KR20140063752A - 견화(犬化) 종양 괴사 인자 항체 및 그의 이용방법 - Google Patents

Abstract

개 (canine) 종양 괴사 인자에 특이적으로 결합하고 TNFR1 수용체에 결합하는 견 TNF의 능력을 억제하는 견화 항체들 및 키메라 항체들과 그들의 항원 결합 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 이를 인코딩하는 핵산 및 상기 항체 및/또는 핵산을 이용하여 개의 만성 염증성 질환, 예컨대 관절염 치료하는 방법까지 확장된다.

Description

견화(犬化) 종양 괴사 인자 항체 및 그의 이용방법 {CANINISED TUMOUR NECROSIS FACTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME}

본 발명은 개 (canine, 犬) 종양 괴사 인자 알파의 억제제로서 작용하는 결합 항체 및 이들의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 이를 제조하는 방법 및 개에서 종양 괴사 인자에 의하여 매개되는 만성 염증성 질병, 예컨대 관절염을 치료하는 데 있어서의 이들 결합 항체 및 단편들의 치료적 용도에까지 이른다.

종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파, TNF-α, TNF)는 면역, 염증, 세포 증식, 분화 및 세포사멸의 조절에 있어서 다면발현성 기능을 발휘하는 강력한 사이토카인이다. 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)-면역글로불린 Fc 도메인 융합 단백질들 또는 항-TNF 중화 모노클로날 항체들을 이용한 TNF의 억제가 다양한 인간 염증성 질병들, 예컨대 류마티스 관절염 및 건선 관절염을 치료하는 성공적인 치료적 접근법임이 입증되어 왔다.

개와 같은 반려 동물들에게서 유사한 염증성 질병들, 예컨대 골관절염, 면역-매개 다발성 관절염, 혈장-림프성 활액막염, 전신성 홍반성 루프스 (SLE), 혈관염 및 다양한 자가면역 피부 질병들이 진행된다. 미국 내 5 마리 성견 중 한 마리는 관절염을 앓고 있는 것으로 추산되고 개는 인간 관절 질병, 예컨대 골관절염, 전방 십자 인대 파열 및 반월상 연골 손상의 모델로 이용되어 왔다.

개의 염증 발병에 있어서 TNF의 역할은 광범위하게 설명되어져 왔다. 예컨대, TNF 억제제 에타너셉트 (TNF inhibitor etanercept, huTNFR-Fc)를 이용한 개의 치료는 대략 25~40%로 심근 손상을 감소시키고 뒤이어 ICAM-1 및 NF-κB와 같은 관련 염증성 마커들이 동반하여 감소하면서 폐쇄성 흉부 모델에서 풍선 폐색에 의하여 유도되는 허혈-재관류를 감소시킨다. 유사하게, 2 mg/kg TNFR-Fc를 이용한 허혈 재관류의 개방성 흉부 개 모델에 있어서 60%의 경색 크기 감소도 또한 입증되었다.

또한, 뒷무릎 관절염을 나타내는 개들의 활액의 세포 침윤에 있어서 TNF 알파의 분비가 증가된다. TNF 및 유형 II TNF 수용체는 광범위한 염증성 반응의 일환으로서 녹내장을 앓는 개들의 중앙 망막 및 주변 망막에서 현저히 증가됨을 보였다. LPS로 치료된 견 PBMC의 상층액에서 캡쳐 ELISA로 낮은 수준의 TNF를 검출하기 위하여 항-견 TNF MAb들이 사용되어져 왔다. 개의 혈관주위세포종, 모모세포종, 지방종 및 비만세포종 피부 시료에서 TNF 알파 발현이 또한 보고되어 왔다. 골관절염 유도 모델에 있어서 TNF-알파 및 TNF 수용체들이 개의 관절 연골에 존재한다. TNF에 대한 인간화 단일클론 항체인 아달리무맙 (adalimumab)을 박탈 피부 홍반 루푸스 (ECLE)를 앓고 있는 두 마리 개들에게 시험하였지만 (8 주간 매 2 주마다 0.5 mg/kg), 질병의 진행에는 변화가 없었고 혈청 TNF-알파 수준도 변화하지 않았다.

따라서, 개의 광범위한 염증 매개성 질환들에 TNF가 관련되어 있으므로, 만성 염증성 질환들을 예방하거나 치료하기 위하여 TNF의 장기간 억제에 사용될 수 있는 견 TNF의 억제제에 대한 요구가 있다.

발명의 요약

많은 노력 끝에, 본 발명의 발명자는 놀랍게도 견 TNF에 특이적으로 결합하고 견 TNF의 생물학적 활성을 중화시키는 항체와 결합 단편들을 생성하는 항체 제조 방법을 동정하였다. 특히, 다수의 아미노산 변형이 상기 항체의 구조 영역 (framework region)으로 도입되었음에도, 이들 변형이 이루어진 신규하고 진보한 방법으로 인하여, 본 발명의 상기 항체들 및 결합 단편들은 높은 특이성을 갖고 견 TNF에 결합한다는 것이 입증되었다. 또한, 결합은 견 TNF의 세포막 발현 TNF 수용체에의 결합을 저해함으로써 견 TNF의 생물학적 활성을 차단한다는 것이 입증되었다. 차례로, 이것은 TNF 매개 유도 작용의 발생, 개의 염증 매개성 질병들, 예컨대 관절염의 발병 또는 진행을 예방할 것이다.

본 발명의 항체들은 재조합 DNA 방법을 이용하여 제조되고 견 TNF에 대하여 결합 특이성을 나타내지만, 개 숙주에 투여되는 경우 그 면역원성을 저감시키기 위하여 개의 구조 영역 및 불변 도메인 서열을 보유한다. 그 결과, 이종항체 (xenoantibody) 유도 위험이 최소화된다. 상기 항체들이 표준 방법론, 예컨대 CDR 그라프팅 또는 그 유사한 방법들을 이용하여 제조된 것이 아니기 때문에 견 TNF에 대한 상기 결합 특이성은 전적으로 놀랍고도 예기치 못한 것이다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 견 종양 괴사 인자 (TNF)에 특이적으로 결합하는 견화 항체 (canninised antibody) 또는 그들의 항원 결합 단편이 제공된다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체는

- 개 이외의 종들로부터 유래하는 공여자 항체를 제공하는 단계로서, 상기 공여자 항체는 종양 괴사 인자에 대하여 결합 특이성을 갖는 것인 단계;

- 상기 공여자 항체의 구조 영역의 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기를 하나 이상의 견 항체들의 구조 영역의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에 존재하는 각 아미노산 잔기와 비교하여, 상기 하나 이상의 견 항체들의 구조 영역의 아미노산 서열 내 대응하는 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기들과 상이한 상기 공여자 항체의 구조 영역의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기들을 식별하는 단계;

- 상기 공여자 항체 내에서 식별된 상기 하나 이상의 아미노산 잔기들을, 상기 하나 이상의 견 항체들 내 대응하는 위치의 상기 하나 이상의 아미노산 잔기들로 치환하는 단계

를 포함하거나, 필수적으로 상기 단계들로 이루어지는 방법에 의하여 제조된다.

상기 방법은, 개에 사용하기 위하여 공여자 항체를 변형하는데, 상기 변형된 항체가, 개의 그 위치에서 외래의 것일 구조 영역 내 임의 위치의 임의 아미노산을 함유하지 않는 방식으로 공여자 항체를 변형한다. 그러므로, 상기 변형된 항체는 표적 항원에 대한 공여자 항체의 특이성 및 친화도를 유지하지만, 중요하게는 어떠한 잠재적으로 외래인 에피토프를 생성하지 않도록 변형된다. 그러므로, 상기 변형된 항체는 개에서 외래의 것으로 여겨지지 않고, 따라서, 특히 장기 투여 이후 항체의 효능 중화를 나타낼 수 있는 개에서의 면역 반응을 유도하지 않는다.

특정 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 식별된 아미노산 잔기들을 치환하는 단계는, 상기 하나 이상의 식별된 아미노산 잔기들을, 하나 이상의 치환되는 아미노산 잔기들과 고도의 상동성을 갖는 대응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기들로 치환하는 것을 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 방법은 공여자 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인들을, 개 항체로부터 유래하는 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인으로 교체하는 단계를 더 포함한다.

상기 방법은 CDR 그라프팅을 포함하지 않는다. 상기 방법에 따라 제조된 항체들은 공여자 항체의 CDR들, 상기 방법에 따라 제조된 견화 구조 영역들 및 개의 불변 도메인들을 포함한다.

본 발명은 하기에 개시되는 것들과 같은, 상기 방법에 따라 제조되는 항체들 및 그들의 단편들에 이른다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 펩타이드, 또는 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물이 제공되는데, 상기 펩타이드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 통상, 상기 펩타이드는 종양 괴사 인자 알파에 결합한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 견화 항체 또는 키메라 항체 또는 그들의 결합 단편이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체는 전술한 항체 제조 방법에 따라 제조된다.

특정 측면에 있어서, 본 발명은 견 종양 괴사 인자 알파 결합 제제, 또는 종양 괴사 인자 알파 결합 제제를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 결합 제제는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 견 종양 괴사 인자 (TNF), 특히 견 TNF 알파 (TNF-α)에 특이적으로 결합하는 견화 항체 또는 키메라 항체 또는 그들의 항원 결합 단편을 제공한다. 통상, 상기 견화 항체 또는 키메라 항체 또는 그들로부터 유래된 상기 항원 결합 단편은 견 TNF의 생물학적 활성을 중화한다. 특히, 상기 견화 항체 또는 키메라 항체 또는 결합 단편의 견 TNF에의 결합은, 견 TNF의 막-결합 (membarane-associated) 견 TNF 수용체들에 결합하여 활성화시키는 능력을 차단한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체 또는 키메라 항체는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체는 전술한 항체 제조 방법에 따라 제조된다.

본 발명의 또 다른 측면은 보체에 결합하여 TNF-알파 발현 세포의 보체-매개 용해 (lysis)를 개시하는 견화 항체를 제공한다. 이러한 항체들은 TNF 발현 염증 세포들의 수를 저감시키므로, 생체 내 (in vivo) 장기간 항-염증 활성이라는 결과를 낳는다. 특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체는 전술한 항체 제조 방법에 따라 제조된다.

본 발명의 상기 측면들의 특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체 또는 키메라 항체, 또는 그들의 결합 단편은 결합 친화도 K_D 1x10^-8 또는 그 미만으로 TNF에 결합한다.

본 발명의 또 다른 또는 관련된 측면에 있어서, 개의 종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파)에 특이적으로 결합할 수 있는 중화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편이 제공되는데, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 그와 85, 90, 95 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 및/또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그와 85, 90, 95 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어진다. 통상, 상기 항체는 키메라 항체 또는 견화 항체이다.

상기 항체가 견화 항체 또는 그 단편인 특정 구현예에 있어서, 이는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 그와 85, 90, 95 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하거나 그 경쇄로 이루어지거나 또는 필수적으로 그 경쇄로 이루어진다.

특정 구현예에 있어서, 상기 중쇄의 가변 영역 (VH)는 하나 이상의 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는 또 다른 아미노산 서열과 결합된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 도메인은 서브클래스 IgG (면역글로불린 G)의 항체로부터 유래하여 본 발명의 견화 항체의 온전한 중쇄를 형성한다. 4 가지의 상이한 개 중쇄 불변 도메인이 알려져 있다. 통상적으로, 상기 불변 도메인은 CH1, CH2 및 CH3 영역를 포함하고, 상기 CH1과 CH2 영역 사이에 위치한 적절한 링커 (또는 "힌지")를 함께 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85, 90, 95 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하거나, 그 중쇄로 이루어지거나, 필수적으로 그 중쇄로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 키메라 항체 또는 항체 결합 단편은 SEQ ID NO:9의 아미노산 또는 그와 85, 90, 95 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하거나, 그 중쇄로 이루어지거나, 필수적으로 그 중쇄로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 키메라 항체는 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.

상기 항체가 견화 항체인 구현예에 있어서, 상기 항체는, 개 대상체에 투여시 그 서열을 탈면역화 (de-immunise)시켜 이종항체들이 그에 대하여 생성되지 않도록 그 잔기들이 결실, 삽입 및/또는 치환에 의하여 변경된 아미노산을 포함한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 개의 종양 괴사 인자 (TNF)에 특이적으로 결합하는 중화 항체, 또는 그들의 항원 결합 단편에까지 이르는데, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어지고, 여기서 상기 경쇄의 가변 영역 (VL)은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 이들과 85, 90, 95 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄의 가변 영역 (VH)은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 상동인 아미노산 서열, 또는 이들과 85, 90, 95 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 필수적으로 이들로 이루어진다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 필수적으로 이것으로 이루어지는 경쇄 및/또는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이와 85% 이상, 더 좋기로는 95% 이상, 그리고 가장 좋기로는 98% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 중쇄를 포함하는 견화 항체이다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열,또는 이와 85% 이상, 더 좋기로는 95% 이상, 그리고 가장 좋기로는 98% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 경쇄, 및/또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열,또는 이와 85% 이상, 더 좋기로는 95% 이상, 그리고 가장 좋기로는 98% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 중쇄를 포함하는 키메라 항체이다.

또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 항체들 또는 결합 단편들은 비(非)글리코실화된 (aglycosylated) 변이체들에 이르고, 여기서 글리코실화에 적합한 불변 도메인 아미노산 잔기들은 글리코실화를 방지하기 위하여 결실되거나 또는 글리코실화될 수 없는 잔기로 치환된다.

또한, 본 발명의 발명자는 상보성 결정 영역 (CDRs)과 조합되어 견화 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 형성할 수 있는 일련의 구조 영역 (framework regions, FR)을 정의하였다. 각각의 중쇄 및 경괘 도메인은 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된, 4개의 구조 영역들을 갖는다.

