KR101783398B1 - 항신경성 성장인자 항체 및 그의 제조방법과 이용방법 - Google Patents

항신경성 성장인자 항체 및 그의 제조방법과 이용방법 Download PDF

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Abstract

개 (canine)에게 사용하기 적합한 항체의 제조방법을 제공한다. 또한, 개의 신경 성장인자 (NGF)에 특이적으로 결합하고 p75 또는 TrkA 개 NGF 수용체에 결합하는 개 NGF의 능력을 중화하는 견(犬)화 항체 (caninised antibody)를 제공한다. 본 발명은 이를 인코딩하는 핵산 및 상기 항체 및/또는 핵산을 이용하여 개의 통증 및 관절염을 치료하는 방법까지 확장된다.

Description

항신경성 성장인자 항체 및 그의 제조방법과 이용방법{ANTI-NERVE GROWTH FACTOR ANTIBODIES AND METHODS OF PREPARING AND USING THE SAME}
본 발명은 개 (canine, 犬) 신경 성장인자의 길항제로서 작용하는 항체 및 이들의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 이를 제조하는 방법 및 개의 신경 성장인자와 관련된 질병, 예컨대 통증, 통증 관련 질환 및 만성 통증을 발생시키는 질병을 치료하는 데 있어서의 이들 항체 및 단편들의 치료적 용도에까지 이른다.
신경 성장인자 (NGF)는 알파, 베타 및 감마 폴리펩타이드 사슬로 이루어지는 자연적으로 존재하는 분비 단백질이다. NGF는 뉴로트로핀 패밀리의 일원이고 여러 가지 많은 역할에 연루되어 있다. NGF는 감각 뉴런 및 교감 뉴런의 생존과 분화를 촉진하고 2개의 막 결합 수용체들, p75, 저친화 NGF 수용체 및 TrkA, 막관통 타이로신 인산화효소이자 고친화 NGF 수용체를 통하여 신호를 전달한다. NGF의 TrkA
또는 p75에의 결합은 감각 뉴런 신경펩타이드의 상승 조절이라는 결과를 낳는다.
인간의 통증 및 통증 감수성을 치료하는 NGF 길항제의 사용은 알려져 있다 (Cattaneo A., Curr. Op. Mol. Ther. 2010 12(1):94-106). 예컨대, 국제출원공보 WO 2006/131951호는 래트 알파D11 (αD11, aD11) 모노클로날 항체의 인간화형을 개시한다. 상기 αD11 항체는 마우스 NGF에 대한 결합 특이성을 갖지만, NGF의 인간형 및 래트형에 결합하는 것으로도 알려져 있다. 래트 유래 αD11 모노클로날 항체의 인간화는 인간에게 투여하기 전에 필요한데, 이는 설치류 유래 항체들에 대응하여 증가하는 인간 항-마우스 항체 (HAMA)로부터 결과되는 중화 항체의 생성을 최소화하기 위함이다. 또한, 마우스의 불변 도메인 (constant domain)의 인간의 불변 도메인으로의 교체는 하류 효과자 (downstream effector) 기능이 선택될 수 있게 한다.
현재, 개의 통증 관리는 몇 가지 류의 진통제 투여, 예컨대 국소적 및 일반적 마취제, 오피오이드 마취제, α2 작용제, 비스테로이드계 항염증제 (NSAIDs) 및스테로이드의 투여를 통하여 제공되고 있다. 이들 각각은 자주 투여될 필요성이 있고, 효능 및 안전성에 있어서 한계도 갖는다. 따라서, 만성 통증, 예컨대 암 통증이나 관절염으로 인한 통증으로 고통받는 개들을 위한 통증 완화형으로서, 덜 자주 투여되는 장기 지속적이고 효과적인 형태에 대한 요구가 있다.
NGF가 개의 조직에서 발현되고 개의 NGF 분자가 밝혀져 있으나 (문헌 Eisele I. Wood IS. German AJ. Hunter L. Trayhurn P. "Adipokine gene expression in dog adipose tissues and dog white adipocytes differentiated in primary culture" Hormone & Metabolic Research. 37(8):474-81, 2005 Genbank XP_540250), 개 NGF에 대한 어떠한 길항제도 알려져 있거나 개의 통증을 예방 또는 경감시키기 위한 NGF 매개 신호전달을 차단하는 용도를 갖고 있지 못하다. 다른 종들에서 항-NGF 길항제로서 작용하는 공지의 항체들을 개에게 사용하는 것은 적당하지 않은데, 중화 항체의 생성 때문이다.
또한, 개 유래 불변 도메인과 공지의 항-NGF 항체, 예컨대 알파D11로부터 유래하는 가변 도메인을 포함하는 키메라 항체의 생성은 개의 NGF에의 결합을 장담할 수 없다. 또한, 이러한 항체는 개에는 존재하지만 그 항체가 애초에 유래한 종에는 존재하지 않을 수 있는 다른 표적 에피토프에 대하여 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 또한, 중화 항체의 생성은 항체의 장기 치료적 투여를 제한할 수 있는데, 이것은 만성 통증 관련 질환 또는 암 질환을 치료하는 경우 특히 중요한 요건이다. 유사하게, CDR 그라프팅 또는 관련 기술을 이용한 항-NGF 항체의 견(犬)화된 (caninised) 형태를 생성하는 것은 중화 항체 생성이라는 결과 역시 낳을 수 있고 또한 항원 결합 친화도 및 결합활성의 감소를 나타낼 수 있다. 따라서, 개의 통증 관리에 사용하기 위한, 개 NGF에 대한 길항제로서 작용하는 결합원에 대한 절실한 요구가 있고, 여기서 상기 결합원은 결합 친화도 및 결합활성은 높은 수준으로 유지하지만 그에 대한 중화 항체의 생성은 회피하는 것이다.
발명의 요약
많은 노력 끝에, 본 발명의 발명자는 놀랍게도 개 NGF에 특이적으로 결합하고 개 NGF의 생물학적 활성을 중화시키는 비면역원성 항체와 결합 단편들을 생성하는 항체 제조 방법을 동정하였다. 특히, 정말로 예기치 않게, 본 발명의 항체 및 결합 단편들의 개 NGF로의 결합은, 고친화 TrkA 수용체 또는 p75 수용체와의 결합을 억제함으로써 개 NGF의 생물학적 활성을 차단한다는 것이 입증되었다. 이것은 차례로, 감각 뉴런 중의 신경펩타이드의 상승조절을 막고 그 결과적인 효과로서 통증 감각은 저감되거나 없어질 것이다. 상기 항체는 DNA 재조합 방법을 이용하여 생성되고 예기치 않게 비면역원성, 즉 개 대상체에 대한 투여 후 그에 대응한 중화 항체들이 증가하지 않는다. 상기 항체들은 표준 방법론, 예컨대 CDR 그라프팅 등등을 이용하여 제조되지 않았으므로 이러한 발견은 전적으로 놀랍고도 예상치 못했던 것이다.
본 발명의 제1 관점에 따르면,
- 개 이외의 종들로부터 유래하는 공여자 항체를 제공하는 단계로서, 여기서 상기 공여자 항체는 개에 존재하는 표적 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 것이고;
- 하나 이상의 견 항체들의 구조영역들 (framework regions)의 아미노산 서열 내 대응하는 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기들과 상이한, 공여자 항체의 구조영역들의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기들을 식별하기 위하여, 상기 하나 이상의 견 항체들의 구조영역들의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에 존재하는 각 아미노산 잔기와 상기 공여자 항체의 구조영역들의 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기를 비교하는 단계; 및
- 상기 공여자 항체 내의 상기 식별된 하나 이상의 아미노산 잔기들을, 상기 하나 이상의 견 항체들 내 대응하는 위치에 존재하는 상기 하나 이상의 아미노산 잔기들로 치환하는 단계
를 포함하거나 필수적으로 이들 단계로 이루어지는, 개에 사용하기에 적합한 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은, 개에 사용하기 위하여 공여자 항체를 변형하는데, 상기 변형된 항체가, 개의 그 위치에서 외래의 것일 구조영역 내 임의 위치의 임의 아미노산을 함유하지 않는 방식으로 공여자 항체를 변형한다. 그러므로, 상기 변형된 항체는 표적 항원에 대한 공여자 항체의 특이성 및 친화도를 유지하지만, 중요하게는 어떠한 잠재적으로 외래인 에피토프를 생성하지 않도록 변형된다. 그러므로, 상기 변형된 항체는 개에서 외래의 것으로 여겨지지 않고, 따라서, 특히 장기 투여 이후 항체의 효능 중화를 나타낼 수 있는 개에서의 면역 반응을 유도하지 않는다.
특정 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 식별된 아미노산 잔기들을 치환하는 단계는, 상기 하나 이상의 식별된 아미노산 잔기들을, 하나 이상의 치환되는 아미노산 잔기들과 고도의 상동성을 갖는 대응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기들로 치환하는 것을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 공여자 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인들을, 개 항체로부터 유래하는 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인으로 교체하는 단계를 더 포함한다. 통상적으로, 상기 중쇄의 불변 도메인은 HCA형 또는 HCD형 개 불변 도메인을 이용하여 교체된다.
특정 구현예에 있어, 표적 항원은 신경 성장인자 (NGF)이다.
본 발명의 제1 관점의 방법은 CDR 그라프팅을 포함하지 않는다. 본 발명의 제1 관점의 방법에 따라 제조된 항체들은 공여자 항체의 CDR들, 본 발명의 제1 관점의 방법에 따라 제조된 견화 구조영역들 및 개의 불변 도메인들을 포함한다.
본 발명은 하기에 개시되는 것들과 같은, 본 발명의 제1 관점에 따라 제조되는 항체들에 이른다.
따라서, 본 발명의 또 다른 관점에 따라 개의 신경 성장인자 (NGF)에 특이적으로 결합하는 견화 항체 또는 그들의 결합 단편이 제공된다. 통상적으로, 상기 견화 항체 또는 그들의 결합 단편은 NGF에 결합되는 경우 그 생물학적 기능을 중화시킨다. 즉, 상기 견화 항체 또는 결합 단편들의 NGF에의 결합은 NGF의 TrkA 수용체 또는 p75 수용체로의 결합하는 능력을 봉쇄한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체 또는 그들의 결합 단편은 결합 친화성 KD 1x10-8 이하로 NGF에 결합한다.
본 발명의 또 다른 또는 관련된 관점에 있어서, 개의 신경 성장인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편이 제공되는데, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 그들과 85, 90, 95 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하거나, 그 경쇄 가변영역으로 이루어지거나, 필수적으로 그 경쇄 가변영역으로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
몇 가지 구현예에 있어서, 상기 중화 항체는 모노클로날 항체이다. 몇 가지 구현예에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체이다. 몇 가지 구현예에 있어서, 상기 항체는 견화 항체, 즉, 개 대상체에 투여되는 경우 그에 대하여 중화 항체가 생성되지 않도록 탈면역화된 (de-immunised) 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 몇 가지 구현예에 있어서, 상기 견화 항체는 본 발명의 제1 관점의 항체 제조 방법에 따라 제조된다. 통상적으로, 상기 항체의 중쇄 불변 도메인은, 상기 불변 도메인이 하류 효과자 기능을 매개하지 않도록 아미노산 치환 또는 결실의 방식으로 선별되거나 변형된다.
몇 가지 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열 또는 그들과 85, 90, 95 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하거나, 그 경쇄로 이루어지거나, 필수적으로 그 경쇄로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
또 다른 또는 관련된 구현예에 있어서, 개의 신경 성장인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편이 제공되는데, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 그들과 85, 90, 95 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역를 포함하거나, 그 중쇄 가변영역으로 이루어지거나, 필수적으로 그 중쇄 가변영역으로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
통상적으로, 상기 중쇄의 가변영역 (VH)는 하나 이상의 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 또 다른 아미노산 서열과 결합된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 도메인은 서브클래스 IgG (면역글로불린 G)의 항체로부터 유래하여 본 발명의 견화 항체의 온전한 중쇄를 형성한다. 4가지의 상이한 개 불변 도메인이 알려져 있다. 통상적으로, 상기 불변 도메인은 CH1, CH2 및 CH3를 포함하고, 상기 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치한 적절한 링커 (또는 "힌지")를 함께 포함한다. 통상적으로, 본 발명의 항-견(犬) NGF 항체는 불변 도메인과 결합된 중쇄 가변 도메인을 포함하는데, 여기서 상기 불변 도메인은 하류 효과자 기능들, 예컨대 보체 고정, ADCC, Fc 수용체 결합 등등을 매개하지 않는다. 통상적으로 상기 중쇄는 개의 중쇄 아이소타입 A 또는 D를 갖는다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 85, 90, 95 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하거나, 그 중쇄로 이루어지거나, 필수적으로 그 중쇄로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 결합 단편은, 그 아미노산 잔기의 글리코실화를 막기 위하여 불변 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되거나 결실된 중쇄를 포함할 수 있다. 따라서, 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 85, 90, 95 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하거나, 그 중쇄로 이루어지거나, 필수적으로 그 중쇄로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
몇 가지 구현예에 있어서, 하류 효과자 기능, 예컨대 보체 고정, ADCC, Fc 수용체 결합 또는 등등을 매개하지 않는 중쇄 불변 도메인을 갖는 항체들 또는 단편들이 양호하다. 이러한 중쇄는 개 유래 아형 IgG-A의 중쇄를 포함할 수 있고, SEQ ID NO:6, 11, 15 또는 19의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이러한 중쇄는 개 유래 아형 IgG-D의 중쇄를 포함할 수 있고, SEQ ID NO:9, 14, 18 및 22의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 또는 관련된 관점에 있어서, 본 발명은 개의 신경 성장인자 (NGF)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체, 또는 그들의 항원 결합 단편에까지 이르는데, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어지고, 여기서 상기 경쇄의 가변영역 (VL)은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 또는 이들과 85, 90, 95 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄의 가변영역 (VH)은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 상동인 아미노산 서열, 또는 이들과 85, 90, 95 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 결합 일원은 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열, 또는 이들과 85% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 서열, 더욱 좋기로는 95% 및 가장 좋기로는 98% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어지는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 결합 일원은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 85% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 서열, 더욱 좋기로는 95% 및 가장 좋기로는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어지는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 하나 이상의 리포터 분자와 연결될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 불변 도메인의 하나 이상의 잔기는 그 잔기의 글리코실화를 막기 위하여 치환 또는 결실될 수 있다. 따라서, 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이들과 85% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 서열, 더욱 좋기로는 95% 및 가장 좋기로는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 15개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 20개 이상의 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 약 25개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
또한, 본 발명의 발명자는 상보성 결정 영역 (CDRs)과 조합되어 견화 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 형성할 수 있는 일련의 구조영역 (framework regions, FR)을 정의하였다. 각각의 중쇄 및 경괘 도메인은 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된, 4개의 구조영역들을 갖는다.
항체 분자는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들 및 사이에 위치하는 연관된 구조영역들을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 상기 중쇄 가변 도메인 (VH) CDRs은 카바트 번호 시스템 (Kabat numbering system)에 따라 하기 위치에서 발견되는 HCDRs로 알려져 있다: VHCDR1 - 카바트 잔기 31-35, VHCDR2 - 카바트 잔기 50-65, VHCDR3 - 카바트 잔기 95-102 (Kabat EA et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5th edition. Bethesda: US Department of Health and Human Services).
또한, 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들 및 사이에 위치하는 연관된 구조영역들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 상기 경쇄 가변 도메인 (VL) CDRs은 카바트 번호 시스템에 따라 하기 아미노산 잔기 위치에서 발견되는 VLCDRs로 알려져 있다: VLCDR1 - 카바트 잔기 24-34, VLCDR2 - 카바트 잔기 50-56, VLCDR3 - 카바트 잔기 89-97.
경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 가변 도메인은 하기의 배열로 CDRs이 끼어든 4개의 구조영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 항-NGF 항체 또는 그들의 NGF 결합 단편에까지 이르는데, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은:
SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR1 구조영역,
SEQ ID NO:25의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR2 구조영역,
SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR3 구조영역,
SEQ ID NO:28의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR4 구조영역 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함, 및/또는
SEQ ID NO:29의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR1 구조영역,
SEQ ID NO:30의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR2 구조영역,
SEQ ID NO:31 또는 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR3 구조영역,
SEQ ID NO:33의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR4 구조영역
중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.
