KR20160079939A - 치료용 개 면역글로불린 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

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엔브이아이피 피티와이 리미티드
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Abstract

개를 치료하는데 사용하기에 적합한 개 항체의 제조방법이 제공된다. 특히, 본 발명에 따라 표적 항원에 결합될 때 하류 보체 매개성 면역 활성화를 매개하는지 매개하지 않는지에 따라 선택될 수 있는 면역글로불린이 선택된다. 특이적인 중쇄 아이소타입을 포함하는 개 유래 항체가 제공된다. 본 발명은 개에 있어서 통증, 염증 질환 및 암 질환과 같은 질환의 치료 방법에 사용되기 위한 본 발명의 면역글로불린의 용도에 관한 것이기도 하다.

Description

치료용 개 면역글로불린 및 이를 이용하는 방법{THERAPEUTIC CANINE IMMUNOGLOBULINS AND METHODS OF USING THE SAME}
본 발명은 가용성 세포외 매개자 및/또는 세포 표면 수용체의 길항제로서 사용되기 위한, 특이적인 중쇄 불변부를 갖는 개 (canine, 犬) 또는 개로부터 유도된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 개과 대상체에 있어서 염증, 통증, 암 또는 감염과 같은 질환을 선택적으로 치료하기 위한 방법에 있어서 상기 항체 또는 그의 단편의 치료적 용도에 관한 것이기도 하다.
염증성 질환 (예컨대 류마티스성 관절염, 건선, 염증성 장질환), 알레르기 (예컨대 천식), 암 (예컨대 임파종, 유방암, 장암), 감염성 질환 (예컨대 RSV 감염), 통증 (예컨대 골괄절염성 통증, 암 통증, 하배부 통증) 및 안 질환 (예컨대 노년기 황반변성)을 비롯한 많은 인간 질환을 치료하는데, 면역글로불린의 불변 도메인 단편들을 이용하여 구축된 재조합 면역글로불린 및 융합 단백질이 이용되고 있다.
이러한 치료의 분자 표적으로는 시토카인 및 케모카인 (예컨대 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-5 (IL-5), 과립구 집락-자극 인자 (GCSF), 과립구-대식세포 집락 자극인자), 성장 인자 (예컨대 신경 성장 인자 (NGF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 종양 괴사 인자 (TNF)), 세포 표면 수용체 (예컨대 HER-2, VEGFR, EGFR, CD20), 세포 표면-결합 성장 인자 (예컨대 미가공 종양 괴사 인자), 바이러스 (예컨대 RSV) 및 보체 캐스케이드의 성분 (예컨대 C5)을 들 수 있다. 질환의 진행과 연관된 것으로 입증된 다른 많은 표적들이 알려져 있다 (예컨대 본 발명에 참조 ㅌ통합된 IMGT /MAb-DB 데이터베이스 Version 1.3.1 14 Dec 2011에 개시되어 있음 (URL: www.imgt.org/mAb-DB/query)).
천연 면역글로불린들은 면역글로불린 G (IgG), 면역글로불린 A (IgA), 면역글로불린 M (IgM) 또는 면역글로불린 E (IgE)를 비롯하여 여러가지 주요 서브타입으로서 생산되며, 이들 면역글로불린들은 감염에 대하여 표적 항원에 대한 결합에 의해 병원체의 인식, 무력화, 파괴 및 제거에 있어서 다양한 역할을 한다. 면역글로불린 G는 (인간에 있어서) IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은 다양한 몇가지 아이소타입 (아이소폼이라고도 알려져 있음)으로서 생산된다. 이들 항체 아이소타입들은 구조가 서로 다르고, 특히 불변부의 아미노산 서열, 특히 C1 및 C2 도메인 사이의 불변 도메인(Fc)의 힌지부 주변의 아미노산 서열이 특히 다르다.
상이한 항체 아이소타입들은 또한 그 항체가 매개하는 하류(downstream) 이펙터 기능의 관점에서도 상이하다. 예를 들어, 어떤 항체의 불변부 서열은 항체의 이펙터 기능 (ADCC, 보체 고정 및 활성화), 약동학 및 물리적 특성과 같은 특징들에 강한 영향을 매개할 수 있다. 상이한 아이소타입들을 갖는 항체는 또한 면역 세포 상의 IgG Fc 수용체들에 결합하는 그들의 능력 측면에서도 상이하다. 인간의 경우, IgG1 및 IgG3는 보체 동원에 활성적임으로 해서 혈액 내의 보체 효소의 연쇄반응(캐스캐이드)에 의해 표적을 파괴하는데 도움을 주고 (CDC: 보체 의존성 세포독성), 이와 유사하게 IgG1 및 IgG3는 항체-매개성 세포독성 (ADCC)에 의해 결합된 항원의 파괴를 표적화하는 면역 세포들 상의 Fc 수용체에 결합한다. 이와 대조적으로, IgG2 및 IgG4는 보체를 동원하거나 ADCC 매개형 공격을 활성화하지는 않고 다만 표적 항원에 고친화도로 결합하여 그의 활성을 억제하거나 무력화시킨다.
재조합 면역글로불린들 및 이로부터 만들어진 융합 단백질은 질병 개재를 위한 표적을 고려할 때 Fc 아이소타입의 활성을 고려하도록 설계된다. 예를 들어, 인간의 암 세포의 사멸에 표적화된 항체의 이용을 목적으로 하는 치료적 접근법이 고려될 경우, IgG1 또는 IgG3 아이소타입 Fc 도메인으로부터의 재조합 면역글로불린을 구축하는 것이 바람직한데, 이는 이들 아이소타입을 사용하면 CDC 및 ADCC와 같은 면역 매개성 파괴 메카니즘이 유도될 것이기 때문이다. 이와 대조적으로, 민감한 인체 조직 관점에서 가용성 매개자를 표적화 할 경우에는 Fc 도메인은 생략되거나 (예컨대 인간의 노년기 황반 변성을 치료하는 경우 VEGF를 표적화하는 Fab 단편들이 바람직하다) 또는 IgG2 또는 IgG4 Fc 도메인을 이용하여 구축된다 (예컨대 신경변성 또는 염증성 통증에서 신경 성장 인자를 표적화하거나, 신염, 건선 또는 류마티스성 관점에서 보체 C5를 표적화). 이러한 논의는 인간 IgG1 Fc 치료에 기반하는, 류마티스성 관절염과 같은 질환을 치료하는 경우 가용성 RNF 수용체 Fc 융합 단백질과 같은 면역글로불린 융합 단백질에도 적용된다.
개 그리고 마우스 및 말과 같은 기타 종에 있어서도, 면역글로불린 아이소폼이 존재하지만 상호 간의 상동성은, CDC 또는 ADCC와 같은 하류 이펙터 기능을 유도하는데 있어서 어떤 서열들이 활성 또는 불활성일지 우선순위(priori)를 매길 수 있을 정도로 충분하지 않다. QNs만 아니라, 종들마다 면역글로불린들의 수는 서로 다르다 (예컨대 개의 경우, 4개의 IgG 면역글로불린들, 즉 caIgG-A, caIgG-B, caIgG-C, 및 caIgG-D가 존재한다 (Tang et al., 2001)). 말의 경우에는 7개의 IgG 아이소타입이 존재한다 (Wagner, 2006).
서열 분석 또는 서열 상동성 만으로는 비인간 종들의 어떤 특이적인 면역글로불린 아이소타입이 Fc 수용체 결합 및 하류 이펙터 기능의 매개 관점에서 활성적일지 또는 불활성적일지를 판정하는 것이 불가능하다. 그러나, 이것을 알 수만 있다면, 유의적인 가치를 지닐 것인데, 이는, 항체 결합 단편 또는 융합 단백질과 같은 항체 또는 항체 기반 치료법의 치료적 효능을 제공하는데 있어서, 항체 생산을 위한 아이소타입 불변부의 선택이 중요할 수 있기 때문이다.
발명의 개요
본 발명의 발명자는 집중적인 연구 실험을 통해, 놀랍게도 개의 IgG 면역글로불린의 아이소타입들이 인간 IgG 항체들에서 관찰되는 특성을 공유한다는 것, 즉 어떤 IgG 항체 아이소타입들은 면역 이펙터 기능을 활성화하는데 있어서 활성적인 반면, 다른 IgG 항체 아이소타입들은 면역 이펙터 기능을 활성화시키지 않으며 그에 따라 불활성적이라는 것을 발견하였다. 뿐만 아니라, 개에 있어서 공지의 4개의 중쇄 면역글로불린들 (HCA (caIgG-A), HCB (caIgG-B), HCC (caIgG-C) 및 HCD (caIgG-D)로 알려짐) 중, 2개 (caIgG-B 및 caIgG-C)의 중쇄 불변 도메인들은 여러가지 치료적 표적들을 표적화하는 다양한 재조합 형태로서 구축될 경우, 놀랍게도 보체에 결합하는 반면, 다른 2개 (caIgG-A 및 caIgG-D)는 그렇지 않다는 것을 밝혀냈다.
따라서, 본 발명은 표적의 파괴가 요망되는 개의 치료법 (예컨대 암 또는 감염성 질환의 치료)에서 이용될 수 있는 특정한 재조합 개 면역글로불린 또는 그로부터 만들어진 융합 단백질; 및 표적의 파괴보다는 단지 표적의 무력화(neutralisation) 만이 요망되는 개의 치료 (예컨대 통증 치료)시 선호될 수 있는 기타의 특정 아이소폼들을 정의한다.
본 발명은 따라서 그들의 중쇄 불변 도메인의 아이소타입에 기초하여, 보체 캐스케이드의 첫번째 구성요소에 결합할 수 있는 그들의 능력에 의해 구별될 수 있는, 개의 재조합 면역글로불린들을 제공한다. 그 결과, 최초로, 개의 치료시
의도된 표적이 보체 매개성 세포독성 (CDC; 예컨대 생체내에서 개의 종양을 사멸시키기 위한 용도)을 통한 면역 매개형 파괴를 위해 선택되는지 또는 표적이 바람직하지 못한 면역 매개형 파괴 (예컨대 신경 근방 또는 눈 근처에서)의 부재시 단지 무력화를 위해 선택되는지에 따라, 개에 대한 요구되는 치료법에 알맞게 개의 재조합 면역글로불린을 최초로 선택할 수 있게 되었다.