항체 분자는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들과 함께 사이에 위치하는 연관된 구조 영역들을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 상기 중쇄 가변 도메인 (VH) CDRs은 카바트 번호 시스템 (Kabat numbering system)에 따라 하기 위치에서 발견되는 VHCDRs로 알려져 있다: VHCDR1 - 카바트 잔기 31-35, VHCDR2 - 카바트 잔기 50-65, VHCDR3 - 카바트 잔기 95-102 (Kabat EA et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5^th edition. Bethesda: US Department of Health and Human Services).

또한, 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역들 및 사이에 위치하는 연관된 구조 영역들을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다. 상기 경쇄 가변 도메인 (VL) CDRs은 카바트 번호 시스템에 따라 하기 아미노산 잔기 위치에서 발견되는 VLCDRs로 알려져 있다: VLCDR1 - 카바트 잔기 24-34, VLCDR2 - 카바트 잔기 50-56, VLCDR3 - 카바트 잔기 89-97.

경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 가변 도메인은 하기의 배열로 CDRs이 끼어든 4개의 구조 영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 항-견 TNF 항체 또는 그들의 견 TNF 결합 단편에까지 이르는데, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은:

SEQ ID NO:10의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR1 구조 영역,

SEQ ID NO:11의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR2 구조 영역,

SEQ ID NO:12의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR3 구조 영역, 및

SEQ ID NO:13의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR4 구조 영역 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함, 및/또는

SEQ ID NO:14의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR1 구조 영역,

SEQ ID NO:15의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR2 구조 영역,

SEQ ID NO:16의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR3 구조 영역, 및

SEQ ID NO:17의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR4 구조 영역

중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.

통상적으로, 경쇄 및 중쇄 CDRs은 개의 TNF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체로부터 유래한다.

통상적으로, 본 발명의 견화 항-견 TNF 항체의 생성은 상기 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인의 구조 영역 안으로 도입되기 위하여 복귀 돌연변이를 필요로 하지 않는 재조합 DNA 프로세스로부터 결과한다.

특정 구현예에 있어서, 전술한 상기 하나 이상의 구조 영역을 포함하는 경쇄 가변 도메인은 개 유래 경쇄 불변 도메인, 통상적으로 경쇄 카파 불변 도메인과 연결되지만, 필요에 따라 람다 경쇄와 연결된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 경쇄는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 FR1 영역, SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 FR2 영역, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 FR3 영역, 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 FR4 영역 또는 전술한 것들과 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 구조 영역을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 5개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 10개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.

또 하나의 특정 구현예에 있어서, 전술한 하나 이상의 구조 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역은 개 유래 중쇄 불변 도메인과 연결된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 불변 도메인의 아미노산 서열은 임의의 번역 후 변형 (post-translational modification)을 갖지 않거나, 또는 N-결합 또는 O-결합 글리코실화의 대상일 수 있는 임의의 또는 모든 잔기들을 제거하도록 변형됨으로써 상기 불변 도메인은 비(非)글리코실화된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 FR1 영역, SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 갖는 FR2 영역, SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 갖는 FR3 영역 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 FR4 영역 또는 전술한 것들과 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 구조 영역을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 상동성은 약 5개 이상의 아미노산 길이, 좋기로는 약 10개 이상의 아미노산 길이에 걸쳐 있다.

또 하나의 특정 구현예에 있어서, 본 발명에 개시된 구조 영역으로의 변형이 이루어질 수 있다. 즉, 본 발명의 발명자는 각각의 구조 영역 중 일부 잔기들로서 주어진 위치에 존재할 수 있는 아미노산 잔기를 선택한다는 것을 밝혔다. 중요하게는, 이들 구조 영역 변경은 상보성 결정 영역에 형태적 변화를 야기하지 않는다는 것인데, 이것은 결과물인 항체의 결합 특이성 및/또는 친화도를 부정적으로 변하게 할 수 있기 때문이다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역의 구조 영역의 아미노산 잔기에 2개 이상의 아미노산 치환을 도입하는 것에 이른다.

따라서, 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 폴리펩타이드, 예컨대 항체 또는 이들의 항원 결합 단편에까지 이르는데, 이는 하나 이상의 하기 아미노산 치환 (여기서 아미노산은 1글자 코드로 표기됨)으로 변형된, SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 FR1 영역을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다: 5번 위치의 아미노산 잔기 T (T5)는 아미노산 잔기 M 또는 I로 교체되고 S7은 T; A9는 L 또는 P; S12는 A; L13은 V; S14는 T 또는 R; Q15는 P 또는 R; E16은 D; K18은 E, A, P, T 또는 L; V19는 A; T20은 S; T22는 S 또는 Y 및 C23은 Y로 교체된다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 상기 경쇄 FR2 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: Y2는 F, I 또는 L; Q3은 R, L 또는 I, Q4는 H, K5는 R, P6은 S 또는 A, G7은 D, A9는 S, T 또는 P, K11은 Q, E 또는 R, L12는 R, P, G, A 또는 S, I14는 L 및 Y15는 F, N, S, E 또는 V로 치환된다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 상기 경쇄 FR3 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: G1은 A, V2는 A, P3은 S, S4는 D, F6은 L 또는 V, S7은 I, G8은 A, T13은 A, D14는 E, T16은 S 또는 R, L17은 F, T18은 R 또는 K, S21은 R, G 또는 T, L22는 V, P24는 A, E25는 D, G, I 또는 N, V27은 A, T, G 또는 S, A28은 G 및 V29는 I 또는 L로 치환된다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 상기 경쇄 FR4 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: G2는 S, Q3은 A, P 또는 T, G4는 E, T5는 P, K6은 Q 또는 S, V7은 L 또는 W, E8은 D 또는 R 및 I9는 L로 치환된다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 FR1 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: E1은 D 또는 G, V2는 G, L, E, I 또는 M, Q3은 H, R, A, V, E, K, L, P 또는 S, L4는 V 또는 P, V5는 A, L, E 또는 M, E6은 Q 또는 A, S7은 F, L 또는 T, G9는 E, G10은 D, A, N, E 또는 T, L11은 Q, R, V 또는 W, V12는 A, I 또는 M, Q13은 K, R 또는 N, P14는 F 또는 T, G15는 A, E 또는 T, G16은 E 또는 A, S17은 T 또는 P, L18은 R, R19는 K, T, G 또는 V, L20은 I 또는 V, S21은 Y, A23은 V, L, I 또는 E, A24는 T, V, G, I 또는 S, S25는 P, G 또는 T, G26은 D, R 또는 T 및 F27은 L, I, S, D, T 또는 V로 치환된다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 FR2 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: W1은 C, V2는 I, A, F 또는 L, Q4는 L 또는 H, A5는 S, T, G, P, V 또는 D, P6은 L, G7은 E, R 또는 L, K8은 R, E, G, A, M 또는 Q, G9는 E, R, D, T 또는 V, L10은 T, P, F 또는 M, E11은 Q, H, D, L, P 또는 R, W12는 L, C, S, Y, F 또는 M, V13은 L, I 또는 F 및 S14는 A, T, G 또는 L로 치환된다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 FR3 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: R1은 Q, F2는 V 또는 L, T3은 A, I 또는 S, I4는 V, L, M 또는 T, S5는 A, F 또는 T, R6은 K, D7은 E 또는 N, N8은 D, T, S, I 또는 G, A9는 G, V, S, D, P 또는 T, K10은 R, E, N, Q, G 또는 M, N11은 D, S, K, H 또는 R, S12는 T, M, I 또는 A, L13은 V, M, A 또는 I, Y14는 F, H, S 또는 T, L15는 I, Q16은 H, E, D, R 또는 A, M17은 L, N18은 D, S, T, H, K, P 또는 R, S19는 G, D, R, N 또는 T, L20은 V, R21은 T, G, K, S 또는 I, A22는 V, D, T, S, G 또는 P, E23은 D, A 또는 V, T25는 A, S 또는 M, A26은 G 또는 V, V27은 M, I, L, F, T, K 또는 Q, Y28은 H, Y29는 F 또는 H, A31은 V, T, G, M, R, S, C 또는 L 및 K32는 R, S, N, G, A, T, P, D, Q, V, E, I, M으로 치환된다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 상기 중쇄 FR4 영역은 하나 이상의 하기 아미노산 치환에 의하여 변형될 수 있다: W1은 L, G2는 A 또는 S, Q3은 P, H, R 또는 D, T5는 A, S, I 또는 N, L6은 S, Q, P 또는 R, V7은 L, I 또는 P, T8은 F, I, A, S, L, P 또는 Y, V9는 A, S10은 A, C, P 또는 T 및 S11은 L, A 또는 P로 치환된다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 통상적으로 상기 항체는 견화 항체 또는 그 단편이다. 혹은 상기 항체는 키메라 항체 또는 그 단편이다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 견화 TNF 중화 항체 또는 키메라 TNF 중화 항체, 또는 그들로부터 유래하는 결합 단편은 평형 해리 상수 (K_D) 1x10^-8 이하의 결합 친화성으로 견 TNF-알파 (종양 괴사 인자 알파)에 특이적으로 결합한다. 또한, 상기 견화 항체 또는 키메라 항체는 개에 존재하는 어떠한 다른 에피토프들과도 교차 반응하지 않고, 또한 그들이 개에 투여되는 때 본 발명의 항체에 대응하여 이종항체를 생성하지 않는 것이 좋다. 또한, 단기간의 항-염증 활성이 생체 내에서 바람직하지 않은 경우, 상기 견 TNF 결합 항체들의 불변 도메인은 어떠한 하류 효과자 기능, 예컨대 보체 고정 및 활성화, ADCC 및 Fc 수용체 결합 및 활성화를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 하류 효과자 기능을 매개하지 않는 것이 좋다. 이러한 불변 도메인은 SEQ ID NO:4, 비글리코실화된 SEQ ID NO:4, 비글리코실화된 SEQ ID NO:5, 비글리코실화된 SEQ ID NO:6, 비글리코실화된 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:7로 이루어지는 중쇄들로부터 선택된다.

특정 구현예에 있어서, 장기간의 항-염증 활성이 바람직한 경우 상기 견 TNF-결합 항체들의 불변 도메인은 효과자 기능, 예컨대 보체 고정 및 활성화, ADCC 및 Fc 수용체 결합 및 활성화를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니고, 그 결과 생체 내에서 견 TNF 발현 세포를 제거하게 되는 효과자 기능을 매개하는 것이 좋다. 이러한 불변 도메인은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어지는 중쇄로부터 선택된다.

또 하나의 특정 구현예에 있어서, 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 대한 변형이 본 발명의 항체에 이루어질 수 있다. 상기 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 변화는 통상적으로 항체의 기능적 특징을 변형하기 위하여 수행된다. 예컨대, 아미노산 변형은 항체의 불변 도메인에 의하여 매개되는 하류 효과자 기능을 막기 위하여 수행될 수 있는데, 예컨대 항체의 Fc 수용체에 결합하거나, 보체를 활성화시키거나 또는 ADCC를 유도하는 능력을 막음으로써 수행될 수 있다. 또한, 변형은, 개에 투여되는 때 항체의 순환 반감기를 변형하기 위하여 중쇄 불변 도메인의 아미노산 잔기에 이루어질 수 있다.

본 발명은 개의 TNF에 결합하여 TNFRs에 결합하는 그의 능력을 봉쇄하는 항체 단편에까지 이른다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체 결합 단편은 플렉시블 링커와 연결되어 단쇄 항체를 형성하는 본 발명의 중쇄 및 경쇄 서열을 포함할 수 있다.

단쇄 Fv (scFv)는 VH 및 VL 도메인을 포함한다. Vh 및 VL 도메인은 연관되어 표적 결합 부위를 형성한다. 이들 2개의 도메인은 펩타이드 링커에 의하여 공유결합적으로 연결된다. scFv 분자는 경쇄 가변 도메인이 N-말단에 요구되는 경우에는VL-링커-VH의 형태를 가질 수 있고, 또는 VH 도메인이 N-말단에 요구되는 경우에는 VH-링커-VL의 형태일 수 있다. 따라서, 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 단쇄 Fv (scFv) 항체 단편이다. 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 항체 결합 단편은 Fab 항체 단편, Fab' 항체 단편, F(ab')₂ 항체 단편, Fv 항체 단편, scFV 항체 단편 등등으로 이루어지는 군으로부터 선택되지만 한정되는 것은 아니다.