통상적으로, 경쇄 및 중쇄 CDRs은 개의 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체로부터 유래한다.
통상적으로, 본 발명의 견화 항-견 NGF 항체의 생성은 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인의 구조영역 안으로 도입되기 위하여 복귀 돌연변이를 필요로 하지 않는다.
특정 구현예에 있어서, 전술한 상기 하나 이상의 구조영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인은 개 유래 경쇄 불변 도메인, 통상적으로 경쇄 카파 불변 도메인과 연결되지만, 필요에 따라 람다 경쇄와 연결된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 갖는 FR1 영역, SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 FR2 영역, SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 FR3 영역, 및 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 FR4 영역 또는 전술한 것들과 85, 90, 95 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 구조영역을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 5개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 10개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, 전술한 하나 이상의 구조영역을 포함하는 중쇄 가변영역은 개 유래 중쇄 불변 도메인과 연결된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 불변 도메인의 아미노산 서열은 임의의 번역 후 변형 (post-translational modification)을 갖지 않거나, 또는 N-결합 또는 O-결합 글리코실화의 대상일 수 있는 임의의 또는 모든 잔기들을 제거하도록 변형됨으로써 상기 불변 도메인은 비(非)글리코실화된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 FR1 영역, SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 FR2 영역, SEQ ID NO:31 또는 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 갖는 FR3 영역 및 SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 FR4 영역 또는 전술한 것들과 85, 90, 95 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 구조영역을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 5개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 10개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, 본 발명에 개시된 구조영역으로의 변형이 이루어질 수 있다. 즉, 본 발명의 발명자는 각각의 구조영역 중 일부 잔기들로서 주어진 위치에 존재할 수 있는 아미노산 잔기를 선택한다는 것을 밝혔다. 중요하게는, 이들 구조영역 변경은 상보성 결정 영역에 형태적 변화를 야기하지 않는다는 것인데, 이것은 결과물인 항체의 결합 특이성 및/또는 친화도를 변하게 할 수 있기 때문이다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 경쇄 가변영역 및/또는 중쇄 가변영역의 구조영역의 아미노산 잔기에 2개 이상의 아미노산 치환을 도입하는 것에 이른다.
따라서, 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 폴리펩타이드, 예컨대 항체 또는 이들의 항원 결합 단편에까지 이르는데, 이는 하나 이상의 하기 아미노산 치환 (여기서 아미노산은 1글자 코드로 표기됨)으로 변형된, SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 FR1 영역을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다: 3번 위치의 아미노산 잔기 Q (Q3)는 아미노산 잔기 V로 교체되고, T5는 M, S7은 T, A9는 L, L13은 V, Q15는 P 또는 R, E16은 G, K18은 T 또는 P, V19는 A, T20은 S, 및 T22는 S로 교체된다. 또한, 하나 이상의 하기의 치환이 더 제공될 수 있다. T5는 I, A9는 P, S12는 A, S14는 R 또는 T, E16은 D, E17은 D, K18은 A, E 또는 L, T22는 Y 및 C23은 Y로 교체된다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, 경쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 FR1 영역을 갖는 경우, 이는 하나 이상의 하기 아미노산 치환으로 변형될 수 있다: 3번 위치의 아미노산 잔기 V (V3)는 아미노산 잔기 Q로 교체되고, T5는 M, S7은 T, A9는 L, L13은 V, Q15는 P 또는 R, E16은 G, K18은 T 또는 P, V19는 A, T20은 S, 및 T22는 S로 교체된다. 또한, 하나 이상의 하기의 치환이 더 제공될 수 있다. T5는 I, A9는 P, S12는 A, S14는 R 또는 T, E16은 D, E17은 D, K18은 A, E 또는 L, T22는 Y 및 C23은 Y로 교체된다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR2 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: Y2는 F, Q3은 R, A9은 S, K11은 Q, 및 L12는 R로 치환된다. 또한, Y2는 I 또는 L, Q3은 I 또는 L, Q4는 H, K5는 R, P6은 A 또는 S, G7은 D, A9는 P 또는 T, K11은 E 또는 R, L12는 A, G, P 또는 S, I14는 L, 및 Y15는 E, F, N, S 또는 V로 치환될 수 있다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 FR3 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: S4는 D, E14는 D, Y15는 F, S16은 T, L17은 F, T18은 K, N20은 S, L22는 V, S24는 P, V27은 A, F31은 Y로 치환된다. 또한, G1은 A, V2는 A, P3은 S, F6은 L 또는 V, S7은 I, G8은 A, T13은 A, S16은 R, T18은 R, S24는 A, E25는 D, G, I 또는 N, V27은 G, S 또는 T, A28은 G, 및 V29는 I 또는 L로 치환될 수 있다.
경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 FR3 영역을 갖는 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 이것은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: S4는 D, E14는 D, F15는 Y, S16은 T, L17은 F, T18은 K, S20은 N, L22는 V, P24는 S, V27은 A, Y31은 F로 치환된다. 또한, G1은 A, V2는 A, P3은 S, F6은 L 또는 V, S7은 I, G8은 A, T13은 A, S16은 R, T18은 R, S24는 A, E25는 D, G, I 또는 N, V27은 G, S 또는 T, A28은 G, 및 V29는 I 또는 L로 치환될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 경새 FR4 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: E8은 D로 치환된다. 또한, G2는 S, A3은 P, Q 또는 T, G4는 E, T5는 P, K6은 Q 또는 S, V7은 L 또는 W, E8은 R, 또는 L9는 I로 치환될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR1 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: D10은 G, N13은 Q, G15는 T, G16은 E, T17은 S, T19는 R, V24는 A, S28은 T, L29는 F, T30은 S로 치환된다. 또한, E1은 D 또는 G, V2는 E, G,I, L 또는 M, Q3은 A, E, H, K, L, P, R, S 또는 V, L4는 P 또는 V, V5는 A, E, L 또는 M, E6은 A 또는 Q, S7은 F, L 또는 T, G9는 E, D10은 A, E, N 또는 T, L11은 Q, R, V 또는 W, V12는 A, I 또는 M, N13은 K 또는 R, P14는 F 또는 T, G15는 A 또는 E, G16은 A, T17은 P, L18은 R, T19는 G, K 또는 V, L20은 I 또는 V, S21은 Y, V23은 A, E, I 또는 L, V24는 G, I, S 또는 T, S25는 G, P 또는 T, G26은 D, R 또는 T, F27은 D, I, L, S, T 또는 V, S28은 A, D, I, L, M, N, P 또는 R, L29는 I, M 또는 V, T30은 D, G, H, I, K, N, R, V로 치환될 수 있다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR2 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: L6은 P, R8은 K, E11은 Q, G14는 A로 치환된다. 또한, W1은 C, V2는 A, F, I 또는 L, Q4는 H 또는 L, A5는 D, G, P, S, T 또는 V, G7은 E, L 또는 R, R8은 A, E, G, M 또는 Q, G9는 D, E, R, T 또는 V, L10은 F, M 또는 P, E11은 D, H, L, P 또는 R, W12는 C, F, L, M, S 또는 Y, V13은 F, I 또는 L, G14는 L,S 또는 T로 치환될 수 있다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR3 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: L2는 F, T5는 S, T8은 N, S9는 A, S11은 N, V13은 L, F14는 Y, K16은 Q, H18은 N, Q21은 R, S22는 A, T27은 V, R32는 K로 치환된다. 또한, R1은 Q, L2는 V, T3은 A, I 또는 S, I4는 L, M, T 또는 V, T5는 A 또는 F, R6은 K, D7은 E 또는 N, T8은 D, G, I 또는 S, S9는 D, G, P, T 또는 V, K10은 E, G, M, N, Q 또는 R, S11은 D, H, K 또는 R, T12는 A, I, M 또는 S, V13은 A, I 또는 M, F14는 H, S 또는 T, L15는 I, K16은 A, D, E, H 또는 R, M17은 L, H18은 D, K, P, R, S 또는 T, S19는 D, G, N, R 또는 T, L20은 V, Q21은 G, I, K, S 또는 T, S22는 D, G, P, T 또는 V, E23은 A, D 또는 V, T25는 A, M 또는 S, A26은 G 또는 V, T27은 F, I, K, L, M 또는 Q, Y28은 H, Y29는 F 또는 H, A31은 C, G, L, M, R, S, T 또는 V, R32는 A, D, E, G, I, L, M, N, P, Q, S, T 또는 V로 치환될 수 있다.
중쇄 가변 도메인이 SEQ ID NO:32의 아모노산 서열을 포함하는 FR3 영역을 갖는 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 이것은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: L2는 F, T5는 S, T8은 N, S9는 A, S11은 N, V13은 L, F14는 Y, Q16은 K, H18은 N, R21은 Q, S22는 A, T27은 V, R32는 K로 치환된다. 또한, R1은 Q, L2는 V, T3은 A, I 또는 S, I4는 L, M, T 또는 V, T5는 A 또는 F, R6은 K, D7은 E 또는 N, T8은 D, G, I 또는 S, S9는 D, G, P, T 또는 V, K10은 E, G, M, N, Q 또는 R, S11은 D, H, K 또는 R, T12는 A, I, M 또는 S, V13은 A, I 또는 M, F14는 H, S 또는 T, L15는 I, K16은 A, D, E, H 또는 R, M17은 L, H18은 D, K, P, R, S 또는 T, S19는 D, G, N, R 또는 T, L20은 V, Q21은 G, I, K, S 또는 T, S22는 D, G, P, T 또는 V, E23은 A, D 또는 V, T25는 A, M 또는 S, A26은 G 또는 V, T27은 F, I, K, L, M 또는 Q, Y28은 H, Y29는 F 또는 H, A31은 C, G, L, M, R, S, T 또는 V, R32는 A, D, E, G, I, L, M, N, P, Q, S, T 또는 V로 치환될 수 있다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 FR4 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: L6은 S로 치환된다. 또한, W1은 L, G2는 A 또는 S, Q3은 D, H, P 또는 R, T5는 A, I, N 또는 S, L6은 P, Q 또는 R, V7은 I, L 또는 P, T8은 A, F, I, L, P, S 또는 Y, V9는 A, S10은 A, C, P 또는 T, S11은 A, L 또는 P로 치환될 수 있다.
본 발명의 상기 관점의 특정 구현예에 있어서, 항체는 모노클로날 항체이다. 통상적으로 상기 항체는 견화 항체이다.
본 발명의 상기 관점의 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 견화 NGF 중화 항체 또는 그들로부터 유래하는 결합 단편은 평형 해리 상수 (KD) 1x10-8 이하의 결합 친화성으로 개의 NGF (신경 성장인자)에 특이적으로 결합한다. 또한, 상기 견화 항체는 개에 존재하는 어떠한 다른 에피토프들과도 교차 반응하지 않고, 또한 그들이 개에 투여되는 때 본 발명의 항체에 대응하여 중화 항체를 생성하지 않는 것이 좋다. 또한, 이 항체들의 불변 도메인은 어떠한 하류 효과자 기능, 예컨대 보체 고정 및 활성화, ADCC 및 Fc 수용체 결합 및 활성화를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 하류 효과자 기능을 매개하지 않는 것이 좋다.
본 발명의 상기 관점의 특정 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 개에서의 혈청 반감기가 1주 이상이다. 통상적으로 상기 혈청 반감기는 8일 이상이다. 통상적으로, 상기 항체는 개에서 면역원성이 아니다.
본 발명의 상기 관점의 특정 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의하여 정제 가능하거나 정제된다. 다른 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 캡토부착 친화 크로마토그래피 이후 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의하여 정제 가능하거나 정제된다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체, 또는 그들의 항원 결합 단편은 하류 효과자 기능들을 매개하지 않는다. 통상적으로 상기 항체 또는 결합 단편은 개의 중쇄 아이소타입 A 또는 D를 갖는다.
특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체는 본 발명의 제1 관점의 항체 제조 방법에 따라 제조된다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, 중쇄의 불변영역의 아미노산 서열에 대한 변형이 본 발명의 항체에 이루어질 수 있다. 상기 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 변화는 통상적으로 항체의 기능적 특징을 변형하기 위하여 수행된다. 예컨대, 아미노산 변형은 항체의 불변 도메인에 의하여 매개되는 하류 효과자 기능을 막기 위하여 수행될 수 있는데, 예컨대 항체의 Fc 수용체에 결합하거나, 보체를 활성화시키거나 또는 ADCC를 유도하는 능력을 막음으로써 수행될 수 있다. 또한, 변형은, 개에 투여되는 때 항체의 순환 반감기를 변형하기 위하여 중쇄 불변 도메인의 힌지 영역의 아미노산 잔기에 이루어질 수 있다.
본 발명은 개의 NGF에 결합하여 p75 또는 TrkA 수용체에 결합하는 그의 능력을 봉쇄하는 항체 단편에까지 이른다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체 결합 단편은 플렉시블 링커와 연결되어 단쇄 항체를 형성하는 본 발명의 중쇄 및 경쇄 서열을 포함할 수 있다.
단쇄 Fv (scFv)는 VH 및 VL 도메인을 포함한다. Vh 및 VL 도메인은 연관되어 표적 결합 부위를 형성한다. 이들 2개의 도메인은 펩타이드 링커에 의하여 공유결합적으로 연결된다. scFv 분자는 경쇄 가변 도메인이 N-말단에 요구되는 경우에는VL-링커-VH의 형태를 가질 수 있고, 또는 VH 도메인이 N-말단에 요구되는 경우에는 VH-링커-VL의 형태일 수 있다. 따라서, 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 단쇄 Fv (scFv) 항체 단편이다. 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 항체 결합 단편은 Fab 항체 단편, Fab' 항체 단편, F(ab')2 항체 단편, Fv 항체 단편, scFV 항체 단편 등등으로 이루어지는 군으로부터 선택되지만 한정되는 것은 아니다.
몇 가지 구현예에 있어서, 본 발명은 다특이적 (multispecific) 또는 다가의 (multivalent) 항체를 제공하며, 이는 병용요법에 사용하기 위한 여러 가지 결합 특이성을 갖는 다른 항체들과 커플링 또는 연결된 본 발명의 항-NGF 항체 또는 결합 단편을 포함한다. 다특이적 항체는 제1 NGF 에피토프에 특이적인 하나 이상의 항체 또는 결합 단편, 및 NGF 상에 존재하는 다른 에피토프 또는 다른 항원에 특이적인 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 다가 항체는 동일한 NGF 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 결합 단편을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 견화 항체의 Fv 영역 또는 Fab 영역을 4개 이상 포함하는 항체 융합 단백질에 이른다. 또 다른 구현예는, 본 발명에 개시되는 항체로부터 유래하는 하나 이상의 Fab 영역과 함께 NGF에 대하여 특이적인 항체들로부터 유래하는 하나 이상의 Fab 또는 Fv 영역을 포함하는 항체 융합 단백질에 이른다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 2특이적 (bispecific) 항체에까지 이르는데, 여기서 본 발명에 따른 항체 또는 그들의 결합 단편은 NGF가 아닌 제2 표적에 대하여 결합 특이성을 갖는 제2 항체 또는 그들의 결합 단편과 연결된다. 좋기로는 상기 제2 표적은 p75 또는 TrkA 수용체를 통한 NGF 매개 신호전달 방지를 보조한다. 이러한 다가의, 2특이적 또는 다특이적 항체들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 다양한 재조합 방법들에 의하여 제조될 수 있다. 본 발명의 또 다른 관점은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-뉴로트로핀 중화 항체를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 뉴로트로핀은 개의 신경 성장인자 (NGF)이다.
본 발명의 또 다른 관점은 개의 통증을 치료, 저해 또는 개선하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은:
- 치료적 유효량의 항-견 NGF 항체, 또는 그들의 항원 결합 단편을 제공하는 단계와,
- 상기의 것을 이를 필요로 하는 개에게 투여하는 단계
를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 견화 항체이다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 및/또는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의, 및 더욱 좋기로는 98% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 항-견 NGF 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 전술한 본 발명의 관점들에 의하여 제공되는 것들 중 임의의 것이다.
