的药剂的步骤。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以与至少一种镇痛剂、NSAID(非甾体抗炎药)、阿片类药物、皮质类固醇或类固醇共同施用。合适的镇痛剂的实例包括但不限于，布托啡诺(butorphanol)、10丁丙诺啡(buprenorphine)、芬太尼(fentanyl)、氟胺烟酸葡胺(flunixin meglumine)、莫哌啶(merpidine)、吗啡(morphine)、纳布啡(nalbuphine)和它们的衍生物。合适的NSAID包括但不限于，醋氨酚(acetaminophen)、乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid)、卡洛芬(carprofen)、依托度酸(etodolac)、酮基布洛芬(ketoprofen)、美洛昔康(meloxicam)、非罗考昔(firocoxib)、罗本纳考昔(robenacoxib)和德拉考昔(deracoxib)等。
在某些实施方式中，前述方法可以伴随至少一种其它药剂的施用。所述药剂可以是治疗活性剂，其可以是选自以下的一种或多种：抗生素、抗真菌剂、抗原虫剂、抗病毒剂或类似的治疗剂。此外，所述至少一种其它药剂可以是炎症介质抑制剂，例如PGE受体拮抗剂；免疫抑制剂，例如环孢素；抗炎性糖皮质激素。在某些另外的方面，所述至少一种其它药剂可以是用于治疗认知紊乱或损伤，例如老龄犬中日益普遍的失忆或相关病症的药剂。此外，所述至少一种其它药剂可以是用于治疗心血管功能紊乱，例如治疗高血压、心肌缺氧和充血性心脏衰竭等的抗高血压药物或其它化合物。另外，所述至少一种其它药剂可以是利尿剂、血管扩张剂、β-肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张素-II转化酶抑制剂、钙通道阻滞剂和HMG-CoA还原酶抑制剂。
在本发明前述方面的某些实施方式中，所述下游免疫系统效应子功能选自：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、和抗体依赖细胞病理(ADCP)。在具体的实施方式中，所述重链恒定结构域的氨基酸序列抑制重链结合C1q，这防止引起补体级联和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在某些实施方式中，所述靶抗原是可溶性介质。在某些实施方式中，所述靶抗原是神经生长因子(NGF)。在某些实施方式中，所述抗体特异性结合并抵消介导疼痛或炎症的受体。在某些其它实施方式中，所述靶抗原可以选自细胞因子或趋化因子(例如，白细胞介素-1和相关的白细胞介素IL-2至IL-35、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、促血小板生成素(thrombopoetin)、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、抑癌蛋白M)、生长因子(例如，神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF))、细胞表面受体(例如，HER-2、VEGFR、EGFR、CD20)、细胞表面结合生长因子(例如，未加工的肿瘤坏死因子)、病毒(例如，RSV)和补体级联的组分(例如，C5、C5a)，但不限于此。
本发明的另外方面，提供了用于治疗犬的抗体、融合蛋白或其结合片段，其中所述抗体、融合蛋白或结合片段具有包含氨基酸序列SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14的重链恒定结构域，其中当所述抗体、融合蛋白或结合片段结合其靶抗原上时，所述重链的氨基酸序列介导下游免疫系统效应子功能的激活。
在某些实施方式中，所述犬的治疗涉及癌性或恶性病症的治疗。
本发明的其他方面提供了包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:14的重链恒定结构域的抗体、融合蛋白或其结合片段在制备用于治疗犬个体中癌性或恶性病症的药物中的用途，其中当所述抗体、融合蛋白或结合片段结合其靶抗原时，所述重链的氨基酸序列介导下游免疫系统效应子功能的激活。
本发明的其他方面提供了用于治疗或预防犬个体中癌性或恶性病症的方法，所述方法包括下列步骤：
提供特异性结合在治疗或预防癌性或恶性病症中具有特定功能的靶抗原的抗体、融合蛋白或其结合片段，其中所述抗体、融合蛋白或其结合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:14的重链恒定结构域，且其中所述抗体、融合蛋白或其结合片段不激活下游免疫系统效应子功能；以及
将治疗有效量的所述抗体、融合蛋白或其结合片段施用至有需要的犬个体。
在某些实施方式中，本发明的前述方法进一步包括：共同施用至少另一种可以增强和/或补助本发明抗体效力的药剂的步骤。
本发明的其他方面提供了犬衍生抗体、融合蛋白或其结合片段在制备用于治疗犬个体的癌性或恶性病症的的药物中的用途，所述抗体、融合蛋白或其结合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14的重链恒定结构域。
在本发明前述方面的某些实施方式中，所述下游免疫系统效应子功能选自：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞病理(ADCP)。在具体的实施方式中，所述重链恒定结构域的氨基酸序列提供了重链与C1q的结合，这防止引发补体级联和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在某些实施方式中，所述重链恒定结构域提供了与Fc受体的结合，其反过来可以介导ADCP和/或ADCC免疫反应。
在某些实施方式中，所述靶抗原是癌特异性抗原。在本发明的某些另外的实施方式中，所述靶抗原可以选自在犬肿瘤细胞上表达的膜结合蛋白。在本发明的另外的实施方式中，所述膜结合犬肿瘤蛋白可以选自包括CD2、CD4、CD8、CD20、EGFR、VEGFR和HER2等的蛋白质的组。在某些另外的实施方式中，所述靶抗原可以选自但不限于：细胞因子和趋化因子(例如白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3和从数字上直至IL-35的白细胞介素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、促血小板生成素(thrombopoetin)、白血病抑制因子、睫状神经营养因子、抑癌蛋白M)、生长因子(例如，神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF))、细胞表面受体(例如，HER-2、VEGFR、EGFR、CD20)、细胞表面结合生长因子(例如，未加工的肿瘤坏死因子)、病毒(例如，RSV)和补体级联的组分(例如，C5、C5a)。
本发明的另外的方面提供了用于治疗犬的病症的抗体、融合蛋白或其结合片段，其中所述抗体、融合蛋白或结合片段具有当所述抗体、融合蛋白或结合片段结合其靶抗原时不结合C1q的重链恒定结构域，且其中所述抗体、融合蛋白或结合片段可以用蛋白质A层析纯化。