본 발명의 첫번째 측면에 따라, 개를 치료하는데 사용되기 위한 항체, 융합 단백질, 그의 결합 단편이 제공되며, 여기서 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것으로서, 여기서 상기 중쇄의 아미노산 서열은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 경우 하류의 면역계 이펙터 기능의 활성화를 최소화시키는 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 개의 치료법은 관절염 또는 관절염 질환과 같이, 통증이나 염증 또는 이와 연관된 질환을 치료하는데 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편의 개 대상체에 있어서 관절염 또는 관절염 질환과 같이, 통증이나 염증 또는 이와 연관된 질환을 치료하는데 사용되는 의약의 제조를 위한 용도를 제공하는 것으로, 여기서 상기 중쇄의 아미노산 서열은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 경우 하류의 면역계 이펙터 기능의 활성화를 최소화시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 관절염 또는 관절염 질환과 같은 통증이나 염증 또는 이와 관련된 질환의 치료를 필요로 하는 개 대상체에 있어서:
- 통증 또는 염증의 치료 또는 예방에 있어서 특이적인 기능을 갖는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편을 제공하는 단계로서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편은 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것이고, 여기서 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편은 하류의 면역계 이펙터 기능을 활성화하지 않는 것인 단계, 및
- 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편의 치료적 유효량을 개 대상체에 투여하는 단계
를 포함하여 이루어지는, 통증 또는 염증 또는 이와 관련된 질환을 치료, 억제, 또는 경감시키기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 개 대상체에 있어서 통증 또는 염증을 치료, 억제 또는 경감시키기 위한 의약을 제조하는데 사용되기 위한 것으로서 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 개로부터 유도된 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
특정 구체예에 있어서, 통증은 신경병성 통증이다. 특히, 통증은 시술 주위, 시술후 또는 외과수술 후의 통증일 수 있다. 시술후 통증 (Post-operative pain)은 개에 있어서 정형외과 수술, 연조직 외과수술, 난소적출수술, 거세 등과 같은 수술 후에 일어날 수 있으나 상기한 수술들로 한정되지 않는다. 또 다른 특정 구체예에서, 통증은 암 또는 암 질환 (발암성 통증)과 연관된 만성 통증이다. 또 다른 특정 구체예에서, 통증은 류마티스성 관절염, 골관절염, 염증 또는 소양증과 연관된 것이거나 이들에 기인하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 개 대상체에 있어서 관절염 또는 관절염 병태의 치료 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은:
- 통증 또는 염증의 치료 또는 예방에 있어서 특이적인 기능을 갖는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편을 제공하는 단계로서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편은 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것이고, 여기서 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편은 하류의 면역계 이펙터 기능을 활성화하지 않는 것인 단계, 및
- 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편의 치료적 유효량을 개 대상체에 투여하는 단계
를 포함하여 이루어지는, 개 대상체에 있어서 관절염 또는 관절염 병태의 치료 방법을 제공하는 것이다.
*특정 구체예에 있어서, 본 발명의 전술한 방법은 본 발명의 항체의 효능을 증강 및/또는 보충할 수 있는 적어도 1종의 추가 물질을 공동-투여하는 단계를 더 포함한다. 에를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 1종의 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드 또는 스테로이드와 함께 공동-투여될 수 있다. 적절한 진통제의 예로는 부토르파놀, 10 부프레노르핀, 펜타닐, 플루닉신 메글루민, 메르피딘, 포르핀, 날부핀 및 그의 유도체를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 적절한 NSAIDS의 예로는 아세트아미노펜, 아세틸살리실산, 카프로펜, 에토돌락, 케토프로펜, 멜록시캄, 피로콕시브, 로베나콕시브, 데라콕시브 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
특정 구체예에서, 전술한 방법은 적어도 1종의 또 다른 성분을 투여하는 것을 수반할 수 있다. 상기 성분은 항생제, 항진균제, 항원생동물제, 항바이러스제 또는 이들과 유사한 치료제로부터 선택된 1종 이상의 치료적 활성 성분일 수 있다. 또한, 상기 적어도 1종의 추가 성분은 염증 매개자(들)의 억제제 예컨대 PGE-수용체 길항제, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 항염성 글루코코르티코이드일 수 있다. 또 다른 측면에서 적어도 1종의 추가 성분은 개가 늙을수록 점점 더 많이 앓게되는 질환인 인지장애 또는 손상 예컨대 기억상실 또는 관련 병태를 치료하는데 사용되는 성분일 수도 있다. 또한, 적어도 1종의 추가 성분은 심혈관 장애, 예컨대 고혈압, 심근 허혈, 울혈성 심부전증 등과 같은 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 항고혈압약 또는 기타 화합물일 수 있다. 나아가, 적어도 1종의 상기 추가 성분은 이뇨제, 혈관확장제, 베타-아드레날린 수용체 길항제, 안지오텐신-II 전환효소 억제제, 칼슘채널 차단제 및 HMG-CoA 환원효소 억제제일 수 있다.
본 발명의 전술한 측면들의 특정 구체예에서, 하류 면역계 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포 매개형 세포독성(ADCC), 및 항체 의존성 세포 발병기전(ADCP)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열은 C1q에 대한 중쇄의 결합을 억제하며, 이것은 보체 연쇄반응(캐스케이드) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)의 유도를 방지한다.
특정 구체예에서, 표적 항원은 가용성 매개자이다. 특정 구체예에서, vywr 항원은 신경 성장 인자 (NGF)이다. 특정 구체예에서, 항체는 통증 또는 염증을 매개하는 수용체에 특이적으로 결합하거나 또는 그 수용체를 길항한다. 또 다른 특정 구체예에서, 표적 항원의 예로는 시토카인 또는 케모카인 (예컨대 인터류킨-1 및 관련 인터류킨 IL-2 내지 IL-35, 과립구 집락-자극 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 에리쓰로포이에틴, 트롬보포이에틴, 백혈병 억제 인자, 섬모 향신경성 인자, 온코스타틴 M), 성장 인자 (예컨대 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유도형 향신경성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 종양 괴사 인자(TNF), 세포 표면 수용체 (예컨대 HER-2, VEGFR, EGFR, CD20), 세포 표면-결합 성장 인자 (예컨대 미가공 종양 괴사 인자), 바이러스 (예컨대 RSV) 및 보체 캐스케이드 성분들 (예컨대 C5, C5a)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라 개를 치료하는데 사용되기 위한 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편이 제공되며, 여기서 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것으로서, 상기 중쇄 아미노산 서열은 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때 하류의 면역계 이펙터 기능의 활성화를 매개하는 것이다.
특정 구체예에서, 개의 치료법은 암 또는 악성 질환의 치료에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 개 대상체의 암 또는 악성 질환 치료용 의약의 제조에 있어서, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편의 용도를 제공하며, 여기서 상기 중쇄 아미노산 서열은 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때 하류의 면역계 이펙터 기능의 활성화를 매개하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 개 대상체에 있어서 암 또는 악성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은:
- 암 또는 악성 질환의 치료에 있어서 특이적인 기능을 갖는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편을 제공하는 단계로서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편은 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것이고, 여기서 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편은 하류의 면역계 이펙터 기능을 활성화시키는 것인 단계, 및
- 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편의 치료적 유효량을 그러한 치료를 필요로 하는 개 대상체에 투여하는 단계
를 포함하여 이루어지는, 개 대상체에 있어서 암 또는 악성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 전술한 방법은 본 발명의 항체의 효능을 증강 및/또는 보충하는 적어도 하나의 추가 제제를 공동-투여하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 개 대상체에 있어서 암 또는 악성 질환 치료용 의약의 제조를 위한, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는, 개로부터 유도된 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 전술한 측면들의 특정 구체예에서, 하류 면역계 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성 (CDC), 항체 의존성 세포 매개성 세포독성 (ADCC), 및 항체 의존성 세포 발병기전 (ADCP)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 중쇄 불변 도메인의 아미노선 서열은 C1q에 대한 중쇄 결합을 제공하는데, 이에 의해 보체 연쇄반응 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)의 유도가 방지된다. 특정 구체예에서, 중쇄 불변 도메인은 Fc 수용체들에 대한 결합을 제공하며, 이것은 다시 ADCP 및/또는 ADCC 면역 반응을 매개할 수도 있다.
특정 구체예에서, 표적 항원은 암 특이 항원이다. 본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 표적 항원은 개의 종양 세포 상에서 발현되는 막 결합 단백질들의 군으로부터 선택될 수도 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 개의 막 결합 종양 단백질은 CD2, CD4, CD8, CD20, EGFR, VEGFR, HER2 등을 포함하는 단백질 군으로부터 선택될 수도 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 표적 항원은: 시토카인 및 케모카인 (예컨대 인터류킨-1 (IL-1), IL-2, IL-3 및 IL-35까지의 인터류킨, 과립구 집락-자극 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 에리쓰로포이에틴, 트롬보포에틴, 백혈병 억제 인자, 섬모 향신경성 인자, 온코스타틴 M), 성장 인자 (예컨대 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유도형 향신경성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 종양 괴사 인자(TNF), 세포 표면 수용체 (예컨대 HER-2, VEGFR, EGFR, CD20), 세포 표면-결합 성장 인자 (예컨대 미가공 종양 괴사 인자), 바이러스 (예컨대 RSV) 및 보체 캐스케이드 성분들 (예컨대 C5, C5a)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 개의 질환 치료에 사용되기 위한 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편을 제공하는데, 여기서 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때 C1q에 결합하지 않는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것이고, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는 것이다.
특정 구체예에서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 특정 구체예에서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:15로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 도메인을 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면은 개에 있어서 통증 및/또는 염증과 관련된 질환의 치료용 의약을 제조하는데 있어서의 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편의 용도를 제공하는 것으로서, 여기서 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때 C1q에 결합하지 않는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것이고, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는 것이다.
특정 구체예에서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 특정 구체예에서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:15로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 도메인을 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면은 개 대상체에 있어서 관절염 또는 관절염 질환과 같은 통증 또는 염증 또는 이와 관련된 질환을 치료, 억제 또는 경감시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은:
- 항체가 그의 표적 항원에 결합할 때 C1q에 결합하지 않는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편을 제공하는 단계로서 여기서 상기 항체는 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는 것인 단계, 및
- 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편의 치료적 유효량을 상기 치료를 필요로 하는 개 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하여 이루어진다.
특정 구체예에서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 특정 구체예에서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:15로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 도메인을 갖는다.
또 다른 다양한 측면에서, 본 발명은: (i) 본 발명의 전술한 항체, 융합 단백질 또는 항체 단편을 인코딩하는 핵산, (ii) 상기 핵산을 운반하는 벡터, (iii) 상기 벡터를 운반하는 숙주 세포에 관한 것이기도 하다. 본 발명은 또한 본 발명에서 상기 정의된 바와 같은 항체 및 융합 단백질의 제조방법에 관한 것이기도 하다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 1종의 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 발명의 항체 또는 융합 단백질을 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 표적 항원에 대한 특이적 결합을 위해 개에게 치료적으로 투여될 수 있는 재조합 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편으로서 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편에 대한 C1q 보체 결합 및 결합된 보체 의존성 세포독성을 의해 특징지어지는 면역 반응을 추가로 매개할 수 있는 것인 재조합 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 제공하며, 여기서 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편의 중쇄는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 B (HCB, caIgG-B), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 C (HCC, caIgG-C) 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 개의 탈글리코실(탈글리코실) 면역글로불린 중쇄 아이소타입 C (HCC, caIgG-C)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 B (HCB, caIgG-B), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 C (HCC, caIgG-C) 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 개의 탈글리코실 면역글로불린 중쇄 아이소타입 C (HCC, caIgG-C)을 포함하는 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의 용도, 즉 표적 항원에 대한 특이적인 결합이 요구되고 상기 항원, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편에 대한 C1q 보체 결합 및 결합된 보체 의존성 세포독성에 의해 특징지어지는 면역 반응이 요망되는 질환의 치료에 사용되기 위한 의약의 제조에 있어서의, 상기 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 개 대상체에 있어서 암 질환의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은:
- 종양 특이 항원에 대한 결합 특이성을 가지고 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 B (HCB, caIgG-B), SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 C (HCC, caIgG-C) 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 개의 탈글리코실 면역글로불린 중쇄 아이소타입 C (HCC, caIgG-C)을 추가로 포함하는 면역글로불린, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 제공하는 단계, 및
- 상기 면역글로불린, 융합 단백질 또는 결합 단편을 상기 치료를 필요로 하는 개 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하여 이루어진다.