특정 구현예에 있어서, 통증은 신경병증 통증이다. 특히, 상기 통증은 수술전후 (peri-operative), 수술 후 (post-operative) 또는 외과술 후 (post-surgical) 통증일 수 있다. 수술 후 통증은 개의 정형외과술, 연조직 수술, 난소자궁절제술 (ovariohysterectomy) 과정, 거세 과정 등등을 포함하는 임의의 수술 과정에 뒤따라 결과되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 암 또는 암 유사 질환과 관련된 만성 통증 (종양 통증)이다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 류마티스 관절염 또는 골관절염과 관련된 또는 이로부터 야기되는 것이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 염증성 통증 또는 소양증 통증이다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 개 대상체에서 관절염 또는 관절 질환의 치료 방법이 제공되는데, 상기 방법은:
- 본 발명에 따른 항-견 NGF 항체 또는 그들의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 제공하는 단계, 및
- 상기의 것을 이를 필요로 하는 개에게 투여하는 단계
를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 견화 항체이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 관절염 또는 관절 질환은 면역 매개 다발성 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염 및 관련 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환들을 포함한다.
통상적으로, 관절염 또는 관절 질환의 치료는 상기 관절 질환과 관련되거나 그것이 원인인 통증의 개시를 개선, 저해, 저감, 억제 또는 지연시키는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점은 개 대상체에서 개의 NGF의 발현 증가 또는 NGF에 대한 감수성 증가에 의하여 야기되거나, 그와 관련되거나 또는 그러한 결과를 야기하는 질환의 치료 방법을 제공하는데, 상기 방법은:
- 본 발명에 따른 견화 항-견 NGF 항체 또는 그들의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 제공하는 단계, 및
- 상기의 것을 이를 필요로 하는 개에게 투여하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 개에서 NGF에 의하여 증식 유도된 종양 및 그와 관련된 질환의 치료 방법을 제공하는데, 상기 방법은:
- 본 발명에 따른 항-견 NGF 항체 또는 그들의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 제공하는 단계, 및
- 상기의 것을 이를 필요로 하는 개에게 투여하는 단계
를 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 종양은 골육종이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 종양은 자가분비 또는 측분비 NGF에 의하여 증식 유도된다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 전술한 방법들은 상기 본 발명의 항-NGF 항체의 효과를 증강 및/또는 보완할 수 있는 하나 이상의 추가 제제를 공투여하는 단계를 더 포함한다. 예컨대, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 하나 이상의 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드 또는 스테로이드와 더불어 공투여될 수 있다.
적절한 진통제의 예시로는 부토르파놀, 부프레노르핀, 펜타닐, 플루닉신 메글루민, 메르피딘, 모르핀, 날부핀 및 이들의 유도체를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 적절한 NSAIDS는 아세트아미노펜, 아세틸살리실산, 카프로펜, 에토돌락, 케토프로펜, 멜록시캄, 피로콕시브, 로베나콕시브, 데라콕시브 등등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 제제는 항생제, 항진균 치료제, 항원충 치료제, 항바이러스 치료제 또는 유사 치료제로부터 선택되는 하나 이상의 군일 수 있는 치료적 활성제일 수 있다. 또한, 상기 하나 이상의 추가 제제는 염증 매개자(들)의 억제제, 예컨대 PGE-수용체 길항제, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 또는 항염증 글루코코르티코이드일 수 있다. 또한, 상기 하나 이상의 추가 제제는 항고혈압제 또는 심혈관 기능장애, 예컨대 고혈압, 심근 허혈, 울혈성 심부전 등등의 치료에 사용하기 위한 기타 화합물일 수 있다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 제제는 나이든 개들에게서 점점 만연될 수 있는 인지 기능장애 또는 손상, 예컨대 기억 상실 또는 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 제제일 수 있다. 그리고 또한, 상기 하나 이상의 추가 제제는 이뇨제, 혈관확장제, 베타-아드레날린성 수용체 길항제, 안지오텐신-II 전환 효소 억제제, 칼슘 채널 차단제 또는 HMG-CoA 환원효소 억제제일 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 전술한 방법들의 일부로서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개에게 약 0.01 mg/체중kg 내지 약 10 mg/체중kg 범위의 투여량으로, 특히 약 0.03 mg/체중kg 내지 약 3 mg/체중kg 범위의 투여량으로 투여된다.
다양한 다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 전술한 임의의 관점에 따fms항체 또는 그들의 결합 단편을 포함하는 조성물에 이른다. 특정 구현예에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 캐리어를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점은 개의 만성 통증 또는 NGF에 의하여 증식 유도된 종양을 야기하거나 그에 의하여 야기되는 통증 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는데, 이는 본 발명에 따른 약학적 유효량의 항체를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 캐리어, 첨가제 또는 희석제와 함께 포함한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드 또는 스테로이드를 더 포함할 수 있다.
다양한 다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산에 이른다.
따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 항-견 NGF 항체 또는 항체 단편의 경쇄 가변 도메인, 또는 SEQ ID NO:5 또는 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 인코딩한다.
또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 항-견 NGF 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 도메인, 또는 SEQ ID NO:6~SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11~SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:18 및 SEQ ID NO:19~SEQ ID NO:22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 인코딩한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 단리된 핵산은 작동가능하게 그와 연결된 하나 이상의 조절 서열을 더 인코딩한다.
다른 관점에 있어서, 본 발명의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 조절 서열을 더 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터이다.
또 다른 관점은 본 발명의 전술한 관점의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나의 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은 항-견 NGF 중화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 전술한 관점의 숙주 세포를 배양하여 세포로 하여금 항-견 NGF 중화 항체를 발현하도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명에 따른 항-견 NGF 항체를 정제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은:
- (i) 음이온 교환 크로마토그래피;
- (ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및
- (iii) 크기 배제 크로마토그래피
의 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명에 따른 항-견 NGF 항체를 정제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은:
- (i) 캡토부착 친화 크로마토그래피; 및
- (ii) 음이온 교환 크로마토그래피
의 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명에 따른 항-견 NGF 견화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이는 적절한 숙주 세포에서 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 본 발명의 전술한 관점들의 폴리뉴클레오티드/핵산 또는 벡터 하나 이상을 발현시키는 단계와, 숙주 세포에서 함께 발현되거나 다른 숙주 세포에서 별개로 발현될 수 있는 그 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계와, 항체를 단리하는단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점은 개의 통증을 치료, 개선 또는 저해하는 방법 또는 NGF에 의하여 증식 유도된 종양을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드의 유효량을 상기 개에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 관점들에 따른 약학적 조성물, 또는 개의 통증을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터를 제공한다.
특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 급성 통증이다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 만성 통증이다. 또한, 상기 통증은 수술 후 통증, 또는 정형외과술, 연조직 수술, 난소자궁적출 과정, 거세 과정 등등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 개에 대한 임의의 수술 과정으로부터 야기되는 통증일 수 있다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 암 또는 암 유사 질환과 관련된 만성 통증이다. 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 류마티스 관절염 또는 골관절염과 관련되거나 그로부터 야기되는 것이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 염증성 통증 또는 소양증 통증이다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 관점들에 따른 약학적 조성물, 또는 관절염, 특히 골관절염 및/또는 류마티스 관절염을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 관점들에 따른 약학적 조성물, 또는 개에서 NGF에 의하여 증식 유도되는 종양 및 그와 관련된 질환들, 특히 골육종을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 종양은 자가분비 또는 측분비 NGF에 의하여 증식 유도된다.
본 발명의 또 다른 관점은 개의 통증을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 관점들에 따른 약학적 조성물, 또는 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터의 용도를 제공한다.
통상적으로, 상기 통증은 만성 통증이다. 또한, 상기 통증은 수술 후 통증, 또는 정형외과술, 연조직 수술, 난소자궁적출 과정, 거세 과정 등등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 개에 대한 임의의 수술 과정으로부터 야기되는 통증일 수 있다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 암 또는 암 유사 질환과 관련된 만성 통증이다. 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 류마티스 관절염 또는 골관절염과 관련되거나 그로부터 야기되는 것이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 염증성 통증 또는 소양증 통증이다.
본 발명의 또 다른 관점은 개의 류마티스 관절염 또는 골관절염을 치료, 저해, 개선 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 관점들에 따른 약학적 조성물, 또는 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은 개에서 NGF에 의하여 증식 유도되는 종양 및 그와 관련된 질환들, 특히 골육종 치료용 의약의 제조에 있어서 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 관점들에 따른 약학적 조성물, 또는 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터의 용도를 제공한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 종양은 자가분비 또는 측분비 NGF에 의하여 증식 유도된다.
또 다른 관점에 있어서, 본 발명에 따른 항-견 NGF 중화 모노클로날 항체 또는 그들의 단편을 생산하는 세포주 또는 그들의 유도체 또는 자손 세포가 제공된다.
본 발명의 또 하나의 관점은 개의 통증을 치료하기 위한, 또는 통증과 관련된 질환을 치료하기 위한, 또는 골관절염 또는 류마티스 관절염과 관련된 통증을 치료, 개선 또는 저해하기 위한 키트를 제공하는데, 이는 본 발명의 전술한 관점들 중 어느 하나에 따른 항-견 NGF 항체 또는 결합 단편과, 이들의 사용에 대한 지침을 포함한다.
본 발명의 또 하나의 관점은 시험관 내 (in vitro), 생체 외 (ex vivo) 및 생체 내 (in vivo)에서 유액 중 항-견 NGF 모노클로날 항체를 검출하기 위한 진단 키트를 제공하는데, 이는 상기 항체의 농도를 측정하는 데 사용하기 위한 것이다. 상기 키트는 본 발명의 항체들 중 어느 하나 또는 그들의 결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 키트는 이들을 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따라 생산된 견화 항체들의 쥐의 NGF 및 개의 NGF에 대한 결합을 보여주는 그래프이다.
도 2A~D는 본 발명의 견화 항체들의 단백질 A 정제를 보여주는 일련의 겔을 보여주고 있다.
도 3은 SDS-Page를 이용한 견화 항체들의 정제 결과를 보여주는 겔을 나타낸다.
도 4는 견화 항체들에 의한, TF-1 세포의 NGF 유도 증식의 저해를 보여주는 그래프이다.
도 5는 항원 포획 견화 항체들에 의하여 유도된 보체 침적을 보여주는 그래프이다.
도 6은 견화 항-NGF의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 보여준다 (SEQ ID NO:1). 카바트 번호로 확인된 3개의 CDR 영역은 밑줄로 표시된다. 특정 잔기 위의 별표는 견화 서열과 래트 알파D11 항-쥐 NGF 모노클로날 항체의 아미노산 서열 간의 서열 차이를 나타낸다.
도 7은 견화 항-NGF의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 보여준다 (SEQ ID NO:2). 카바트 번호로 확인된 3개의 CDR 영역은 밑줄로 표시된다. 특정 잔기 위의 별표는 견화 서열과 래트 알파D11 항-쥐 NGF 모노클로날 항체의 아미노산 서열 간의 서열 차이를 나타낸다.
도 8은 견화 항-NGF 경쇄 가변 도메인 견 카파 경쇄 (caN-kLC) 항체의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:5)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.
도 9는 견화 항-NGF 중쇄 가변 도메인 견 IgG-A 중쇄 (caN-HCA)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:6)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.
도 10은 견화 항-NGF 중쇄 가변 도메인 견 IgG-B 중쇄 (caN-HCB)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:7)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.
도 11은 견화 항-NGF 중쇄 가변 도메인 견 IgG-C 중쇄 (caN-HCC)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.
도 12는 견화 항-NGF 중쇄 가변 도메인 견 IgG-D 중쇄 (caN-HCB)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:9)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.
도 13A는 SEQ ID No: 5와 7 및 SEQ ID No: 10과 11의 희석률 변화를 이용하여 항-견-NGF 모노클로날 항체의 NGF에 대한 결합의 비교를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 13B는 도 13A의 상층액의 보체 침적을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 14A는 HCB 및 HCC 중쇄 아이소타입을 갖는 항-견-NGF 모노클로날 항체의 N-글리코실화 및 비글리코실화 변이체의 NGF에 대한 결합의 비교를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 14B는 도 14A의 상층액의 보체 침적을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 15A 및 B는 (1) 음이온 교환 크로마토그래피, (2) 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 (3) 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 3 단계 방법 (방법 I)을 이용한 본 발명의 항-견 NGF 항체의 정량적 정제를 보여준다. 도 15A는 크기 배제 HPLC에 의한 분획화 결과를 보여준다. 도 15B는 각 단계 후 분획들의 환원 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 도 15C 및 D는 캡토부착 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 2 단계 방법 (방법 II)를 이용한 본 발명의 항-견 NGF 항체의 정량적 정제를 보여준다. 도 15C: 비환원 및 환원 조건하의 SDS-PAGE 분석. 레인 1은 MWS, 레인 2는 3450 시료 2 μg/mL 및 0 μl 환원제, 레인 3은 3450 시료 4 μg/mL 및 0 μl 환원제, 레인 4는 3450 시료 6 μg/mL 및 0 μl 환원제, 레인 5는 MWS, 레인 6은 3450 시료 2 μg/mL 및 3 μl 환원제, 레인 7은 3450 시료 4 μg/mL 및 3 μl 환원제, 레인 8은 3450 시료 6 μg/mL 및 3 μl 환원제 및 레인 9는 MWS이다. 도 15D: 크기 배제 크로마토그래피.
도 16은 방법 I 및 II에 의하여 정제된 항-NGF 모노클로날 항체의 비교를 나타낸다. 도 16A: 비환원 및 환원 SDS-PAGE에 의한 비교. 도 16B: 항-NGF ELISA에 의한 비교.
도 17은 항-견 NGF 항체를 개에 정맥 투여한 후 체중 (위 패널) 및 온도 (아래 패널)가 안정함을 보여준다.
도 18은 개에 정맥 주사 후 혈장의 항-견 NGF 모노클로날 항체 농도에 대한 동력학적 분석을 보여준다. 비글견에 항-NGF 항체를 2 mg/kg으로 정맥 주사하고, 혈장 시료를 표시된 시간에 채취하여 NGF ELISA에 의하여 항-NGF 모노클로날 항체를 검출하였다. 항-견 NGF 모노클로날 항체는 놀랍게도 대략 9일의 장기 소실기 (베타) 반감기 (long elimination (beta) phase half life)를 갖는다.
도 19는 항-견 NGF 모노클로날 항체가 개의 염증성 통증을 감소시킨다는 것을 보여준다. -1 일에 카올린을, 0 일에 항체 또는 비히클 대조군을 비글견의 풋패드로 주입하고 육안 점수 스케일로 다리 절음 (lameness)을 측정하였다.
발명의 상세한 설명
방대한 실험 후, 본 발명의 발명자는 래트 항-마우스 NGF 모노클로날 항체 (MAb) αD11 아미노산 서열을 얻었고 이것을 사용하여 놀랍게도 비면역원성 항-견 NGF 항체를 생산하였다. 결과물인 표준 CDR 그라프팅 방법을 이용하여 생산된 것이 아닌 비면역원성 항체는 개의 NGF에 대하여 고친화 결합을 나타냄을 보여준다. 이 항체는 개의 NGF 생물학적 기능, 가장 구체적으로는 수용체 TrkA 및 p75에 기초한 NGF의 세포로의 결합을 저해함으로써 개의 NGF 생물학적 기능을 중화시킨다. 또한, 예기치 않게도, 개에게 투여되는 경우 그에 대한 중화 항체가 생성되지 않는다는 것 역시 발견하였다. 따라서, 본 발명의 상기 견화 항체는 개의 장기적 만성 통증 완화제로 적합하다.
본 발명의 발명자에 의하여 이용된 본 발명의 항체를 위한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 생성하는 공정은, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 구조영역 내에 존재하는 특이적인 래트 (공여자) 아미노산 잔기들을, 본 발명자들의 분석에 기초하여, 그것이 비변형된 형태로 개에게 투여된다면 그 항체에 대응하여 생성되는 중화 항체를 야기할 수 있는 면역원성 에피토프의 존재를 감소시키면서 CDR 영역의 형태를 보유하므로 결합 특이성 및 결합 활성을 유지하는 잔기로 교체하게 되는 결과를 낳는다. 구체적으로, 본 발명의 항체 제조 방법은 (PETisation으로 알려짐) 개에게 투여하는 적합성에 대하여 공여자 항체의 구조영역의 서열을 개로부터 유래하는 항체 또는 항체 풀의 서열과 비교함으로써 상기 공여자 (예컨대, 래트) 항체의 구조영역의 서열을 평가하는 단계를 포함한다. 공여자 서열과 표적 서열 중 단 하나의 제공원 간에만 상기 비교가 이루어질 수 있다고 하여도, 표적 서열의 풀과의 비교가 바람직하다는 것은 자명한데, 이것은 표적 종들에 있어서 각 카바트 위치에서 자연 선택의 수가 확장될 것이기 때문이다. 이것은 공여자와 표적 간의 "매치" 확률을 증가시킬 뿐 아니라, 매치가 존재치 않는 교체에 대한 선택 역시 확장시킬 것이다. 그 결과로서, 공여자와 가능한 근접한 특징을 갖는 교체의 선택이 가능해질 것이다. 공여자 서열과 개의 서열이 임의의 카바트 번호 또는 대응하는 위치에서 상이한 경우, 공여자 서열은 문제의 아미노산 잔기가, 개에서 그 위치에 천연적으로 존재하는 것으로 알려진 아미노산 잔기로 치환되도록 변형된다.