在某些实施方式中，所述抗体、融合蛋白或结合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的重链恒定结构域。在某些实施方式中，所述抗体、融合蛋白或结合片段具有选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12和SEQID NO:15的重链恒定结构域。
本发明的另外的方面提供了包含重链恒定结构域的抗体、融合蛋白或结合片段在制备用于治疗与犬的疼痛和/或炎症相关病症的药物中的用途，当所述抗体、融合蛋白或结合片段结合其靶抗原时，所述重链恒定结构域不结合C1q，且其中所述抗体、融合蛋白或结合片段可以用蛋白质A层析纯化。
在某些实施方式中，所述抗体、融合蛋白或结合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的重链恒定结构域。在某些实施方式中，所述抗体、融合蛋白或结合片段具有选自由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15组成的组的重链恒定结构域。
本发明的另外的方面提供了用于治疗、抑制或减轻需要其的犬个体的疼痛或炎症或与此相关的病症例如关节炎或关节炎病症的方法，所述方法包括下列步骤：
提供包含重链恒定结构域的抗体、融合蛋白或结合片段，当所述抗体结合其靶抗原时，所述重链恒定结构域不结合C1q，且其中所述抗体可以用蛋白质A层析纯化；以及
将治疗有效量的所述抗体、融合蛋白或其结合片段施用至所述犬个体。
在某些实施方式中，所述抗体、融合蛋白或结合片段具有包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的重链恒定结构域。在某些实施方式中，所述抗体、融合蛋白或结合片段具有选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12和SEQID NO:15的重链恒定结构域。
在各种其他方面中，本发明延伸至：(i)编码本发明任何前述抗体、融合蛋白或结合片段的核酸，(ii)携带所述核酸的载体，(iii)携带所述载体的宿主细胞。本发明进一步延伸至用于产生本发明前述中限定的抗体和融合蛋白的方法。在另外的方面中，本发明延伸至包含本发明的抗体或融合蛋白以及至少一种载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
本发明的另一方面提供了重组抗体、融合蛋白或其结合片段，其可在治疗上施用于犬以特异性结合靶抗原并且且进一步介导免疫反应，所述免疫反应的特征在于C1q补体结合所述抗体、融合蛋白或其结合片段和相关的补体依赖性细胞毒性，其中所述抗体、融合蛋白或其结合片段的重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型B(HCB，caIgG-B)、具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型C(HCC，caIgG-C)或具有氨基酸序列SEQ ID NO:14的无糖基犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型C(HCC，caIgG-C)。
本发明的另一方面提供了包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型B(HCB，caIgG-B)、具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型C(HCC，caIgG-C)或具有氨基酸序列SEQ ID NO:14的无糖基犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型C(HCC，caIgG-C)的抗体、融合蛋白或其结合片段，在制备用于治疗需要特异性结合靶抗原且期望发生免疫反应的病症的药物中的用途，所述免疫反应的特征在于C1q补体结合所述抗体、融合蛋白或其结合片段和相关的补体依赖性细胞毒性。
本发明的另一方面提供了治疗犬个体中的癌性状况的方法，所述方法包括以下步骤：
提供对肿瘤特异性抗原具有结合特异性且进一步包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型B(HCB，caIgG-B)、具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型C(HCC，caIgG-C)或具有氨基酸序列SEQ ID NO:14的无糖基犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型C(HCC，caIgG-C)的免疫球蛋白、融合蛋白或其结合片段；以及
-将治疗有效量所述免疫球蛋白、融合蛋白或结合片段施用至需要其的犬个体。
在各种另外的方面中，本发明延伸至结合期望的靶抗原且包含不结合C1q的重链恒定结构域且因此不介导包括补体依赖性细胞毒性的免疫反应的抗体或融合蛋白。
因此，在本发明的另一方面提供了可以在治疗上施用于犬以特异性结合靶抗原的重组抗体、融合蛋白或其结合片段，其中所述抗体或融合蛋白的恒定结构域不结合C1q补体，且其中所述恒定结构域的重链包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型A(HCA，caIgG-A)、具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型D(HCD，caIgG-D)或具有氨基酸序列SEQ IDNO:13的无糖基犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型B(HCB*，caIgG-B)。
本发明的另一方面提供了包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型A(HCA，caIgG-A)、具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型D(HCD，caIgG-D)或具有氨基酸序列SEQ ID NO:13的无糖基犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型B(HCB*，caIgG-B)的抗体、融合蛋白或其结合片段，在制备用于治疗需要特异性结合靶抗原且不希望发生免疫反应的病症的药物中的用途，所述免疫反应的特征在于C1q补体结合所述抗体、融合蛋白或其结合片段和相关的补体依赖性细胞毒性。
本发明的另一方面提供了用于治疗犬个体中病症的方法，所述方法包括下列步骤：
提供对肿瘤特异性抗原具有结合特异性且进一步包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型A(HCA，caIgG-A)、具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型D(HCD，caIgG-D)或具有氨基酸序列SEQ ID NO:13的无糖基犬免疫球蛋白重链恒定结构域同种型B(HCB*，caIgG-B)的免疫球蛋白、融合蛋白或其结合片段；以及
将治疗有效量所述免疫球蛋白、融合蛋白或结合片段施用至需要其的犬个体。