다양한 추가 측면에서, 본 발명은 요망되는 표적 항원에 결합하고, C1q에 결합하지 않는 중쇄 불변 도메인을 포함하며 따라서 보체 의존성 세포독성과 연관된 면역 반응을 매개하지 않는 항체 또는 융합 단백질에 관한 것이기도 하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따라, 표적 항원에 대한 특이적 결합을 위해 개에게 치료적으로 투여될 수 있는 재조합 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편으로서 상기 항체 또는 융합 단백질은 C1q 보체에 결합하지 않는 것이고 상기 불변 도메인의 중쇄는 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 A (HCA, caIgG-A), SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 D (HCD, caIgG-D) 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 개의 탈글리코실 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 B (HCB*, caIgG-B)를 포함하는 것인, 재조합 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 A (HCA, caIgG-A), SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 D (HCD, caIgG-D) 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 개의 탈글리코실 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 B (HCB*, caIgG-B)를 포함하는 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의 용도, 즉 표적 항원에 대한 특이적인 결합이 요구되고 상기 항원, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편에 대한 C1q 보체 결합 및 결합된 보체 의존성 세포독성에 의해 특징지어지는 면역 반응이 요망되지 않는 질환의 치료에 사용되기 위한 의약의 제조에 있어서의, 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 개 대상체에 있어서 질환의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은:
- 종양 특이 항원에 대한 결합 특이성을 가지고 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 A (HCA, caIgG-A), SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 D (HCD, caIgG-D) 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 개의 탈글리코실 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 B (HCB*, caIgG-B)를 추가로 포함하는 면역글로불린, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 제공하는 단계, 및
- 상기 면역글로불린, 융합 단백질 또는 결합 단편을 상기 치료를 필요로 하는 개 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하여 이루어진다.
특정 구체예에서, CDC 활성 부재시 항체 구축을 위해 설계되는 탈글리코실화된 불변 도메인은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 알라닌-치환된 탈 글리코실화된 중쇄 HCB이다. 본 발명의 또 다른 다양한 측면에서, 중쇄 HCA, HCD 또는 중쇄 HCA, HCB 또는 HCD의 CDC 불활성 탈글리코실화 형태 (HCA*, HCB* 또는 HCD*: SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:15)를 갖는 항체들은 개의 성장 인자, 호르몬, 시토카인, 케모카인 또는 보체 연쇄반응의 구성원과 같은 기타 가용성 매개자들에 지향된 것이다. 특정 구체예에서, 중쇄 HCA, HCD 또는 HCB*를 갖는 항체들은 CDC를 유도함이 없이, 개의 NGF 생물학적 활성을 무력화할 목적에서 개의 신경 성장 인자 (NGF)에 지향된 것이다.
본 발명의 전술한 측면들의 특정 구체예에서 항체는 모노클로날 항체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 항체는 키메라 항체이다. 몇몇 구체예에서, 항체는 견화(犬化: caninised) 항체, 즉, 개 대상체에게 투여될 경우 그에 대해 무력화 항체가 생성되지 않도록 탈면역화되어진 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 일반적으로 항체의 중쇄 불변 도메인은 불변 도메인이 하류 이펙터 기능을 매개하지 않도록 하는 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 변형 또는 선택된다. 특정 구체예에서, 항체는 적어도 1종의 리포터 분자에 컨쥬게이트될 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서 본 발명의 전술한 측면의 항체 또는 융합 단백질의 불변 도메인 중의 적어도 1개의 잔기는 그 잔기의 글리코실화 방지를 위해 치환 또는 결실될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 시토카인 또는 시토카인인 수용체 또는 기타 막-투과 단백질 (예컨대 TNF 수용체)의 세포외 도메인에 전체적으로 또는 부분적으로 융합될 수 있으며, 개의 세포외 도메인-면역글로불린 중쇄 융합 단백질이 CDC를 활성화시키지 않는 것이 요망될 경우 (예컨대 TNF 수용체 Fc 융합 단백질이 가용성 TNF의 무력화를 위해 설계된 경우) 개의 면역글로불린 중쇄 불변부 도메인의 전부 또는 단편이 HCA, HCD 또는 HCB*로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는, 반대로, 개의 세포외 도메인-면역글로불린 중쇄 융합 단백질이 CDC를 활성화시키는 것이 요망될 경우 (예컨대 TNF 수용체 Fc 융합 단백질이 막-결합 TNF 산생 염증 세포를 살해하도록 설계된 경우) 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 HCB, HCC 또는 HCC*로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 개의 수용체-Fc 융합 단백질은 개의 면역글로불린 도메인 중쇄 Fc 영역에 융합하는 개의 세포 상에서 발견된 막 결합 수용체의 세포외 도메인 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 중쇄 HCB, HCC 또는 HCC*를 포함하는 항체들은 세포 표면 상에서 CD20에 대한 이들 항체의 결합을 통해, 개의 임파종 세포와 같은, 개의 CD20 발현 세포의 CDC 유도를 위해 CD20에 지향된다.
뿐만 아니라, 견화 (caninised) 항체들은 개에 존재하는 다른 어떤 에피토프들과도 교차반응하지 않을 뿐 아니라 개에게 투여될 경우 본 발명의 항체에 대하여 무력화 항체가 생산되지 않는다.
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 융합 단백질에서 중쇄의 불변부의 아미노산 서열을 변형시킬 수 있다. 상기 변형은 1 이상의 아미노산 잔기의 추가, 치환 또는 삭제일 수 있다. 상기 아미노산 변경은 일반적으로 항체의 기능적 특징 변경을 n이해 수행된다. 예를 들어, 아미노산 변형은 항체가 Fc 수용체에 결합하는 능력, 보체를 활성화시키거나 ADCC를 유도하는 능력을 방지함으로써, 항체 불변 도메인에 의해 매개되는 하류 이펙터 기능을 방지하기 위해 수행될 수 있다. 뿐만 아니라, 개에게 항체 투여시 그 항체의 순환 반감기를 변경하기 위해 중쇄 불변부의 힌지부의 아미노산 잔기를 변형시킬 수도 있다.
몇몇 구체예에서 본 발명은 복합 치료법에 사용되기 위해 상이한 결합 특이성을 갖는 다른 항체와 커플링되거나 결합된(conjoined) 본 발명의 항체 또는 결합 단편을 포함하는 다중특이(multi-specific) 항체 또는 다가(multivalent) 항체를 제공한다. 다중특이 항체는 첫번째 에피토프에 특이적인 적어도 1종의 항체 또는 결합 단편과, 그 항원에 존재하는 다른 에피토프 또는 다른 항원에 특이적인 적어도 1개의 결합 부위를 포함한다. 다가 항체는 동일 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 항체들 또는 항체 결합 단편들이다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 4 이상의 Fv 영역 또는 Fab 영역을 포함하는 항체 융합 단백질에 관한 것이기도 하다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 결합 단편이 제2 표적에 대하여 결합 특이적인 제2 항체 또는 그의 결합 단편에 링크된 것으로서 상기 표적은 제1 항원이 아닌 것인 이중특이적(bispecific) 항체에 관한 것이기도 하다. 이러한 다가, 이중특이적 또는 다중특이적 항체들은 당업자에게 잘 알려진 다양한 재조합 방법에 의해 만들어질 수 있다.
특정 구체예에서, 전술한 방법의 일환으로서 항체, 융합 단백질 또는 항원 결합 단편을 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중, 특히 0.03 mg/kg 체중 내지 약 3 mg/kg 체중의 투여량 범위로 개에게 투여한다.
추가의 다양한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 전술한 측면에 따른 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 포함하 조성물에 관한 것이기도 하다. 특정 구체예에서, 본 조성물은 적어도 1종의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 조성물은 적어도 1종의 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드 또는 스테로이드를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 항체 결합 단편을 인코딩한 분리된 핵산에 관한 것이기도 하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면에 따른 항체, 융합 단백질 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 특정 구체예에서, 분리된 핵산은 작동적으로 결합된 1 이상의 조절 서열을 추가로 인코딩한다.
또 다른 측면에서 본 발명의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 또는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 특정 구체예에서 상기 발현 벡터는 1 이상의 조절 서열을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서 상기 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터이다. 또 다른 측면에 따라 본 발명의 전술한 측면의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 전술한 측면의 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체 또는 융합 단백질의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 전술한 측면에 따른 숙주 세포를 배양하여 세포로 하여금 항체를 발현하도록 하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 적절한 숙주 세포에서 본 발명의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하는 본 발명의 전술한 측면의 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드/핵산 또는 벡터를 발현시키는 단계, 숙주 세포에서 함께 발현되거나 또는 다른 숙주 세포에서 별도로 발현될 수 있는 상기 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계 및 항체를 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는, 본 발명의 항체 또는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 항체 또는 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 유효량을 개에게 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 개에 있어서 통증의 치료, 경감 또는 억제를 위한 방법을 제공한다.
개의 항체의 정제
원치 않는 면역 이펙터 활성의 부재 하에 표적 무력화가 요망되는 개의 항체에서, 본 발명의 발명자는 놀랍게도, CDC 활성을 결여하는 개의 중쇄의 천연 아이소폼들이 스타필로코커스 단백질 A (Staphylococcus 단백질 A)에 대해서도 극히 저조하게 결합하고, 그 결과 항체 정제를 위한 이 일반적인 방법을 제조에 사용할 수 없다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 대안적인 정제 전략의 이용 및 생산 과정에서 글리코실화를 방지하기 위한 중쇄 돌연변이를 통한 이러한 제약사항으르 극복하는 3가지 방법에 대하여 설명한다. 이들 방법에 의해 제조된 정제된 항체들이 본 발명자에 의해 생산되었으며 원치않는 면역원성을 나타냄이 없이 개에 있어서 안전하고도 효과적인 바람직한 생체내 특성을 나타내었다.
본 발명의 또 다른 측면은 소스 혼합물로부터 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 아이소타입 A의 개의 중쇄 불변 도메인 (HCA, caIgG-A) 또는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 아이소타입 D의 개의 중쇄 불변 도메인 (HCD, caIgG-D)을 포함하는 개로부터 유도된 면역글로불린 또는 면역글로불린 또는 융합 단백질의 정제 방법을 제공하되, 상기 방법은:
(i) 표적 면역글로불린들 또는 융합 단백질을 포함하는 소스 혼합물을 제공하는 단계,
(ii) 상기 소스 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하는 단계;
(iii) 상기 소스 혼합물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 처리하는 단계; 및
(iv) 상기 소스 혼합물을 크기 배제 크로마토그래피 처리하는 단계.