공여자 면역글로불린 구조영역에 존재하는 아미노산 잔기의 치환이 필요한 경우, 통상적으로 이것은, 아미노산 잔기가 개의 그 카바트 위치에서 자연적으로 존재하고, 크기, 전하 및 소수성에 있어서 공여자 서열에서 치환되는 아미노산과 가능한 근접하여 관련되는 아미노산 잔기로 교체되는 보존적 치환의 원리를 이용하여 이루어진다. 그 목적은 상기 공여자 항체의 3차원 구조에 어떠한 동요 또는 혼란을 야기하지 않거나, 또는 오직 최소한의 동요 또는 혼란만을 야기하는 교체를 선택하기 위함이다. 특정 경우에 있어서는, 어떠한 명확한 선택권이 없을 것이고 각각의 선택은 유리 및 불리를 동시에 가질 것이다. 최종 결정은 3차원 모델링이나 다양한 대안 서열의 발현을 필요로 할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 명확한 선호가 있을 것이다. 이러한 방법의 결과로, 공여자 서열의 변화는 그 잔기가 표적에서 외래의 것이고 그 교체 아미노산이 대체되는 아미노산과 가능한 근접하게 관련된 경우에만 이루어진다. 따라서, 외래의 에피토프의 생성은 회피되지만, 총 3차원 구조는 보존되고 그 결과로 친화도 및 특이성 역시 보존된다.
경쇄 및 중쇄 불변영역은 통상적으로 개 (표적) 유래 항체들로부터 유래한다. 중쇄 불변 도메인은 그들이 하류 효과자 기능을 매개하지 않도록 선택되거나 변형된다. 상당히 놀랍게도, 본 발명에 따라 생성되는 항체들에 대응하여 중화 항체가 전혀 생산되지 않거나 최소한으로 생산된다는 것이 밝혀졌기 때문에, 이 항체들은 놀랍게도 장기 순환 반감기 및 반복 투여에 대한 선택권과 관련된 이점을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 구조 잔기들의 치환이 CDR 영역의 3차원 형태에 영향을 미치지 않는 방식으로 이루어지기 때문에, 원하는 표적에 대한 결합 특이성에 있어서 변화가 없을 것이다.
인간과 마우스에 있어서 4종의 주요 IgG 아이소타입이 있고, 명명법은 유사하지만 그들의 행동 및 기능, 예컨대 단백질 A 및 단백질 G와 같은 박테리아 산물에 대한 친화도, 보체 의존성 세포용해 (CDC)를 활성화시키는 그들의 능력 및 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)를 통한 표적 세포의 사멸을 유도하는 그들의 능력 등에 있어서 상이하다. CDC 및 ADCC 활성인 IgG 아이소타입 또는 "무장된 (armed)" 불변 도메인의 선택은, 예컨대 종양학 또는 염증 통제에 있어서 항체가 그들의 동족 항원을 함유하는 표적 세포를 제거하기 위하여 설계될 때 임상적 이점으로 여겨진다 (예컨대, 인간에 대한 의학적 용도에 있어서, 인간의 IgG1 아이소타입이 상기 목적으로 바람직하다). 반대로, 염증, 통증 또는 자가면역의 완화에서와 같은 다른 환경에 있어서는 면역계의 활성화가 바람직하지 않은 것으로 여겨지므로, 최소한의 CDC 및 ADCC 활성을 갖는 인간 IgG 아이소타입이 선호된다 (예컨대, 이러한 인간에 대한 의학적 용도에 있어서는 IgG4 아이소타입이 종종 선호된다). 개의 면역계에 있어서 하나의 카파 및 람다 불변 도메인 서열과 더불어 4개의 특징적인 면역글로불린 감마 (IgG) 중쇄 불변 도메인 아이소타입이 개시되었다 (US Patent No. 5,852,183, Tang L. et al. 2001. Veterinary Immunology and Immunopathology, 80. 259-270). 4개의 개 중쇄 불변 도메인 A, B, C 및 D는 그들에 의하여 매개되는 기능적 활성의 관점에서 밝혀져 있지는 않다. IgG 패밀리에 대한 전체적인 상동성에도 불구하고, 개의 IgG를 인코딩하는 단백질들은 다른 종들 유래의 패밀리 일원들에 비하여 서로에 대하여 더욱 연관되어 있으므로, 존재한다면 상기 기능들 중 어떠한 것이 개의 4개의 아이소타입 각각에 속하는지 상동성만으로 정의하는 것은 가능하지 않다.
CDC 및 ADCC 활성 불변 도메인을 갖는 IgG 아이소타입의 선택은, 예컨대 종양학 또는 염증 통제에 있어서 항체가 그들의 동족 항원을 함유하는 표적 세포를 제거하기 위하여 설계될 때 임상적 이점으로 여겨지며, 예컨대, 인간에 대한 의학적 용도에 있어서, 인간의 IgG1 아이소타입이 상기 목적으로 바람직하다. 반대로, 염증, 통증 또는 자가면역의 완화에서와 같은 다른 환경에 있어서는 면역계의 활성화가 바람직하지 않은 것으로 여겨지므로, 최소한의 또는 "비무장된 (disarmed)" CDC 및 ADCC 활성의 인간 IgG 아이소타입이 선호되며, 예컨대, 인간에 대한 의학적 용도에 있어서는 IgG4 아이소타입이 선택될 것이다.
본 발명의 항체들은 개 유래 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 또한, 상보성 결정 영역은 래트 알파D11 항-마우스 NGF 항체로부터 유래한다. 상기 αD11 항체는 Cattaneo 등에 의하여 최초로 개시되었다 [문헌 (Cattaneo A, Rapposelli B, Calissano P. (1988) "Three distinct types of monoclonal antibodies after long-term immunization of rats with mouse nerve growth factor". J Neurochem 50(4):1003-1010).] 이어서, 상기 알파D11 항체는 Ruberti 등에 의하여 클로닝되었다 (Ruberti, F. et al. (1993) "Cloning and Expression of an Anti-Nerve Growth Factor (NGF) Antibody for Studies Using the Neuroantibody Approach". Cellular and Molecular Neurobiology. 13(5):559-568).
상기 αD11 항체로부터 유래되는 CDR 영역은 본 발명의 발명자에 의하여 결정된 구조영역 서열과 조합되어, 상기 항체가 개에게 투여되는 때에 그에 대응하여 중화 항체가 생성되는 것은 막으면서 CDR 3차 구조를 보존하므로, 따라서 결합 특이성도 보존하게 된다.
각각의 경쇄 및 중쇄 가변영역은 FR1~FR4라고 일컬어지는 4개의 구조영역을 함유한다. 이들 각각의 구조영역에 대하여, 본 발명의 발명자는 각각의 특이적 위치에 대하여 양호한 아미노산 (소위 선호 잔기) 및 또한 그 위치에 제공될 수 있는 대체 아미노산 잔기를 밝혔다. 하기 표 1 내지 8은 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 4개의 구조영역들을 나타내고 있다. 표는 구체적인 구조영역의 위치에 상대적이고, 또한 온전한 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 길이를 따라 특정 잔기의 위치를 식별하는 데 사용되는 카바트 번호 시스템에 따라 아미노산 위치를 제공한다. 그룹 1으로 나타낸 잔기 또는 잔기들이 선호 잔기들이고, 그룹 2 잔기들은 대체 잔기들이다. 그러나, 구체적인 위치와 관련하여, 이들은 일반적으로 그룹 1에 나타낸 잔기들만큼 선호되지는 않는다. 한 글자 시스템을 이용하여 아미노산 잔기들이 식별된다.
표 1 - 경쇄 가변 도메인 FR1 잔기들
Figure 112013112120588-pct00001
표 2 - 경쇄 가변 도메인 FR2 잔기들
Figure 112013112120588-pct00002
표 3 - 경쇄 가변 도메인 FR3 잔기들
Figure 112013112120588-pct00003
Figure 112013112120588-pct00004
표 4 - 경쇄 가변 도메인 FR4 잔기들
Figure 112013112120588-pct00005
표 5 - 중쇄 가변 도메인 FR1 잔기들
Figure 112013112120588-pct00006
Figure 112013112120588-pct00007
표 6 - 중쇄 가변 도메인 FR2 잔기들
Figure 112013112120588-pct00008
표 7 - 중쇄 가변 도메인 FR3 잔기들
Figure 112013112120588-pct00009
Figure 112013112120588-pct00010
표 8 - 중쇄 가변 도메인 FR4 잔기들
Figure 112013112120588-pct00011
그러므로, 본 발명의 견화 항체는, 예컨대 첫번째 종으로부터 유래하는 온전한 가변영역과 두번째 종으로부터 유래하는 불변 도메인으로 이루어지는 키메라 모노클로날 항체, 또는 중쇄 및 경쇄 가변영역의 상보성 결정 영역 (CDRs)이 공여자 항체로부터 유래한 아미노산 잔기를 포함하고 표적 항체로부터 유래한 구조영역 (FR)과 불변영역 (CR)으로 도입된 CDR-그라프트 견화 항체, 또는 개의 생식세포 서열들과는 상이하다.
상기 견화 항체는 실질적으로 그 CDRs이 유래한 모체 (공여자) 항체의 결합 특성을 보유한다. 이것은 상기 견화 항체가 그 CDRs이 유래하는 공여자 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 항원-결합 친화도 및 결합 활성을 나타낼 것을 의미한다. 이상적으로는, 표적 에피토프에 대한 상기 견화 항체의 친화도는 공여자 항체의 친화도 기준 10% 미만은 아닐 것이고, 더욱 좋기로는 약 30% 미만은 아니며, 가장 좋기로는 친화도는 모체 (공여자) 항체의 50% 미만은 아닐 것이다. 항원 결합 친화도 평가 방법은 이 기술 분야에 잘 알려져 있고 하프-맥시멀 결합 분석 (half-maximal binding assays), 경쟁 분석 및 스카트차드 분석 (Scatchard analysis)을 들 수 있다.
앞서 기재한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 견화 항체로부터 유래하는 결합 일원 또는 항원 결합 단편에 이른다. 이러한 항원 결합 단편은 개의 NGF에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 결합 일원 또는 항원 결합 단편들은 단리된 결합 일원들일 수 있다. 본 발명의 결합 일원 또는 항원 결합 단편은 본 발명의 항체의 단편, 예컨대 전장 견화 항체 분자의 단편, 예컨대 오로지 중쇄 또는 경쇄, 또는 예컨대 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 결합 일원은 통상적으로 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 필수적으로 이들로 이루어질 수 있다. 결합 일원의 VH 도메인은 또한 본 발명의 일부로서 제공된다. 각각의 VH 및 VL 도메인 내에는, 3개의 상보성 결정 영역 ("CDRs")과 더불어 4개의 연관 구조영역 ("FRs")이 존재한다. VH 도메인은 통상적으로 3개의 HCDRs (중쇄 상보성 결정 영역)을 포함하고, VL 도메인은 통상적으로 3개의 LCDRs (경쇄 상보성 결정 영역)을 포함한다. 따라서, 결합 일원은, 서열상으로 VH CDR1 (또는 HCDR1), CDR2 (HCDR2) 및 CDR3 (HCDR3) 영역과 더불어 수 개의 관련 구조영역을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 추가로, 또는 선택적으로 결합 일원은 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과 더불어 관련 구조영역을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 상기 VH 또는 VL 도메인은 통상적으로 4개의 구조영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바, "구조영역" 또는 "구조 서열"이라는 용어는 가변영역에서 CDRs을 빼고 남은 서열을 말한다. CDR 서열에 대한 정확한 정의는 여러 가지 시스템 (카바트, 쇼시아 (Chothia) 등)으로 결정될 수 있기 때문에, 구조영역의 의미도 그에 따라서 여러 가지 해석이 가능하다. 6개의 CDRs (경쇄의 VL-CDR1, CDR2 및 CDR3 및 중쇄의 VH-CDR1, CDR2 및 CDR3)은 상기 경쇄 및 중쇄상의 구조영역을 각 쇄 상에서 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 알려진 4개의 하위-영역으로 나눈다.
도 6은 본 발명에 따른 항-NGF 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄로 나타내었다. 이와 같이, 그리고 도 6에 나타낸 바와 같이, VL-CDR1은 FR1과 FR2 구조영역 사이에 위치하고, VL-CDR2은 FR2와 FR3 구조영역 사이에 위치하며, VL-CDR3은 FR3과 FR4 구조영역 사이에 위치한다. 도 7은 본 발명에 따른 항-NGF 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄로 나타내었다. 도 6에서 경쇄 가변영역으로서 나타낸 바와 같이, VH-CDR1은 FR1과 FR2 구조영역 사이에 위치하고, VH-CDR2은 FR2와 FR3 구조영역 사이에 위치하며, VH-CDR3은 FR3과 FR4 구조영역 사이에 위치한다.
도 6 및 도 7에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 (도 6) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 (도 7)은 관용적으로 카바트 등에 의하여 고안된 번호 시스템에 따라 번호 매져진다 (Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391). 카바트 번호 시스템은 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 또는 그들의 항원 결합 부분에서 다른 아미노산 잔기들보다 더욱 가변적인 (즉, 초가변적) 아미노산 잔기들을 번호 매기는 시스템을 말한다. 그러므로, 카바트 번호 시스템은 일반적으로 가변 도메인의 잔기 (대략 경쇄의 1~104 잔기 및 중쇄의 1~113)를 일컬을 때 사용된다. 이 번호 시스템은, 언급되는 경우 본 명세서에서도 사용될 수 있다. 카바트 잔기 지정은 본 발명에 나열되는 관련 서열들로 제공되는 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 잔기의 선형 번호와 항상 직접적으로 대응되는 것은 아니다. 특히, 실제의 선형 아미노산 서열은, 중쇄 또는 경쇄의 기본적인 가변 도메인 구조의 구조영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)이 될지 아닐지, 구조적 요소의 단축 또는 그 요소로의 삽입에 대응하는 엄격한 카바트 번호에 비하여 아미노산을 덜 또는 더 함유할 수 있다. 주어진 임의의 항체에 대한 잔기들의 정확한 카바트 번호는, 카바트 번호가 적용된 표준 서열과 상기 항체의 서열상 잔기들을 정렬시킴으로써 결정될 수 있다.
또한, 도 7은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 보여준다. 또한 이것은 SEQ ID NO:2로 나타내었다. 그러나, 도 7에서, 번호는 아미노산 잔기 80, 80A, 80B, 및 80C로 감안되나, SEQ ID NO:2에서 상기 번호는 순차적으로 80, 81, 82 및 83으로 계속된다. 도 7에서 카바트 잔기 100, 100A, 100B, 100C, 100D, 100E 및 100F에 대하여도 마찬가지이다.
앞서 설명한 바와 같이, 항체 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편 및 scFv (단쇄 가변 단편)을 포함하는 군으로부터, 또는 펩티도미메틱 (peptidomimetic), 2가 항체 절편 (diabody), 또는 관련 다가 유도체들로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에 있어서, 상기 항체 결합 단편은 Fab, 또는 F(ab')2 단편이고, 이는 항체의 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 VL 도메인은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH 도메인은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 상기 CL 및 CH1 도메인은 개의 면역글로불린의 CL 및 CH1 도메인의 아미노산 서열에 기반한다.
Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편의 재조합 생산에 사용되는 방법은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, PCT 국제특허공보 WO 92/22324에 기재된 것, 및 Sawai 등의 문헌 ["Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNA Expression Vectors", 1995, AJRI 34:26-34]에 기재된 것들을 포함한다. scFv (단일 사슬 Fv 단편)를 생산하는데 사용될 수 있는 방법의 예시는 Huston 등의 문헌 ["Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins", Methods in Enzymology, vol. 203:46-88 (1991)]에 기재되어 있고, 그 내용은 참조로서 본 발명에 포함된다.