몇 가지 구현예에 있어서, 본 발명은 다특이적 (multispecific) 또는 다가의 (multivalent) 항체를 제공하며, 이는 병용요법에 사용하기 위한 여러 가지 결합 특이성을 갖는 다른 항체들과 커플링 또는 연결된 본 발명의 항-TNF 항체 또는 결합 단편을 포함한다. 다특이적 항체는 제1 TNF 에피토프에 특이적인 하나 이상의 항체 또는 결합 단편, 및 TNF 상에 존재하는 다른 에피토프 또는 다른 항원에 특이적인 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 다가 항체는 동일한 TNF 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 결합 단편을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 견화 항체의 Fv 영역 또는 Fab 영역을 4개 이상 포함하는 항체 융합 단백질에 이른다. 또 다른 구현예는, 본 발명에 개시되는 항체로부터 유래하는 하나 이상의 Fab 영역과 함께 TNF에 대하여 특이적인 항체들로부터 유래하는 하나 이상의 Fab 또는 Fv 영역을 포함하는 항체 융합 단백질에 이른다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명은 2특이적 (bispecific) 항체에까지 이르는데, 여기서 본 발명에 따른 항체 또는 그들의 결합 단편은 TNF가 아닌 제2 표적에 대하여 결합 특이성을 갖는 제2 항체 또는 그들의 결합 단편과 연결된다. 좋기로는 상기 제2 표적은 TNFR1 수용체를 통한 TNF 매개 신호전달 방지를 보조한다. 이러한 다가의, 2특이적 또는 다특이적 항체들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 다양한 재조합 방법들에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 그를 필요로 하는 경우, 개의 면역 매개 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은:

- 견 TNF 알파에 특이적으로 결합하는, 치료적 유효량의 본 발명의 항체, 또는 그들의 항원 결합 단편을 제공하는 단계, 및

- 상기의 것을 개에게 투여하는 단계

를 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 견화 항체이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 견화 항체는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 갖는 경쇄 및/또는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이와 85% 이상 그리고 더욱 좋기로는 98% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 필수적으로 이들로 이루어지는 중쇄를 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및/또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 키메라 항체이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 키메라 항체는 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그와 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 면역 매개 질환은 만성 염증성 질병이다. 상기 만성 염증성 질병은 류마티스 관절염 (RA), 골관절염 및 기타 다발성 관절염, 강직성 척추염 (AS), 크론병 및 궤양성 대장염, 건선 및 건선성 관절염 (PsA), 전신성 혈관염, 아토피성 피부염, 울혈성 심부전 (CHF), 난치성 포도막염, 기관지 천식 및 알레르기 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 염증 매개성 질환은 또한 패혈증 및 쇼크, 당뇨병 및 신경 퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 근위축성 측색 경화증을 포함할 수도 있다. TNF-알파에 대한 모노클로날 항체 또한 암의 악액질, 피부 종양, 예컨대 기저세포암, 대장암 및 난소암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

특정 구현예에 있어서, 상기 면역 매개 질환은 TNF-알파 관련 장애 또는 TNF-알파가 핵심적인 염증 매개자인 장애일 수 있다. 이러한 질환들은 베체트병, 수포성 피부염, 독성 표피 괴사, 전신 혈관염, 농피증 괴저, 농포성 피부염, 알코올성 간염, 대뇌 말라리아, 용혈성 요독 증후군, 임신 중독증, 이식 거부, 중이염, 뱀에 물린 상처, 결절성 홍반, 골수이형성 증후군, 이식편대숙주병, 피부근염 및 다발성근염을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 그를 필요로 하는 개 대상체의 관절염 또는 관절 질환의 치료 방법이 제공되는데, 상기 방법은:

- 본 발명에 따른 항-견 TNF 항체 또는 그들의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 제공하는 단계, 및

- 상기의 것을 상기 개에게 투여하는 단계

를 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 견화 항체이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 이들과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 관절염 또는 관절 질환은 면역 매개 다발성 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 소아 특발성 관절염, 강직성 척추염 및 관련 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환들을 포함한다.

통상적으로, 관절염 또는 관절 질환의 치료는 상기 관절 질환의 원인이거나, 그와 관련되거나 그것이 원인인 면역 반응을 개선, 저해, 저감, 억제시키는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 그를 필요로 하는 개에서 견 TNF의 발현 증가 또는 TNF에 대한 감수성 증가에 의하여 야기되거나, 그와 관련되거나 또는 그러한 결과를 야기하는 질환의 치료 방법을 제공하는데, 상기 방법은:

- 본 발명에 따른 항-견 TNF 항체 또는 그들의 항원 결합 단편의 치료적 유효량을 제공하는 단계, 및

- 상기의 것을 상기 개에게 투여하는 단계

를 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 본 발명의 전술한 방법들은 상기 본 발명의 항-TNF 항체의 효과를 증강 및/또는 보충할 수 있는 하나 이상의 추가 제제를 공투여하는 단계를 더 포함한다. 예컨대, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 하나 이상의 추가적인 약학 조성물들과 함께 공투여될 수 있는데, 상기 추가적인 조성물들은 만성 염증성 질환, 특히 TNF-알파 관련 장애를 치료하는 데 유용한 약물을 포함한다. 특히 상기 추가적인 약학 조성물은 메토트렉세이트 (methotrexate), 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체 또는 이들의 유도체들, 견 TNF에 대한 키메라 항체 또는 견 항체, 항-견 TNF 항체 단편, 하나 이상의 진통제, 사이토카인 억제 항-염증 약물, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드 또는 스테로이드 또는 신경 성장 인자의 길항제, 예컨대 항-NGF 항체일 수 있다.

적절한 진통제의 예시로는 부토르파놀, 부프레노르핀, 펜타닐, 플루닉신 메글루민, 메르피딘, 모르핀, 날부핀 및 이들의 유도체를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 적절한 NSAIDS는 아세트아미노펜, 아세틸살리실산, 카프로펜, 에토돌락, 케토프로펜, 멜록시캄, 피로콕시브, 로베나콕시브, 데라콕시브 등등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 제제는 항생제, 항진균제, 항원충제, 항바이러스제 및 유사 치료제로부터 선택되는 하나 이상의 군일 수 있는 치료적 활성제일 수 있다. 또한, 상기 하나 이상의 추가 제제는 염증 매개자(들)의 억제제, 예컨대 PGE-수용체 길항제, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 또는 항염증 글루코코르티코이드일 수 있다. 또한, 상기 하나 이상의 추가 제제는 항고혈압제 또는 심혈관 기능장애, 예컨대 고혈압, 심근 허혈, 울혈성 심부전 등등의 치료에 사용하기 위한 기타 화합물일 수 있다. 또 다른 특정 측면에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 제제는 나이든 개들에게서 점점 만연될 수 있는 인지 기능장애 또는 손상, 예컨대 기억 상실 또는 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 제제일 수 있다. 그리고 또한, 상기 하나 이상의 추가 제제는 이뇨제, 혈관확장제, 베타-아드레날린성 수용체 길항제, 안지오텐신-II 전환 효소 억제제, 칼슘 채널 차단제 또는 HMG-CoA 환원효소 억제제일 수 있다.

특정 구현예에 있어서, 전술한 방법들의 일부로서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 개에게 약 0.01 mg/체중kg 내지 약 10 mg/체중kg 범위의 투여량으로, 특히 약 0.03 mg/체중kg 내지 약 3 mg/체중kg 범위의 투여량으로 투여된다.

다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 전술한 임의의 측면에 따fms항체 또는 그들의 결합 단편을 포함하는 조성물에 이른다. 특정 구현예에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 캐리어를 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 개의 만성 통증을 야기하거나 그에 의하여 야기되는 통증 또는 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는데, 이는 본 발명에 따른 약학적 유효량의 항-견 TNF 견화 항체를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 캐리어, 첨가제 또는 희석제와 함께 포함한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 조성물은 메토트록세이트 또는 하나 이상의 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드, 스테로이드 또는 신경 성장 인자의 길항제를 더 포함할 수 있다.

다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산에 이른다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산 또는 폴리올리고뉴클레오티드를 제공한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 항-견 TNF 견화 항체 또는 항체 단편의 경쇄 가변 도메인, 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 인코딩한다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 항-견 TNF 견화 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 도메인, 또는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 인코딩한다.

또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 항-견 TNF 키메라 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 인코딩한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 단리된 핵산은 작동가능하게 그와 연결된 하나 이상의 조절 서열을 더 인코딩한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 조절 서열을 더 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터이다.

또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나의 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 견화된 항-견 TNF 중화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 전술한 측면의 숙주 세포를 배양하여 세포로 하여금 견화된 항-견 TNF 중화 항체를 발현하도록 하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 항-견 TNF 견화 항체를 생산하는 방법을 제공하는데, 이는 적절한 숙주 세포에서 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 본 발명의 전술한 측면들의 폴리뉴클레오티드/핵산 또는 벡터 하나 이상을 발현시키는 단계와, 숙주 세포에서 함께 발현되거나 다른 숙주 세포에서 별개로 발현될 수 있는 그 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계와, 항체를 단리하는단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 개의 통증을 치료, 개선 또는 저해하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 단편의 유효량을 상기 개에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 개의 통증을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 측면들에 따른 약학적 조성물, 또는 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터를 제공한다.

특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 급성 통증이다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 만성 통증이다. 또한, 상기 통증은 수술 후 통증, 또는 정형외과술, 연조직 수술, 난소자궁적출 과정, 거세 과정 등등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 개에 대한 임의의 수술 과정으로부터 야기되는 통증일 수 있다. 또 다른 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 암 또는 암 유사 질환과 관련된 만성 통증이다. 또 하나의 특정 구현예에 있어서, 상기 통증은 류마티스 관절염 또는 골관절염과 관련되거나 그로부터 야기되는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 관절염, 특히, 면역 매개 다발성 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 소아 특발성 관절염 또는 강직성 척추염의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 측면들에 따른 약학적 조성물, 또는 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 개의 만성 염증성 질병을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 측면들에 따른 약학적 조성물, 또는 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 개의 류마티스 관절염 또는 골관절염을 치료, 저해, 개선 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 결합 단편, 또는 본 발명의 전술한 측면들에 따른 약학적 조성물, 또는 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 것들을 포함하는 핵산 또는 벡터의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명에 따른 항-견 TNF 중화 모노클로날 항체 또는 그들의 단편을 생산하는 세포주 또는 그들의 유도체 또는 자손 세포가 제공된다.

본 발명의 또 하나의 측면은 개의 만성 염증성 질병을 치료하기 위한, 또는 통증과 관련된 질환을 치료하기 위한, 또는 골관절염 또는 류마티스 관절염을 치료, 개선 또는 저해하기 위한 키트를 제공하는데, 이는 본 발명의 전술한 측면들 중 어느 하나에 따른 항-견 TNF 항체와, 이들의 사용에 대한 지침을 포함한다.

본 발명의 또 하나의 측면은 시험관 내 (in vitro), 생체 외 (ex vivo) 및 생체 내 (in vivo)에서 유액 중 항-견 TNF 모노클로날 항체를 검출하기 위한 진단 키트를 제공하는데, 이는 상기 항체의 농도를 측정하는 데 사용하기 위한 것이다. 상기 키트는 본 발명의 항체들 중 어느 하나 또는 그들의 결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 키트는 이들을 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 SEQ ID NO:1으로, 본 발명의 견화 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 보여준다.

도 2는 SEQ ID NO:2로, 본 발명의 견화 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 보여준다.

도 3은 SEQ ID NO:3으로 본 발명의 견화 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 보여준다.

도 4는 견화 항-TNF 중쇄 가변 도메인 견 IgG-A 중쇄 (caN-HCA)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:4)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.

도 5는 견화 항-TNF 중쇄 가변 도메인 견 IgG-B 중쇄 (caN-HCB)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:5)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.

도 6은 견화 항-TNF 중쇄 가변 도메인 견 IgG-C 중쇄 (caN-HCC)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:6)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.

도 7은 견화 항-TNF 중쇄 가변 도메인 견 IgG-D 중쇄 (caN-HCB)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:7)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.

도 8은 키메라 항-TNF 항체의 견 카파 경쇄의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.

도 9는 키메라 항체의 중쇄 가변 도메인 견 IgG-B 중쇄 (caN-HCB)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:9)을 보여준다. 가변 도메인 잔기는 굵게 나타내었다.

도 10(A)는 단백질 A를 이용하여 정제하고 SDS-PAGE로 분석된 공발현 견화 항체 (SEQ ID NO:3 더하기 SEQ ID NO:5) 및 키메라 항체 (SEQ ID NO:8 더하기 SEQ ID NO:9)들의 결과를 보여주는 반면, 도 10(B)는 ELISA 결과를 나타내는데 발현된 재조합 단백질들의 견 TNF-알파에의 결합을 보여준다. 5 ug/ml에서 0.05 ug/ml까지 다양한 항체 희석을 이용한 결과를 보여준다.

도 11은 NF-kB-EGFP 리포터 컨스트럭트 pTRH1로 트랜스펙션된 293-HEK 세포를 이용한 견 TNF 생활성의 억제를 보여준다. 이들 세포는 형광으로 견 TNF에 반응한다. 견화 MAbs (SEQ ID NO:3 더하기 SEQ ID NO:5)(도 11a) 및 키메라 MAbs (SEQ ID NO:8 더하기 SEQ ID NO:9)(도 11b) 양자 모두 TNF-유도 형광을 똑같이 잘 억제하였다 (도 11c에 정량).

도 12(a)는 CHO 세포에서 발현되고 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제된 항-TNF MAb 클론 148계 또 다른 견화 MAb와의 비교를 보여준다 (패널 A, 좌측 레인). 이 MAb를 도 10의 견화 (Ca) 및 키메라 (Ch) D2E7계 MAbs와 비교하여 인간 TNF (패널 B) 및 견 TNF (패널 C)에의 결합에 대하여 시험하였다 (백그라운드 음성 대조 결합은 화살표로 나타내었다). 이 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 견화 및 키메라 D2E7계 MAbs 및 본 발명의 대상체는 예기치 못한 인간 TNF에의 결합과 균등한 견 TNF와의 강력한 결합을 나타내었지만 견화 MAb 148은 인간 TNF에만 결합을 보인다.

도 12(b)는 SEQ ID NO:18로서, 견화 MAb 148의 중쇄의 아미노산 서열을 보여준다.

도 12(c)는 SEQ ID NO:19로서 견화 MAb 148의 경쇄의 아미노산 서열을 보여준다.

도 13은 SEQ ID NO:3과 SEQ ID NO:5를 합하여 공발현시켜 제조된 견화 항-TNF 모노클로날 항체가 TNF 발현 세포들의 보체 매개 용해를 유도할 수 있음을 보여준다.

발명의 상세한 설명

방대한 실험 후, 본 발명의 발명자는 견 TNF에 결합한다고 알려지지 않았던 항체인, D2E7 항-인간 TNF 모노클로날 항체를 얻었고 이것을 기본으로 사용하여 놀랍게도 견 TNF-알파에 특이적으로 결합하는 길항적 항체를 생산하였다. 결과물인 표준 CDR 그라프팅 방법을 이용하여 생산된 것이 아닌 비면역원성 항체는 개의 TNF에 대하여 고친화 결합을 나타냄을 보여준다. 이 항체는 개의 TNF 생물학적 기능, 가장 구체적으로는 세포 막 결합 수용체 TNFR1 (cell membrane associated receptor TNFR1)와 TNF의 결합을 저해함으로써 개의 TNF 생물학적 기능을 중화시킨다. 또한, 그것은 그 구조 영역 및 불변 영역이 오직 견 IgG 분자들에 존재하는 잔기들만을 포함하여, 개에게 투여되는 경우 그에 대한 이종항체들이 생성될 개연성이 낮도록 설계되었다. 따라서, 본 발명의 상기 견화 항체는 개의 만성 염증성 질병들의 치료를 위한 장기적 투여에 적합하다.