를 포함하여 이루어진다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 인산염 완충 염수에서 완충액 교환하는 단계를 포함한다. 일반적으로 이 방법에 의해 높은 순도와 생물활성을 갖도록 분별된 정제된 항체가 얻어진다.
본 발명의 또 다른 측면은 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는 탈글리코실화된 개의 항체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 다양한 추가 측면에서, 개의 치료 방법에 사용되기 위한, 본 발명에서 정의된 방법에 따라 제조된 개의 또는 개로부터 유도된 항체 또는 융합 단백질이 제공된다. 다양한 추가 측면에서, 개에 있어서 면역 매개성 질환 또는 통증과 관련된 질환의 치료에 사용되는 의약의 제조를 위한 항-견(犬) NGF 항체의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 아이소타입 A의 개의 중쇄 불변 도메인 (HCA, caIgG-A) 또는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 아이소타입 D의 개의 중쇄 불변 도메인 (HCD, caIgG-D)을 포함하는 개로부터 유도된 면역글로불린 또는 면역글로불린 또는 융합 단백질을 소스 혼합물로부터 정제하는 방법을 제공하되, 상기 방법은:
(i) 표적 면역글로불린들을 포함하는 소스 혼합물을 제공하는 단계,
(ii) 상기 소스 혼합물을 캡토어드히어(captoadhere) 친화성 크로마토그래피 처리하는 단계 및
(iii) 상기 소스 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하는 단계
를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 또 다른 측면은 개의 치료 방법에 사용되기 위한 본 발명의 전술한 측면의 정제 방법으로부터 제조된 항체 또는 융합 단백질에 관한 것이기도 하다.
발명의 상세한 설명
집중적인 연구 실험 끝에, 본 발명자는 여러가지 상이한 중쇄 불변 도메인 아이소타입들을 이용하여 개의 몇 가지 모노클로날 항체들을 설계 및 구축하고 놀랍게도 하류 이펙터 기능을 매개하는 이들의 능력 및 특히 보체에 결합하는 이들의 능력으로부터 유용한 특성들이 연역될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명자는 개의 여러가지 상이한 면역글로불린 서브타입들에 의해 매개되는 여러가지 상이한 생물학적 효과를 동정하였다. 보체-결합 개 항체 아이소타입에 있어서, 이 특징은 생체내에서 보체 지향된 세포독성(CDC)에 있어서 동일한 항체에 의해 결합된 세포를 지향하는데 유용하다. 이 기능적 특성이 요망되는 일례는 개의 암 치료법으로서 여기서는 종양 항원에 지향된 항체가 파괴를 위해 그 항체에 의해 결합되어 있는 세포를 표적화하는 보체 시스템에 지향하게 될 것이다.
이와 대조적으로, 보체 활성이 바람직하지 않은 경우, 예컨대 신경 근방, 눈 또는 이미 염증이 생긴 조직의 경우, 또는 단지 항체의 예기치 못한 부작용 위험성을 감소시키고자 할 경우에는, 보체에 결합하지 않고 그에 따라 CDC를 일으키지 않는 항체 아이소타입들이 바람직하다.
따라서, 개의 어떤 아이소타입이 개의 항체 치료법을 설계 및 이용하는데 적합한지를 예측할 수 있다면 매우 바람직하고 유용할 것이다.
4가지 상이한 개의 면역글로불린 G 아이소타입에 관하여 설명하였다 (caIgG-A (개의 면역글로불린 G 아이소타입 A), caIgG-B, caIgG-C, 및 caIgG-D - Tang et al., 2001). 간략을 기하기 위해 (그리고 상이한 항체 구축물들을 경쇄 성분들과 구별하기 위해), 본 명세서에서 중쇄 불변 도메인을 HCA (caIgG-A), HCB (caIgG-B), HCC (caIgG-C) 및 HCD caIgG-D)라 명명하였다.
항체의 정제
본 발명자는 항-NGF 항체의 소망되는 HCA 및 HCD 아이소폼들을 정제하는 과정에서 놀랍게도, 상기 아이소폼들 중 어느 것도, 치료 단백질의 대규모 정제품을 생산하기 위한 단백질 A 친화성 컬럼 크로마토그래피 형태로 산업적 제조 규모로 사용되는 리간드인단백질 A에 결합하지 않는다는 것을 발견하였다. 도 5는 소규모 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 항-NGF 항체의 HCA, HCB, HCC 및 HCD 아이소폼들의 상대적 회수율을 나타낸 도면이다. 결과적으로, HCA 또는 HCD 아이소폼들의 정제를 위해서는 다른 방법들이 필요하였는데 이는 이들 아이소폼들은 단백질 A 친화성 크로마토그래피로는 정제할 수 없기 때문이었다. 집중적인 연구 실험 끝에, 본 발명자는 놀랍게도 caN-HCA-kLC 항체 구축물 또는 HCA 또는 HCD 중쇄 아이소타입을 갖는 개의 기타 항체들을 정제하는데 이용가능한 2가지 대체 방법 (본 발명에서 방법 I 및 방법 II라 칭해짐)을 동정해냈다.
첫번째 방법은 음이온 교환 크로마토그래피, 소수상 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 조합한 것이다. 두 번째 방법은 캡토어드히어(captoadhere) 친화성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 조합한 것이다. 도 6은 이들 2 가지 방법 각각에 의하여 HCA 함유 항-NGF 항체를 정제하는 것을 도시하고 있다. 각 방법에 의해 고도로 정제된 물질이 수득되며 이들 2 가지 방법들은 NGF ELISA로 측정시 생물활성이 유사한 물질을 생산하였다 (도 7). HCA 및 HCD 아이소타입은 HCB와 HCC 아이소타입에 비해 서로 더욱 유사하게 관련되어 있기 때문에, 이들 두 가지 아이소타입 모두에 대해 이들 방법들이 이용된다.
항체 정제를 탐구하는 또 다른 연구에서, 본 발명자는 놀랍게도 탈글리코실 HCB* 아이소타입 항-NGF 항체가 HCB 아이소타입과 마찬가지로, 단백질 A에 여전히 결합할 수 있었고 따라서 CDC 활성의 결여라는 바람직한 특성을 가지며 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제됨을 발견하였다.
개의 안전성 시험
원치 않는 CDC 활성을 갖지 않도록 설계된 본 발명의 항체들이 개에게 투여하기에 안전한지를 입증하기 위해, 고도로 정제된 항-NGF HCA 아이소타입 항체를 3 마리의 개에게 정맥 주사하였다 (동물윤리위원회-CRL, 아일랜드에 의해 사전 승인 받은 후). 도 8은 수의사에 의해 관찰된 행동 변화 결여에 더해 이 3마리의 개들은 HCA 아이소타입 항체 (단일의 2 mg/kg 투여량)의 주사 후 체중 변화나 체온 변화를 일으키지 않음을 보여준다.
3마리 개에 있어서 HCA 아이소타입 항체의 혈장 약동학은 약 9일이라는 긴 베타 반감기를 비롯하여 2-기(two-phase) 분포 및 제거 메카니즘과도 일치하였다 (도 9). 후속적인 14일간 동안의 신속한 제거 결여는 이들이 개 항체에 대해 아무런 항-항체 반응을 일으키지 않았다는 것과 일치하였다. 이와 대조적으로 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인은 개에 있어서 면역원성이었고 이들은 약 8일 또는 9일의 주입 후 혈장으로부터 신속히 제거된다 (Richter 1999, Drug Met. Disp. 27, 21-25).
개의 염증 모델
모든 실험은 윤리위원회(CRL, Ireland)의 사전 승인을 받은 후 수행되었다. 비글종 개 (제 -1일)의 한쪽 뒷다리의 발바닥에 카올린을 주사하여 대략 24 시간 후에 저절로 풀어지는 염증을 발생시켰는데 이러한 염증으로 인해 개는 일시적으로 절거리게 된다. 이 모델에서, 일단 카올린에 대한 초기 염증 반응이 약해지면, 개들은 약 1-2 주일 동안 안정적으로 덜 절게 되며 그 후 완전히 회복된다.
3마리 그룹의 개에게 항-견 (HCA 아이소타입) NGF 모노클로날 항체를 200 ㎍/kg 체중의 양으로 또는 비히클 대조군으로서 인산염 완충 염수를 정맥 주사하였다 (=제0일). 육안 점수법으로 7일에 걸쳐 개들의 저는 정도를 평가하였다 (0점, 절지 않음 (체중을 완전히 지탱함); 1점, 약간 절음 (체중을 완전히 지탱하지는 않으나 잘 걸어다님); 2점, 보통 정도로 절음 (체중을 약간만 지탱하며 잘 걷지 못함); 3점, 심하게 절음 (체중을 지탱하지 못함)). 관찰은 어떤 개에게 어떤 주사를 놓았는지를 알리지 않는 방식으로 행하였다.
결과를 도 10에 나타내었다. 절뚝거림 점수는 비히클 대조군과 비교할 때 주사 3일 후 항-NGF 모노클로날 항체를 맞은 개에 있어서 감소되었는데, 이는 항-NGF 모노클로날 항체들이 비히클만이 주사된 개들에서 관찰되는 것보다 통증을 감소시키는 효과가 있음을 가리키는 것이다. 지연된 활성은 항-견 NGF 모노클로날 항체의 혈장 약동학과 일치하였는데 이는 약 30시간에 걸쳐 서서히 조직 분포 (알파)되어 발바닥 부분의 혈관화가 상대적으로 덜 되었음을 입증한다. 도 10에 도시된 결과는 본 발명의 항-견 NGF 항체가 개에 있어서 염증을 감소시키고 그 결과 절뚝거림도 감소시킴을 보여준다.
본 발명자가 설명한 결과와 함께 CDC 불활성 HCA 아이소타입을 이용하여 구축된 정제된 개 항체들은 개에 있어서 안전하고 효과적이며 바람직한 긴 반감기를 갖는 것으로 입증되었다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌들은 참조 병합되었다. 본 발명의 설명된 구체예에 대하여 본 발명의 범위를 일탈함이 없이 다양한 변화와 변형이 가해질 수 있음을 당업자들을 잘 이해할 수 있을 것이다. 비록 바람직한 특정 구체예를 efdj 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 이들 특정 구체예들로 부당하게 한정되어서는 아니됨을 이해할 수 있을 것이다. 실제로, 당업자들에게 자명한 다양한 변형들이 본 발명에 가해질 수 있으며 이들 역시 본 발명의 범위에 포함되도록 의도된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학 용어는 본 발명의 기술 분야의 숙련자에 의하여 통상 이해되는 의미를 갖는다. 이 용어들의 의미 및 범위는 명확하여야 하나, 모호한 경우, 본 발명에서 제공되는 정의가 사전적 또는 외적 정의에 우선한다.