특정 구현예에 있어서, 항체 단편은 모리모토 방법에 따른 단백질 분해에 의하여 전장 항체로부터 유래될 수 있다 (Morimoto et al., "Single-step purification of F(ab')2 fragments of mouse monoclonal antibodies (immunoglobulins G1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW" Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)). 또한, 항체 단편은 숙주 세포로부터 직접 생산될 수 있다 (Carter et al., "High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment" Bio/Technology 10:163-167 (1992)).
개의 NGF에 결합 특이성을 갖고 개의 NGF 기능에 대하여 길항 작용을 하는 견화 모노클로날 항체를 제공하는 것 외에도, 본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3으로 정의되는 VL (경쇄 가변) 영역 및 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4로 정의되는 VH (중쇄 가변) 영역의 아미노산 서열에 기반하는 한 쌍의 결합 도메인을 포함하는 항체들 이외의 결합 일원에까지도 이른다. 특히, 본 발명은 본 발명 항체들의 견화 항체의 VL 또는 VH 영역 중 어느 하나에 기반하는 단일 결합 도메인에 이른다.
따라서, 본 발명의 또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 인간화 항체로부터 유래하는 단일 결합 도메인을 포함하거나, 그것으로 이루어지거나 또는 필수적으로 그것으로 이루어지는 결합 일원이 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 단일 결합 도메인은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4로 정의되는 VH (중쇄 가변 도메인)의 아미노산 서열로부터 유래한다. 이러한 결합 도메인은 개의 NGF에 대한 표적 제제로서 사용될 수 있다.
특정 구현예에 있어서, 본 발명의 항체를 변형시키기 위하여 추가적인 조작 방법이 사용될 수 있는데, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원 의존성 세포 독성을 변화시킬 수 있는 Fc 영역의 변형 등에 의할 수 있다. 또한, 특정 구현예에 있어서, 글리코실화 패턴을 변화시킨 항체 또는 항체 단편이 생산될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 항체는 그 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변화된다. 폴리펩타이드의 글리코실화는 통상적으로 N-결합 또는 O-결합된다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인데, 아스파라긴 측쇄에의 탄수화물 모이어티 효소적 부착의 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내에 이들 트리펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 형성한다. O-결합 글리코실화는 당류 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로오스 중 하나의 하이드록시아미노산에의 부착을 의미하는데, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신 역시 사용될 수 있지만 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌에의 부착을 의미한다. 본 발명의 발명자는 비글리코실화된 개의 불변 도메인을 제공하는데, 이들은 본 발명에서 SEQ ID NO:15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 및 22로 정의된다.
또 하나의 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 항-견 NGF 항체들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 유도체와 항체를 반응시킴으로써 PEG화될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 탈퓨코오스화되어, 그러므로 퓨코오스 잔기가 없다.
특정 구현예에 있어서, 항체의 생물학적 특성의 변형은 (a) 치환되는 구역의 폴리펩타이드 백본의 구조, 예컨대 시트 또는 나선형 형태와 같은 구조에 영향을 미치거나, (b) 표적 위치에서 그 분자의 전하 또는 소수성에 영향을 미치거나, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 아미노산들은 그들의 측쇄 성질의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) 비극성: Ala (A), VaI (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비전하 극성: GIy (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), GIu (E); (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H). 또는, 자연적으로 존재하는 잔기들은 일반적인 측쇄 성질에 근거하여 그룹으로 나뉠 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, VaI, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, GIn; (3) 산성: Asp, GIu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기들: GIy, Pro; (6) 방향성: Trp, Tyr, Phe. 비보존적 치환은 이들 부류들 중 하나의 어떤 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환 잔기들은 보존적 치환 위치 또는 나머지 (예컨대, 비보존되는) 위치로도 도입될 수 있다.
다양한 다른 관점에 있어서, 본 발명은, 파트너 분자와 연결된 본 발명의 항-견 NGF 항체 또는 그들의 항원 결합 부분을 포함하는 면역컨쥬게이트에 이른다. 특정 구현예에 있어서, 이러한 항체-파트너 분자 컨쥬게이트는 화학적 링커, 예컨대 펩티딜 링커, 하이드라진 링커 또는 이황화 링커의 수단으로 컨쥬게이션된다. 특정 구현예에 있어서, 커플링 파트너는 효과자 분자, 표지, 약물 또는 캐리어 분자이다. 본 발명의 항체들을 펩티딜 및 비펩티딜 커플링 파트너들과 커플링시키기 위한 적절함 방법들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있을 것이다. 적절한 표지의 예시로는 검출가능한 표지, 예컨대 방사능표지, 또는 효소적 표지, 예컨대 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제, 또는 화학적 모이어티, 예컨대 비오틴을 들 수 있다. 또는, 상기 표지는 기능적 표지, 예컨대, 라이신 (ricin) 또는 항체 결합 부위에서 전구약물이 활성 약물로 변환될 수 있는 전구약물일 수 있다.
다양한 다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 견화 항체, 항체 단편들 및 결합 일원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 특히 단리된 폴리뉴클레오티드에 이른다. 본 발명에 정의된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"는 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 포함하며, 이는 비변형 RNA 또는 DNA, 또는 변형 RNA 또는 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA를 제한없이 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그들의 대립형질 변이체 및/또는 중간 정도 또는 높은 스트린젠시 조건하에서 이러한 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 등 그들의 상보물 (complements)을 포함한다.
또한, 본 발명은 항체 모방체 (antibody mimetics)에까지 이르는데, 예컨대 본 발명의 개 NGF 항체에 기반한 도메인 항체, 나노바디, 유니바디, 베르사바디 및 듀오칼린 (duocalins) 등이다. 매우 다양한 항체 모방체 기술이 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 예컨대, 소위 도메인 항체 (Domantis, UK)는 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄 둘 중 하나의 가변영역에 해당하는, 항체의 기능성 결합 소유닛이다. 이러한 도메인 항체의 생산에 관한 설명은 미국 특허 제6,291,158호, 미국 특허 제6,582,915호 및 미국 특허 제6,593,081호에서 찾을 수 있다. 나노바디는 카멜리드 (camelids)에서 발견되는 자연적으로 존재하는 중쇄 항체의 고유 구조적 기능적 특성을 함유하는 항체 유래 치료 단백질이다. 유니바디는 IgG4 항체의 힌지 영역을 제외하는 것에 기반하는 또 하나의 항체 단편 기술이다. 힌지 영역의 결실은 대략 전통적인 IgG4 항체의 절반 크기이며 1가의 결합 영역을 갖는 분자를 야기한다. 유니바디는 비활성인 IgG4 항체의 특성을 보존하고 있으므로, 면역 반응을 유도하지 않는다.
또 다른 결합 분자로는 애피바디 (affibody) 분자 (미국 특허 제5,831,012호), 다르핀 (DARPins, 안키린 반복 설계된 단백질)(PCT 국제공개공보 WO 02/20565) 및 안티칼린 (anticalins)(미국 특허 제7,250,297호 및 WO 99/16873)을 들 수 있다. 베르사바디 역시 항체 모방체 기술이다. 베르사바디 (Amunix, 미국 공개공보 2007/0191272)는 마이크로단백질이라고 불리며, 시스테인 잔기가 15%를 초과하는 3~5 kDa의 작은 단백질로, 단백질이 통상적으로 나타내는 소수성 코어를 대신하는 이황화 결합의 밀도가 높은 스캐폴드를 형성한다.
아비머 (avimers)는 또 다른 유형의 항체 모방체이다. 아비머는 인간의 혈청 단백질 패밀리의 재조합에서 기원한다. 이들은 모듈 결합 도메인으로 구성된 단일 단백질 사슬로서, 각각의 모듈 결합 도메인은 특정 표적 위치에 결합하도록 설계된다. 아비머는 하나의 단백질 표적 상의 위치 및/또는 다수의 단백질 표적 상의 위치에 동시에 결합할 수 있다. 다지점 부착 또는 결합 활성으로 알려진, 이러한 결합 메커니즘은 세포와 분자가 체내에서 상호작용하는 방식을 모방하고, 길항제 및 작용제의 생성을 뒷받침하며, 그 결과 다수의 기능과 강력한 활성을 갖는 약물이라는 결과를 낳는다. 아비머 라이브러리는 본 발명에 참조로서 포함된 WO 2004/044011 및, 예컨대 US 2005/0053973에 따라 생성될 수 있다. 아비머 라이브러리는 Avidia Inc, Mountain View, California, USA로부터도 시판, 구득이 가능하다.
항체 생산
본 발명의 항체 및 결합 일원은 전적으로 또는 부분적으로 화학적 합성에 의하여 생산될 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 및 결합 일원들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법들, 예컨대 표준 액체 펩타이드 합성 또는 고상 펩타이드 합성 방법에 의하여 제조될 수 있다. 또는, 상기 항체 및 결합 일원들은 액상 펩타이드 합성 기법을 이용하여 용액 중에서 제조되거나, 또는 고상, 액상 및 용액 화학의 조합에 의하여 제조될 수도 있다.
또한, 본 발명은 적절한 발현 시스템으로 본 발명의 항체인 하나 이상의 아미노산을 인코딩하는 핵산 발현에 의하여, 그로써 목적하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 인코딩될 수 있는 본 발명의 항체 또는 결합 일원들의 생산에까지 이른다. 예컨대, 아미노산 경쇄를 인코딩하는 핵산 및 아미노산 중쇄를 인코딩하는 제2 핵산은 발현되어 본 발명의 항체를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 특정 관점에 있어서, 본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 형성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산이 제공된다.
통상적으로, 본 발명의 항체 또는 결합 일원을 형성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산은 단리되거나 정제된 형태로 제공되거나, 또는 하나 이상의 조절 서열을 제외하고는 자연적으로 그와 관련되어 있을 수 있는 물질을 실질적으로 포함하지 않는 형태로 제공된다. 본 발명의 항체 또는 결합 일원을 발현하는 핵산은 전적으로 또는 부분적으로 합성된 것일 수 있고, DNA, cDNA 및 RNA를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 핵산 서열은, 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 기법들, 예컨대 문헌 [Sambrook et al. "Molecular Cloning", A laboratory manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001 (ISBN-0879695773)], 및 문헌 [Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4th Edition, 1999 (ISBN - 0471250929)]에 기술된 기법들을 이용하여 숙련자에 의하여 쉽게 제조될 수 있다. 상기 기법들은 (i) 핵산 시료를 증폭하기 위한 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 이용, (ii) 화학적 합성, 또는 (iii) cDNA 서열의 제조 등을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 DNA는, 예컨대 DNA 인코딩시키고, 발현될 부분 양 옆의 적절한 제한 효소 인식 부위를 동정하고, DNA로부터 상기 부분을 잘라내는 등 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 임의의 적절한 방식으로 생성 및 사용될 수 있다. 잘려진 부분은 그 후 적절한 프로모터와 작동적으로 연결, 적절한 발현 시스템, 예컨대 시판 발현 시스템으로 발현될 수 있다. 또는, 관련 DNA 부분은 적절한 PCR 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다. DNA 서열에 대한 변형은 위치 지정 돌연변이법 (site directed mutagenesis)을 이용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 핵산 서열은 전술한 핵산 하나 이상을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태로 컨스트럭트로서 제공될 수 있다. 상기 컨스트럭트는 상기 컨스트럭트를 하나 이상 포함하는 재조합 숙주 세포 내에 포함될 수 있다. 편리하게는, 발현은 적당한 조건하에서, 적절한 핵산 서열을 함유한 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 발현 이후, 항체 또는 항체 단편들은 임의의 적절한 기법을 이용하여 단리 및/또는 정제된 후, 적절히 사용될 수 있다.
여러 다양한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 클로닝 및 발현하기 위한 시스템이 잘 알려져 있다. 적절한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 효모, 곤충 및 배큘로바이러스 시스템을 들 수 있다. 이 기술 분야에서 이형접합 폴리펩타이드의 발현을 위하여 이용가능한 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 NS0 마우스 골수종 세포를 들 수 있다. 흔한, 양호한 박테리아 숙주는 이. 콜라이 (E. coli)이다. 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 이 기술 분야에 잘 구축되어 있다. 진핵 세포에서의 배양 발현 역시 결합 일원 생산의 한 가지 선택지로서 이 기술 분야의 숙련자에게 이용 가능하다.
예컨대, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497]; 미국특허 제4,376,110호; 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor]에 기재된 방법들로 항체를 생산하는 일반적인 기술들이 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 상기 참고 문헌들과, 예컨대 유럽특허 제0,368,684호에는 재조합 항체 분자들의 제조 기술이 기술되어 있다.
본 발명의 특정 구현예에 있어서, 항체 또는 결합 일원들의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 삽입체 (insert)를 포함하는 재조합 핵산이 사용된다. 정의에 의하면, 이러한 핵산은 인코딩 단일 가닥 핵산, 상기 코딩 핵산과 그에 상보적인 핵산으로 이루어지는 이중 가닥 핵산, 또는 이들 상보적 (단일 가닥) 핵산 그들 자체를 포함한다.
또한, 항체들의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 자연적으로 존재하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 진정 서열 또는 그들의 돌연변이를 갖는 효소적으로 합성되거나 화학적으로 합성된 핵산일 수 있다.
본 발명의 항체는 직접적인 방법이 아닌, 재조합 방법에 의하여 이형접합 폴리펩타이드를 갖는 융합 폴리펩타이드로로서 생산될 수 있는데, 이형접합 폴리펩타이드는 좋기로는 신호 서열 또는 성숙된 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드이다. 선택되는 이형접합 신호 서열은 좋기로는 숙주 세포에 의하여 인식되고 가공되는 (즉, 신호 펩티다아제에 의한 분해) 것이다. 본래의 항체 신호 서열을 인식 및 가공하지 못하는 원핵 숙주 세포에 대하여는, 상기 신호 서열은 예컨대 알칼리 인산가수분해효소, 페니실리나아제, lpp 또는 열-안정 엔테로톡신 II 리더로 이루어지는 군으로부터 선택되는 원핵 세포 신호 서열에 의하여 치환된다.
본 발명의 견화 항체, 또는 그들로부터 유래되는 결합 일원 또는 이들을 인코딩하는 폴리펩타이드에 관하여 사용되는 경우 "단리된"이라는 용어는 그 상태에서 상기 항체 , 결합 일원들 또는 핵산 (폴리뉴클레오티드)이 단리되 및/또는 정제된 형태로 제공되는 상태를 말하고, 즉 그들이 그들의 자연적 조건으로부터 분리, 단리 또는 정제되었고 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로 제공되거나, 또는 핵산의 경우, 필요로 되는 기능을 가진 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 제외한 제공원의 핵산 또는 유전자가 없는 또는 실질적으로 없는 핵산을 말한다. 따라서, 이러한 단리된 항체, 결합 일원 및 단리된 핵산은 그들이 자연적으로 관련되어 있는 물질, 예컨대 그들의 자연 조건에서, 또는 그 제조가 시험관 내 또는 생체 내에서 실시되는 재조합 DNA 기술인 경우 그들이 제조되는 조건 (예컨대, 세포 배양)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않을 것이다.
항체, 결합 일원 및 핵산은 희석제 또는 아쥬반트와 함께 제제화될 수 있고, 또한, 실시 목적을 위하여 단리된 형태로 제공되는 것으로 고려될 수 있다. 예컨대, 상기 항체 및 결합 일원들은 면역분석에 사용하기 위한 마이크로타이터 플레이트를 피폭하는 데 사용된다면 젤라틴 또는 기타 캐리어와 함께 혼합되거나, 진단 또는 치료요법에 사용되는 경우 약학적으로 허용가능한 캐리어나 희석제와 함께 혼합될 것이다. 상기 항체 또는 결합 일원들은 자연적으로 또는 이형접합 진핵 세포 시스템 (예컨대, CHO 또는 NSO 세포)에 의하여 글리코실화될 수 있고, 또는 이들은 (예컨대, 원핵 세포에서 발현에 의하여 생산된다면) 비글리코실화될 수 있다.
항-견 NGF 견화 항체 분자를 포함하는 이종혼합 (heterogeneous) 제제 역시 본 발명의 일부를 형성한다. 예컨대, 이러한 제제는 전장 중쇄 및 C-말단 리신을 결여하는 중쇄를 갖는, 다양한 정도로 글리코실화 및/또는 유도 아미노산을 갖는, 예컨대 N-말단 글루탐산의 고리화로 피로글루탐산 잔기를 형성한, 항체들의 혼합물일 수 있다.