在某些实施方式中，设计用于在没有CDC活性时进行抗体构建的非糖基化恒定结构域是丙氨酸取代的具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的非糖基化重链HCB(表示为HCB*)。在本发明的各种其他方面中，包含HCA、HCB或HCD的重链HCA、HCD或CDC不活跃非糖基化形式(HCA*、HCB*或HCD*：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:15)的抗体涉及犬生长因子、荷尔蒙、细胞因子、趋化因子或其它可溶性介质，例如补体级联的组分。在某些实施方式中，包含重链HCA、HCD或HCB*的抗体涉及用于抵消犬中的犬NGF生物活性而不引起CDC的的犬神经生长因子(NGF)。
在本发明前述方面的某些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在某些另外的实施方式中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，所述抗体是犬源化抗体，即，该抗体具有已去免疫的氨基酸序列，使得当施用于犬个体时，不会产生针对其的中和抗体。通常，所述抗体的重链恒定结构域通过氨基酸取代或缺失的方式选择或修饰，使得所述恒定结构域不介导下游效应子功能。在某些实施方式中，所述抗体可以缀合于至少一个受体分子。
在某些另外的实施方式中，可以取代或缺失本发明前述方面的抗体或融合蛋白的恒定结构域中的至少一个残基，以防止该残基的糖基化。在本发明的另一方面中，所述犬免疫球蛋白重链恒定结构域可以全部或部分融合细胞因子或趋化因子受体或其它跨膜蛋白质(例如TNF受体)的胞外域，使得在期望所述犬胞外域-免疫球蛋白重链融合蛋白不激活CDC的情况下(例如，其中TNF受体Fc融合蛋白被设计用于中和可溶性TNF的情况)，所述犬免疫球蛋白恒定结构域的全部或片段选自组HCA、HCD或HCB*；或反之，在期望所述犬胞外域-免疫球蛋白重链融合蛋白激活的情况下，(例如，TNF受体Fc融合蛋白被设计以杀死具有炎性细胞的膜相关TNF的情况)所述犬免疫球蛋白恒定结构域选自组HCB、HCC或HCC*。
在本发明的另外的方面中，所述犬受体-Fc融合蛋白可以选自在融合到犬免疫球蛋白结构域重链Fc区的犬细胞上发现的膜结合受体的胞外结构域。在本发明的另外的方面中，包含重链HCB、HCC或HCC*的抗体涉及CD20，以通过这些抗体与犬CD20表达细胞例如犬淋巴瘤细胞表面上的CD20结合引起所述细胞的CDC的。
此外，优选的是，所述犬源化的抗体不与犬中存在的任何其它表位交叉反应，而且当施用于犬时，并不产生针对本发明的抗体的中和抗体。
在某些另外的实施方式中，可对本发明的抗体或融合蛋白进行所述重链恒定结构域的氨基酸序列的修饰。所述修饰可以包括添加、取代或缺失一个或多个氨基酸残基。通常进行上述氨基酸变化修饰是为了修饰所述抗体的功能特性。例如，可以进行氨基酸修饰，例如通过阻止所述抗体结合Fc受体的能力、激活补体或诱导ADCC，以阻止抗体恒定结构域介导的下游效应子功能。此外，可以对所述重链恒定结构域的铰链区的氨基酸残基进行修饰，以在施用于犬时调节抗体的循环半衰期。
在一些实施方式中，本发明提供了包含以不同的结合特异性缀合或结合其他抗体的本发明的抗体或结合片段的多重特异性或多价抗体，以用于联合治疗。多重特异性抗体包含针对第一表位的至少一个抗体或结合片段，以及针对存在于该抗原上的另一个表位或另一抗原的至少一个结合位点。多价抗体包含对相同表位具有结合特异性的抗体或抗体结合片段。因此，在某些实施方式中，本发明延伸至包含四个或更多个本发明抗体的Fv区或Fab区的抗体融合蛋白。在某些另外的实施方式中，本发明延伸至双特异性抗体，其中本发明的抗体或其结合片段连接到对第二靶标具有结合特异性的第二抗体或其结合片段，所述靶标不是第一抗原。这种多价抗体、双特异性抗体或多重特异性抗体可以通过为本领域技术人员熟知的多种重组方法制得。
在某些实施方式中，将所述抗体、融合蛋白或抗原结合片段以约0.01mg/kg体重至10mg/kg体重、特别是约0.03mg/kg体重至3mg/kg体重的剂量范围施用于犬，作为前述方法的一部分。
在各种其他的方面中，本发明延伸至包含本发明任何前述方面的抗体、融合蛋白或其结合片段的组合物。在某些实施方式中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载体。在某些实施方式中，所述组合物可以进一步包含至少一种镇痛剂、NSAID、阿片类药物、皮质类固醇或类固醇。
在各种其他的方面中，本发明延伸至编码本发明抗体、融合蛋白或抗体结合片段的分离的核酸。因此，本发明的另一方面提供了编码本发明任何前述方面的抗体、融合蛋白或抗原结合片段的分离的核酸。在某些实施方式中，所述分离的核酸还编码与其可操作地连接的一个或多个调控序列。
本发明的另一方面提供了包含编码本发明的重链可变结构域和/或轻链可变结构域或重链恒定结构域和/或轻链恒定结构域的多核苷酸的表达载体。在某些实施方式中，所述表达载体进一步包含一个或多个调控序列。在某些实施方式中，所述载体是质粒或逆转录病毒载体。本发明的另一方面提供了合并本发明前述方面的表达载体的宿主细胞。本发明的另一方面提供了产生本发明任何前述方面的抗体的宿主细胞。
本发明的又一方面提供了用于产生本发明的抗体或融合蛋白的方法，所述方法包括培养本发明前述方面的宿主细胞以允许该细胞表达抗体的步骤。本发明的又一方面提供了产生本发明的抗体或融合蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：在合适的宿主细胞中表达本发明前述方面的一个或多个多核苷酸/核酸或载体，其表达本发明的抗体的轻链和/或重链；回收(recovering)表达的多肽，其可在一个宿主细胞中共同表达，或在不同的宿主细胞中分别表达；以及分离抗体。本发明的又一方面提供了用于治疗、减轻或抑制犬疼痛的方法，所述方法包括将有效量的编码具有含氨基酸序列SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:11的重链恒定结构域的抗体或融合蛋白的多核苷酸施用至犬的步骤。
犬抗体纯化
在没有不需要的免疫效应子活性而期望靶标中和的犬抗体中，本发明人出人意料地发现，缺乏CDC活性的犬重链的原生同种型也非常弱地结合葡萄球菌蛋白A，如果确是如此，则这种纯化抗体的常用方法不能用于其制备。本发明人提出三种方法来克服这一限制，通过使用替代的纯化策略并通过重链的突变来阻止生产过程中的糖基化。通过这些方法制备的纯化抗体由本发明人制得，并显示出在狗体内具有期望的安全性和有效性，而没有不想要的免疫原性。
本发明的再一方面提供了用于从源混合物纯化犬衍生免疫球蛋白或免疫球蛋白或融合蛋白的方法，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的同种型A(HCA，caIgG-A)的犬重链恒定结构域或具有氨基酸序列SEQID NO:11的同种型D(HCD，caIgG-D)的犬免疫球蛋白重链恒定结构域，所述方法包括下列步骤：
(i)提供包含靶免疫球蛋白或融合蛋白的源混合物；
(ii)对所述源混合物进行阴离子交换层析；
(iii)对所述源混合物进行疏水作用层析；以及
(iv)对所述源混合物进行尺寸排阻层析。
在某些实施方式中，所述方法包括将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液中的步骤。典型地，所述方法产生出分级为高纯度和高生物活性的纯化抗体。
本发明的另一方面提供了产生非糖基化犬抗体的方法，所述非糖基化抗体可以通过蛋白质A层析纯化。
在本发明的各种其他的方面中，提供了根据本文限定的任何方法产生的犬抗体或犬衍生抗体或融合蛋白，用于犬的治疗。在各种其他的方面中，提供了抗犬NGF抗体在制备用于治疗犬中免疫介导病症或与疼痛相关的病症的药物中的用途。