본 발명의 발명자에 의하여 이용된 본 발명의 항체를 위한 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 생성하는 공정은, 그 위치에서 개에게 외래인 것으로 알려진 특이적인 공여자 아미노산 잔기들을, 본 발명자들의 분석에 기초하여, 그것이 비변형된 형태로 개에게 투여된다면 그 항체에 대응하여 생성되는 중화 항체를 야기할 수 있는 면역원성 에피토프의 존재를 감소시키면서 CDR 영역의 형태를 보유하므로 결합 특이성 및 결합 활성을 유지하는 개의 잔기로 교체하게 되는 결과를 낳는다. 구체적으로, 본 발명의 항체 제조 방법은 (PETisation으로 알려짐) 개에게 투여하는 적합성에 대하여 공여자 항체의 구조 영역의 서열을 개로부터 유래하는 항체 또는 항체 풀의 서열과 비교함으로써 상기 공여자 (예컨대, 인간) 항체의 구조 영역의 서열을 평가하는 단계를 포함한다. 공여자 서열과 표적 서열 중 단 하나의 제공원 간에만 상기 비교가 이루어질 수 있다고 하여도, 표적 서열의 풀과의 비교가 바람직하다는 것은 자명한데, 이것은 표적 종들에 있어서 각 카바트 위치에서 자연 선택의 수가 확장될 것이기 때문이다. 이것은 공여자와 표적 간의 "매치" 확률을 증가시킬 뿐 아니라, 매치가 존재치 않는 교체에 대한 선택 역시 확장시킬 것이다. 그 결과로서, 공여자와 가능한 근접한 특징을 갖는 교체의 선택이 가능해질 것이다. 공여자 서열과 개의 서열이 임의의 카바트 번호 또는 대응하는 위치에서 상이한 경우, 공여자 서열은 문제의 아미노산 잔기가, 개에서 그 위치에 천연적으로 존재하는 것으로 알려진 아미노산 잔기로 치환되도록 변형된다.

공여자 면역글로불린 구조 영역에 존재하는 아미노산 잔기의 치환이 필요한 경우, 통상적으로 이것은, 아미노산 잔기가 개의 그 카바트 위치에서 자연적으로 존재하고, 크기, 전하 및 소수성에 있어서 공여자 서열에서 치환되는 아미노산과 가능한 근접하여 관련되는 아미노산 잔기로 교체되는 보존적 치환의 원리를 이용하여 이루어진다. 그 목적은 상기 공여자 항체의 3차원 구조에 어떠한 동요 또는 혼란을 야기하지 않거나, 또는 오직 최소한의 동요 또는 혼란만을 야기하는 교체를 선택하기 위함이다. 특정 경우에 있어서는, 어떠한 명확한 선택권이 없을 것이고 각각의 선택은 유리 및 불리를 동시에 가질 것이다. 최종 결정은 3차원 모델링이나 다양한 대안 서열의 발현을 필요로 할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 명확한 선호가 있을 것이다. 이러한 방법의 결과로, 공여자 서열의 변화는 그 잔기가 표적에서 외래의 것이고 그 교체 아미노산이 대체되는 아미노산과 가능한 근접하게 관련된 경우에만 이루어진다. 따라서, 외래의 에피토프의 생성은 회피되지만, 총 3차원 구조는 보존되고 그 결과로 친화도 및 특이성 역시 보존된다.

경쇄 및 중쇄 불변 영역은 통상적으로 개 (표적) 유래 항체들로부터 유래한다. 단기의 TNF 억제를 원한다면, 상기 중쇄 불변 도메인은 그들이 하류 효과자 기능, 즉 HCA, HCD 또는 비글리코실화된 HCB 또는 HCC을 매개하지 않도록 선택되거나 변형된다. 장기의 TNF 억제를 원한다면, 상기 중쇄 불변 도메인은 그들이 하류 효과자 기능, 즉 HCB 또는 HCC을 매개하지 않도록 선택되거나 변형된다. 또한, 구조 잔기들의 치환이 CDR 영역의 3차원 형태에 영향을 미치지 않는 방식으로 이루어지기 때문에, 원하는 표적에 대한 결합 특이성에 있어서 변화가 없을 것이다.

인간과 마우스에 있어서 4종의 주요 IgG 아이소타입이 있고, 명명법은 유사하지만 그들의 행동 및 기능, 예컨대 단백질 A 및 단백질 G와 같은 박테리아 산물에 대한 친화도, 보체 의존성 세포용해 (CDC)를 활성화시키는 그들의 능력 및 항체 의존성 세포 독성 (ADCC)를 통한 표적 세포의 사멸을 유도하는 그들의 능력 등에 있어서 상이하다. CDC 및 ADCC 활성인 IgG 아이소타입 또는 "무장된 (armed)" 불변 도메인의 선택은, 예컨대 종양학, 장기의 염증 제어 또는 감염 통제에 있어서 항체가 그들의 인식 항원을 함유하는 표적 세포를 제거하기 위하여 설계될 때 임상적 이점으로 여겨진다 (예컨대, 인간에 대한 의학적 용도에 있어서, 인간의 IgG1 아이소타입이 상기 목적으로 바람직하다). 반대로, 염증, 통증 또는 자가면역의 완화에서와 같은 다른 환경에 있어서는 면역계의 활성화가 바람직하지 않은 것으로 여겨지므로, 최소한의 CDC 및 ADCC 활성을 갖는 인간 IgG 아이소타입이 선호된다 (예컨대, 이러한 인간에 대한 의학적 용도에 있어서는 IgG4 아이소타입이 종종 선호된다). 개의 면역계에 있어서 하나의 카파 및 람다 불변 도메인 서열과 더불어 4개의 특징적인 면역글로불린 감마 (IgG) 중쇄 불변 도메인 아이소타입이 개시되었다 (US Patent No. 5,852,183, Tang L. et al. 2001. Veterinary Immunology and Immunopathology, 80. 259-270). 4개의 개 중쇄 불변 도메인 A, B, C 및 D는 그들에 의하여 매개되는 기능적 활성의 측면에서 밝혀져 있지는 않다. IgG 패밀리에 대한 전체적인 상동성에도 불구하고, 개의 IgG를 인코딩하는 단백질들은 다른 종들 유래의 패밀리 일원들에 비하여 서로에 대하여 더욱 연관되어 있으므로, 존재한다면 상기 기능들 중 어떠한 것이 개의 4개의 아이소타입 각각에 속하는지 상동성만으로 정의하는 것은 가능하지 않다.

본 발명의 항체들은 개 유래 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 또한, 상보성 결정 영역은 D2E7 항체로부터 유래한다. 상기 D2E7 항체는 Salfeld et al. 2000 및 미국 특허 6,090,382에 개시되었다.

상기 D2E7 항체로부터 유래되는 CDR 영역은 본 발명의 발명자에 의하여 결정된 구조 영역 서열과 조합되어, 상기 항체가 개에게 투여되는 때에 그에 대응하여 이종항체가 생성되는 것은 막으면서 CDR 3차 구조를 보존하므로, 따라서 결합 특이성도 보존하게 된다.

각각의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 FR1~FR4라고 일컬어지는 4개의 구조 영역을 함유한다. 이들 각각의 구조 영역에 대하여, 본 발명의 발명자는 각각의 특이적 위치에 대하여 양호한 아미노산 잔기 (소위 선호 잔기) 및 또한 그 위치에 허용될 수 있는 대체 아미노산 잔기를 밝혔다. 표 1 내지 8은 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 4개의 구조 영역들을 나타내고 있다. 표는 구체적인 구조 영역의 위치에 상대적이고, 또한 온전한 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 길이를 따라 특정 잔기의 위치를 식별하는 데 사용되는 카바트 번호 시스템에 따라 아미노산 위치를 제공한다. 한 글자 시스템을 이용하여 아미노산 잔기들이 식별된다.

표 1 - 경쇄 가변 도메인 FR1 잔기들

표 2 - 경쇄 가변 도메인 FR2 잔기들

표 3 - 경쇄 가변 도메인 FR3 잔기들

표 4 - 경쇄 가변 도메인 FR4 잔기들

표 5 - 중쇄 가변 도메인 FR1 잔기들

표 6 - 중쇄 가변 도메인 FR2 잔기들

표 7 - 중쇄 가변 도메인 FR3 잔기들

표 8 - 중쇄 가변 도메인 FR4 잔기들

그러므로, 본 발명의 견화 항체는, 예컨대 첫번째 종으로부터 유래하는 온전한 가변 영역과 두번째 종으로부터 유래하는 불변 도메인으로 이루어지는 키메라 모노클로날 항체, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 (CDRs)이 공여자 항체로부터 유래한 아미노산 잔기를 포함하고 표적 항체로부터 유래한 구조 영역 (FR)과 불변 영역 (CR)으로 도입된 CDR-그라프트 견화 항체, 또는 개의 생식세포 서열들과는 상이하다.

상기 견화 항체는 실질적으로 그 CDRs이 유래한 모체 (공여자) 항체의 결합 특성을 보유한다. 이것은 상기 견화 항체가 그 CDRs이 유래하는 공여자 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 항원-결합 친화도 및 결합 활성을 나타낼 것을 의미한다. 이상적으로는, 표적 에피토프에 대한 상기 견화 항체의 친화도는 공여자 항체의 친화도 기준 10% 미만은 아닐 것이고, 더욱 좋기로는 약 30% 미만은 아니며, 가장 좋기로는 친화도는 적어도 모체 (공여자) 항체의 친화도 이상일 것이다. 항원 결합 친화도 평가 방법은 이 기술 분야에 잘 알려져 있고 하프-맥시멀 결합 분석 (half-maximal binding assays), 경쟁 분석 및 스카트차드 분석 (Scatchard analysis)을 들 수 있다.

앞서 기재한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 견화 항체로부터 유래하는 결합 일원 또는 항원 결합 단편에 이른다. 이러한 항원 결합 단편은 개의 TNF에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 결합 일원 또는 항원 결합 단편들은 단리된 결합 일원들일 수 있다. 본 발명의 결합 일원 또는 항원 결합 단편은 본 발명의 항체의 단편, 예컨대 전장 견화 항체 분자의 단편, 예컨대 오로지 중쇄 또는 경쇄, 또는 예컨대 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 결합 일원은 통상적으로 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 필수적으로 이들로 이루어질 수 있다. 결합 일원의 VH 도메인은 또한 본 발명의 일부로서 제공된다. 각각의 VH 및 VL 도메인 내에는, 3개의 상보성 결정 영역 ("CDRs")과 더불어 4개의 연관 구조 영역 ("FRs")이 존재한다. VH 도메인은 통상적으로 3개의 HCDRs (중쇄 상보성 결정 영역)을 포함하고, VL 도메인은 통상적으로 3개의 LCDRs (경쇄 상보성 결정 영역)을 포함한다. 따라서, 결합 일원은, 서열상으로 VH CDR1 (또는 VHCDR1), CDR2 (VHCDR2) 및 CDR3 (VHCDR3) 영역과 더불어 수 개의 관련 구조 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 추가로, 또는 선택적으로 결합 일원은 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과 더불어 관련 구조 영역을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 상기 VH 또는 VL 도메인은 통상적으로 4개의 구조 영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바, "구조 영역" 또는 "구조 서열"이라는 용어는 가변 영역에서 CDRs을 빼고 남은 서열을 말한다. CDR 서열에 대한 정확한 정의는 여러 가지 명명 시스템 (카바트, 쇼시아 (Chothia) 등)으로 결정될 수 있기 때문에, 구조 영역의 의미도 그에 따라서 여러 가지 해석이 가능하다. 6개의 CDRs (경쇄의 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3 및 중쇄의 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3)은 상기 경쇄 및 중쇄상의 구조 영역을 각 쇄 상에서 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 알려진 4개의 하위-영역으로 나눈다.

도 1은 본 발명에 따른 항-TNF 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄로 나타내었다. 이와 같이, 그리고 도 1에 나타낸 바와 같이, VLCDR1은 FR1과 FR2 구조 영역 사이에 위치하고, VLCDR2은 FR2와 FR3 구조 영역 사이에 위치하며, VLCDR3은 FR3과 FR4 구조 영역 사이에 위치한다. 도 2는 본 발명에 따른 항-TNF 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 보여준다. CDR1, CDR2 및 CDR3 영역은 밑줄로 나타내었다. 도 1에서 경쇄 가변 영역으로서 나타낸 바와 같이, VHCDR1은 FR1과 FR2 구조 영역 사이에 위치하고, VHCDR2은 FR2와 FR3 구조 영역 사이에 위치하며, VHCDR3은 FR3과 FR4 구조 영역 사이에 위치한다.