항체의 정제
견 항-NGF MAbs 아이소타입 A,B, C 및 D는 대등하다. 이들 아이소타입이 원하는 바 보체에의 결합을 결여하기 때문에 견 IgG 아이소타입 A 및 D가 본 발명의 용도에 양호할 수 있다. 그러나, 이들 아이소타입은 스태필로코쿠스 단백질 A (Staphylococcus Protein A) 또는 스트렙토코칼 단백질 G (Streptococcal Protein G)에 결합하지 않으므로, 이들 일반적인 수단을 이용하여 정제될 수 없다. 본 발명의 발명자들은 아이소타입 A 및/또는 D를 정제하는 데 사용될 수 있는 대안이 될 2가지 방법을 밝혔다. 첫번째 방법은 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합을 포함한다. 두번째 방법은 캡토부착 친화 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피의 조합을 포함한다.
약학적 조성물
통상적으로 본 발명의 약학적 조성물은 액체 제형, 동결건조 제형, 액체로 재구성되는 동결건조 제형, 또는 에어로졸 제형으로 제형화된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 제형의 항체는: 약 0.5 mg/ml 내지 약 250 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 45 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 약 100 mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 또는 약 50 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 농도이다.
특정 구현예에 있어서, 상기 제형은 또한 완충액을 포함한다. 통상적으로 상기 제형의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 완충액은 약 4 mM 내지 약 60 mM 히스티딘 완충액, 약 5 mM 내지 약 25 mM 숙시네이트 완충액, 또는 약 5 mM 내지 25 mM 아세테이트 완충액을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 완충액은 약 10mM 내지 300mM 농도의, 통상적으로 약 125mM 농도의 염화나트륨을 포함하고, 약 5mM 내지 50mM 농도의, 통상적으로 25mM 농도의 시트르산나트륨을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 제형은 단지 0% 초과 약 0.2%의 농도의 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-85, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트-20이고, 약 125 mM 농도의 염화나트륨과 약 25 mM 농도의 시트르산나트륨을 더 포함할 수 있다.
투여
본 발명의 항체 또는 결합 일원은 단독으로 투여될 수 있으나, 목적하는 투여 경로에 따라 선택되는 약학적으로 허용가능한 적절한 첨가제, 희석제 또는 캐리어를 일반적으로 포함할 약학적 조성물로서 투여되는 것이 좋을 것이다. 적절한 약학적 캐리어의 예시로는; 물, 글리세롤, 에탄올 등등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 결합 일원은 임의의 적절한 경로를 통하여 치료를 필요로 하는 개 환자에게 투여될 수 있다. 통상적으로, 상기 조성물은 주사 또는 투입에 의하여 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 양호한 경로의 예시로는 정맥 내, 심장 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 공동 내, 피하, 점막, 흡입 또는 경피 투여를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로는 또한, 국소적 투여 및 장 투여를 포함할 수 있으며, 예컨대 점막 (폐 포함), 구강, 비강, 직장 투여를 포함할 수 있다.
상기 조성물이 주사가능한 조성물, 예컨대 정맥 내, 피내 또는 피하 적용과 같은 주사가능한 조성물인 경우 구현예에 있어서, 활성 성분은 피로겐-무함유이고 적절한 pH, 등장도 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 이 기술 분야의 관련 기술들은, 예컨대 등장 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, Ringer 주사 또는 젖산화 Ringer 주사 등 적절한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요하다면 보존제, 안정화제, 완충액, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 마이크로스피어, 리포좀, 기타 마이크로입자 전달 시스템 또는 혈액 등 특정 조직에 위치하는 지연 방출 제제를 통하여 투여될 수 있다.
전술된 이 기술들 및 프로토콜 및 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 기술들과 프로토콜의 예시는 그 전체가 본 발명에 참조로서 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins]; [20th edition ISBN 0-912734-04-3 and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems]; [Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 항체 및 조성물은 통상적으로 대상체에게 "치료적 유효량"으로 투여되는데, 이것은 그 조성물이 투여되는 대상체에게 유익함을 보여주는 충분량이다. 실제 투여량, 및 투여 속도 및 시간 코스는 치료될 질병의 성질 및 중증도, 및 치료 대상체의 연령, 성별 및 체중, 및 투여 경로에 의존적일 것이고, 이를 당연히 참조하여 결정될 수 있다. 또한, 예컨대 제제 중 항체 또는 결합 일원의 결합 활성 및 생체 내 혈장 수명, 농도 및 전달 경로, 위치 및 전달 속도 등 조성물의 성질도 당연한 고려의 대상이어야 한다.
투여 방법 (dosage regimen)은 본 발명의 항체 또는 조성물의 1회 투여, 또는 상기 항체 또는 조성물의 다회 투여를 포함할 수 있다. 또한, 항체 또는 항체 함유 조성물은, 본 발명의 항체 또는 결합 일원이 치료를 위하여 투여되는 질병의 치료에 사용되는 다른 치료제 및 의약과 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
대상체에게 투여될 수 있는 투여 방법의 예시로는 1 μg/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 10 μg/kg/일 내지 1 mg/kg/일을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 구현예에 있어서, 상기 투여량은 항체의 혈장 농도 1 μg/ml 내지 100 μg/ml이 얻어지는 것이다. 그러나, 투여되는 조성물의 실제 투여량 및 투여 속도 및 시간 코스는 치료되는 질병의 성질 및 중증도에 달려있을 것이다. 치료에 대한 처방, 예컨대 투여량 등에 대한 결정은 궁극적으로 수의학 종사자 및 기타 수의사들의 책임 및 재량 범위이고, 통상적으로 치료 대상인 질환, 개별적인 환자의 질병, 전달 부위, 투여 방법 및 종사자들에게 알려진 다른 인자들을 고려한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학 용어는 본 발명의 기술 분야의 숙련자에 의하여 통상 이해되는 의미를 갖는다. 이 용어들의 의미 및 범위는 명확하여야 하나, 모호한 경우, 본 발명에서 제공되는 정의가 사전적 또는 외적 정의에 우선한다.
명세서 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다 (comprise)" 또는 "포함하다 (include)" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 서술된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하지만 기타 임의의 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "하나 (a, an)" 및 "그 (the)"와 같은 용어는 문맥상 명확히 달리 요구되지 않는 한 단수 및 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예컨대 "활성 제제" 또는 "약학적으로 활성인 제제"라는 언급은 단일한 활성 제제 뿐 아니라 2 이상의 상이한 활성 제제의 조합을 포함하고, "캐리어"라는 언급은 2 이상의 캐리어의 혼합물 뿐 아니라 단일한 캐리어 등등을 포함한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다.
본 발명에서 정의되는 바, "통증"이라는 용어는 실질적이거나 잠재적인 조직 손상과 관련된, 또는 이러한 손상의 관점에서 설명되는 불쾌한 감각 및 감정적 경험을 의미한다.
수술 통증 또는 수술 후 통증과 관련하여, 미국 동물 복지법 (Animal Welfare Act 2002. AWA regulations, CFR, Title 9 (Animals and Animal Products), Chapter 1 (Animal and Plant Health Inspection Service, Department of Agriculture), Subchapter A (Animal Welfare), Parts 1-4)는 통증 과정을 그 과정이 가해지는 인간에게서 약간 이상의 또는 순간적인 통증 또는 고통, 즉, 주사 또는 기타 사소한 과정에 의하여 야기되는 것 이상의 고통을 야기할 것으로 합리적으로 예상되는 임의의 과정으로 정의한다. 그러므로, 개가 통증이 있는 외과 수술을 겪는 경우라면, 그 동물은 수술 후 진통제를 받아야 한다.
또 다른 예에 있어서, 의학적 질병, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절염, 염증 또는 암 또는 악성 질환과 관련된 결과로 개는 심각한 또는 만성 통증을 경험할 수 있다.
"통각"이라는 용어는 유해 자극의 인식을 말한다. 본 발명에서 정의되는 바 "신경병증성 통증" (또한 '신경통'으로 알려짐)은 신경의 신호 문제로부터 발생하는 통증이다. 이것은 체성 감각 시스템에 영향을 미치는 장애 또는 질환의 결과로서 발생할 수 있다. 신경병증성 통증에는 원인이 있고, 이는 자연 발생적인 소위 감각장애 (dysesthesia)인 비정상적 감각과 관련된 것일 수 있다. 또는, 일반적으로는 통증을 야기하지 않을 터치 또는 자극으로 통증이 오거나 통증이 악화되는 경우 결과되는 이질통증과 연관된 것일 수 있다. 예컨대, 당신이 삼차 신경통이 있다면 얼굴에 약간의 터치가 통증을 촉발시키고, 또는 당신이 당뇨성 신경병증을 갖는다면 침구의 압력이 통증을 촉발할 수 있다. 또한, 그 통증이 평소 통증을 야기하지 않을 터치 또는 자극으로 생기거나 악화되는 경우에는 신경병증 통증은 이질통증의 결과일 수 있다. 예컨대, 대상체가 삼차 신경통을 갖는다면 얼굴에의 약한 터치는 통증을 촉발시킬 수 있다. 통각 과민과 관련된 신경병증 통증은 통상 단지 약한 불편함만을 야기하는 자극 또는 터치로부터 심한 통증이 느껴진다는 것을 의미하고, 감각이상은, 예컨대 핀 및 바늘 등 통증을 야기하는 부위와 아무런 접촉이 없는 경우에도 불편하고 통증이 있는 느낌이 발생하는 것을 의미한다. 신경병증 통증의 다른 형태로는 소양증 또는 가려움을 포함하고, 이는 피부의 알레르기 반응 또는 염증 반응 및 조직 손상 및 복구 과정의 결과인 염증 통증과 관련될 수 있다.
본 발명에서 정의되는 바, "NGF 중화 항체" 또는 그 유사 용어는 NGF의 생물학적 활성화 및 신호를 중화시킬 수 있는 항체를 말한다. 길항 항체, 또는 블로킹 항체라고도 말할 수 있는 중화 항체는 특이적으로, 및 좋기로는 선택적으로 NGF에 결합하고 NGF의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 예컨대, 상기 중화 항체는 NGF의 그 표적 리간드, 예컨대 세포막에 결합된 TrkA또는 p75 수용체 등으로의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바, "생물학적 활성"이라는 용어는 (생체 내에서 자연적으로 존재하는 것으로 발견되는, 또는 재조합 수단에 의하여 가능케 되거나 제공되는) 분자의 내재적 생물학적 성질 중 임의의 하나 이상의 것을 말한다. 생물학적 성질은 수용체 결합 및/또는 활성화; 세포 신호전달 또는 세포 증식의 유도, 세포 생장 억제, 사이토카인 생산 유도, 세포 사멸 유도, 및 효소 활성 유도 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 바 "상보성 결정 영역 (CDR)"이라는 용어는, 카바트 등에 의하여 기술된 (Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242), 본래 면역글로불린 결합 위치의 자연적 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 말한다. 본 발명에서 사용되는 바 "구조영역 (FR)"이라는 용어는 CDRs 사이에 자리하는 아미노산 서열을 말한다. 항체 중 이들 부분은 CDRs을 적당한 배향으로 잡아주는 역할을 한다 (CDRs로 하여금 항원과 결합할 수 있도록 함).
본 발명에서 사용되는 바 "불변영역 (CR)"이라는 용어는 효과자 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 말한다. 본 발명에서, 불변영역은 통상적으로 개의 불변영역을 의미, 즉, 대상 견화 항체의 불변영역이 개의 면역글로불린으로부터 유래한다는 것을 의미한다. 중쇄 불변영역은 4개의 아이소타입: A, B, C 또는 D 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바 "키메라 항체"라는 용어는 통상적으로 서로 다른 종의 것인 2개의 서로 다른 항체로부터 유래하는 서열을 함유하는 항체를 의미한다. 가장 통상적인 키메라 항체는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 공여자로부터 유래하는 가변 도메인과, 상기 항체가 투여될 표적 종으로부터 얻어지는 항체로부터 유래하는 불변 도메인을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바 "면역원성"이라는 용어는 수용자에게 투여되는 경우 면역 반응 (체액성 또는 세포성 반응)을 이끌어내는 표적 단백질 또는 치료 모이어터 능력의 척도를 말한다. 본 발명은 대상 견화 항체의 면역원성에 관한 것이다. 본 발명의 상기 항체는 좋기로는 어떠한 면역원성도 없는데, 즉, 개에게 투여되었을 때 그들에 대항하여 어떠한 중화 항체도 발생되지 않고, 또한 그 항체의 Fc 영역에 의하여 매개되는 어떠한 효과자 기능도 없다는 것이다.
본 발명에서 사용되는 바 "상동성" 또는 "서열 상동성"이라는 용어는 정렬된 서열 중 임의의 특정 아미노산 잔기 위치에 있어서 상기 정렬된 서열간 아미노산 잔기가 동일하다는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 바 "유사성" 또는 "서열 유사성"이라는 용어는 정렬된 서열 중 임의의 특정 위치에서, 상기 서열간 아미노산 잔기가 유사한 유형의 것이라는 것을 나타낸다. 예컨대, 류신은 이소류신 또는 발린 잔기를 치환할 수 있다. 이것을 보존적 치환이라고 부를 수 있다. 좋기로는, 본 발명의 아미노산 서열이, 그에 함유된 임의의 아미노산 잔기가 보존적 치환 방식으로 변형되었을 때, 이러한 변화는 비변형 항체와 비교하는 경우 결과되는 항체의 결합 특이성 또는 기능적 활성에 어떠한 효과도 미치지 않는다.
본 발명의 (본래) 폴리펩타이드 및 그 기능적 유도체와 관련한 서열 상동성은 서열들을 정렬하고 갭을 도입한 후 대응하는 본래 폴리펩타이드의 잔기와 동일한, 필요하다면 최대의 상동성 백분율을 얻기 위하여 상기 서열 상동성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않는, 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율에 관한 것이다. N- 또는 C- 말단 연장이나 삽입 어떠한 것도 서열 상동성 (identity or homology)을 저감시키는 것으로 해석되지는 않을 것이다. 2 이상의 아미노산 서열 정렬을 수행하고 그들의 서열 상동성을 결정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예컨대 2 이상의 아미노산 서열의 상동성 또는 유사성 백분율은, 예컨대 BLAST (Altschul et al. 1990), FASTA (Pearson & Lipman 1988), 또는 Smith-Waterman 알고리즘 (Smith & Waterman 1981)을 이용하여 쉽게 계산될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바 제2 아미노산 잔기에 대하여 "가장 높은 상동성"을 갖는 아미노산 잔기는 제2 아미노산 잔기와 가장 공통되는 특징 또는 성질을 갖는 아미노산 잔기를 말한다. 아미노산 잔기가 제2 아미노산 잔기에 대하여 가장 높은 상동성을 갖는지를 결정하는 데 있어서, 평가는 통상적으로 전하, 극성, 소수성, 측쇄 질량 및 측쇄의 크기 등의 인자로 이루어질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 바 "대응하는 위치"라는 용어는 두 서열이 두 서열간 최대 서열 상동성을 갖도록 정렬될 때 제1 서열 중의 위치와 동일한 위치의 제 2 서열 중의 위치를 말하는 것으로 의도되는, 제1 서열 중의 특정 아미노산 잔기에 대응하는 위치의 제2 서열 중에 존재하는 아미노산 잔기를 말한다. 대응하는 위치의 아미노산 잔기들은 동일한 카바트 번호를 갖는다.
본 발명에서 사용되는 "필수적으로 ~로 이루어지다" 또는 "필수적으로 ~로 이루어지는"이라는 용어는 추가적인 특징 또는 요소가 개의 NGF에 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는다면, 폴리펩타이드가 기술된 것을 넘어선 이러한 추가적인 특징 또는 요소를 가질 수 있음을 의미한다. 즉, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 상기 항체 또는 항체 단편은 개의 NGF에 결합하고 개의 NGF 기능 활성에 길항 작용을 하는 항체 또는 항체 단편들의 능력을 간섭하지 않는 추가적인 특징 또는 요소를 가질 수 있다. 이러한 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위하여 아미노산 서열로 도입될 수 있다. 예컨대, 필수적으로 특정된 서열로 이루어지는 폴리펩타이드는 그 아미노산들이 개의 NGF에 대한 결합 및 그 생물학적 기능을 봉쇄하는 데 있어 상기 항체 또는 단편의 역할을 간섭, 억제, 차단 또는 중단시키지 않는다면, 상기 서열의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 모두에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 추가, 결실 또는 치환된 아미노산을 함유할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 개 NGF 길항 항체로 기여하는 폴리펩타이드 분자는 그 기능기들이 개의 NGF에 결합하고 그 기능을 길항 작용하는 항체 또는 항체 단편의 능력을 간섭하지 않는다면 이러한 하나 이상의 기능기로 화학적 변형될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는 p75 및/또는 TrkA 수용체로의 개 NGF 결합을 억제하는 데 요구되는 본 발명의 제제, 결합 화합물, 소분자, 융합 단백질 또는 펩티도미메틱의 양을 의미한다.