명세서 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다 (comprise)" 또는 "포함하다 (include)" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 서술된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함하지만 기타 임의의 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "하나 (a, an)" 및 "그 (the)"와 같은 용어는 문맥상 명확히 달리 요구되지 않는 한 단수 및 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예컨대 "활성 제제" 또는 "약학적으로 활성인 제제"라는 언급은 단일한 활성 제제 뿐 아니라 2 이상의 상이한 활성 제제의 조합을 포함하고, "담체"라는 언급은 2 이상의 담체의 혼합물 뿐 아니라 단일한 담체 등등을 포함한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다.
본 발명에서 정의되는 바, "통증"이라는 용어는 실질적이거나 잠재적인 조직 손상과 관련된, 또는 이러한 손상의 관점에서 설명되는 불쾌한 감각 및 감정적 경험을 의미한다.
수술 통증 또는 수술 후 통증과 관련하여, 미국 동물 복지법 (Animal Welfare Act 2002. AWA regulations, CFR, Title 9 (Animals and Animal Products), Chapter 1 (Animal and Plant Health Inspection Service, Department of Agriculture), Subchapter A (Animal Welfare), Parts 1-4)는 통증 과정을 그 과정이 가해지는 인간에게서 약간 이상의 또는 순간적인 통증 또는 고통, 즉, 주사 또는 기타 사소한 과정에 의하여 야기되는 것 이상의 고통을 야기할 것으로 합리적으로 예상되는 임의의 과정으로 정의한다. 그러므로, 개가 통증이 있는 외과 수술을 겪는 경우라면, 그 동물은 수술 후 진통제를 받아야 한다.
또 다른 예에 있어서, 의학적 질병, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절염, 감염 또는 암 또는 악성 질환과 관련된 결과로 개는 심각한 또는 만성 통증을 경험할 수 있다.
"통각"이라는 용어는 유해 자극의 인식을 말한다. 본 발명에서 정의되는 바 "신경병증성 통증" (또한 '신경통'으로 알려짐)은 신경의 신호 문제로부터 발생하는 통증이다. 이것은 체성 감각 시스템에 영향을 미치는 장애 또는 질환의 결과로서 발생할 수 있다. 신경병증성 통증에는 원인이 있고, 이는 자연 발생적인 소위 감각장애 (dysesthesia)인 비정상적 감각과 관련된 것일 수 있다. 또는, 일반적으로는 통증을 야기하지 않을 터치 또는 자극으로 통증이 오거나 통증이 악화되는 경우 결과되는 이질통증과 연관된 것일 수 있다. 예컨대, 당신이 삼차 신경통이 있다면 얼굴에 약간의 터치가 통증을 촉발시키고, 또는 당신이 당뇨성 신경병증을 갖는다면 침구의 압력이 통증을 촉발할 수 있다. 또한, 그 통증이 평소 통증을 야기하지 않을 터치 또는 자극으로 생기거나 악화되는 경우에는 신경병증 통증은 이질통증의 결과일 수 있다. 예컨대, 대상체가 삼차 신경통을 갖는다면 얼굴에의 약한 터치는 통증을 촉발시킬 수 있다. 통각 과민과 관련된 신경병증 통증은 통상 단지 약한 불편함만을 야기하는 자극 또는 터치로부터 심한 통증이 트껴진다는 것을 의미하고, 감각이상은, 예컨대 핀 및 바늘통증을 야기하는 부위와 아무런 접촉이 없는 경우에도 불편하고 통증이 있는 느낌이 발생하는 것을 의미한다. 신경병증 통증의 다른 형태로는 소양증 또는 가려움을 포함하고, 이는 피부의 알레르기 반응 또는 염증 반응 및 조직 손상 및 복구 과정의 결과인 염증 통증과 관련될 수 있다.
본 발명에서 정의되는 바, "NGF 무력화 항체" 또는 그 유사 용어는 NGF의 생물학적 활성화 및 신호를 무력화시킬 수 있는 항체를 말한다. 길항 항체, 또는 블로킹 항체라고도 말할 수 있는 무력화 항체는 특이적으로, 및 좋기로는 선택적으로 NGF에 결합하고 NGF의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 예컨대, 상기 무력화 항체는 NGF의 그 표적 리간드, 예컨대 세포막에 결합된 TrkA또는 p75 수용체 등으로의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바, "생물학적 활성"이라는 용어는 (생체 내에서 자연적으로 존재하는 것으로 발견되는, 또는 재조합 수단에 의하여 가능케 되거나 제공되는) 분자의 내재적 생물학적 성질 중 임의의 하나 이상의 것을 말한다. 생물학적 성질은 수용체 결합 및/또는 활성화; 세포 신호전달 또는 세포 증식의 유도, 세포 성장 억제, 시토카인 또는 케모카인 생산 유도, 세포 사멸 유도, 및 효소 활성 유도 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 바 "상보성 결정 영역 (CDR)"이라는 용어는, 카바트 등에 의하여 기술된 (Kabat,E.A., Wu,T.T., Perry,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242), 본래 면역글로불린 결합 위치의 자연적 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 말한다. 본 발명에서 사용되는 바 "구조 영역 (FR)"이라는 용어는 CDRs 사이에 자리하는 아미노산 서열을 말한다. 항체 중 이들 부분은 CDRs을 적당한 배향으로 잡아주는 역할을 한다 (CDRs로 하여금 항원과 결합할 수 있도록 함).
본 발명에서 사용되는 바 "불변 영역 (CR)"이라는 용어는 효과자 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 말한다. 본 발명에서, 불변 영역은 통상적으로 개의 불변 영역을 의미, 즉, 대상 견화 항체의 불변 영역이 개의 면역글로불린으로부터 유래한다는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 바 "키메라 항체"라는 용어는 통상적으로 서로 다른 종의 것인 2개의 서로 다른 항체로부터 유래하는 서열을 함유하는 항체를 의미한다. 가장 통상적인 키메라 항체는 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 공여자로부터 유래하는 가변 도메인과, 상기 항체가 투여될 표적 종으로부터 얻어지는 항체로부터 유래하는 불변 도메인을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바 "면역원성"이라는 용어는 수용자에게 투여되는 경우 면역 반응 (체액성 또는 세포성 반응)을 이끌어내는 표적 단백질 또는 치료 모이어터 능력의 척도를 말한다. 본 발명은 대상 견화 항체의 면역원성에 관한 것이다. 본 발명의 상기 항체는 좋기로는 어떠한 면역원성도 없는데, 즉, 개에게 투여되었을 때 그들에 대항하여 어떠한 무력화 항체도 발생되지 않고, 또한 그 항체의 Fc 영역에 의하여 매개되는 어떠한 효과자 기능도 없다는 것이다.
본 발명에서 사용되는 바 "상동성" 또는 "서열 상동성"이라는 용어는 정렬된 서열 중 임의의 특정 아미노산 잔기 위치에 있어서 상기 정렬된 서열간 아미노산 잔기가 동일하다는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 바 "유사성" 또는 "서열 유사성"이라는 용어는 정렬된 서열 중 임의의 특정 위치에서, 상기 서열간 아미노산 잔기가 유사한 유형의 것이라는 것을 나타낸다. 예컨대, 류신은 이소류신 또는 발린 잔기를 치환할 수 있다. 이것을 보존적 치환이라고 부를 수 있다. 좋기로는, 본 발명의 아미노산 서열이, 그에 함유된 임의의 아미노산 잔기가 보존적 치환 방식으로 변형되었을 때, 이러한 변화는 비변형 항체와 비교하는 경우 결과되는 항체의 결합 특이성 또는 기능적 활성에 어떠한 효과도 미치지 않는다.
본 발명의 (본래) 폴리펩타이드 및 그 기능적 유도체와 관련한 서열 상동성은 서열들을 정렬하고 갭을 도입한 후 대응하는 본래 폴리펩타이드의 잔기와 동일한, 필요하다면 최대의 상동성 백분율을 얻기 위하여 상기 서열 상동성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않는, 후보 서열 중 아미노산 잔기의 백분율에 관한 것이다. N- 또는 C- 말단 연장이나 삽입 어떠한 것도 서열 상동성 (identity or homology)을 저감시키는 것으로 해석되지는 않을 것이다. 2 이상의 아미노산 서열 정렬을 수행하고 그들의 서열 상동성을 결정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예컨대 2 이상의 아미노산 서열의 상동성 또는 유사성 백분율은, 예컨대 BLAST (Altschul et al. 1990), FASTA (Pearson & Lipman 1988), 또는 Smith-Waterman 알고리즘 (Smith & Waterman 1981)을 이용하여 쉽게 계산될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바 제2 아미노산 잔기에 대하여 "가장 높은 상동성"을 갖는 아미노산 잔기는 제2 아미노산 잔기와 가장 공통되는 특징 또는 성질을 갖는 아미노산 잔기를 말한다. 아미노산 잔기가 제2 아미노산 잔기에 대하여 가장 높은 상동성을 갖는지를 결정하는 데 있어서, 평가는 통상적으로 전하, 극성, 소수성, 측쇄 질량 및 측쇄의 크기 등의 인자로 이루어질 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 바 "대응하는 위치"라는 용어는 두 서열이 두 서열간 최대 서열 상동성을 갖도록 정렬될 때 제1 서열 중의 위치와 동일한 위치의 제 2 서열 중의 위치를 말하는 것으로 의도되는, 제1 서열 중의 특정 아미노산 잔기에 대응하는 위치의 제2 서열 중에 존재하는 아미노산 잔기를 말한다. 대응하는 위치의 아미노산 잔기들은 동일한 카바트 번호를 갖는다.
본 발명에서 사용되는 "필수적으로 ~로 이루어지다" 또는 "필수적으로 ~로 이루어지는"이라는 용어는 추가적인 특징 또는 요소가 개의 NGF에 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항체 단편의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는다면, 폴리펩타이드가 기술된 것을 넘어선 이러한 추가적인 특징 또는 요소를 가질 수 있음을 의미한다. 즉, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 상기 항체 또는 항체 단편은 개의 NGF에 결합하고 개의 NGF 기능 활성에 길항 작용을 하는 항체 또는 항체 단편들의 능력을 간섭하지 않는 추가적인 특징 또는 요소를 가질 수 있다. 이러한 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위하여 아미노산 서열로 도입될 수 있다. 예컨대, 필수적으로 특정된 서열로 이루어지는 폴리펩타이드는 그 아미노산들이 개의 NGF에 대한 결합 및 그 생물학적 기능을 봉쇄하는 데 있어 상기 항체 또는 단편의 역할을 간섭, 억제, 차단 또는 중단시키지 않는다면, 상기 서열의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 모두에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 추가, 결실 또는 치환된 아미노산을 함유할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 개 NGF 길항 항체로 기여하는 폴리펩타이드 분자는 그 기능기들이 개의 NGF에 결합하고 그 기능을 길항 작용하는 항체 또는 항체 단편의 능력을 간섭하지 않는다면 이러한 하나 이상의 기능기로 화학적 변형될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는 요망되는 치료 효과를 전달하는데 필요한 본 발명의 제제, 결합 화합물, 소분자, 융합 단백질 또는 펩티도미메틱의 양을 의미한다.