本发明的另一方面提供了用于从源混合物纯化犬衍生免疫球蛋白或免疫球蛋白或融合蛋白的方法，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的同种型A(HCA，caIgG-A)的犬重链恒定结构域或具有氨基酸序列SEQID NO:11的同种型D(HCD，caIgG-D)的犬免疫球蛋白重链恒定结构域，所述方法包括下列步骤：
(i)提供包含靶免疫球蛋白的源混合物；
(ii)对所述源混合物进行captoadhere亲和层析；以及
(iii)对所述源混合物进行阴离子交换层析。
本发明的另一方面延伸至由本发明前述方面的纯化方法产生的抗体或融合蛋白，用于犬的治疗。
附图说明
图1A通过ELISA显示了使用犬重链的四种不同的同种型(HCA、HCB、HCC、HCD)构建的抗NGF抗体(表示为转染CHO细胞的上清液)对鼠NGF的等效结合；以及图1B显示了TF-1细胞的NGF增殖的等效抑制。
图2显示了以抗C1q ELISA测量的补体对NGF-结合抗犬NGF抗体同种型的差别结合。
图3a和3b显示了以抗C1q ELISA测量的NGF捕获的糖基化的和非糖基化的犬源化抗NGF单克隆抗体对补体的结合。
图4显示了通过抗C1q ELISA测量的NGF捕获的犬源化抗NGF单克隆抗体(MAb)、抗犬VEGF MAb和抗人CD20/犬HCB嵌合MAb对补体的结合。特别是，图4A、4B和4C显示了补体对使用各种犬重链同种型构建的抗体的结合。犬源化单克隆抗体(MAb)在CHO细胞中表达，并测试其结合补体C1q的能力。板A-犬源化抗NGF抗体(caN-HCB、caN-HCC)与人源化抗体同种型(huN-G1、huN-G4)相比较；板B-用犬HCA(caV-HCA)和HCB(caV-HCB)同种型构建的抗VEGF抗体；板C-使用HCB同种型(mub-HCA)构建的抗CD20抗体与小鼠IgG2a同种型(muB-2a)相比较。
图5显示了通过蛋白质A纯化并使用抗犬多克隆免疫球蛋白通过蛋白质印迹检测的抗NGF抗体同种型的相对回收。使来自图1的上清液经过蛋白质A柱并特异性结合洗脱材料。使等体积的洗脱液经历SDS-PAGE。犬同种型HCA、HCC和HCD弱结合蛋白质A，如洗涤和流通分级(wash and flow through fractions)中所示。图A-D显示了通过蛋白质A相对回收犬抗体同种型HCA、HCB、HCC和HCD：L，加载(load)；W，洗涤(wash)；P，纯化(purified)；F，流通(flowthrough)。来自图1中抗NGF抗体上清液用于此实验。
图6A和6B显示了使用三步法(方法I)定量纯化抗犬NGF抗体(HCA同种型)，该三步法(方法I)包括(1)阴离子交换层析、(2)疏水作用层析和(3)尺寸排阻层析。图6A显示了通过尺寸排阻HPLC的分级结果。图6B显示了每一步骤后级分的还原性SDS-PAGE凝胶。图6C和6D显示了使用两步法(方法II)定量纯化本发明的抗犬NGF抗体，该两步法(方法II)包括Captoadhere层析和阴离子交换层析。图6C显示了在非还原和还原条件下的SDS-PAGE分析。在图6C中，泳道1是MWS，泳道2是2μg/mL抗犬NGF抗体和0μl还原剂，泳道3是4μg/mL抗犬NGF抗体和0μl还原剂，泳道4是抗6μg/mL犬NGF抗体和0μl还原剂，泳道5是MWS，泳道6是2μg/mL抗犬NGF抗体和3μl还原剂，泳道7是4μg/mL抗犬NGF抗体和3μl还原剂，泳道8是6μg/mL抗犬NGF抗体和3μl还原剂，以及泳道9是MWS。图6D：纯化的抗犬NGF抗体的尺寸排阻层析。
图7显示了通过方法I和II纯化的抗犬NGF抗体(HCA同种型)的对比。图7A：通过非还原和还原SDS-PAGE的对比。图7B：通过抗NGF ELISA的对比。
图8显示了对狗静脉给药抗犬NGF抗体(HCA同种型，通过方法I纯化)后体重(上表)和温度(下表)保持稳定。
图9显示了对狗静脉注射后血浆抗犬NGF单克隆抗体浓度的动力学分析。以2mg/kg将抗NGF抗体静脉注射入比格犬，在指示的时间采集血浆样品且用NGF ELISA检测抗NGF单克隆抗体。该抗犬NGF单克隆抗体具有约9天的出奇长的消除(β)相半衰期。
图10显示了抗犬NGF单克隆抗体(HCA同种型，通过方法I纯化)减轻了狗的炎性疼痛。在-1天时将高岭土注射入比格犬的垫脚中，在0天进行抗体或媒介对照，并通过目测评分量表判断跛足程度。
发明详述
经过大量实验，本发明人使用不同的重量恒定结构域同种型设计并构建了几种犬单克隆抗体，且令人惊奇地显示出，有益的性质从它们介导下游效应子功能的能力(或其它方面)、特别是从它们结合补体的能力可以推断出有益的特性。因此，本发明人已鉴定出不同的犬免疫球蛋白同种型介导的不同的生物效应。对于补体结合犬抗体同种型，这种有益的特性在用于体内补体调控细胞毒性(CDC)的相同抗体结合的调控(directing)细胞中。需要这种功能特性的一个实例是在犬癌症治疗中，其中针对肿瘤抗原的抗体随后会引导补体系统靶向已被该抗体结合的细胞，用于破坏。
相比之下，在不需要补体活性的情况下，例如在神经附近、在眼中或在已发炎的组织中，或仅仅出于降低抗体无法预料的副作用风险的考虑，优选不结合补体从而不导致CDC的抗体同种型。
因此，预测哪种犬同种型适合于设计并适合使用犬抗体治疗能力，无疑是非常需要和有用的。
已经描述了四种不同的犬免疫球蛋白G同种型(caIgG-A(犬免疫球蛋白G同种型A)、caIgG-B、caIgG-C和caIgG-D-Tang et al.,2001)。为简单起见(以允许不同抗体构建上的区别并来自轻链组分)，该重链恒定结构域被称为HCA(caIgG-A)、HCB(caIgG-B)、HCC(caIgG-C)和HCD(caIgG-D)。
抗体的纯化
本发明人在纯化期望的抗NGF抗体的HCA和HCD同种型的过程中意外地发现，以蛋白质A亲和柱层析的形式用于工业生产规模以生产大规模纯化治疗用蛋白质的配体也不结合蛋白质A。图5显示了通过蛋白质A亲和层析小规模地相对回收抗NGF抗体的HCA、HCB、HCC和HCD同种型。因此，需要其它方法来纯化HCA或HCD同种型，因为这些不能通过蛋白质A亲和层析进行纯化。经过大量实验，发明者令人惊奇地发现了可以用于纯化caN-HCA-kLC抗体构建或具有HCA或HCD重链同种型的其它犬抗体的两种替代方法(这里称为方法I和方法II)。
第一种方法包括阴离子交换层析、疏水作用层析和排阻层析的组合。第二种方法包括captoadhere亲和层析和阴离子交换层析的组合。图6说明了通过两种方法的每一种纯化含有抗NGF抗体的HCA。通过每种方法都获得了高纯度的材料，且通过NGF ELISA显示两种方法产生了具有相似生物活性的材料(图7)。由于HCA和HCD同种型相互之间比与HCB和HCC同种型更为类似，上述方法可用于该两种同种型。
在对抗体纯化的进一步探索中，本发明人意外地发现非糖基化HCB*同种型抗NGF抗体，如HCB同种型，仍然能够结合蛋白质A，因此具有缺乏CDC活性并且通过蛋白质A层析纯化的期望特性。
犬安全性试验
为了说明被设计成没有不想要的CDC活性的本发明的抗体对狗是安全的，将高度纯化的抗NGF的HCA同种型抗体通过静脉注射注入三只狗中(following prior approval by the Institutional Animal Ethics Committee-CRL,Ireland，经过公共动物伦理委员会-CRL事先批准后)。图8显示了除了由兽医观察到的没有行为变化之外，这三只狗在注射HCA同种型抗体(单只2mg/kg的剂量)之后没有显示出体重变化或发热。