상기 표들에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 및 중쇄 가변 도메인의 잔기는 관용적으로 카바트 등에 의하여 고안된 번호 시스템에 따라 번호 매져진다 (Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391). 카바트 번호 시스템은 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 그들의 항원 결합 부분에서 다른 아미노산 잔기들보다 더욱 가변적인 (즉, 초가변적) 아미노산 잔기들을 번호 매기는 시스템을 말한다. 그러므로, 카바트 번호 시스템은 일반적으로 가변 도메인의 잔기 (대략 경쇄의 1~104 잔기 및 중쇄의 1~113)를 일컬을 때 사용된다. 이 번호 시스템은, 언급되는 경우 본 명세서에서도 사용될 수 있다. 카바트 잔기 지정은 본 발명에 나열되는 관련 서열들로 제공되는 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 잔기의 선형 번호와 항상 직접적으로 대응되는 것은 아니다. 특히, 실제의 선형 아미노산 서열은, 중쇄 또는 경쇄의 기본적인 가변 도메인 구조의 구조 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)이 될지 아닐지, 구조적 요소의 단축 또는 그 요소로의 삽입에 대응하는 엄격한 카바트 번호에 비하여 아미노산을 덜 또는 더 함유할 수 있다. 주어진 임의의 항체에 대한 잔기들의 정확한 카바트 번호는, 카바트 번호가 적용된 표준 서열과 상기 항체의 서열상 잔기들을 정렬시킴으로써 결정될 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 항체 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편 및 scFv (단쇄 가변 단편), 펩티도미메틱 (peptidomimetic), 2가 항체 절편 (diabody), 또는 관련 다가 유도체들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

특정 구현예에 있어서, 상기 항체 결합 단편은 Fab, 또는 F(ab')2 단편이고, 이는 항체의 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진다. 특정 구현예에 있어서, 상기 VL 도메인은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 VH 도메인은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구현예에 있어서, 상기 CL 및 CH1 도메인은 개의 면역글로불린의 CL 및 CH1 도메인의 아미노산 서열에 기반한다.

Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편의 재조합 생산에 사용되는 방법은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, PCT 국제특허공보 WO 92/22324에 기재된 것, 및 Sawai 등의 문헌 ["Direct Production of the Fab Fragment Derived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and cDNA Expression Vectors", 1995, AJRI 34:26-34]에 기재된 것들을 포함한다. scFv (단일 사슬 Fv 단편)를 생산하는데 사용될 수 있는 방법의 예시는 Huston 등의 문헌 ["Protein Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins", Methods in Enzymology, vol. 203:46-88 (1991)]에 기재되어 있고, 그 내용은 참조로서 본 발명에 포함된다.

특정 구현예에 있어서, 항체 단편은 모리모토 방법에 따른 단백질 분해에 의하여 전장 항체로부터 유래될 수 있다 (Morimoto et al., "Single-step purification of F(ab')2 fragments of mouse monoclonal antibodies (immunoglobulins G1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl-5PW" Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)). 또한, 항체 단편은 숙주 세포로부터 직접 생산될 수 있다 (Carter et al., "High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment" Bio/Technology 10:163-167 (1992)).

개의 TNF에 결합 특이성을 갖고 개의 TNF 기능에 대하여 길항 작용을 하는 견화 모노클로날 항체를 제공하는 것 외에도, 본 발명은 SEQ ID NO:1으로 정의되는 VL (경쇄 가변) 영역 및 SEQ ID NO:2로 정의되는 VH (중쇄 가변) 영역의 아미노산 서열에 기반하는 한 쌍의 결합 도메인을 포함하는 항체들 이외의 결합 일원에까지도 이른다. 특히, 본 발명은 본 발명 항체들의 견화 항체의 VL 또는 VH 영역 중 어느 하나에 기반하는 단일 결합 도메인에 이른다.

따라서, 본 발명의 또 다른 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 견화 항체로부터 유래하는 단일 결합 도메인을 포함하거나, 그것으로 이루어지거나 또는 필수적으로 그것으로 이루어지는 결합 일원이 제공된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 단일 결합 도메인은 SEQ ID NO:2로 정의되는 VH (중쇄 가변 도메인)의 아미노산 서열로부터 유래한다. 이러한 결합 도메인은 개의 TNF에 대한 표적 제제로서 사용될 수 있다.

특정 구현예에 있어서, 본 발명의 항체를 변형시키기 위하여 추가적인 조작 방법이 사용될 수 있는데, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원 의존성 세포 독성을 변화시킬 수 있는 Fc 영역의 변형 등에 의할 수 있다. 또한, 특정 구현예에 있어서, 글리코실화 패턴을 변화시킨 항체 또는 항체 단편이 생산될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 항체는 그 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변화된다. 폴리펩타이드의 글리코실화는 통상적으로 N-결합 또는 O-결합된다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인데, 아스파라긴 측쇄에의 탄수화물 모이어티 효소적 부착의 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내에 이들 트리펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 형성한다. O-결합 글리코실화는 당류 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로오스 중 하나의 하이드록시아미노산에의 부착을 의미하는데, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신 역시 사용될 수 있지만 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌에의 부착을 의미한다.

또 하나의 특정 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 항-견 TNF 항체들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 유도체와 항체를 반응시킴으로써 PEG화될 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 항체는 탈퓨코오스화되어, 그러므로 퓨코오스 잔기가 없다.

특정 구현예에 있어서, 항체의 생물학적 특성의 변형은 (a) 치환되는 구역의 폴리펩타이드 백본의 구조, 예컨대 시트 또는 나선형 형태와 같은 구조에 영향을 미치거나, (b) 표적 위치에서 그 분자의 전하 또는 소수성에 영향을 미치거나, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다. 아미노산들은 그들의 측쇄 성질의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2^nd Ed., 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) 비극성: Ala (A), VaI (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비전하 극성: GIy (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), GIu (E); (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H). 또는, 자연적으로 존재하는 잔기들은 일반적인 측쇄 성질에 근거하여 그룹으로 나뉠 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, VaI, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, GIn; (3) 산성: Asp, GIu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기들: GIy, Pro; (6) 방향성: Trp, Tyr, Phe. 비보존적 치환은 이들 부류들 중 하나의 어떤 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환 잔기들은 보존적 치환 위치 또는 나머지 (예컨대, 비보존되는) 위치로도 도입될 수 있다.

다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은, 파트너 분자와 연결된 본 발명의 항-견 TNF 항체 또는 그들의 항원 결합 부분을 포함하는 면역컨쥬게이트에 이른다. 특정 구현예에 있어서, 이러한 항체-파트너 분자 컨쥬게이트는 화학적 링커, 예컨대 펩티딜 링커, 하이드라진 링커 또는 이황화 링커의 수단으로 컨쥬게이션된다. 특정 구현예에 있어서, 커플링 파트너는 효과자 분자, 표지, 약물 또는 캐리어 분자이다. 본 발명의 항체들을 펩티딜 및 비펩티딜 커플링 파트너들과 커플링시키기 위한 적절함 방법들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있을 것이다. 적절한 표지의 예시로는 검출가능한 표지, 예컨대 방사능표지, 또는 효소적 표지, 예컨대 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제, 또는 화학적 모이어티, 예컨대 비오틴을 들 수 있다. 또는, 상기 표지는 기능적 표지, 예컨대, 라이신 (ricin) 또는 항체 결합 부위에서 전구약물이 활성 약물로 변환될 수 있는 전구약물일 수 있다.

다양한 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 견화 항체, 항체 단편들 및 결합 일원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 특히 단리된 폴리뉴클레오티드에 이른다. 본 발명에 정의된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"는 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 포함하며, 이는 비변형 RNA 또는 DNA, 또는 변형 RNA 또는 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA를 제한없이 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그들의 대립형질 변이체 및/또는 중간 정도 또는 높은 스트린젠시 조건하에서 이러한 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 등 그들의 상보물 (complements)을 포함한다.

또한, 본 발명은 항체 모방체 (antibody mimetics)에까지 이르는데, 예컨대 본 발명의 개 TNF 항체에 기반한 도메인 항체, 나노바디, 유니바디, 베르사바디 및 듀오칼린 (duocalins) 등이다. 매우 다양한 항체 모방체 기술이 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 예컨대, 소위 도메인 항체 (Domantis, UK)는 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄 둘 중 하나의 가변 영역에 해당하는, 항체의 기능성 결합 소유닛이다. 이러한 도메인 항체의 생산에 관한 설명은 미국 특허 제6,291,158호, 미국 특허 제6,582,915호 및 미국 특허 제6,593,081호에서 찾을 수 있다. 나노바디는 카멜리드 (camelids)에서 발견되는 자연적으로 존재하는 중쇄 항체의 고유 구조적 기능적 특성을 함유하는 항체 유래 치료 단백질이다. 유니바디는 IgG4 항체의 힌지 영역을 제외하는 것에 기반하는 또 하나의 항체 단편 기술이다. 힌지 영역의 결실은 대략 전통적인 IgG4 항체의 절반 크기이며 1가의 결합 영역을 갖는 분자를 야기한다. 유니바디는 비활성인 IgG4 항체의 특성을 보존하고 있으므로, 면역 반응을 유도하지 않는다.

항체 생산

본 발명의 항체 및 결합 일원은 전적으로 또는 부분적으로 화학적 합성에 의하여 생산될 수 있다. 예컨대, 상기 본 발명의 항체 및 결합 일원들은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법들, 예컨대 표준 액체 펩타이드 합성 또는 고상 펩타이드 합성 방법에 의하여 제조될 수 있다. 또는, 상기 항체 및 결합 일원들은 액상 펩타이드 합성 기법을 이용하여 용액 중에서 제조되거나, 또는 고상, 액상 및 용액 화학의 조합에 의하여 제조될 수도 있다.

또한, 본 발명은 적절한 발현 시스템으로 본 발명의 항체인 하나 이상의 아미노산을 인코딩하는 핵산 발현에 의하여, 그로써 목적하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 인코딩될 수 있는 본 발명의 항체 또는 결합 일원들의 생산에까지 이른다. 예컨대, 아미노산 경쇄를 인코딩하는 핵산 및 아미노산 중쇄를 인코딩하는 제2 핵산은 발현되어 본 발명의 항체를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 특정 측면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 형성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산이 제공된다.

통상적으로, 본 발명의 항체 또는 결합 일원을 형성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산들은 단리되거나 정제된 형태로 제공되거나, 또는 하나 이상의 조절 서열을 제외하고는 자연적으로 그와 관련되어 있을 수 있는 물질을 실질적으로 포함하지 않는 형태로 제공된다. 본 발명의 항체 또는 결합 일원을 발현하는 핵산들은 전적으로 또는 부분적으로 합성된 것일 수 있고, DNA, cDNA 및 RNA를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 핵산 서열은, 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 기법들, 예컨대 문헌 [Sambrook et al. "Molecular Cloning", A laboratory manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, Volumes 1-3, 2001 (ISBN-0879695773)], 및 문헌 [Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4^th Edition, 1999 (ISBN-0471250929)]에 기술된 기법들을 이용하여 숙련자에 의하여 쉽게 제조될 수 있다. 상기 기법들은 (i) 핵산 시료를 증폭하기 위한 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 이용, (ii) 화학적 합성, 또는 (iii) cDNA 서열의 제조 등을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 DNA는, 예컨대 DNA 인코딩시키고, 발현될 부분 양 옆의 적절한 제한 효소 인식 부위를 동정하고, DNA로부터 상기 부분을 잘라내는 등 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 임의의 적절한 방식으로 생성 및 사용될 수 있다. 잘려진 부분은 그 후 적절한 프로모터와 작동적으로 연결, 적절한 발현 시스템, 예컨대 시판 발현 시스템으로 발현될 수 있다. 또는, 관련 DNA 부분은 적절한 PCR 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다. DNA 서열에 대한 변형은 위치 지정 돌연변이법 (site directed mutagenesis)을 이용하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 항체 또는 결합 일원들을 인코딩하는 핵산 서열은 전술한 핵산 하나 이상을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태로 컨스트럭트로서 제공될 수 있다. 상기 컨스트럭트는 상기 컨스트럭트를 하나 이상 포함하는 재조합 숙주 세포 내에 포함될 수 있다. 편리하게는, 발현은 적당한 조건하에서, 적절한 핵산 서열을 함유한 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 발현 이후, 항체 또는 항체 단편들은 임의의 적절한 기법을 이용하여 단리 및/또는 정제된 후, 적절히 사용될 수 있다.

여러 다양한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 클로닝 및 발현하기 위한 시스템이 잘 알려져 있다. 적절한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 효모, 곤충 및 배큘로바이러스 시스템을 들 수 있다. 이 기술 분야에서 이형접합 폴리펩타이드의 발현을 위하여 이용가능한 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 NS0 마우스 골수종 세포를 들 수 있다. 흔한, 양호한 박테리아 숙주는 이. 콜라이 (E. coli)이다. 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 이 기술 분야에 잘 구축되어 있다. 진핵 세포에서의 배양 발현 역시 결합 일원 생산의 한 가지 선택지로서 이 기술 분야의 숙련자에게 이용 가능하다.

예컨대, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497]; 미국특허 제4,376,110호; 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor]에 기재된 방법들로 항체를 생산하는 일반적인 기술들이 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 상기 참고 문헌들과, 예컨대 유럽특허 제0,368,684호에는 재조합 항체 분자들의 제조 기술이 기술되어 있다.

본 발명의 특정 구현예에 있어서, 항체 또는 결합 일원들의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 삽입체 (insert)를 포함하는 재조합 핵산이 사용된다. 정의에 의하면, 이러한 핵산은 단일 가닥 핵산, 상기 코딩 핵산과 그에 상보적인 핵산으로 이루어지는 이중 가닥 핵산, 또는 이들 상보적 (단일 가닥) 핵산 그들 자체를 포함한다.

또한, 항체들의 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 자연적으로 존재하는 중쇄 가변 도메인 및/또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 진정 서열 또는 그들의 돌연변이를 갖는 효소적으로 합성되거나 화학적으로 합성된 핵산일 수 있다.

본 발명의 항체는 직접적인 방법이 아닌, 재조합 방법에 의하여 이형접합 폴리펩타이드를 갖는 융합 폴리펩타이드로로서 생산될 수 있는데, 이형접합 폴리펩타이드는 좋기로는 신호 서열 또는 성숙된 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드이다. 선택되는 이형접합 신호 서열은 좋기로는 숙주 세포에 의하여 인식되고 가공되는 (즉, 신호 펩티다아제에 의한 분해) 것이다. 본래의 항체 신호 서열을 인식 및 가공하지 못하는 원핵 숙주 세포에 대하여는, 상기 신호 서열은 예컨대 알칼리 인산가수분해효소, 페니실리나아제, lpp 또는 열-안정 엔테로톡신 II 리더로 이루어지는 군으로부터 선택되는 진핵 세포 신호 서열에 의하여 치환된다.