"폴리펩타이드", "펩타이드", 또는 "단백질"이라는 용어는 본 발명에서 인접 잔기들의 알파-아미노기와 카복시기 간 펩타이드 결합에 의하여 서로간에 연결된 일련의 선형 아미노산 잔기를 지명하기 위하여 상호 교환적으로 사용된다. 아미노산 잔기는 보통 천연 "L" 이성질형으로 존재한다. 그러나 "D" 이성질형 잔기들은 그 폴리펩타이드에 의하여 원하는 기능적 성질이 보유되는 한 임의의 L-아미노산 잔리를 치환할 수 있다.
본 발명에서 정의되는 "항체"는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들의 단편에 의하여 유전적으로 인코딩 가능하거나 재조합으로 제조될 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 갖는, 관심 대상 표적 항원에, 이 경우에는 개의 신경 성장 인자에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질을 포함한다. "항체"라는 용어는 모노클로날 및 키메라 항체, 특히 견화 항체를 포함하고, 폴리클로날 항체 또는 임의의 부류 또는 서브타입의 항체들 역시 포함한다. "항체"는 혼성화 항체, 2특이적 항체, 헤테로항체 및 항원 결합을 보유하는 이들의 기능적 단편에까지 이른다.
"특이적으로 결합하는"이라는 구문은 이형혼합 집단의 단백질들 중에 존재하는 특정 단백질 또는 표적에 대한 항체의 결합을 말한다. 그러므로, 특정한 면역 분석 조건하에 존재하는 경우, 상기 항체들은 특정 단백질, 이 경우에는 개의 NGF에 결합하고, 그 시료 중에 존재하는 다른 단백질들에 대하여는 유의한 양으로 결합하지 않는다.
본 발명에서 정의되는 "개 (canine)"은 "개 (dog)"로도 일컬어 질 수 있다. 개는 3항명 카니스 루푸스 파밀리아리스 (Canis lupus familiaris)(카니스 파밀리아리스 도메스티쿠스 (Canis familiaris domesticus)) 또는 카니스 루푸스 딩고 (Canis lupus dingo)를 갖는 아종에 속하는 것으로 범주화될 수 있다. 개는 임의의 견종을 포함하고 야생 및 애완 품종 모두를 포함하며, 후자는 또한 반려 동물로도 일컬어진다.
본 발명은 설명의 목적으로 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지는 않는 하기 실시예들을 참조하여 설명될 것이다. 달리 표시되지 않는 한, 본 발명의 방법 및 기술들은 일반적으로 이 기술 분야에 잘 알려지고, 본 명세서를 통하여 인용되고 설명된 일반적이고 좀 더 구체적인 다양한 참조들에 개시된 관용적인 방법들에 따라 수행된다.
도 1A 및 1B는 ELISA에 의해 분석된 4가지의 상이한 개의 중쇄 아이소타입 (HCA, HCB, HCC, HCD)을 이용하여 구축된 항-NGF 항체 (형질감염된 CHO 세포의 상등액 내로 발현됨)의 쥐의 NGF에 대한 동등한 결합을 나타내는 도면 (도 1A) 및 TF-1 세포들의 NGF 증식의 동등한 억제를 나타내는 도면 (도 1B)이다.
도 2는 항-C1q ELISA에 의해 측정되는 NGF-결합 항-견 NGF 항체 아이소타입에 대한 보체의 상이한 결합을 나타내는 도면이다.
도 3a 및 3b는 NGF-캡쳐된 글리코실화 및 탈글리코실화된 견화(caninised) 항-NGF 모노클로날 항체의 보체에 대한 결합을 항-C1q ELISA에 의해 측정한 도면이다.
도 4는 NGF-포획된 견화 항-NGF 모노클로날 항체 (MAbs), 항-견 VEGF MAbs 및 항-인간 CD20/개의 HCB 키메라 MAb의 보체에 대한 합을 항-C1q ELISA에 의해 측정한 도면이다. 특히, 도 4A, 4B 및 4C는 다양한 개의 중쇄 아이소타입을 이용하여 구축한 항체에 대한 보체의 결합을 나타낸다. 견화 모노클로날 항체 (MAb)를 CHO 세포에서 발현시켜 보체 C1q에 대한 그들의 결합능을 시험하였다. 패널 A - 인간화 항체 아이소타입 (huN-G1, huN-G4)과 비교한 견화 항-NGF 항체 (caN-HCB, caN-HCC); 패널 B - 개의 HCA (caV-HCA) 및 HCB (caV-HCB) 아이소타입을 이용하여 구축한 항-VEGF 항체; 패널 C - 마우스 IgG2a 아이소타입 (muB-2a)와 비교한, HCB 아이소타입 (mub-HCA)을 이용하여 구축한 항-CD20 항체.
도 5는 단백질 A에 의해 정제되고 웨스턴 블롯에 의해 항-견 폴리클로날 면역글로불린을 이용하여 탐지된 항-NGF 항체 아이소타입의 상대적 회수를 나타낸 도면이다. 도 1로부터의 상등액을 단백질 A 컬럼을 통해 통과시키자 용리된 물질에 특이적으로 결합하였다. 동량의 용리액을 SDS-PAGE 처리하였다. 개의 아이소타입 HCA, HCC 및 HCD는 분별을 통한 세척 유출액 중에 상당량의 물질이 있는 것으로 시사되는 바와 같이, 단백질 A에 약하게 결합하였다. 도 A-D는 단백질 A에 의한 개의 항체 아이소타입 HCA, HCB, HCC 및 HCD의 상대적 회수를 나타낸 도면이다: L, 부하량(load); W, 세척량(wash); P, 정제량(purified); F, 유동량(flow through). 도 1로부터의 항-NGF 항체 상등액을 이 실험에 이용하였다.
도 6A 및 6B는 (1) 음이온 교환 크로마토그래피, (2) 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 (3) 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 3단계 방법 (방법 I)을 이용한 항-견 NGF 항체 (HCA 아이소타입)의 정량적 정제를 나타낸 도면이다. 도 6A는 크기 배제 HPLC에 의한 분별 결과를 도시한 도면이다. 도 6B는 각 단계에 따른 분별의 환원성 DS-PAGE 겔 결과를 나타낸 도면이다. 도 6C 및 6D는 캡토어드히어(Captoadhere) 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 2단계 방법 (방법 II)를 이용한 본 발명의 항-견 NGF 항체의 정량적 정제를 나타낸 도면이다. 도 6C는 비환원 조건 및 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도면이다. 도 6c, 레인 1은 MWS, 레인 2는 항-견 NGF 항체 2㎍/mL 및 0㎕ 환원제, 레인 3은 항-견 NGF 항체 4㎍/mL 및 0㎕ 환원제, 레인 4는 항-견 NGF 항체 6㎍/mL 및 0㎕ 환원제, 레인 5는 MWS, 레인 6은 항-견 NGF 항체 2㎍/mL 및 3㎕ 환원제, 레인 7은 항-견 NGF 항체 4㎍/mL 및 3㎕ 환원제, 레인 8은 항-견 NGF 항체 6㎍/mL 및 3㎕ 환원제 그리고 레인 9는 MWS이다. 도 6D: 정제된 항-견 NGF 항체의 크기 배제 크로마토그래피.
도 7은 방법 I 및 II에 의해 정제된 항-견 NGF 항체 (HCA 아이소타입)를 비교한 도면이다. 도 7A: 비환원 및 환원 SDS-PAGE에 의한 비교. 도 7B: 항-NGF ELISA에 의한 비교.
도 8은 항-견 NGF 항체 (HCA 아이소타입, 방법 I에 의해 정제됨)를 개에 정맥 투여한 후 체중 (상부 패널)과 체온(하부 패널)이 안정함을 나타내는 도면이다.
도 9는 개에게 정맥 주사한 후 항-견 NGF 모노클로날 항체의 혈장 농도의 키네틱 분석을 나타낸 도면이다. 비글종 개에게 항-NGF 항체를 2 mg/kg의 양으로 정맥 주사하고, 표시 시점에서 혈장 샘플을 채취하여 항-NGF 모노클로날 항체를 NGF ELISA로 탐지하였다. 항-견 NGF 모노클로날 항체는 약 9일이라는 놀랍도록 긴 제거(베타) 상(phase) 반감기를 가졌다.
도 10은 항-견 NGF 모노클로날 항체 (HCA 아이소타입, 방법 I에 의해 정제됨)가 개에 있어서 염증성 통증을 감소시킴을 나타낸다. 제 -1일에 비글종 개의 발바닥에 카올린을 주사하고, 제0일에 항체 또는 비히클 대조군을 투여한 다음 육안 점수법으로 절뚝거리는 정도를 측정하였다.
실시예
실시예 1 - 개의 상이한 아이소타입들을 갖는 항-견 NGF 항체들의 설계 및 생산
개의 NGF에 지향된 항체 (caN 항체라 명명됨)를 HCA (SEQ ID NO:1), HCB (SEQ ID NO:2), HCC (SEQ ID NO:3) 또는 HCD (SEQ ID NO:4)로부터 선택된 중쇄 불변 도메인 (CH2 및 CH3)에 결합된 동일한 중쇄 가변 도메인(VH)을 이용하여 설계 및 구축하였다. 경쇄 가변부(VL)를 개의 캅파 불변 도메인 (SEQ ID NO:5)에 결합시켰다. 결합된 아미노산 서열을 코돈의 최적 선택, 완전한 화학적 유전자 합성 및 포유동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.1+ 내로의 클로닝에 의해 포유동물 세포에서 발현가능한 형태로 전환시켰다. 상세히 설명하면, 설계된 아미노산 서열들을 합성 cDNA-발현가능한 형태로 구축하여 포유동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.1(+) 내로 클로닝시켰다. 견화된 가변 도메인 서열과 개의 C-말단 불변 중쇄 또는 불변 경쇄 서열을 조합함으로써 전체 항체 서열을 제조하였다. 견화된 aD11 VH 도메인을 4개의 중쇄 아이소타입 HCA, HCB, HCC 및 HCD (SEQ ID NO:1- SEQ ID NO:4) 각각과 조합시키고 견화된 aD11 VL 도메인을 개의 캅파 경쇄 불변 도메인(SEQ ID NO:5)과 조합시켰다. 조합된 아미노산 서열들을 코돈의 최적 선택 및 완전한 화학적 유전자 합성 및 포유동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.1+ 내로의 클로닝에 의해 포유동물 세포에서 발현가능한 형태로 전환시켰다.