"폴리펩타이드", "펩타이드", 또는 "단백질"이라는 용어는 본 발명에서 인접 잔기들의 알파-아미노기와 카복시기 간 펩타이드 결합에 의하여 서로간에 연결된 일련의 선형 아미노산 잔기를 지명하기 위하여 상호 교환적으로 사용된다. 아미노산 잔기는 보통 천연 "L" 이성질형으로 존재한다. 그러나 "D" 이성질형 잔기들은 그 폴리펩타이드에 의하여 원하는 기능적 성질이 보유되는 한 임의의 L-아미노산 잔리를 치환할 수 있다.
본 발명에서 정의되는 "항체"는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들의 단편에 의하여 유전적으로 인코딩 가능하거나 재조합으로 제조될 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 갖는, 관심 대상 표적 항원에, 이 경우에는 개의 신경 성장인자에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질을 포함한다. "항체"라는 용어는 모노클로날 및 키메라 항체, 특히 견화 항체를 포함하고, 폴리클로날 항체 또는 임의의 부류 또는 서브타입의 항체들 역시 포함한다. "항체"는 혼성화 항체, 2특이적 항체, 헤테로항체 및 항원 결합을 보유하는 이들의 기능적 단편에까지 이른다.
"특이적으로 결합하는"이라는 구문은 이형혼합 집단의 단백질들 중에 존재하는 특정 단백질 또는 표적에 대한 항체의 결합을 말한다. 그러므로, 특정한 면역 분석 조건하에 존재하는 경우, 상기 항체들은 특정 단백질, 이 경우에는 개의 NGF에 결합하고, 그 시료 중에 존재하는 다른 단백질들에 대하여는 유의한 양으로 결합하지 않는다.
본 발명에서 정의되는 "개 (canine)"은 "개 (dog)"로도 일컬어 질 수 있다. 개는 3항명 카니스 루푸스 파밀리아리스 (Canis lupus familiaris)(카니스 파밀리아리스 도메스티쿠스 (Canis familiaris domesticus)) 또는 카니스 루푸스 딩고 (Canis lupus dingo)를 갖는 아종에 속하는 것으로 범주화될 수 있다. 개는 임의의 견종을 포함하고 야생 및 애완 품종 모두를 포함하며, 후자는 또한 반려 동물로도 일컬어진다.
본 발명은 설명의 목적으로 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지는 않는 하기 실시예들을 참조하여 설명될 것이다. 달리 표시되지 않는 한, 본 발명의 방법 및 기술들은 일반적으로 이 기술 분야에 잘 알려지고, 본 명세서를 통하여 인용되고 설명된 일반적이고 좀 더 구체적인 다양한 참조들에 개시된 관용적인 방법들에 따라 수행된다.
실시예
실시예 1 - 항체의 생산
전체 서열 항체는 견화 가변 도메인 서열을 C-말단 견 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 서열과 조합하여 생산되었다. 4개의 고유 면역글로불린 감마 (IgG) 중쇄 불변 도메인 아이소타입은 하나의 카파 및 람다 불변 도메인 서열과 더불어 개의 면역계에서 알려져 있다 (Tang L. et al. 2001. Veterinary Immunology and Immunopathology, 80. 259-270).
견화 α11 VH 도메인을 각각 4개의 IgG 중쇄 아이소타입 A, B, C 및 D와 조합하였고, 견화 α11 VL 도메인을 견 카파 경쇄 불변 도메인과 조합하였다. 전장의 성숙 항체 사슬의 서열 (caN)을 SEQ ID 5 (VL1과 견 카파 불변 도메인), 6 (VH1과 중쇄 아이소타입 A), 7 (VH1과 중쇄 아이소타입 B), 8 (VH1과 중쇄 아이소타입 C) 및 9 (VH1과 중쇄 아이소타입 D)로 나타내었다. 변이체 항체 (caN2)의 경쇄 서열은 SEQ ID No:10 (경쇄 변이체 (VL2)와 견 카파 불변 도메인)으로 나타내었다. 변이체 항체 (caN2)의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:11 (HCA 변이체 - VH2과 중쇄 아이소타입 A), SEQ ID NO:12 (HCB 변이체 - VH2와 중쇄 아이소타입 B), SEQ ID NO:13 (HCC 변이체 - VH2와 중쇄 아이소타입 C) 및 SEQ ID NO:14 (HCD 변이체 - VH2와 중쇄 아이소타입 D)로 제공된다.
상기 조합된 아미노산 서열은 최적 코돈의 선택 및 전체 화학적 유전자 합성과 포유동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.1+로의 클로닝을 이용하여 포유동물 세포에서의 발현가능형으로 전환되었다.
결과물인 cDNA를 CHO 세포로 트랜스펙션하고 서열 SEQ ID NO:6~9을 갖는 중쇄의 상층액을 실시예 2에서 분석하였다. 경쇄 서열 SEQ ID NO:10 및 중쇄 서열 SEQ ID NO:11을 갖는 항체를 실시예 11에서 정제하였다.
실시예 2 - 쥐 및 개 NGF 에 대한 항체의 결합 측정
견화 중쇄 및 경쇄 cDNA를 CHO 세포에 트랜스펙션하고, 상층액을 수집하고, 개의 NGF 또는 쥐의 NGF 둘 중 하나와 ELISA 포맷에서 반응시켰다. 반응 및 수세 단계 이후, 결합된 견 항체를 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)와 연결된 고트-항 견 IgG 특이적 폴리클로날 항체와 반응엇으로 검출하고 TMB를 이용하여 현상하였다. 결과 생성물의 광학 밀도를 450 nm에서 측정하고 비어있는 목 (mock) 벡터 트랜스펙션된 상층액의 그것과 비교하였다 (도 1에서 "목"으로 나타냄).
결과를 도 1의 그래프에 나타내었다. 마우스 NGF에의 결합은 4개의 견화 항체에 대하여 나타내었다. 이들 항체들 각각은 동일한 경쇄 (caN-kLC-1)를 가지며, 경쇄는 개의 카파 불변 도메인을 포함한다. 각 항체는 서로 다른 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 따라서, 특정 중쇄 가변 도메인은 4개의 상이한 불변 도메인 (caN-HCA, caN-HCB, caN-HCC 또는 caN-HCD) 중 하나와 조합된다. 그래프의 두번째 부분에서, caN-kLC-1 경쇄 및 caN-HCB 불변 사슬로 구성된 단일 항체의 개 NGF에 대한 결합을 나타내었다.
실시예 3 - 견화 항체의 정제
실시예 2에서 얻은 상층액을 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제, SDS-PAGE로 분리하고 항-견 IgG 폴리클로날 항체 HRP에 대한 반응성을 시험하였다. 이 폴리클로날 항체는 중쇄를 우세하게 인식한다.
도 2 A~D에 결과를 나타내었다. 범례: A - HCA는 caN-HCA 중쇄 및 caN-kLC 경쇄를 포함하는 견화 항체이고, HCB는 caN-HCB 중쇄 및 caN-kLC 경쇄를 포함하는 견화 항체이며, C - HCC는 caN-HCC 중쇄 및 caN-kLC 경쇄를 포함하는 견화 항체이고, D - HCD는 caN-HCA 중쇄 및 caN-kLC 경쇄를 포함하는 견화 항체이다. 도 2A~D에 대하여, L은 로딩, W는 수세, P는 피크 분획, 및 F는 플로우 쓰루를 의미한다.
단백질 A는 HCB 아이소타입 (즉, caN-HCB 중쇄를 포함하는 견화 항체)에 우선적으로 결합하지만, HCA, HCC 및 HCD 아이소타입에 의하여는 유의한 물질이 머무르지 않고 단백질 A로부터 쉽게 수세되어 떨어짐을 볼 수 있다.
실시예 4 - SDS - PAGE 를 이용한 정제 견화 항체의 분석
실시예 2 (도 2A~D)에 나타낸 겔의 피크 중 대표 분획을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 블루로 염색하였다.
그 결과를 도 3에 나타낸 겔에 나타내었다. 이 겔은 중쇄 및 경쇄가 명확히 보인다는 것을 나타낸다. 왼쪽부터 레인 순서는 다음과 같다: 1 - 사이즈 스탠다드, 레인 2 - HCA caN-HCA + caN-kLC1, 레인 3 - HCB caN-HCB + caN-kLC1, 레인 4 - HCC caN-HCC + caN-kLC1, 레인 5 - HCD caN-HCA + caN-kLC.
실시예 5 - 견화 항체에 의한 TF -1 세포의 NGF 유도 증식의 억제
실시예 2의 트랜스펙션된 CHO 세포 상층액을 순차적 희석시켜 ("길항제") 0.3 ng/mL NGF의 존재하에서 TF-1 세포와 반응시켰다. 그 결과 증식을, 티미딘의 끼어듦 (incorporation)으로 측정하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 계산된 농도 0.75~1.5 ng/mL 모노클로날 항체 (MAb)에서 50%의 억제가 관찰되었다.
실시예 6 - 항원 포획 견화 항체에 의하여 유도된 보체 침적
항체를 포획하기 위하여 실시예 2의 트랜스펙션된 CHO 세포 상층액을 0.1 ng/mL NGF로 코팅된 플레이트를 이용하여 반응시켰다. 상기 플레이트를 수세한 후 인간 혈청과 반응시키고 결합된 보체 C1q를 항-인간 C1q 폴리클로날 항체 HRP와의 결합을 통하여 측정하고 전술한 대로 현상하였다.
보체 결합 방법
플레이트를 5 μg/ml의 마우스 NGF 100 μl/웰로 코팅하고 5% BSA/PBS로 블로킹하였다. 코팅된 웰을, PBS/1% BSA (100 μl/웰)로 희석된 재조합 견화 항-NGF IgG를 함유하는 세포 배양 상층액과 함께 실온에서 1 시간 반응시켰다. 플레이트를 수세하고 0.5 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.05% 트윈-20, 0.1% 젤라틴 및 0.5% BSA를 함유하는 베로날 완충액에서 1/100 희석된 인간 혈청 100 μl/웰과 실온에서 1 시간 반응시켰다. 수세 후, 플레이트를 PBS/1% BSA 중에서 1/800 희석된 쉽 (sheep) 항-C1q-HRP (Serotec) 100 μl와 반응시켰다. 수세 후, 100 μl의 TMB 기질 (Thermo Scientific)을 첨가함으로써 플레이트를 현상하였다. 100 μl의 2N H2SO4 을 첨가하여 현상을 중지하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 5의 그래프로 나타내었다. 이들 결과는 고정화 견화 HCB 및 HCC형 항체에 대한 C1q의 결합을 보여주고, 견화 HCA 및 HCD형 항체에 대한 C1q의 비결합을 보여준다. 그러므로, 이 결과는 놀랍게도 여러 가지 개 유래 중쇄들이 서로 다른 보체 결합 및 활성화 특성을 나타내고 상기 HCA 및 HCD형 중쇄를 갖는 견화 항체들이 예기치 않게 개의 NGF에 대한 길항 작용에 사용되기에 좋다는 것을 나타내었다. NGF가 용해성 매개자이기 때문에, 보체 고정을 매개하지 않는 개 유래 중쇄의 동정은 특히 유익한 발견이다.
실시예 7 - NGF 에 대한 항-견- NGF 모노클로날 항체의 결합 비교
구조 VL1 및 VH1 (SEQ ID NO:1 및 2) 대 대체 구조 VL2 및 VH2 (SEQ ID NO:3 및 4)를 이용하여 항-견-NGF 모노클로날 항체의 NGF와의 결합 비교가 수행되었다. SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11로 기재되는 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA를 합성하여 pcDNA3.1+의 분비 신호 서열 펩타이드 하류에 클로닝하였다. 상기 DNA들을 CHO 세포로 공-트랜스펙션하고, 마우스 NGF에 대한 ELISA 결합에 의하여, 이를 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:7 공발현된 CHO 상층액과 비교하였다.
그 결과를 도 13A에 나타내었다. 레인 A~D는 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:7로부터의 상층액 (각각 희석하지 않음, 1/10, 1/100, 1/1000)을 보여준다. 레인 E~H는 SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11로부터의 상층액 (각각 희석하지 않음, 1/10, 1/100, 1/1000)을 보여준다. 레인 I은 희석되지 않은 음성 대조군 상층액을 보여준다.
실시예 8 - NGF -포획 견화 항체에 의하여 유도된 보체 침적
C1q ELISA 분석을 이용하여 그 보체를 끌어오는 능력에 대하여 실시예 7의 트랜스펙션된 CHO 세포를 시험하였다 (도 5에 설명된 방법을 이용).
그 결과를 도 13B에 나타내었다. VL2 (SEQ ID 10) 및 VH2 구조 더하기 HCA형 불변 도메인 (SEQ ID 11)의 조합은, 패널 A에서 관찰된 NGF에 대한 결합이 HCB형 중쇄 MAb (SEQ ID 5+7)의 그것과 동등하였음에도 보체를 끌어오는 데 있어서는 비활성이었다. 4, 2 및 1 ug/ml의 연속적 희석으로 상기 MAb를 시험하였다. C는 음성 대조군이었다.
실시예 9 - HCB 및 HCC 중쇄 아이소타입을 갖는 항-견- NGF 모노클로날 항체 N-글 리코실 화 변이체 및 비글리코실화 변이체의 NGF 에 대한 결합 비교
HCB 및 HCC 중쇄 아이소타입을 갖는 항-견-NGF 모노클로날 항체 N-글리코실화 변이체 및 비글리코실화 변이체의 결합 비교가 수행되었다. SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:7 (HCB), SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:16 (HCB*), SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:8 (HCC), 또는 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:17 (HCC*)로 기재되는 경쇄 및 중쇄 쌍을 인코딩하는 발현 벡터를 CHO 세포로 공-트랜스펙션하고 마우스 NGF에 대한 ELISA 결합으로써 그 상층액들을 비교하였다.
그 결과를 도 14A에 나타내었다. 백색 박스는 희석되지 않은 상층액을 나타내고, 음영된 박스는 1/100 희석을 나타내며, C는 희석되지 않은 음성 대조군 상층액을 나타낸다. NGF에 대한 동등한 결합이 관찰되었다.
실시예 10 - NGF -포획 견화 항체에 의하여 유도되는 보체 침적
C1q ELISA 분석을 이용하여 그 보체를 끌어오는 능력에 대하여 실시예 9의 트랜스펙션된 CHO 세포를 시험하였다 (도 5에 설명된 방법을 이용).
그 결과를 도 14B에 나타내었다. 보체 C1q를 끌어들이는 능력은 B형 중쇄에서 N-결합 글리코실화 부위를 없애자 (HCB*) 사라졌고, C형 중쇄에서 유사한 돌연변이에 의하여 (HCC*)는 그 능력이 감소하였다.
따라서, 본 발명에서는 상당히 놀랍게도, 본 발명의 항체가 HCA 또는 HCD 아형의 개 유래 중쇄를 갖는 경우, 개의 NGF에 대한 그 항체의 결합은 보체 활성화 또는 기타 하류 효과자 기능, 예컨대 ADCC를 불러일으키지 않는다는 것을 입증하였다. 그러므로, 개 NGF의 막 결합 TrkA 또는 p75 수용체에 대한 결합을 막음으로써 개 NGF의 생물학적 기능적 활성을 길항 작용하는 데 있어서, 상기 항체는 그와 관련된 하류 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 억제한다. 또한, NGF 발현은 자주 신경 등등에 근접하여 나타나므로, 개 유래 HCA 또는 HCD 아형 중쇄를 갖는 본 발명의 상기 길항 또는 중화 항체는 광범위한 면역 반응을 이끌어 냄이 없이 개의 NGF 생물학적 활성을 봉쇄할 수 있다. 이러한 기능적 특성은 예측된 것은 아니지만 매우 바람직한 것이다.