这三只狗的HCA同种型抗体的血浆动力学与包括约9天的长beta半衰期的两相分布和消除相符合(图9)。在14天的追踪期间内快速清除的缺少与它们对于犬抗体的无抗抗体反应相符合。相比之下，人类免疫球蛋白重链恒定结构域在狗中产生免疫性，且在注入后8或9天从血浆中快速清除(Richter 1999,Drug Met.Disp.27,21-25)。
炎症犬模型
在社会伦理委员会(Institutional Ethics Committee，CRL,爱尔兰)的预先批准下进行所有的实验。将高岭土(kaolin)注入(-1天时)比格犬的一条后腿的垫脚中，从而在约24小时后开始自身化解炎症，这导致狗暂时性跛足。在该模型中，一旦对高岭土的初始炎性反应减弱，在约1-2周内该狗的跛足程度将稳定地减小，然后全部恢复。
通过静脉注射将抗犬NGF单克隆抗体以每千克体重200μg或作为媒介对照的磷酸盐缓冲液注入(0天时)到3只狗的组中。7天后，通过目测评分方法评价狗的跛足程度：0分，没有跛足(全负重)；1分，轻微跛足(非全负重但行走正常)；2分，中等跛足(轻微负重且行走不正常)；3分，严重跛足(无负重)。观察者不了解哪只狗接受了注射。
图10示出了该结果。与媒介对照组相比，注射3天后，接受抗NGF单克隆个抗体的狗的跛足评分减小，这表明与仅用媒介相比，抗NGF单克隆抗体具有降低狗的疼痛的效果。延迟的活性与抗犬NGF单克隆抗体的血浆药物动力学一致，这表明约30小时的慢的组织分布相和垫脚区相对差的血管形成。图10示出的结果表明，本发明的抗犬NGF抗体在降低跛足的同时降低了狗的炎性疼痛。
本发明人描述的所有结果共同表明，使用CDC不活跃HCA同种型构建的纯化的犬抗体对于犬是安全和有效的，且具有令人满意的长半衰期。
通过引用将本发明提及的所有文献并入本文中。在不背离本发明的范围的情况下，对本发明的实施方案进行各种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的。虽然就具体优选的实施方案进行了描述本发明，但是应该理解，请求保护的本发明不应该不适当地限制为这些具体的实施方案。事实上，本发明意图涵盖对本领域技术人员显而易见的实施本发明的方式的各种修改。
定义
除非另有限定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清楚，然而，在发生歧义的情况下，本文给出的定义优先于任何字典或外在的定义。
在全文中，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”或“包括(include)”或其他变体例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”、“包括(includes)”“包括(including)”应理解为表示包含所述整数或整数组，但并不排除任何其他的整数或整数组。
如本文所使用的，除非文中明确要求，诸如“a(一个/种)”、“an(一个/种)”以及“the(该/所述)”的术语包括单数个或复数个参照物。因此，例如，提到“一种活性剂(an active agent)”或“一种药学活性剂”包括一种单一的活性剂和两种或以上不同的活性剂组合，而提到“载体”，其包括两种或以上载体以及单一载体的混合物等。而且，除非文中另有要求，单数的术语包括复数并且复数的术语也包括单数。
如本文所限定的，术语“疼痛”指与实际的或潜在的组织损伤相关的或按照这样的损伤描述的不愉快的感觉和情感体验。
关于手术或手术后疼痛，US动物福利法(Animal Welfare Act 2002.AWA regulations,CFR,Title 9(Animals and Animal Products),Chapter 1(Animal and Plant Health Inspection Service,Department of Agriculture).Subchapter A(Animal Welfare),Parts 1–4)将疼痛的过程规定为合理地预期将引起应用该过程的人类超过轻微或短暂疼痛或悲痛的任何过程，也就是说，超过通过注射或其他小的手术引起的疼痛。因此，如果犬经历疼痛的外科手术，则该动物应该施用术后镇痛剂。
在另外的情况下，由于有关的医疗状况例如风湿性关节炎、骨关节炎、炎性或癌性或恶性病症，犬可能经历严重的疼痛或慢性痛。
术语“伤害性感受”指伤害刺激的感觉。本文限定的“神经病理性疼痛”(也被称为神经痛)指来自有神经信号问题的疼痛。其可能由于影响躯体感觉系统的损害或疾病而发生。存在数种神经疼痛的原因并且其可能与自发发生的、被称为感觉迟钝的感觉异常有关。可选地，其可能与触摸痛有关，当正常不发生疼痛的接触或刺激使得疼痛发生或转坏时，将引起触摸痛。例如，如果有三叉神经痛，则轻微地触碰脸将引发疼痛，或者如果有糖尿病性神经病，则床上用品的压迫可能引发疼痛。神经病理性疼痛也可以由触摸痛导致，其中当正常不发生疼痛的接触或刺激使得疼痛发生或转坏时，将引起疼痛。例如，如果个体患有三叉神经痛，则轻微地触碰脸将引发疼痛。与痛觉有关的神经病理性疼痛指正常只引起轻微的不适的刺激或接触所产生的严重的疼痛，而感觉异常指，即使当没有任何东西与引起疼痛的区域接触时发生的不舒服的或痛苦的感觉，例如四肢发麻。神经病理性疼痛的其他形式包括瘙痒或发痒，其可以与皮肤中的过敏反应或炎症反应以及由组织损伤和募集过程产生的炎性痛有关。
如本文所限定的，术语“NGF中和抗体”或类似的术语描述了能够中和NGF的生物激活和信号传导的抗体。中和抗体也可以称为拮抗性抗体或阻断抗体，其特异性优选选择性地结合NGF并抑制NGF的一种或多种生物活性。例如，中和抗体可以抑制NGF与其靶配体的结合，例如细胞膜结合TrkA或p75受体。
如本文所使用的，术语“生物活性”指分子的任何一种或多种内在的生物学特性(不管是体内发现天然存在的还是通过重组方法给予或激活的)。生物学特性包括但不限于受体结合和/或激活、诱导细胞信号传导或细胞增殖、抑制细胞生长、诱导细胞因子或趋化因子产生、诱导细胞凋亡和酶活性。
如本文使用的，术语“互补性决定区(CDR)”指一起限定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列，如同Kabat et al.(Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition.NIHPublication No.91-3242，免疫学研究的蛋白质的序列)中所述的。如本文所使用的，术语“框架区(FR)”指插入在CDR之间的氨基酸序列。抗体的这些部分用来将CDR保持在合适的方向(允许CDR结合抗原)。
如本文所使用的，术语“恒定区(CR)”指抗体分子赋予效应子功能的部分。在本发明中，恒定区通常指犬的恒定区，也就是说，主题犬源化抗体的恒定区来源于犬免疫球蛋白。
本文所用的术语“嵌合抗体”指含有衍生自两种不同抗体的序列的抗体，所述不同抗体通常为不同物种的。最典型的是，嵌合抗体包含衍生自供体物种且特异性结合靶表位的可变结构域和从施用该抗体的靶物种获得的抗体衍生的恒定结构域。
本文所用的术语“免疫原性”指当施用至接受者时引起免疫反应(体液的或细胞的)的寻靶蛋白或治疗部分的能力的估量。本发明涉及主题犬源化抗体的免疫原性。优选本发明的抗体不具有免疫原性，也就是说，当施用至犬时，将不会产生针对它们的中和抗体，并且进一步，没有通过抗体的Fc区介导的效应子功能。