견화된 중쇄 및 경쇄 cDNA 플라스미드들의 조합들 (SEQ ID NO:5 플러스 SEQ ID NO:1을 이용한 caN-HCA-kLC (HCA); SEQ ID NO:5 플러스 SEQ ID NO:2를 이용한 caN-HCB-kLC (HCB); SEQ ID NO:5 플러스 SEQ ID NO:3를 이용한 caN-HCC-kLC (HCC) 및 SEQ ID NO:5 플러스 SEQ ID NO:4를 이용한 caN-HCD-kLC (HCD))을 CHO 세포 내로 형질감염시키고 상등액을 수확하여 ELISA 포맷으로 NGF와 반응시켰다. 인큐베이션 및 세척 단계 후에, 결합된 개의 항체들을 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 결합된 염소의 항 개 IgG 특이적 폴리클로날 항체와의 반응성에 의해 탐지하고 TMB를 이용하여 디벨롭시켰다. 얻어진 생성물의 광학 밀도를 450nm에서 측정하고 모크 엠티(mock empty) 벡터에 의해 형질감염된 상등액의 그것과 비교하였다. 견화된 4 가지 항체 아이소타입들에 대한 NGF의 결합 결과를 도 1에 나타내었다. 이들 항체들 각각은 동일한 경쇄(caN-kLC)를 가지며, 이 경쇄는 개의 캅파 불변 도메인을 포함하는 것이다. 각각의 항체들은 서로 다른 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 따라서 트기적인 중쇄 가변 도메인을 4개의 상이한 불변 도메인(caN-HCA, caN-HCB, caN-HCC 또는 caN-HCD) 중 어느 하나와 조합시킨다. 개의 중쇄 아이소타입들 각각은 NGF와동등하게 결합하는 것으로 관찰되었다.
항체 상등액을 ELISA 분석법을 이용하여 NGF 결합에 대해 시험하고 (도 1A) TF-1 세포 증식 억제 분석에 의해 NGF 무력화를 시험하였다(도 1B). 도 1에 도시된 바와 같이, 이들 4 가지 아이타입들은 이들 분석에서 상호 동등한 활성을 나타내었으며, 이는 이들 모두가 개의 NGF에 특이적으로 결합함을 나타내는 것이다.
실시예 2: NGF-포획 견화 항체에 의해 유도된 보체 침적
이어서 4종의 항체-함유 상등액들을, 보체 C1q ELISA를 이용하여 NGF에 결합될 때 보체에 결합하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 플레이트를 5 ㎍/ml의 마우스 NGF 100 ㎕/웰로 코팅하고 5% BSA/PBS로 블로킹하였다. 코팅된 웰을, PBS/1% BSA (100 ㎕/웰)로 희석된 재조합 견화 항-NGF IgG 아이소타입들을 함유하는 세포 배양 상층액과 함께 실온에서 1 시간 반응시켰다. 플레이트를 수세하고 0.5 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0.05% 트윈-20, 0.1% 젤라틴 및 0.5% BSA를 함유하는 베로날 완충액에서 1/100 희석된 인간 혈청 100 ㎕/웰과 반응시켰다. 수세 후, 플레이트를 PBS/1% BSA 중에서 1/800 희석된 양의 (sheep) 항-C1q-HRP (Serotec) 100 ㎕와 반응시켰다. 수세 후, 100 ㎕의 TMB 기질 (Thermo Scientific)을 첨가함으로써 플레이트를 현상하였다. 모든 보체 C1q 결합을 A450 마이너스 열-불활성화된 보체 백그라운드로서 표현하였다. 100 ㎕의 2N H2SO4 을 첨가하여 현상을 중지하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 2의 그래프로 나타내었다. 이들 결과는 고정화 견화 HCB 및 HCC형 항체에 대한 C1q의 결합을 보여주고, 견화 HCA 및 HCD형 항체에 대한 C1q의 비결합을 보여준다. 그러므로, 이 결과는 놀랍게도 여러 가지 개 유래 중쇄들이 서로 다른 보체 결합 및 활성화 특성을 나타내고 상기 HCA 및 HCD형 중쇄를 갖는 견화 항체들이 예기치 않게 개의 NGF에 대한 길항 작용에 사용되기에 좋다는 것을 나타내었다. 따라서 개의 NGF에 특이적으로 결합하면서도 CDC를 매개하지 않는 항체를 생산하는 능력이 매우 유리한데, 이는 NGF에 특이적으로 결합하면서도 NGF를 발현하는 세포 근방에서 면역 반응을 매개하는 항체는 매우 바람직하지 않을 것이기 때문이다.
실시예 3: HCB 및 HCC 중쇄 아이소타입을 갖는 항-견- NGF 모노클로날 항체의 NGF 포획 N-글리코실화 및 탈글리코실화 변이체들의 보체 결합
HCB 및 HCC 중쇄 아이소타입을 갖는 항-견-NGF 모노클로날 항체의 N-글리코실화 변이체 및 비글리코실화 변이체의 결합 비교가 수행되었다. SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:2 (HCB), SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6 (HCB*), SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:3 (HCC), 또는 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:7 (HCC*)로 기재되는 경쇄 및 중쇄 쌍을 인코딩하는 발현 벡터를 CHO 세포로 공동-형질감염시키고 마우스 NGF에 대한 ELISA 결합으로써 그 상층액들을 비교하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 좌측 패널은 HCB 중쇄 (HCB), 탈글리코실 HCB 중쇄 (HCB*), HCC 중쇄 (HCC) 또는 탈글리코실 HCC 중쇄 (HCC*)을 이용하여 구축된 항-NGF MAbs의 발현을 ELISA로 탐지한 도면이다 - 색칠되지 않은 막대는 희석되지 않은 상등액, 색칠된 막대는 1/10 희석된 상등액을 나타내고 C는 희석되지 않은 음성 대조군 상등액을 나타낸다. NGF에 대해 동등하게 결합된 것으로 관찰되었다.
마찬가지로, HCB 및 HCC의 불변 도메인 N-링크된 글리코실화 부위 (HCB* (SEQ ID NO: 6) 및 HCC* (SEQ ID NO:7)라 명명됨)를 제거하도록 설계된 항체들을 그들의 보체 결합을 제거하려는 시도에서, 경쇄와 함께 공동-발현시키고 보체 활성에 대해 평가하였다 (도 3). 놀랍게도, 탈글리코실화된 HCB*는 보체에 결합하지 못하였으나, 탈글리코실화된 HCC*는 보체와 결합한 채로 유지될 수 있었다. 보체 고정을 매개하지 않는 개로부터 유래하는 글리코실화 및 탈글리코실화된 중쇄의 동정은 NGF가 노시셉틴과 관련된 가용성 매개자이므로 특히 유리한 발견이다.
얻어진 CHO 세포 형질감염 상등액을, 실시예 2에 설명된 C1q ELISA 분석법을 이용하여 보체를 동원하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 결과를 도 3의 우측 패널에 도시하였다. 도 3의 결과와 함께 보체 C1q를 동원하는 능력은 B형 중쇄 (HCB*)에서 N-결합 글리코실화 부위를 없애자 사라졌고, C형 중쇄(HCC*)에서의 유사한 돌연변이에 의하여는 그 능력이 감소하였다.
따라서, 상당히 놀랍게도, 항체가 HCA, HCD 서브타입 또는 탈글리코실화된 HCB* 아이소타입의 개 유래 중쇄를 갖는 경우, 개의 NGF에 대한 그 항체의 결합은 보체 활성화 (및 잠재적으로 다른 하류 이펙터 기능 예컨대 ADCC 및 ADCP)를 불러일으키지 않는다는 것으로 나타났다. 그러므로, 개 NGF의 세포 막 결합 TrkA 또는 p75 수용체에 대한 결합을 방지함으로써 개 NGF와 같은 표적의 생물학적 기능적 활성을 길항 작용하는 데 있어서, 상기 항체들은 그와 관련된 하류 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 억제한다. 또한, NGF 발현은 신경 근방에서 빈번히 일어나므로, HCA, HCD 또는 HCB* 서브타입의 개 유래 중쇄를 갖는 이러한 NGF 길항 또는 무력화 항체들은 보다 광역의 면역 반응을 동원함이 없이 개의 NGF 생물학적 활성을 격리한다. 따라서, 이러한 결과는 놀랍게도, 상이한 개 유래 중쇄들이 상이한 보체 결합 및 활성화 특징을 나타내고, HCA 및 HCD형 중쇄를 갖는 견화 항체들이 예기치 않게도 개의 NGF의 길항에 사용되는데 바람직함을 가리키는 것이다.
실시예 4: 다른 항원: VEGF 및 CD20에 대한 개의 중쇄 불변 도메인을 갖는 항체들의 생산 및 보체에 대한 이들의 결합
개의 상이한 중쇄 아이소타입들이 보체에 대해 상이한 결합 특성을 갖는다는 놀라운 결과에 기초하여, 항-VEGF 및 항-CD20 항체들을 실시예 1에 설명된 것과 동일한 방법론을 이용하여 CHO 세포에서 발현된 개 중쇄 불변 도메인을 이용하여 유사하게 구축하였다. 보체 ELISA 중의 이들 항체 상등액으로부터 얻은 분석 결과를 도 4에 나타내었다. 이 결과를 그들의 동족 항원에 대한 결합에 이어서 보체를 동원하는 능력에 대해 전술한 항-NGF 항체들과 비교하였다.
결과를 도 4에 나타내었다. 패널 A는 개의 중쇄 아이소타입 B와 C를 이용하여 구축된 견화 항-NGF MAb 및 인간 중쇄 아이소타입 IgG1 및 IgG4를 이용하여 구축된 인간화 항체들을 NGF가 코팅된 플레이트 상에 포획시켜, 인간 혈청과 함께 인큐베이션시킨 다음, HRP에 컨쥬게이트된 항-C1q 폴리클로날 항체를 이용하여, 결합된 C1q를 ELISA에 의해 탐지하는 것을 도시하고 있다. 패널 B에는 개의 중쇄 아이소타입 A 및 B (SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9)를 이용하여 구축된 VEGF-포획 견화 항-VEGF MAbs에 대한 보체 C1q의 결합 결과가 도시되어 있다. 패널 C는 huCD20 세포외 도메인 펩타이드 상에 포획된 항-CD20 MAb에 대한 보체 C1q 결합 결과를 도시한 도면이다 (muB-2a: 쥐의 항-인간 CD20 MAb 및 muB-HCB: 쥐의 항-인간 CD20 MAb 개의 중쇄 아이소타입 B (SEQ ID NO:9)과의 키메라 융합 단백질로서 발현됨). 모든 보체 C1q 결합은 A450 마이너스 열-불활성화된 보체 백그라운드로서 표현하였다.
이와 함께 이들 데이터는 HCA가 아니라 HCB 중쇄 불변 도메인을 이용하여 구축된 항-VEGF 항체들이 보체를 동원할 수 있고 개의 HCB를 이용하여 구축된 항-CD20 항체는 보체에 결합할 수 있으며 따라서 전술한 바와 같이 보체에 대한 항-NGF 항체 아이소타입들의 상이한 결합에 일맥상통함을 나타내는 것이다. 요약하면, 이들 데이터는 HCB 및 HCC 아이소타입을 이용하여 구축된 항원-포획 항체들은 보체에 결합하는 반면 HCA 및 HCD는 그렇지 않다는 놀라운 관찰 결과를 뒷받침해주는 것이다. HCB 및 HCC 아이소타입이 보체에 결합한다는 동정 사실은 종양 세포, 예컨대 VEGF를 발현하거나 CD20을 발현하는 종양 세포들를 사멸시키는데 있어서 특히 유리하다.