본 발명의 견화 항체, 또는 그들로부터 유래되는 결합 일원 또는 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관하여 사용되는 경우 "단리된"이라는 용어는 그 상태에서 상기 항체 , 결합 일원들 또는 핵산 (폴리뉴클레오티드)이 단리된 및/또는 정제된 형태로 제공되는 상태를 말하고, 즉 그들이 그들의 자연적 조건으로부터 분리, 단리 또는 정제되었고 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로 제공되거나, 또는 핵산의 경우, 필요로 되는 기능을 가진 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 제외한 제공원의 핵산 또는 유전자가 없는 또는 실질적으로 없는 핵산을 말한다. 따라서, 이러한 단리된 항체, 결합 일원 및 단리된 핵산은 그들이 자연적으로 관련되어 있는 물질, 예컨대 그들의 자연 조건에서, 또는 그 제조가 시험관 내 또는 생체 내에서 실시되는 재조합 DNA 기술인 경우 그들이 제조되는 조건 (예컨대, 세포 배양)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않을 것이다.

항체, 결합 일원 및 핵산은 희석제 또는 아쥬반트와 함께 제제화될 수 있고, 또한, 실시 목적을 위하여 단리된 형태로 제공되는 것으로 고려될 수 있다. 예컨대, 상기 항체 및 결합 일원들은 면역분석에 사용하기 위한 마이크로타이터 플레이트를 피폭하는 데 사용된다면 젤라틴 또는 기타 캐리어와 함께 혼합되거나, 진단 또는 치료요법에 사용되는 경우 약학적으로 허용가능한 캐리어나 희석제와 함께 혼합될 것이다. 상기 항체 또는 결합 일원들은 자연적으로 또는 이형접합 진핵 세포 시스템 (예컨대, CHO 또는 NSO 세포)에 의하여 글리코실화될 수 있고, 또는 이들은 (예컨대, 원핵 세포에서 발현에 의하여 생산된다면) 비글리코실화될 수 있다.

항-견 TNF 견화 항체 분자를 포함하는 이종혼합 (heterogeneous) 제제 역시 본 발명의 일부를 형성한다. 예컨대, 이러한 제제는 전장 중쇄 및 C-말단 리신을 결여하는 중쇄를 갖는, 다양한 정도로 글리코실화 및/또는 유도 아미노산을 갖는, 예컨대 N-말단 글루탐산의 고리화로 피로글루탐산 잔기를 형성한, 항체들의 혼합물일 수 있다.

약학적 조성물

통상적으로 본 발명의 약학적 조성물은 액체 제형, 동결건조 제형, 액체로 재구성되는 동결건조 제형, 또는 에어로졸 제형으로 제형화된다. 특정 구현예에 있어서, 상기 제형의 항체는: 약 0.5 mg/ml 내지 약 250 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 45 mg/ml, 약 0.5 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 약 100 mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 또는 약 50 mg/ml 내지 약 250 mg/ml의 농도이다.

특정 구현예에 있어서, 상기 제형은 또한 완충액을 포함한다. 통상적으로 상기 제형의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5이다. 특정 구현예에 있어서, 상기 완충액은 약 4 mM 내지 약 60 mM 히스티딘 완충액, 약 5 mM 내지 약 25 mM 숙시네이트 완충액, 또는 약 5 mM 내지 25 mM 아세테이트 완충액을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 완충액은 약 10mM 내지 300mM 농도의, 통상적으로 약 125mM 농도의 염화나트륨을 포함하고, 약 5mM 내지 50mM 농도의, 통상적으로 25mM 농도의 시트르산나트륨을 포함한다. 특정 구현예에 있어서, 상기 제형은 약 0% 내지 약 0.2%를 초과하는 농도의 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트-20, 폴리소르베이트-40, 폴리소르베이트-60, 폴리소르베이트-65, 폴리소르베이트-80, 폴리소르베이트-85, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 양호한 구현예에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트-20이고, 약 125 mM 농도의 염화나트륨과 약 25 mM 농도의 시트르산나트륨을 더 포함할 수 있다.

투여

본 발명의 항체 또는 결합 일원은 단독으로 투여될 수 있으나, 목적하는 투여 경로에 따라 선택되는 약학적으로 허용가능한 적절한 첨가제, 희석제 또는 캐리어를 일반적으로 포함할 약학적 조성물로서 투여되는 것이 좋을 것이다. 적절한 약학적 캐리어의 예시로는; 물, 글리세롤, 에탄올 등등을 들 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체 또는 결합 일원은 임의의 적절한 경로를 통하여 치료를 필요로 하는 개 환자에게 투여될 수 있다. 통상적으로, 상기 조성물은 주사 또는 투입에 의하여 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 양호한 경로의 예시로는 정맥 내, 심장 내, 동맥 내, 복강 내, 관절 내, 근육 내, 공동 내, 피하, 점막 또는 경피 투여를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로는 또한, 국소적 투여 및 장 투여를 포함할 수 있으며, 예컨대 점막 (폐 포함), 구강, 비강 또는 직장 투여를 포함할 수 있다.

상기 조성물이 주사가능한 조성물, 예컨대 정맥 내, 피내 또는 피하 적용과 같은 주사가능한 조성물인 경우 구현예에 있어서, 활성 성분은 피로겐-무함유이고 적절한 pH, 등장도 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 이 기술 분야의 관련 기술들은, 예컨대 등장 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, Ringer 주사 또는 젖산화 Ringer 주사 등 적절한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요하다면 보존제, 안정화제, 완충액, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 마이크로스피어, 리포좀, 기타 마이크로입자 전달 시스템 또는 혈액 등 특정 조직에 위치하는 지연 방출 제제를 통하여 투여될 수 있다.

전술된 이 기술들 및 프로토콜 및 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 기술들과 프로토콜의 예시는 그 전체가 본 발명에 참조로서 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Lippincott Williams & Wilkins]; [20th edition ISBN 0-912734-04-3 and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems]; [Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN 0-683305-72-7]에서 찾을 수 있다.

본 발명의 항체 및 조성물은 통상적으로 대상체에게 "치료적 유효량"으로 투여되는데, 이것은 그 조성물이 투여되는 대상체에게 유익함을 보여주는 충분량이다. 실제 투여량, 및 투여 속도 및 시간 코스는 치료될 질병의 성질 및 중증도, 및 치료 대상체의 연령, 성별 및 체중, 및 투여 경로에 의존적일 것이고, 이를 당연히 참조하여 결정될 수 있다. 또한, 예컨대 제제 중 항체 또는 결합 일원의 결합 활성 및 생체 내 혈장 수명, 농도 및 전달 경로, 위치 및 전달 속도 등 조성물의 성질도 당연한 고려의 대상이어야 한다.

투여 방법 (dosage regimen)은 본 발명의 항체 또는 조성물의 1회 투여, 또는 상기 항체 또는 조성물의 다회 투여를 포함할 수 있다. 또한, 항체 또는 항체 함유 조성물은, 본 발명의 항체 또는 결합 일원이 치료를 위하여 투여되는 질병의 치료에 사용되는 다른 치료제 및 의약과 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

대상체에게 투여될 수 있는 투여 방법의 예시로는 1 μg/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 10 μg/kg/일 내지 1 mg/kg/일을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 구현예에 있어서, 상기 투여량은 항체의 혈장 농도 1 μg/ml 내지 100 μg/ml이 얻어지는 것이다. 그러나, 투여되는 조성물의 실제 투여량 및 투여 속도 및 시간 코스는 치료되는 질병의 성질 및 중증도에 달려있을 것이다. 치료에 대한 처방, 예컨대 투여량 등에 대한 결정은 궁극적으로 수의학 종사자 및 기타 수의사들의 책임 및 재량 범위이고, 통상적으로 치료 대상인 질환, 개별적인 환자의 질병, 전달 부위, 투여 방법 및 종사자들에게 알려진 다른 인자들을 고려한다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학 용어는 본 발명의 기술 분야의 숙련자에 의하여 통상 이해되는 의미를 갖는다. 이 용어들의 의미 및 범위는 명확하여야 하나, 모호한 경우, 본 발명에서 제공되는 정의가 사전적 또는 외적 정의에 우선한다.

명세서 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다 (comprise)" 또는 "포함하다 (include)" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 서술된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하지만 기타 임의의 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바, "하나 (a, an)" 및 "그 (the)"와 같은 용어는 문맥상 명확히 달리 요구되지 않는 한 단수 및 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예컨대 "활성 제제" 또는 "약학적으로 활성인 제제"라는 언급은 단일한 활성 제제 뿐 아니라 2 이상의 상이한 활성 제제의 조합을 포함하고, "캐리어"라는 언급은 2 이상의 캐리어의 혼합물 뿐 아니라 단일한 캐리어 등등을 포함한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다.

본 발명에서 정의되는 바, "TNF 중화 항체" 또는 그 유사 용어는 TNF의 생물학적 활성 및 신호를 중화시킬 수 있는 항체를 말한다. 길항 항체, 또는 블로킹 항체라고도 말할 수 있는 중화 항체는 특이적으로, 및 좋기로는 선택적으로 TNF에 결합하고 TNF의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 예컨대, 상기 중화 항체는 TNF의 그 표적 리간드, 예컨대 세포막에 결합된 TNF 수용체 1 (TNFR1) 수용체 (CD120a) 등으로의 결합을 억제할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 바, "생물학적 활성"이라는 용어는 (생체 내에서 자연적으로 존재하는 것으로 발견되는, 또는 재조합 수단에 의하여 가능케 되거나 제공되는) 분자의 내재적 생물학적 성질 중 임의의 하나 이상의 것을 말한다. 생물학적 성질은 수용체 결합 및/또는 활성화; 세포 신호전달 또는 세포 증식의 유도, 세포 생장 억제, 사이토카인 생산 유도, 세포 사멸 유도, 및 효소 활성 유도 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 바 "상보성 결정 영역 (CDR)"이라는 용어는, 카바트 등에 의하여 기술된 (Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242), 본래 면역글로불린 결합 위치의 자연적 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 말한다. 본 발명에서 사용되는 바 "구조 영역 (FR)"이라는 용어는 CDRs 사이에 자리하는 아미노산 서열을 말한다. 항체 중 이들 부분은 CDRs을 적당한 배향으로 잡아주는 역할을 한다 (CDRs로 하여금 항원과 결합할 수 있도록 함).

본 발명에서 사용되는 바 "불변 영역 (CR)"이라는 용어는 효과자 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 말한다. 본 발명에서, 불변 영역은 통상적으로 개의 불변 영역을 의미, 즉, 대상 견화 항체의 불변 영역이 개의 면역글로불린으로부터 유래한다는 것을 의미한다. 중쇄 불변 영역은 4개의 아이소타입: A, B, C 또는 D 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 바 "키메라 항체"라는 용어는 통상적으로 서로 다른 종으로부터 유래하는, 2개의 서로 다른 항체로부터 유래하는 서열을 함유하는 항체를 의미한다. 가장 통상적인 키메라 항체는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 공여자로부터 유래하는 가변 도메인과, 상기 항체가 투여될 표적 종으로부터 얻어지는 항체로부터 유래하는 불변 도메인을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 바 "면역원성"이라는 용어는 수용자에게 투여되는 경우 면역 반응 (체액성 또는 세포성 반응)을 이끌어내는 표적 단백질 또는 치료 모이어터 능력의 척도를 말한다. 본 발명은 대상 견화 항체의 면역원성에 관한 것이다. 본 발명의 상기 항체는 좋기로는 어떠한 면역원성도 없는데, 즉, 개에게 투여되었을 때 그들에 대항하여 어떠한 이종항체도 발생되지 않는다는 것이다.

본 발명에서 사용되는 바 "상동성" 또는 "서열 상동성"이라는 용어는 정렬된 서열 중 임의의 특정 아미노산 잔기 위치에 있어서 상기 정렬된 서열간 아미노산 잔기가 동일하다는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 바 "유사성" 또는 "서열 유사성"이라는 용어는 정렬된 서열 중 임의의 특정 위치에서, 상기 서열간 아미노산 잔기가 유사한 유형의 것이라는 것을 나타낸다. 예컨대, 유신은 이소류신 또는 발린 잔기를 치환할 수 있다. 이것을 보존적 치환이라고 부를 수 있다. 좋기로는, 본 발명의 아미노산 서열이, 그에 함유된 임의의 아미노산 잔기가 보존적 치환 방식으로 변형되었을 때, 이러한 변화는 비변형 항체와 비교하는 경우 결과되는 항체의 결합 특이성 또는 기능적 활성에 어떠한 효과도 미치지 않는다.

본 발명의 (본래) 폴리펩타이드 및 그 기능적 유도체와 관련한 서열 상동성은 서열들을 정렬하고 갭을 도입한 후 대응하는 본래 폴리펩타이드의 잔기와 동일한, 필요하다면 최대의 상동성 백분율을 얻기 위하여 상기 서열 상동성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않는, 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율에 관한 것이다. N- 또는 C- 말단 연장이나 삽입 어떠한 것도 서열 상동성 (identity or homology)을 저감시키는 것으로 해석되지는 않을 것이다. 2 이상의 아미노산 서열 정렬을 수행하고 그들의 서열 상동성을 결정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예컨대 2 이상의 아미노산 서열의 상동성 또는 유사성 백분율은, 예컨대 BLAST (Altschul et al. 1990), FASTA (Pearson & Lipman 1988), 또는 Smith-Waterman 알고리즘 (Smith & Waterman 1981)을 이용하여 쉽게 계산될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 바 제2 아미노산 잔기에 대하여 "가장 높은 상동성"을 갖는 아미노산 잔기는 제2 아미노산 잔기와 가장 공통되는 특징 또는 성질을 갖는 아미노산 잔기를 말한다. 아미노산 잔기가 제2 아미노산 잔기에 대하여 가장 높은 상동성을 갖는지를 결정하는 데 있어서, 평가는 통상적으로 전하, 극성, 소수성, 측쇄 질량 및 측쇄의 크기 등의 인자로 이루어질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 바 "대응하는 위치"라는 용어는 두 서열이 두 서열간 최대 서열 상동성을 갖도록 정렬될 때 제1 서열 중의 위치와 동일한 위치의 제 2 서열 중의 위치를 말하는 것으로 의도되는, 제1 서열 중의 특정 아미노산 잔기에 대응하는 위치의 제2 서열 중에 존재하는 아미노산 잔기를 말한다. 대응하는 위치의 아미노산 잔기들은 동일한 카바트 번호를 갖는다.