本文所用的术语“同一性”或“序列同一性”指在比对的序列中任何特定的氨基酸残基位置处，氨基酸残基在比对的序列间是相同的。本文所用的术语“相似性”或“序列相似性”表示，在比对的序列的任何特定的位置，氨基酸残基在这些序列之间具有相似的类型。例如，亮氨酸可以被异亮氨酸或缬氨酸取代。这可以被称为保守取代。优选地,当本发明的氨基酸序列通过其中包含的任一氨基酸的保守取代来修饰时,与未修饰的抗体相比，这些变化对所产生的抗体的结合特异性或功能活性没有影响。
本发明的(天然)多肽及其功能衍生物的序列同一性涉及，在比对序列并且在必要时引入缺口以实现最大百分比同源性且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与对应的天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。不管是N端或C端的延长，还是插入，都不应该解释为降低序列同一性或同源性。用于实施两个或以上氨基酸序列的比对和用于确定它们的序列同一性或同源性的方法和计算机程序，是本领域技术人员熟知的。例如，使用算法例如BLAST(Altschul et al.1990)、FASTA(Pearson&Lipman 1988)或Smith-Waterman algorithm(史密斯-沃特曼算法，Smith&Waterman 1981)可以容易地计算2个氨基酸序列的同一性或相似性的百分比。
如本文所用的，提到与第二氨基酸残基具有最高同源性的氨基酸残基，指与第二氨基酸残基共有最多的特征和特性的氨基酸残基。在确定氨基酸残基与第二氨基酸残基是否具有最高同源性时,评定通常可以由各种因素组成,例如但不限于电荷、极性、疏水性、侧臂质量和侧臂尺寸。
术语“对应的位置”在本文中用来表示存在于第二序列的与第一序列中的特定氨基酸对应的某位置的氨基酸残基，且该术语用于表示，当比对两条序列以允许两条序列之间的最大序列同一性时，与第一序列的位置相同的第二序列中的位置。对应位置处的氨基酸残基具有相同的Kabat编号。
本文所用的术语“基本上由…组成”或“基本上由…组成”表示，多肽可以含有除所描述的以外的其他要素或元素，条件是这样的要素或元素并不会实质地影响抗体或抗体片段特异性结合犬NGF的能力。也就是说，包含多肽的抗体或抗体片段可以具有不干扰抗体或抗体片段结合犬NGF的能力和不抵消犬NGF功能活性的能力的其他要素或元素。可以将这样的修饰引入氨基酸序列中，从而降低抗体的免疫原性。例如，基本上由特定序列组成的多肽在该序列的一端或两端可以含有一个、两个、三个、四个、五个或以上额外缺失或取代的氨基酸，条件是这些氨基酸并不干扰、抑制、阻断或干扰抗体或片段结合犬NGF和隔离其生物功能的作用。同样，有助于抵消本发明的抗体的犬NGF的多肽分子可以被一个或多个官能团化学修饰，条件是这类官能团不干扰抗体或抗体片段结合犬NGF和抵消其功能的能力。
本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”指实现治疗效果所需的本发明的药物、结合化合物、小分子、融合蛋白或药物筛选化合物(peptidomimetic)的量。
本文中术语“多肽”、“肽”或“蛋白”可交换地用来表示通过相邻残基的α氨基和羰基之间的肽键连接的线性氨基酸残基。氨基酸残基通常是天然的“L”同分异构形式。然而，只要通过多肽保留期望的功能特性，“D”同分异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基。
如本文所限定的，“抗体”包含特异性结合目的靶抗原的抗原-结合蛋白，所述靶抗原具有可以被重组制备或通过免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽，在本文中该靶抗原是犬神经生长因子。术语“抗体”包含单克隆抗体和嵌合抗体，特别是犬源化抗体，并且进一步包含多克隆抗体或任何类或子类的抗体。“抗体”进一步延伸至杂合抗体、双特异性抗体、异种抗体以及其保留抗原结合的功能片段。
短语“特异性结合”指抗体与存在于异源蛋白群中的特定蛋白或靶的结合。因此，当存在于免疫测定条件时，抗体结合特定蛋白而并不大量地结合样品中存在的其他蛋白，在本文中该特定蛋白指犬NGF。
如本文所限定的，“犬”还可以指“狗”。犬可以被归类为学名家犬(Canis familiaris domesticus)或澳洲野犬(Canis lupus dingo)的亚种。犬包括任何种类的狗，并且包括野生品种和宠物品种，宠物品种还被称为伴侣动物。
现将参考以下实施例描述本发明，所提供的实施例用于说明的目的并非意图用于限制本发明。除非另有指明，通常根据本领域熟知的常规方法和如本发明引用和讨论的各种一般文献和详细文献中所描述的方法来实施本发明的方法和技术。
神经病理性疼痛神经病理性疼痛神经病理性疼痛神经病理性疼痛导致神经病理性疼痛
具体实施方式
实施例1—设计并产生具有不同犬同种型的抗犬NGF抗体
使用连接至选自HCA(SEQ ID NO:1)、HCB(SEQ ID NO:2)、HCC(SEQ ID NO:3)或HCD(SEQ ID NO:4)的重链恒定结构域(CH2和CH3)的相同的可变重链结构域(VH)，设计并构建针对犬NGF的抗体(称为caN抗体)。可变轻链(VL)连接至犬κ恒定结构域(SEQ ID NO:5)。通过密码子优选和完整的化学基因合成将该组合的氨基酸序列转换为哺乳动物细胞中的可表达形式并克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+。具体而言，所设计的氨基酸序列被构建成合成的cDNA-可表达形式并被克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(+)中。通过组合犬源化可变结构域序列和C-端犬恒定重链序列或恒定轻链序列来产生完整的抗体序列。该犬源化的aD11VH结构域与四个重链同种型HCA、HCB、HCC和HCD(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4)中的每一个结合，以及该犬源化的aD11 VL结构域与犬κ轻链恒定结构域(SEQ ID NO:5)结合。通过密码子优选和完整的化学基因合成并克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+，将所组合的氨基酸序列换为哺乳动物细胞中的可表达形式。
使犬源化的重链cDNA质粒和轻链cDNA质粒的组合(caN-HCA-kLC使用SEQ ID NO:5加SEQ ID NO:1(HCA)；caN-HCB-kLC使用SEQ ID NO:5加SEQ ID NO:2(HCB)；caN-HCC-kLC使用SEQ ID NO:5加SEQ ID NO:3(HCC)以及caN-HCD-kLC使用SEQID NO:5加SEQ ID NO:4(HCD))转染入CHO细胞，收集上清液并以ELISA模式使其与与NGF进行反应。在孵育和清洗步骤后，通过与连接辣根过氧化物酶(HRP)的山羊-抗犬IgG特异性多克隆抗体的反应性来检测结合的犬抗体并使用TMB使其显影。在450nm下测量所得的产物的光密度，并将其与来自模拟空白载体转染的上清液(图1中表示为“模拟”)的光密度进行比较。图1显示四种犬源化抗体同种型结合NGF的结果。这些抗体的每一种都具有相同的轻链(caN-kLC-1)，即为包含犬κ恒定结构域的轻链。每一种抗体都具有不同的重链恒定结构域。因此，将一种特定的重链可变结构域与四种不同的恒定结构域(caN-HCA、caN-HCB、caN-HCC或caN-HCD)之一组合。观察每一种犬重链同种型对NGF的等效结合。