실시예 11: CHO 세포에서의 발현 후 항- NGF 모노클로날 항체의 정제
HCA 및 HCD 아이소타입의 견 항-NGF 모노클로날 항체가 원하는 대로 보체에 대한 결합을 나타내지 않았지만 (도 5), 스태필로코쿠스 단백질 A에 대하여는 약하게 결합하기 때문에 (도 2), 대안의 정제 방법이 개발되었다. SEQ ID NO:10 (경쇄 변이체 (VL2) 및 개 카파 불변 도메인) 및 SEQ ID NO:11 (HCA 변이체 - VH2 및 중쇄 아이소타입 A)를 발현하는 발현 벡터로부터 유래하는 항-견 NGF 모노클로날 항체를 CHO 세포에서 발현시키고, 많은 실험을 거쳐 두 가지 전제 방법에 의하여 견 항-NGF 항체가 높은 순도로 분획화 될 수 있음이 밝혀졌다.
첫번째 방법에서, 항-견 NGF 모노클로날 항체는 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 (방법 I - 도 15A 및 B)에 의하여 정제되었다. 두번째 방법에서, 상기 항-NGF 항체는 캡토부착 친화 크로마토그래피 후 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다 (방법 II - 도 15C 및 D).
둘 중 하나의 방법에 의하여 정제된 항-NGF 모노클로날 항체의 주요 피크는 대략 150 kDa 분자량에 해당한다. SDS-PAGE 및 ELISA에 의한 비교는 (도 16) 방법 I 및 II가 유사한 순도 및 생활성을 갖는 항체 제제를 생산한다는 것을 설명해 준다. 이들 방법에 의하여 생산된 정제된 항-NGF 모노클로날 항체를 TF-1 NGF 중화 분석 (도 4에 기재)에서 시험하고, 고효능을 가짐을 보였다 (IC50 13 pM 항-NGF 중화 37 pM NGF; 미기재).
실시예 12: 정맥 내로 안전하게 개에게 투여될 수 있고 발열을 야기하지 않는 항-견 NGF 모노클로날 항체
SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11을 발현하는 발현 벡터로부터 유래하는 항-견 NGF 모노클로날 항체 (견 HCA형 중쇄)를 CHO 세포에서 발현시키고 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합으로 정제하여 (방법 I, 도 15A 및 B) 인산 완충액으로 완충액 교환하였다. 상기 항체를 2 mg/체중kg으로 비글견에게 정맥 내 주사하고 수의사의 육안 관찰에 의거 독성 신호, 체중, 체온 및 혈장 생화학의 변화에 대하여 평가하였다. 도 17은 체중과 체온 측정을 보여준다. 이들 또는 측정된 어떠한 혈장 생화학 분석 대상 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 염소염, 칼슘, 인산염, 우레아, 크레아틴, 글루코오스, 콜레스테롤, 빌리루빈, 알라닌 트랜스아미나아제, 알칼리 인산 가수분해효소, 아밀라아제, 리파아제, 총단백질 또는 알부민: 미기재)에 있어서도 변화가 관찰되지 아니하였다.
실시예 13. 생체 내에서 장기 혈청 반감기 및 면역원성의 결여를 입증하는 항-견 NGF 모노클로날 항체의 혈장 약동학
SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11을 발현하는 발현 벡터로부터 유래하는 항-견 NGF 모노클로날 항체 (견 HCA형 중쇄)를 CHO 세포에서 발현시키고 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합으로 정제하여 (방법 I, 도 15A 및 B) 인산 완충액으로 완충액 교환하였다. 상기 항체를 2 mg/체중kg으로 비글견에게 정맥 내 주사하고 이후 2 주에 걸쳐 다양한 시점에 혈장 시료를 채취하였다. 표적으로 NGF와, 항-견 폴리클로날 항체-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 2차 시약을 이용한 ELISA로, 희석된 혈장 시료들을 항-견 NGF 항체 농도에 대하여 평가하고 도 1에 의한 바와 같이 현상하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 측정된 혈장 농도는 대략 33 시간의 조직 분포기 (알파) 반감기 및 놀랍게도 대략 9 일의 장기 제거기 (베타)로, 2-기 동력학과 일치하였다.
100 시간 내지 300 시간 사이에 항-견 NGF 항체 농도가 혈장에서 급격히 감소하지 않는 것은 개 혈중에 기존에 존재하던 재조합 항-NGF 모노클로날 항체에 대한 중화 항체나, 투입 후 생성된 임의의 그러한 중화 항체 어떤 것도 없음을 입증한다. 비교하면, 재조합 인간 면역글로불린계 단백질들은 투입 후 대략 200 시간후에 개의 혈중에서 항체에 의하여 중화된다 (Richter et al, Drug Metabolism and Disposition 27: 21, 1998). 그러므로, 이들 결과는 본 발명의 항-견 NGF 항체가 정맥 내 주사 후 생체 내에서 장기의 혈청 반감기 (9 일)를 가지며, 기간 중 상기 주사된 항-NGF 항체를 중화시키는 어떠한 기존 항체나 새로 생성된 항체가 없다는 것을 보여준다.
실시예 14 - 생체 내에서 염증성 통증을 감소시키는 항-견 NGF 모노클로날 항체의 효과
항체 요법:
SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11을 발현하는 발현 벡터로부터 유래하는 항-견 NGF 모노클로날 항체 (견 HCA형 중쇄)를 CHO 세포에서 발현시키고 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합으로 정제하여 (방법 I) 인산 완충액으로 완충액 교환하였다.
염증에 대한 개 모델:
모든 실험은 기관 윤리 위원회 (CRL, Ireland)의 사전 승인을 얻어 수행되었다. 대략 24 시간 후에 개시되고, 개를 일시적으로 절름발이가 되게 하는 자가-해소 염증을 생성하기 위하여 비글견의 한쪽 뒷다리 풋패드에 카올린을 주사하였다 (= -1 일). 이 모델에서, 카올린에 대한 초기의 염증 반응이 일단 약화되면, 대략 1~2 주의 시간에 걸쳐 개는 점차 덜 다리를 절게되고, 그 후 완전히 회복하게 된다.
3 마리 개로 이루어진 그룹들에 200 μg/kg체중으로 항-견 NGF 모노클로날 항체 또는 비히클 대조군으로서 인산 완충액 둘 중 하나를 정맥 내 주사하였다 (= 0 일). 육안 점수 방법으로, 7일에 걸쳐 개들의 다리 절음을 평가하였다 (점수 0, 절지 않음 (온전한 체중 지지); 점수 1, 약간 절음 (온전한 체중 지지는 아니나 잘 걸음); 점수 2, 중간 정도 절음 (약한 체중 지지 및 잘 걷지 못함), 점수 3, 심하게 절음 (체중 지지 못함)). 어떠한 개가 어떠한 주사를 맞았는지는 맹검 관찰되었다.
그 결과를 도 19에 나타내었다. 비히클 대조군과 비교하여, 주사 3일 후에 항-NGF 모노클로날 항체를 투여받은 개들에서 다리 절음 점수가 감소하였고, 이는 상기 항-NGF 모노클로날 항체가 비히클만으로 나타나는 효과에 비하여 개의 통증을 저감시키는 효과가 있음을 나타내는 것이다. 지연된 활성은 대량 30 시간의 느린 조직 분산기 (알파)를 보여주었던 항-견 NGF 모노클로날 항체의 혈장 약동학 및 비교적 좋지 않은 풋패드 부위의 혈관형성과 일치하는 것이다. 도 19에 나타낸 결과는 본 발명의 항-견 NGF 항체가 다리 절음에 있어서 결과적인 감소로 개의 염증성 통증을 감소시킨다는 것을 보여준다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 참조로서 본 발명에 포함된다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 기재된 구현예들에 대한 다양한 변형 및 변경이 이 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 구체적인 양호한 구현예와 관련하여 본 발명을 설명하였지만, 청구된 바 본 발명이 그러한 구체적인 구현예들로 부당하게 한정되어서는 아니됨이 이해되어야 한다. 실제로, 이 기술 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명에 기재된 모드 수행에 대한 다양한 변형은 본 발명에 의하여 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NVIP Pty Ltd <120> ANTI-NERVE GROWTH FACTOR ANTIBODIES AND METHODS OF PREPARING AND USING THE SAME <130> P119711.WO.02 <150> GB1114858.2 <151> 2011-08-29 <150> US61/483481 <151> 2011-05-06 <150> US61/531439 <151> 2011-09-06 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain mark 1 (VL1) <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asp Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln His Tyr Phe His Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 100 105 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain mark 1 (VH1) <400> 2 Glu Val 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170 175 Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val 195 200 205 His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Glu Ser 210 215 220 Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile 245 250 255 Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Ala Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu 325 330 335 Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr 340 345 350 Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu 370 375 380 Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr 385 390 395 400 Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser 435 440 445 His Ser Pro Gly Lys 450 <210> 19 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 and aglycosylated HCA <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser Leu Ser Ser Met Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val 195 200 205 His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Phe Asn Glu Cys 210 215 220 Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile 245 250 255 Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Ala Gly Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu 325 330 335 Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr 340 345 350 Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser 355 360 365 Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu 370 375 380 Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr 385 390 395 400 Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala 420 425 430 Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser 435 440 445 His Ser Pro Gly Lys 450 <210> 20 <211> 457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 and aglycosylated HCB <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala 195 200 205 His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu 210 215 220 Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp 275 280 285 Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 290 295 300 Ala Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His 340 345 350 Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys 355 360 365 Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp 370 375 380 Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys 385 390 395 400 Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu 405 410 415 Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr 420 425 430 Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 435 440 445 Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 21 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 and aglycosylated HCC <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Gln Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Val Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala 195 200 205 His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Ala Lys Glu Cys 210 215 220 Glu Cys Lys Cys Asn Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile 245 250 255 Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu 260 265 270 Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser Lys 275 280 285 Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Ala Gly 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser 325 330 335 Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln Ala His Gln Pro 340 345 350 Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys Asn Thr 355 360 365 Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp 370 375 380 Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg 385 390 395 400 Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile 420 425 430 Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ile Ser 435 440 445 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 22 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 and aglycosylated HCD <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gln Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val 195 200 205 His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Glu Ser 210 215 220 Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile 245 250 255 Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His 275 280 285 Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Ala Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys 305 310 315 320 Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu 325 330 335 Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr 340 345 350 Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu 370 375 380 Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr 385 390 395 400 Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser 435 440 445 His Ser Pro Gly Lys 450 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL - FR1 <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 24 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL2 - FR1 <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL - FR2 <400> 25 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 26 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL - FR3 <400> 26 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 27 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL2 - FR3 <400> 27 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL - FR4 <400> 28 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH - FR1 <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr 20 25 30 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH - FR2 <400> 30 Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 31 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH - FR3 <400> 31 Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu Lys 1 5 10 15 Met His Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 32 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH2 - FR3 <400> 32 Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu Gln 1 5 10 15 Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH - FR4 <400> 33 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

Claims (90)

  1. 삭제
  2. 개 신경 성장인자 (NGF)와 특이적으로 결합하고, p75 또는 TrkA 개 NGF 수용체에 결합하는 개 NGF의 능력을 억제하는 것이 가능한 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은,
    - SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역으로서, RASEDIYNALA (SEQ ID NO:1의 24-34 잔기)를 포함하는 CDR1 서열, NTDTLHT (SEQ ID NO:1의 50-56 잔기)를 포함하는 CDR2 서열 및 QHYFHYPRT (SEQ ID NO:1의 89-97 잔기)를 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
    - SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역으로서, NNNVN (SEQ ID NO:2의 31-35 잔기)을 포함하는 CDR1 서열, GVWAGGATDYNSALKS (SEQ ID NO:2의 50-65 잔기)를 포함하는 CDR2 서열 및 DGGYSSSTLYAMDA (SEQ ID NO:2의 98-111 잔기)를 포함하는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변영역
    을 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 개의 그 위치에서 외래의 것인 임의 위치의 임의 아미노산을 FR영역 내에 함유하지 않는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은,
    SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및
    SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역
    을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은,
    SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및
    SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역
    을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은,
    SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 E16G, K18T, E70D 및 A100Q를 더 포함하는 경쇄 가변영역, 및
    SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 D10G, N13Q, T17S, T19R, V24A, L41P, R43K, L67F, T70S, T73N, S74A, S76N, T92V 및 L117S를 더 포함하는 중쇄 가변영역
    을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제2항에 있어서, 상기 경쇄는,
    SEQ ID NO:5의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제6항에 있어서, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:18로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  15. 개 신경 성장인자 (NGF)와 특이적으로 결합하고, p75 또는 TrkA 개 NGF 수용체에 결합하는 개 NGF의 능력을 억제하는 것이 가능한 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은:
    RASEDIYNALA (SEQ ID NO:1의 24-34 잔기)를 포함하는 CDR1 서열, NTDTLHT (SEQ ID NO:1의 50-56 잔기)를 포함하는 CDR2 서열 및 QHYFHYPRT (SEQ ID NO:1의 89-97 잔기)를 포함하는 CDR3 서열,
    SEQ ID NO:23의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR1 구조영역,
    SEQ ID NO:25의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR2 구조영역,
    SEQ ID NO:27의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR3 구조영역, 및
    SEQ ID NO:28의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR4 구조영역을 포함하고,
    상기 중쇄 가변영역은:
    NNNVN (SEQ ID NO:2의 31-35 잔기)을 포함하는 CDR1 서열, GVWAGGATDYNSALKS (SEQ ID NO:2의 50-65 잔기)를 포함하는 CDR2 서열 및 DGGYSSSTLYAMDA (SEQ ID NO:2의 98-111 잔기)를 포함하는 CDR3 서열,
    SEQ ID NO:29의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR1 구조영역,
    SEQ ID NO:30의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR2 구조영역,
    SEQ ID NO:32의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR3 구조영역, 및
    SEQ ID NO:33의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FR4 구조영역을 포함하고;
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, 개의 그 위치에서 외래의 것인 임의 위치의 임의 아미노산을 FR영역 내에 함유하지 않는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은:
    SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 FR1 구조영역,
    SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 FR2 구조영역,
    SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 FR3 구조영역, 및
    SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 FR4 구조영역을 포함하고,
    상기 중쇄 가변영역은:
    SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 FR1 구조영역,
    SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 FR2 구조영역,
    SEQ ID NO:31 또는 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 FR3 구조영역, 및
    SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하는 FR4 구조영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 경쇄 가변영역은:
    SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 E16G 및 K18T를 더 포함하는 FR1 구조영역,
    SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 FR2 구조영역,
    SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 E14D를 더 포함하는 FR3 구조영역, 및
    SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 A3Q를 더 포함하는 FR4 구조영역을 포함하고,
    상기 중쇄 가변영역은:
    SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 D10G, N13Q, T17S, T19R 및 V24A를 더 포함하는 FR1 구조영역,
    SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 L6P 및 R8K를 더 포함하는 FR2 구조영역,
    SEQ ID NO:31 또는 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 L2F, T5S, T8N, S9A, S11N 및 T27V를 더 포함하는 FR3 구조영역, 및
    SEQ ID NO:33의 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 치환 L6S를 더 포함하는 FR4 구조영역을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  18. 제2항 또는 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 하류 효과자 기능(effector functions)을 매개하지 않는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, 비글리코실레이션된 유형 HCB, HCA 또는 HCD 개 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  20. 제18항에 있어서, 유형 HCA 또는 HCD 개 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  21. 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 캐리어, 첨가제 또는 희석제와 함께, 제2항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 개의 통증 또는 염증의 치료, 억제 또는 경감용 약학적 조성물.
  22. 제2항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 개의
    통증 치료에 사용하기 위한; 또는 면역 매개 다발성 관절염, 골관절염 또는 류마티스 관절염과 관련된 통증의 치료, 개선 또는 억제를 위한; 또는 개 NGF에 의하여 증식 유도된 종양의 치료를 위한, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  23. 개의 통증 치료에 사용하기 위한; 또는 개의 통증 치료 또는 면역 매개 다발성 관절염, 골관절염 또는 류마티스 관절염과 관련된 통증의 치료, 개선 또는 억제를 위한; 또는 개 NGF에 의하여 증식 유도된 종양의 치료를 위한,
    제2항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편과, 이들의 사용을 위한 지침을 포함하는 키트.
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