본 발명에서 사용되는 "필수적으로 ~로 이루어지다" 또는 "필수적으로 ~로 이루어지는"이라는 용어는 추가적인 특징 또는 요소가 개의 TNF에 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는다면, 폴리펩타이드가 기술된 것을 넘어선 이러한 추가적인 특징 또는 요소를 가질 수 있음을 의미한다. 즉, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 상기 항체 또는 항체 단편은 개의 TNF에 결합하고 개의 TNF 기능 활성에 길항 작용을 하는 항체 또는 항체 단편들의 능력을 간섭하지 않는 추가적인 특징 또는 요소를 가질 수 있다. 이러한 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위하여 아미노산 서열로 도입될 수 있다. 예컨대, 필수적으로 특정된 서열로 이루어지는 폴리펩타이드는 그 아미노산들이 개의 TNF에 대한 결합 및 그 생물학적 기능을 봉쇄하는 데 있어 상기 항체 또는 단편의 역할을 간섭, 억제, 차단 또는 중단시키지 않는다면, 상기 서열의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 모두에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 추가, 결실 또는 치환된 아미노산을 함유할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 개 TNF 길항 항체로 기여하는 폴리펩타이드 분자는 그 기능기들이 개의 TNF에 결합하고 그 기능을 길항 작용하는 항체 또는 항체 단편의 능력을 간섭하지 않는다면 이러한 하나 이상의 기능기로 화학적 변형될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는 TNFR1 수용체로의 개 TNF 결합을 억제하는 데 요구되는 본 발명의 제제, 결합 화합물, 소분자, 융합 단백질 또는 펩티도미메틱의 양을 의미한다.

"폴리펩타이드", "펩타이드", 또는 "단백질"이라는 용어는 본 발명에서 인접 잔기들의 알파-아미노기와 카복시기 간 펩타이드 결합에 의하여 서로간에 연결된 일련의 선형 아미노산 잔기를 지명하기 위하여 상호 교환적으로 사용된다. 아미노산 잔기는 보통 천연 "L" 이성질형으로 존재한다. 그러나 "D" 이성질형 잔기들은 그 폴리펩타이드에 의하여 원하는 기능적 성질이 보유되는 한 임의의 L-아미노산 잔리를 치환할 수 있다.

본 발명에서 정의되는 "항체"는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들의 단편에 의하여 유전적으로 인코딩 가능하거나 재조합으로 제조될 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 갖는, 관심 대상 표적 항원에, 이 경우에는 개의 종양 괴사 인자에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질을 포함한다. "항체"라는 용어는 모노클로날 및 키메라 항체, 특히 견화 항체를 포함하고, 폴리클로날 항체 또는 임의의 부류 또는 서브타입의 항체들 역시 포함한다. "항체"는 혼성화 항체, 2특이적 항체, 헤테로항체 및 항원 결합을 보유하는 이들의 기능적 단편에까지 이른다.

"특이적으로 결합하는"이라는 구문은 이형혼합 집단의 단백질들 중에 존재하는 특정 단백질 또는 표적에 대한 항체의 결합을 말한다. 그러므로, 특정한 면역 분석 조건하에 존재하는 경우, 상기 항체들은 특정 단백질, 이 경우에는 개의 TNF에 결합하고, 그 시료 중에 존재하는 다른 단백질들에 대하여는 유의한 양으로 결합하지 않는다.

본 발명에서 정의되는 "개 (canine)"은 개 (dog)로도 일컬어 질 수 있다. 개는 3항명 카니스 루푸스 파밀리아리스 (Canis lupus familiaris)(카니스 파밀리아리스 도메스티쿠스 (Canis familiaris domesticus)) 또는 카니스 루푸스 딩고 (Canis lupus dingo)를 갖는 아종에 속하는 것으로 범주화될 수 있다. 개는 임의의 견종을 포함하고 야생 및 애완 품종 모두를 포함하며, 후자는 또한 반려 동물로도 일컬어진다.

본 발명에서 정의되는 "이종항체"라는 용어는 숙주에 외래인 에피토프에 대항하여 상기 숙주에 의하여 발생되는 항체를 일컫는다.

본 발명은 설명의 목적으로 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지는 않는 하기 실시예들을 참조하여 설명될 것이다. 달리 표시되지 않는 한, 본 발명의 방법 및 기술들은 일반적으로 이 기술 분야에 잘 알려지고, 본 명세서를 통하여 인용되고 설명된 일반적이고 좀 더 구체적인 다양한 참조들에 개시된 관용적인 방법들에 따라 수행된다.

실시예

실시예 1 - 견 PET 화 ( PETised ) 항-견 TNF MAbs 인코딩 DNA 의 발현

SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:9의 서열을 설계하고 올리고뉴클레오티드 합성을 이용하여 DNAs로 제조하여 pcDNA3.1+ 발현 벡터에 서브클로닝하고 다양한 조합으로 CHO 세포로 트랜스펙션 하였다.

SEQ ID NO:3 (경쇄) 및 SEQ ID NO:5 (중쇄)의 아미노산 서열을 갖는 견화 항-TNF 모노클로날 항체 및 SEQ ID NO:8의 아미노산를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO:9의 중쇄를 갖는 키메라 항-TNF 모노클로날 항체를 인코딩하는 cDNAs을 pcDNA3.1+ (Invitrogen/ Life technologies)로 서브클로닝하였다. CHO 세포를 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:5의 견화 중쇄 및 경쇄 서열 (ca-HCB + ca-kLC) 또는 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9의 키메라 중쇄 및 경쇄 서열 (ch-HCB + ch-kLC) 중 하나의 조합으로 공트랜스펙션시켰다. 결과물 상층액을 단백질 A 상에서 정제, SDS-PAGE로 분석하고 (도 10A) ELISA로 표시된 항체 농도 (ug/ml)에서 견 TNFa에 대한 결합을 시험하여 (5 ug/ml에서 코팅; R&D systems) 항-견 폴리클로날 항체-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트를 이용하여 검출하였다 (Sigma A9042) (도 10B). 음성 대조군은 항원만으로 코팅된 상에서 검출된 폴리클로날 항체였다.

실시예 2 - 견 TNF 활성의 억제

인간 TNF에 대하여 형광으로 반응하는 TNF 감수성 NF-kB-EGFP 리포터 세포주를 생산하는 pTRH1 (Vince et al, Cell 131, 682, 2007)로 트랜스펙션시킨 293-HEK 세포들을 이용하여 정제된 항체들을 그들의 견 TNF 활성 억제능에 대하여 시험하였다. 견 TNF가 이들 세포들에서 GFP 발현을 활성화시킨다는 것이 최초로 입증되었고 그 후 도 11에 보여진 견 항체들을 그들의 1 ng/mL 견 TNF를 억제하는 능력에 대하여 시험하였다.

도 11에 나타난 바, 이 시험에서 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:5의 공트랜스펙션에 의하여 생산된 견화 항체 (ca-HCB + ca-kLC) 및 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9의 트랜스펙션으로 생산된 키메라 항체 (ch-HCB + ch-kLC) 양자 모두는 견 TNF에 대한 강력한 억제자이다.

이들 결과들은 함께 본 발명의 견화 항체들과 인간-견 키메라 컨스트럭트가 견 TNF에 결합하고 대등하다는 것을 ELISA 및 억제 시험 양자 모두를 통하여 ㅂ보보여주었고, 이는 견화 프로세스가 오리지날 D2E7 항체의 온전히 활성인 견 버전을 생산하였음을 입증하는 것이다.

도 12(A)는 항-인간 TNF MAb 클론 148계 다른 견화 항체와 상기 견화 및 키메라 D2E7 모노클로날 항체들 (MAbs)의 비교를 나타내고 있다. 견화 항--huTNF MAb 148 (SEQ ID NO:18 (ca148-HCB) 및 SEQ ID NO:19 (ca148-kLC))를 CHO 세포에서 발현시키고 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다 (패널 A, 좌 레인). 도 10 및 11의 견화 (Ca) 및 키메라 (Ch) D2E7계 MAbs와 비교하여 인간 TNF에의 결합 (패널 B) 및 견 TNF에의 결합 (패널 C)에 대하여 상기 MAb를 시험하였다 (백그라운드 음성 대조군 결합을 화살표로 나타내었다). 패널 B와 C로부터, 견화 MAb 148은 인간 TNF에 결합하지만 (패널 B) 견 TNF에는 결합하지 않음을 (패널 C) 알 수 있었다. 따라서, D2E7계 견화 및 키메라 MAbs 및 본 발명의 대상은 인간 TNF에의 결합과 동등한 견 TNF에의 예측치 못한 강한 결합을 보여주는 반면, 견화 MAb 148은 인간 TNF에만 결합을 보인다. 그러므로, 견화 D2E7계 MAbs은 견 TNF에 의하여 매개되는 개의 질병 치료에 놀랍도록 유용하다. 도 12(b) 및 12(c)는 각각 견화 MAb 148의 중쇄 아미노산 서열 (SEQ ID NO:18) 및 견화 MAb 148의 경쇄 아미노산 서열 (SEQ ID NO:19)을 보여준다.

도 13은 TNF 발현 세포들의 보체 제거를 매개하는 데 있어서 견화 D2E7 모노클로날 항체의 활성을 보여준다. RAW 세포를 10 ng/ml LPS로 처리 (컬럼 1-3) 또는 미처리 (컬럼 4-6)하여 막-결합 TNF 및 분비 TNF 발현을 유도하였다. 그 후, 상기 세포들을 10 μg/ml 견화 항-TNF 항체 (ca-HCB + ca-kLC)의 존재 또는 부존재 혈청으로 처리하였다. 컬럼 1 및 4, 혈청 더하기 항체; 컬럼 2 및 5, 혈청만; 컬럼 3 및 6, 무혈청 또는 무항체. 세포의 사멸을 Trypan Blue 염색된 죽은 세포들을 계수함으로써 평가하였다. 특이적인 세포 사멸은 견화 항체, 혈청 및 LPS 처리 조합에서만 관찰되었다 (컬럼 1). 도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 견화 항체 더하기 혈청의 조합으로의 후속 처리는 트리판 블루 염색으로 측정되는 세포 사멸을 유도한 반면, 항체나 혈청 단독은 그러하지 않았다. 이러한 항체들을 개에게 주입하는 것은 생체 내 견 TNF 발현 세포들의 수를 감소시켜 장기간 항-염증 효과라는 결과를 낳을 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 문헌은 참조로서 본 발명에 포함된다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 기재된 구현예들에 대한 다양한 변형 및 변경이 이 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 구체적인 양호한 구현예와 관련하여 본 발명을 설명하였지만, 청구된 바 본 발명이 그러한 구체적인 구현예들로 부당하게 한정되어서는 아니됨이 이해되어야 한다. 실제로, 이 기술 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명에 기재된 모드 수행에 대한 다양한 변형은 본 발명에 의하여 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> NVIP Pty Ltd Gearing, David <120> TUMOUR NECROSIS FACTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME <130> P120969.WO.01 <150> US 61/529020 <151> 2011-08-30 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninised anti-TNF Mab VK domain <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninised anti-TNF MAb VH domain <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser 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Human VK - canine kappa light chain <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Ala Gln 100 105 110 Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp Gln Leu His Thr Gly 115 120 125 Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln Asp Thr Gly Ile Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser His Glu Leu Tyr Ser 180 185 190 Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ser Phe 195 200 205 Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp 210 215 <210> 9 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric anti-TNF MAb. Human VH - canine heavy chain type B constant domain <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val 130 135 140 Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn 210 215 220 Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly 275 280 285 Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 290 295 300 Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln 340 345 350 Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn 355 360 365 Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile 370 375 380 Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr 385 390 395 400 Arg Thr <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FR1 <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FR2 <400> 11 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 12 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FR3 <400> 12 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FR4 <400> 13 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 FR1 <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 20 25 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 FR2 <400> 15 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 FR3 <400> 16 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 FR4 <400> 17 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ca148-HCB <400> 18 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 130 135 140 Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys 145 150 155 160 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly 165 170 175 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr 180 185 190 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 195 200 205 Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu 210 215 220 Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp 225 230 235 240 Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp 245 250 255 Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 260 265 270 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr 305 310 315 320 Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys 340 345 350 Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile 385 390 395 400 Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp 420 425 430 Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser 435 440 445 Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala 450 455 460 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 465 470 475 480 <210> 19 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ca148-kLC <400> 19 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Lys Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 115 120 125 Arg Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp 130 135 140 Gln Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln 165 170 175 Asp Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser 195 200 205 His Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr 210 215 220 Leu Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp 225 230 235 <210> 20 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric anti-TNF MAb. Human VH - canine heavy chain type A constant domain <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val 130 135 140 Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His 195 200 205 Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg 210 215 220 Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr 275 280 285 Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu 305 310 315 320 Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile 355 360 365 Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp 370 375 380 Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro 385 390 395 400 Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val 420 425 430 Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 21 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric anti-TNF MAb. Human VH - canine heavy chain type C constant domain <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Gln Ser Gly Ser Thr Val 130 135 140 Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Val Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Ala Lys Glu Cys Glu 210 215 220 Cys Lys Cys Asn Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro Gly Cys Gly Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu 245 250 255 Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp 260 265 270 Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser Lys Gln 275 280 285 Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Asn Gly Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Ser 305 310 315 320 Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro 325 330 335 Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln Ala His Gln Pro Asn 340 345 350 Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys Asn Thr Val 355 360 365 Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu Ile Asp Val 370 375 380 Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Met 385 390 395 400 Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys 420 425 430 Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Ile Ser Leu 435 440 445 Ser His Ser Pro Gly Lys 450 <210> 22 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric anti-TNF MAb. Human VH - canine heavy chain type D constant domain <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val 130 135 140 Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His 195 200 205 Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Glu Ser Thr 210 215 220 Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr 275 280 285 Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu 305 310 315 320 Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp 370 375 380 Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala 385 390 395 400 Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450