通过ELISA试验测试抗体上清液对NGF的结合(图1A)，并通过TF-1细胞增殖抑制试验测试NGF中和(图1B)。由图1中可见，在这些试验中，四种同种型相互之间具有相当的活性，即它们都特异性结合犬NGF。
实施例2：NGF捕获的犬源化抗体诱导的补体沉积
然后当使用补体C1q ELISA结合NGF时，评价含有四种抗体的上清液结合补体的能力。用100μl/孔的5μg/ml小鼠NGF涂覆板，并用5％BSA/PBS封阻该板。于室温下用细胞培养物上清液将涂覆的孔孵育1小时，并且将其在PBS/1％BSA(100μl/孔)中稀释，其中该细胞培养物上清液含有重组的犬源化抗NGF IgG。洗涤该板，并在室温下用在含有0.5mM MgCl2、2mM CaCl2、0.05％吐温-20、0.1％明胶和0.5％BSA的弗罗那缓冲盐水中1/100稀释的100μl/孔的人血清孵育该板1小时。洗涤后，用100μl的在PBS/1％BSA中1/800稀释的绵羊抗-C1q-HRP(抗体)孵育该板。洗涤后，通过加入100l TMB底物(Thermo Scientifi)使该板显影。所有补体C1q的结合表示为A450—热灭活补体的背景。通过加入100μl的2N H2SO4停止显影并在450nm处读出吸光度。
图2示出该结果。这些结果显示了C1q与固定的犬源化HCB和HCC型抗体的结合，且没有C1q与犬源化的HCA和HCD型抗体结合。因而，该结果出乎意料地表明，不同的犬衍生的重链显示出不同的补体结合和激活特征，并且出乎意料地证明，具有HCA和HCD型重链的犬源化抗体优选用于抵消犬NGF。由于特异性结合NGF且在表达NGF的细胞附近介导免疫反应的抗体是非常不期望的，因此，产生特异性结合犬NGF且不介导CDC的抗体的能力是非常有利的。
实施例3：用HCB和HCC重链同种型比较抗犬NGF单克隆抗体的
N糖基化(N-glycosylated)变体和非糖基化(aglycosylated)变体与NGF结合
将具有HCB和HCC重链同种型的抗犬NGF单克隆抗体的N糖基化(N-glycosylated)变体和非糖基化(aglycosylated)变体与NGF的结合进行比较。使编码SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7(HCB)、SEQ ID NO:5和SEQID NO:16(HCB*)、SEQ ID NO:5和EQ ID NO:8(HCC)、或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:17(HCC*)描述的轻链和重链对的表达载体共转染到CHO细胞，并通过与小鼠NGF的结合ELISA比较上清液。结果显示于图3中。左边的图表显示了通过ELISA检测用HCB重链(HCB)、无糖基HCB重链(HCB*)、HCC重链(HCC)或无糖基HCC重链(HCC*)构建的抗NGF MAb的表达的—空白框显示未稀释的上清液，阴影框显示1/10稀释的上清液，以及C显示未稀释的阴性对照上清液。观察到与NGF等效结合。
类似地，将设计为除去HCB和HCC的恒定结构域N-连接的糖基化位点的抗体(被称为HCB*(SEQ ID NO:6)和HCC*(SEQ ID NO:7))与轻链共表达，并评价补体活性(图3)以试图消除其补体结合。令人惊奇地，非糖基化的HCB*不能结合补体，但是非糖基化的HCC*仍然能够结合补体。由于NGF是涉及伤害感受的可溶性介质,因此,对不介导补体募集结合的犬衍生糖基化的和非糖基化的重链的识别是特别有利的发现。
使用实施例2描述C1qELISA试验测试CHO细胞转染上清液募集补体的能力。
图3-右栏示出该结果。通过除去B型重链(HCB*)中的N-连接糖基化位点，废除募集补体C1q的能力，并且通过C型重链(HCC*)中的类似突变削弱该能力。
因此，本文出乎意料地证明，当本发明的抗体具有HCA或HCD亚型或非糖基化HCB*亚型时的犬衍生的重链时，抗体与犬NGF的结合并不引起补体激活(以及其他下游的效应子功能，例如ADCC)。因此，在通过防止犬NGF与膜结合TrkA或p75受体的结合抵消靶标例如犬NGF的生物功能活性时，所述抗体抑制相关的下游细胞内的信号级联。而且，由于NGF表达频繁地发生在神经等的附近，本发明的NGF抵消或中和抗体，其具有HCA或HCD亚型或HCB*亚型的犬衍生重链，能够在没有募集更宽泛的免疫反应的情况下隔绝犬NGF的生物活性。因此，该结果出人意料地表明，不同的犬衍生重链展示出不同的补体结合和激活特性，且具有HCA和HCD型重链的犬源化抗体已出人意料地显示出优选用于抵消犬NGF。由于NGF是可溶性介质，因此，对不介导补体结合的犬衍生重链的识别是非常有利的发现。这样的功能特性是意想不到的，也是非常期望的。
实施例4：针对其它抗原VEGF和CD20的具有犬重链恒定结构域的
抗体的产生以及其与补体的结合
考虑到令人惊讶的结果，即不同的犬重链同种型具有对补体的有差别的结合，使用以CHO细胞表达的犬重链恒定结构域并用如实施例1中描述的相同的方法类似地构建抗VEGF和抗CD20抗体。图4示出由这些抗体上清液在补体ELISA中得到的试验结果。将这些结果与上面描述的抗NGF抗体在结合它们的同源抗原之后募集补体的能力进行比较。
这些结果显示于图4中。图表A显示了将使用犬重链同种型B和C构建的犬源化抗NGF MAb和使用人重链同种型IgG1和IgG4构建的人源化抗体捕获到NGF涂覆板上，用人血清培养，并使用缀合于HRP的抗C1q多克隆抗体通过ELISA检测结合的C1q。图表B显示了补体C1q结合使用犬重链同种型A和B(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)构建的VEGF捕获的犬源化抗VEGF MAbs的结果。图表C显示了补体C1q结合huCD20胞外域肽上捕获的抗CD20MAb(muB-2a：鼠抗人CD20MAb以及muB-HCB：鼠抗人CD20MAb，表示为具有犬重链同种型B(SEQID NO:9)的嵌合融合蛋白)的结果。所有补体C1q的结合表示为A450—热灭活补体背景。
所有这些数据共同表明了使用HCB但非HCA犬重链恒定结构域构建的抗VEGF抗体可以募集补体，且使用犬HCB构建的抗CD20抗体可以结合补体，因此与上面描述的抗NGF抗体同种型对补体的有差别的结合类似。总的来说，这些数据支持了所述的令人惊奇的发现，即以HCB和HCC同种型构建的抗原捕获的抗体结合补体，而HCA和HCD则不是这样。HCB和HCC同种型结合补体的这种识别对于杀灭肿瘤细胞例如VEGF表达的或CD20表达的的肿瘤细胞是非常有利的。
这些实验的结果支持了实施例1中所述的出人意料的发现，即包含犬重链恒定结构域HCA、HCD和非糖基化的HCB(HCB*)同种型的抗体导致了不介导CDC活性的免疫球蛋白。因此，发明者已首次识别出，这种犬衍生重链在用于治疗方法的免疫球蛋白中具有效用(utility)，该治疗方法中不期望CDC介导的免疫反应。这种应用的实例可以在通过细胞因子或趋化因子、生长因子、荷尔蒙和其它细胞外介质，包括体内或例如疼痛、黄斑变性或炎症的疾病中的补体自身的犬免疫球蛋白的抑制中发现。
既然HCA、HCD和HCB*同种型在CDC非活性抗体的设计中是最有用的，发明者也令人惊奇地识别出，HCB(caIgG-B)和HCC(caIgG-C)同种型的犬抗体在CDC活性抗体的设计中是有用的。这种抗体例如在癌症治疗中，在将细胞作为靶标进行破坏时是有用的。有许多人肿瘤抗原通过使用CDC活性抗体、包括CD20、HER2和EGFR而被作为靶标，因此使用HCB和HCC同种型构建的犬抗体会在犬类中有类似的用途。