Claims (56)

1. 견(犬) 종양 괴사 인자에 특이적으로 결합하는 견화 항체 (canninised antibody) 또는 그들의 항원 결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체는
   - 개 이외의 종들로부터 유래하는 공여자 항체를 제공하는 단계로서, 상기 공여자 항체는 종양 괴사 인자에 대하여 결합 특이성을 갖는 것인 단계;
   - 상기 공여자 항체의 구조 영역의 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기를 하나 이상의 견 항체들의 구조 영역의 아미노산 서열 내 대응하는 위치에 존재하는 각 아미노산 잔기와 비교하여, 상기 하나 이상의 견 항체들의 구조 영역의 아미노산 서열 내 대응하는 위치의 하나 이상의 아미노산 잔기들과 상이한 상기 공여자 항체의 구조 영역의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기들을 식별하는 단계;
   - 상기 공여자 항체 내에서 식별된 상기 하나 이상의 아미노산 잔기들을, 상기 하나 이상의 견 항체들 내 대응하는 위치의 상기 하나 이상의 아미노산 잔기들로 치환하는 단계
   를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
3. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 식별된 아미노산 잔기들을 치환하는 단계는, 상기 하나 이상의 식별된 아미노산 잔기들을, 하나 이상의 치환되는 아미노산 잔기들과 고도의 상동성을 갖는 대응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기들로 치환하는 것을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 방법은,
   상기 공여자 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인들을, 견 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인들로 교체하는 단계를 더 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 견화 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
6. 제5항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:4, 비글리코실화된 SEQ ID NO:4, 비글리코실화된 SEQ ID NO:5, 비글리코실화된 SEQ ID NO:6, 비글리코실화된 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은
   SEQ ID NO:10의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR1 구조 영역,
   SEQ ID NO:11의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR2 구조 영역,
   SEQ ID NO:12의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR3 구조 영역, 및
   SEQ ID NO:13의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR4 구조 영역 중 하나 이상을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는
   SEQ ID NO:14의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR1 구조 영역,
   SEQ ID NO:15의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR2 구조 영역,
   SEQ ID NO:16의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR3 구조 영역, 및
   SEQ ID NO:17의 아미노산 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 FR4 구조 영역
   중 하나 이상을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
10. 제9항에 있어서, 5번 위치의 아미노산 잔기 T (T5)는 아미노산 잔기 M 또는 I로 교체, S7은 T, A9는 L 또는 P, S12는 A, L13은 V, S14는 T 또는 R, Q15는 P 또는 R, E16은 D, K18은 E, A, P, T 또는 L, V19는 A, T20은 S, T22는 S 또는 Y 및 C23은 Y로 교체되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형된 SEQ ID NO:10의 FR1 영역을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, Y2는 F, I 또는 L, Q3은 R, L 또는 I, Q4는 H, K5는 R, P6은 S 또는 A, G7은 D, A9는 S, T 또는 P, K11은 Q, E 또는 R, L12는 R, P, G, A 또는 S, I14는 L 및 Y15는 F, N, S, E 또는 V로 치환되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형된 SEQ ID NO:11의 FR2 영역을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, G1은 A, V2는 A, P3은 S, S4는 D, F6은 L 또는 V, S7은 I, G8은 A, T13은 A, D14는 E, T16은 S 또는 R, L17은 F, T18은 R 또는 K, S21은 R, G 또는 T, L22는 V, P24는 A, E25는 D, G, I 또는 N, V27은 A, T, G 또는 S, A28은 G 및 V29는 I 또는 L로 치환되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형된 SEQ ID NO:12의 FR3 영역을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, G2는 S, Q3은 A, P 또는 T, G4는 E, T5는 P, K6은 Q 또는 S, V7은 L 또는 W, E8은 D 또는 R 및 I9는 L로 치환되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형된 SEQ ID NO:13의 FR4 영역을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
14. 제9항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, E1은 D 또는 G, V2는 G, L, E, I 또는 M, Q3은 H, R, A, V, E, K, L, P 또는 S, L4는 V 또는 P, V5는 A, L, E 또는 M, E6은 Q 또는 A, S7은 F, L 또는 T, G9는 E, G10은 D, A, N, E 또는 T, L11은 Q, R, V 또는 W, V12는 A, I 또는 M, Q13은 K, R 또는 N, P14는 F 또는 T, G15는 A, E 또는 T, G16은 E 또는 A, S17은 T 또는 P, L18은 R, R19는 K, T, G 또는 V, L20은 I 또는 V, S21은 Y, A23은 V, L, I 또는 E, A24는 T, V, G, I 또는 S, S25는 P, G 또는 T, G26은 D, R 또는 T 및 F27은 L, I, S, D, T 또는 V로 치환되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형된 SEQ ID NO:14의 FR1 영역을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
15. 제9항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, W1은 C, V2는 I, A, F 또는 L, Q4는 L 또는 H, A5는 S, T, G, P, V 또는 D, P6은 L, G7은 E, R 또는 L, K8은 R, E, G, A, M 또는 Q, G9는 E, R, D, T 또는 V, L10은 T, P, F 또는 M, E11은 Q, H, D, L, P 또는 R, W12는 L, C, S, Y, F 또는 M, V13은 L, I 또는 F 및 S14는 A, T, G 또는 L로 치환되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형된 SEQ ID NO:15의 FR2 영역을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
16. 제9항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, R1은 Q, F2는 V 또는 L, T3은 A, I 또는 S, I4는 V, L, M 또는 T, S5는 A, F 또는 T, R6은 K, D7은 E 또는 N, N8은 D, T, S, I 또는 G, A9는 G, V, S, D, P 또는 T, K10은 R, E, N, Q, G 또는 M, N11은 D, S, K, H 또는 R, S12는 T, M, I 또는 A, L13은 V, M, A 또는 I, Y14는 F, H, S 또는 T, L15는 I, Q16은 H, E, D, R 또는 A, M17은 L, N18은 D, S, T, H, K, P 또는 R, S19는 G, D, R, N 또는 T, L20은 V, R21은 T, G, K, S 또는 I, A22는 V, D, T, S, G 또는 P, E23은 D, A 또는 V, T25는 A, S 또는 M, A26은 G 또는 V, V27은 M, I, L, F, T, K 또는 Q, Y28은 H, Y29는 F 또는 H, A31은 V, T, G, M, R, S, C 또는 L 및 K32는 R, S, N, G, A, T, P, D, Q, V, E, I, M으로 치환되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형된 SEQ ID NO:16의 FR3 영역을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
17. 제9항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, W1은 L, G2는 A 또는 S, Q3은 P, H, R 또는 D, T5는 A, S, I 또는 N, L6은 S, Q, P 또는 R, V7은 L, I 또는 P, T8은 F, I, A, S, L, P 또는 Y, V9는 A, S10은 A, C, P 또는 T 및 S11은 L, A 또는 P로 치환되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형된 SEQ ID NO:17의 FR4 영역을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
18. 견 종양 괴사 인사에 특이적으로 결합하는 키메라 항체 또는 그들의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
19. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
20. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 그들의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:22로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 그와 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 결합 친화도 (K_D) 1x10^-8 또는 그 미만으로 견 TNF에 결합하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 견 TNF에 대한 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 TNFR1 수용체에 결합하는 견 TNF의 능력을 억제하는 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
23. 상기 항원 결합 단편은 단쇄 Fv (scFv) 항체 단편, Fab 항체 단편, Fab' 항체 단편 및 F(ab')₂ 항체 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 기재된 그들의 항원 결합 단편.
24. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 다가 항체 (multivalent antibody)인 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
25. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 다특이적 항체 (multispecific antibody)인 것인 항체 또는 그들의 항원 결합 단편.
26. - 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편 치료적 유효량을 제공하는 단계와,
    - 그를 필요로 하는 개에게 이들을 투여하는 단계
    를 포함하는 면역 매개 질환을 치료, 개선 또는 예방하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 면역 매개 질환은 만성 염증성 질병인 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 만성 염증성 질병은 면역 매개 다발성 관절염, 류마티스 관절염, 골관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선 및 건선성 관절염, 전신성 혈관염, 아토피성 피부염, 울혈성 심부전, 난치성 포도막염, 기관지 천식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
29. 제26항에 있어서, 상기 면역 매개 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 허혈성 심장 질환 및 근위축성 측색 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 TNF-알파 관련 장애인 것인 방법.
30. 제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료 제제를 공투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료 제제는 메토트렉세이트 (methotrexate), 견 TNF 융합 단백질, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체 또는 이들의 유도체들, 견 TNF에 대한 키메라 항체 또는 견 항체, 항-견 TNF 항체 단편, 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드, 스테로이드 및 신경 성장 인자의 길항제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료 제제는 항생제, 항진균제, 항원충제 및 항바이러스 치료 제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
33. 제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료 제제는 염증 매개자의 억제제, PGE-수용체 길항제, 면역억제제, 시클로스포린, 항염증 글루코코르티코이드, 인지 기능장애 또는 인지 손상의 치료에 사용하기 위한 제제, 항고혈압제, 심혈관 기능장애의 치료에 사용하기 위한 화합물, 이뇨제, 혈관확장제, 베타-아드레날린성 수용체 길항제, 안지오텐신-II 전환 효소 억제제, 칼슘 채널 차단제 및 HMG-CoA 환원효소 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
34. 제26항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 개에게 약 0.01 mg/체중kg 내지 약 10 mg/체중kg 범위의 투여량으로 투여되는 것인 방법.
35. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 치료적 유효량의 항체 또는 그들의 결합 단편과 더불어 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 캐리어, 첨가제 또는 희석제를 포함하는, 면역 매개 질환의 치료, 개선 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
36. 제35항에 있어서, 메토트렉세이트, 견 TNF 융합 단백질, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체 또는 이들의 유도체들, 견 TNF에 대한 키메라 항체 또는 견 항체, 항-견 TNF 항체 단편, 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드, 스테로이드 및 신경 성장 인자의 길항제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 치료 제제를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
37. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
38. SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 항-견 TNF 견화 항체 또는 항체 단편의 경쇄 가변 도메인, 또는
    SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄
    를 인코딩하는 단리된 핵산.
39. SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 항-견 TNF 견화 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 도메인, 또는
    SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄
    를 인코딩하는 단리된 핵산.
40. 제37항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 조절 서열들과 작동적으로 연결된 것인 단리된 핵산.
41. 제37항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 조절 서열들을 더 포함하는 것인 발현 벡터.
43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터인 것인 발현 벡터.
44. 제41항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
45. 세포로 하여금 견화 항-견 TNF 중화 항체를 발현하도록 하는 제44항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항-견 TNF 중화 항체의 생산 방법.
46. 제37항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산의 치료적 유효량을 개에게 투여하는 단계를 포함하는, 개의 면역 매개 질환을 치료, 개선 또는 억제하는 방법.
47. 개의 염증성 질병을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한,
    제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항체 결합 단편,
    제35항 또는 제36항에 기재된 약학적 조성물,
    제37항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산, 또는
    제41항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터.
48. 제47항에 있어서, 상기 만성 염증성 질병은 류마티스 관절염, 골관절염 및 기타 다발성 관절염, 면역 매개 다발성 관절염, 강직성 척추염, 크론병 및 궤양성 대장염, 건선 및 건선성 관절염, 전신성 혈관염, 아토피성 피부염, 울혈성 심부전, 난치성 포도막염, 기관지 천식 및 알레르기성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
49. 관절염의 치료에 사용하기 위한,
    제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항체 결합 단편,
    제35항 또는 제36항에 기재된 약학적 조성물,
    제37항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산, 또는
    제41항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터.
50. 제49항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염, 면역 매개 다발성 관절염 및 류마티스 관절염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
51. 개의 만성 염증성 질병을 치료, 개선 또는 예방하기 위한 의약에 제조에 있어서,
    제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항체 결합 단편,
    제35항 또는 제36항에 기재된 약학적 조성물,
    제37항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산, 또는
    제41항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터의 용도.
52. 제51항에 있어서, 상기 만성 염증성 질병은 류마티스 관절염, 면역 매개 다발성 관절염, 골관절염 및 기타 다발성 관절염, 강직성 척추염, 크론병 및 궤양성 대장염, 건선 및 건선성 관절염, 전신성 혈관염, 아토피성 피부염, 울혈성 심부전, 난치성 포도막염, 기관지 천식 및 알레르기성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 상기 항체 또는 항체 결합 단편의 용도.
53. 개의 관절염을 치료, 억제, 개선 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서,
    제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체 또는 항체 결합 단편,
    제35항 또는 제36항에 기재된 약학적 조성물,
    제37항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산, 또는
    제41항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 발현 벡터의 용도.
54. 제53항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염, 면역 매개 다발성 관절염 및 류마티스 관절염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 상기 항체 또는 항체 결합 단편의 용도.
55. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 항-견 TNF 중화 모노클로날 항체 또는 그들의 단편을 생산하는, 세포주 또는 그들의 유도체 또는 자손 세포.
56. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 기재된 항-견 TNF 항체 및 이들의 사용을 위한 지침을 포함하는, 개의 만성 염증성 질병 치료를 위한 키트.

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