实施例5：在CHO细胞中表达后抗NGF单克隆抗体的纯化
由于HCA和HCD同种型的犬抗NGF单克隆抗体具有期望的不结合补体的特性(图2)，但对葡萄球菌蛋白质A弱结合(图5)，从而发明了纯化的替代方法(图6)。抗犬NGF单克隆抗体(使用重链同种型HCA构建)在CHO细胞中表达，并在经大量实验后，令人惊奇地发现，犬抗NGF抗体通过两种可替换的纯化方法可被分级为高纯度(>89％单体IgG峰值，如图6A、6D所示)。
在第一种方法中，抗犬NGF单克隆抗体通过阴离子交换层析、疏水作用层析和排阻层析(方法I-图6A和B)进行纯化。在第二种方法中，抗犬NGF抗体可以通过Captoadhere亲和层析，以及随后的阴离子交换层析(方法II-图6C和D)进行纯化。
通过任何一种方法纯化的抗NGF单克隆抗体的主峰对应于约150kDa的分子量。通过SDS-PAGE和ELISA的对比(图7)说明，方法I和方法II产生了具有类似的纯度和生物活性的抗体制剂。通过这些方法产生的纯化的抗NGF单克隆抗体在TF-1NGF中和试验中进行测试(如图1中所述)，并显示出具有高效能(IC50 13pM抗-NGF中和的37pMNGF，未示出)。
实施例6：抗犬NGF单克隆抗体可通过静脉注射安全地施用于犬，
且不会导致发热
将来源于含有犬HCA型重链的表达载体的抗犬NGF单克隆抗体在CHO细胞中表达，并通过离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析(方法I，图6A和B)的组合进行纯化，且缓冲液更换为磷酸盐缓冲液。将该抗体以2mg/kg体重静脉注射入比格犬，并由兽医通过目测观察评价毒性体征、体重变化、体温以及血浆生化。图8示出了体重和温度的测量。在测量的这些和任何血浆生化分析物(包括钠、钾、氯化物、钙、磷酸盐、尿素、肌酸酐、葡萄糖、胆固醇、胆红素、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、淀粉酶、脂肪酶、总蛋白质或白蛋白：未显示)中没有观察到变化。
实施例7：体内抗犬(HCA同种型)NGF单克隆抗体的血浆药代动
力学证明了长的血清半排出期且没有免疫原性
将来源于表达犬HCA型重链的表达载体的抗犬NGF单克隆抗体在CHO细胞中表达,并通过离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析的组合进行纯化，并将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液(方法I,图6A和B)。
通过静脉注射以每千克体重2mg将抗体注射入比格犬内，在其次的2周内的不同时间采集血浆样品。通过ELISA，使用作为靶的NGF和抗犬多克隆抗体-辣根过氧化物酶第二试剂，评价稀释的血浆样品的抗犬NGF抗体浓度，并如图1显影。图18示出该结果。测得的血浆浓度与二相动力学一致，具有约33小时的组织分布(α)相半衰期和约9天的出奇长的消除(β)相。
在100-300小时之间抗犬NGF抗体血浆浓度没有急剧下降，这表明在狗血液中既没有已有的中和抗体导致的重组抗NGF单克隆抗体，注入后也没有生成任何这样的中和抗体。通过比较，在注入后200小时时，狗血液中的抗体中和了基于蛋白的重组人免疫球蛋白(Richter et al,DrugMetabolism and Disposition 27:21,1998)。因此，这些结果表明，本发明的抗犬NGF抗体在静脉注射后在体内具有长的血清半衰期(9天)，并且随时间的过去，不存在中和注射的抗NGF抗体的已有抗体或新产生的抗体。
实施例14-抗犬NGF单克隆个抗体对降低体内炎性疼痛的影响
抗体疗法
在CHO细胞中表达衍生自表达SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11(犬HCA型重链)的表达载体的抗犬NGF单克隆抗体，并且通过离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析的组合(方法I)使其纯化，并且将缓冲液更换为磷酸盐缓冲液。
有炎症的犬模型：
在机构伦理委员会(Institutional Ethics Committee，CRL,爱尔兰)的预先批准下进行所有的实验。将高岭土(kaolin)注入(-1天时)比格犬的一条后腿的垫脚中，从而在约24小时后开始自身化解炎症，这导致狗暂时性跛足。在该模型中，一旦对高岭土的起初始炎性反应减弱，在约1-2周内该狗的跛足程度将稳定地减小，然后全部恢复。
通过静脉注射将抗犬NGF单克隆抗体以每千克体重200μg或作为媒介对照的磷酸盐缓冲液注入(0天时)到3只狗的组中。7天后，通过目测评分方法评价狗的跛足程度：0分，没有跛足(全负重)；1分，轻微跛足(非全负重但行走正常)；2分，中等跛足(轻微负重且行走不正常)；3分，严重跛足(无负重)。观察者不了解哪只狗接受了注射。
图19示出了该结果。与对照组相比，注射3天后，接受抗NGF单克隆个抗体的狗的跛足评分减小，这表明与仅用媒介相比，抗NGF单克隆抗体具有降低狗的疼痛的效果。延迟的活性与抗犬NGF单克隆个抗体的血浆药物动力学一致，这表明约30小时的慢的组织分布相和垫脚区相对差的血管形成。图19示出的结果表明，本发明的抗犬NGF抗体在降低跛足的同时降低了狗的炎性疼痛。
通过引用将本发明提及的所有文献并入本文中。在不背离本发明的范围的情况下，对本发明的实施方案进行各种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的。虽然就具体优选的实施方案进行了描述本发明，但是应该理解，请求保护的本发明不应该不适当地限制为这些具体的实施方案。事实上，本发明意图涵盖对本领域技术人员显而易见的实施本发明的方式的各种修改。
Claims (6)
1.抗体、融合蛋白或其结合片段在制备用于治疗犬的癌性或恶性病症的药物中的用途，希望在所述犬中激活下游免疫系统效应子功能，所述抗体、融合蛋白或结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14的重链恒定结构域，其中当所述抗体、融合蛋白或结合片段结合其靶抗原时，所述重链的氨基酸序列介导下游免疫系统效应子功能的激活。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述犬的治疗涉及癌性或恶性病症或传染病的治疗。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述下游免疫系统效应子功能选自补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞病理。
4.如权利要求2或3所述的用途，其中所述靶抗原是癌特异性抗原。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述癌特异性抗原选自细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞表面受体、病毒和补体级联的组分。
6.如权利要求4所述的用途，其中所述癌特异性抗原选自蛋白质CD2、CD4、CD8、CD20、EGFR、VEGFR和HER2。
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