이러한 실험 결과들은 개의 중쇄 불변 도메인 HCA, HCD 및 탈글리코실화된 HCB (HCB*) 아이소타입들을 포함하는 항체들이 CDC 활성을 매개하지 않는 면역글로불린을 결과시킨다는, 실시예 1로부터의 예기치 않은 발견을 뒷받침해주는 것이다. 따라서, 본 발명자는 이러한 개 유래된 중쇄가, CDC 매개형 면역 반응이 바람직하지 못한 치료방법에 사용되기 위한 면역글로불린에 있어서 유용성을 가진다는 것을 최초로 밝혀내었다. 이러한 용도의 예로는 생체내 또는 통증, 노인성 퇴화 또는 염증과 같은 질환에서 시토카인 또는 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 및 보체 자체를 비롯한 기타 세포외 매개자들의 개 면역글로불린에 의한 억제를 들 수 있다.
HCA, HCD 및 HCB* 아이소타입들은 CDC 불활성 항체를 설계하는데 있어서 가장 유용한 반면, 본 발명자는 놀랍게도 CDC 활성 항체를 설계하는데 있어서, HCB (caIgG-B) 및 HCC (caIgG-C) 아이소타입들의 개 항체들이 유용하다는 것을 밝혀내었다. 이러한 항체들은 예컨대 암 치료에서와 같이 세포 파괴를 위해 세포를 표적화시킬 때 유용하다. 예컨대 CD20, HER2 및 EGFR을 비롯하여 CDC 활성 항체를 이용하여 표적화되는 인간 종양 항원은 많이 존재하며, 따라서 HCB 및 HCC 아이소타입을 이용하여 구축되는 개 항체들도 개에 있어서 마찬가지로 동등한 용도를 가질 것이다.
실시예 5: CHO 세포에서의 발현에 이은 항-NGF 모노클로날 항체의 정제
HCA 및 HCD 아이소타입의 개의 항-NGF 모노클로날 항체들은 보체에 대해 결합하지 않는다는 면에서 유리하지만 (도 2) 스타필로코커스 단백질 A에 약하게 결합하기 때문에 (도 5), 대안적인 정제 방법이 개발되었다 (도 6). 항-견 NGF 모노클로날 항체 (중쇄 아이소타입 HCA를 이용하여 구축함)를 CHO 세포에서 발현시킨 후 집중적인 연구 실험 끝에 놀랍게도, 개의 항-NGF 항체가 2가지 대안적인 정제 방법에 의해 고순도 (>89% 모노머 IgG 피크, 도 6A, 6D에 도시됨)로 분별화될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
첫번째 방법에서, 항-견 NGF 모노클로날 항체는 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 (방법 I - 도 6 및 B)에 의하여 정제되었다. 두번째 방법에서, 상기 항-NGF 항체는 음이온 교환 크로마토그래피 후 캡토어드히어 친화 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다 (방법 II - 도 6C 및 D).
둘 중 하나의 방법에 의하여 정제된 항-NGF 모노클로날 항체의 주요 피크는 대략 150 kDa 분자량에 해당한다. SDS-PAGE 및 ELISA에 의한 비교는 (도 7) 방법 I 및 II가 유사한 순도 및 생활성을 갖는 항체 제제를 생산한다는 것을 설명해 준다. 이들 방법에 의하여 생산된 정제된 항-NGF 모노클로날 항체를 TF-1 NGF 중화 분석 (도 1에 기재)에서 시험하고, 고효능을 가짐을 보였다 (IC50 13 pM 항-NGF 중화 37 pM NGF; 미기재).
실시예 6: 항-견 NGF 모노클로날 항체는 정맥 내로 안전하게 개에게 투여될 수 있고 발열을 야기하지 않는다
개의 HCA형 중쇄를 함유하는 발현 벡터로부터 유래하는 항-견 NGF 모노클로날 항체를 CHO 세포에서 발현시키고 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합으로 정제하여 (방법 I, 도 6A 및 B) 인산 완충액으로 완충액 교환하였다. 상기 항체를 2 mg/kg 체중의 비글견에게 정맥 내 주사하고 수의사의 육안 관찰에 의거 독성 신호, 체중, 체온 및 혈장 생화학의 변화에 대하여 평가하였다. 도 8은 체중과 체온 측정을 보여준다. 이들 또는 측정된 어떠한 혈장 생화학 분석 대상 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 염소염, 칼슘, 인산염, 우레아, 크레아틴, 글루코오스, 콜레스테롤, 빌리루빈, 알라닌 트랜스아미나아제, 알칼리 인산 가수분해효소, 아밀라아제, 리파아제, 총단백질 또는 알부민: 미기재)에 있어서도 변화가 관찰되지 아니하였다.
실시예 7. 항-견( HCA 아이소타입 ) NGF 모노클로날 항체의 생체내 혈장 약동학으로부터 장기간 혈청 반감기와 면역원성의 결여가 입증된다
개의 HCA형 중쇄를 발현하는 발현 벡터로부터 유래하는 항-견 NGF 모노클로날 항체를 CHO 세포에서 발현시키고 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합으로 정제하여 (방법 I, 도 6A 및 B) 인산 완충액으로 완충액 교환하였다. 상기 항체를 2 mg/kg 체중의 비글견에게 정맥 내 주사하고 이후 2 주에 걸쳐 다양한 시점에 혈장 시료를 채취하였다. 표적으로 NGF와, 항-견 폴리클로날 항체-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 2차 시약을 이용한 ELISA로, 희석된 혈장 시료들을 항-견 NGF 항체 농도에 대하여 평가하고 도 1에 의한 바와 같이 현상하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 측정된 혈장 농도는 대략 33 시간의 조직 분포기 (알파) 반감기 및 놀랍게도 대략 9일의 장기 제거기 (베타)로, 2-기 동력학과 일치하였다.
100 시간 내지 300 시간 사이에 항-견 NGF 항체 농도가 혈장 에서 급격히 ㄱ감소하지 않는 것은 개 혈중에 기존에 존재하던 재조합 항-NGF 모노클로날 항체에 대한 중화 항체나, 투입 후 생성된 임의의 그러한 중화 항체 어떤 것도 없음을 입증한다. 비교하면, 재조합 인간 면역글루불린계 단백질들은 투입 후 대략 200 시간후에 개의 혈중에서 항체에 의하여 중화된다 (Richter et al, Drug Metabolism and Disposition 27: 21, 1998). 그러므로, 이들 결과는 본 발명의 항-견 NGF 항체가 정맥 내 주사 후 생체 내에서 장기간의 혈청 반감기 (대략 9일)를 가지며, 기간 중 상기 주사된 항-NGF 항체를 중화시키는 어떠한 기존 항체나 새로 생성된 항체가 없다는 것을 보여준다.
실시예 8 - 생체 내에서 염증성 통증을 감소시키는 항-견 NGF 모노클로날 항체의 효과
항체 요법:
개의 HCA형 중쇄를 포함하는 발현 벡터로부터 유래하는 항-견 NGF 모노클로날 항체를 CHO 세포에서 발현시키고 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합으로 정제하여 (방법 I) 인산 완충액으로 완충액 교환하였다.
개의 염증 모델:
모든 실험은 기관 윤리 위원회 (CRL, Ireland)의 사전 승인을 얻어 수행되었다. 대략 24 시간 후에 개시되고, 개를 일시적으로 절름발이가 되게 하는 자가-해소 염증을 생성하기 위하여 비글견의 한쪽 뒷다리 발바닥에 카올린을 주사하였다 (= -1 일). 이 모델에서, 카올린에 대한 초기의 염증 반응이 일단 약화되면, 대략 1~2 주의 시간에 걸쳐 개는 점차 덜 다리를 절게되고, 그 후 완전히 회복하게 된다.
3 마리 개로 이루어진 그룹들에 200 마이크로그램/체중 kg의 항-견 NGF 모노클로날 항체 또는 비히클 대조군으로서 인산 완충액 둘 중 하나를 정맥 내 주사하였다 (= 0 일). 육안 점수 방법으로, 7일에 걸쳐 개들의 다리 절음을 평가하였다 (점수 0, 절지 않음 (온전한 체중 지지); 점수 1, 약간 절음 (온전한 체중 지지는 아니나 잘 걸음); 점수 2, 중간 정도 절음 (약한 체중 지지 및 잘 걷지 못함), 점수 3, 심하게 절음 (체중 지지 못함)). 어떠한 개가 어떠한 주사를 맞았는지는 맹검 관찰되었다.
그 결과를 도 10에 나타내었다. 비히클 대조군과 비교하여, 주사 3일 후에 항-NGF 모노클로날 항체를 투여받은 개들에서 다리 절음 점수가 감소하였고, 이는 상기 항-NGF 모노클로날 항체가 비히클만으로 나타나는 효과에 비하여 개의 통증을 저감시키는 효과가 있음을 나타내는 것이다. 지연된 활성은 대략 30 시간의 느린 조직 분산기 (알파)를 보여주었던 항-견 NGF 모노클로날 항체의 혈장 약동학 및 비교적 좋지 않은 발바닥 부위의 순환과 일치하는 것이다. 도 10에 나타낸 결과는 본 발명의 항-견 NGF 항체가 다리 절음에 있어서 결과적인 감소로 개의 염증성 통증을 감소시킨다는 것을 보여준다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 참조로서 본 발명에 포함된다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 기재된 구현예들에 대한 다양한 변형 및 변경이 이 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 구체적인 양호한 구현예와 관련하여 본 발명을 설명하였지만, 청구된 바 본 발명이 그러한 구체적인 구현예들로 부당하게 한정되어서는 아니됨이 이해되어야 한다. 실제로, 이 기술 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명에 기재된 모드 수행에 대한 다양한 변형은 본 발명에 의하여 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NVIP Pty Ltd <120> Therapeutic Canine Immunoglobulins and Methods of Using the Same <130> P122572.WO.01 <150> GB1114858.2 <151> 2011-08-29 <150> US61/483481 <151> 2011-05-06 <150> US61/531439 <151> 2011-09-06 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninised anti-NGF VH canine IgG-A heavy chain (caN-HCA) <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met His Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ser Val 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Caninised anti-NGF VH aglycosyl canine immunoglobulin heavy chain type C (caN-HCC*) <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30 Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met His Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Gln Ser Gly Ser Thr 130 135 140 Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Val Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr 180 185 190 Val 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Artificial Sequence <220> <223> Canine immunoglobulin heavy chain type B Fc domain (HCB) <400> 9 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys 100 105 110 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 115 120 125 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 130 135 140 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 145 150 155 160 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 165 170 175 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 180 185 190 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Claims (48)

  1. 개의 치료 방법에 사용되기 위한, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편으로서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때, 하류의 면역계 이펙터 기능의 활성화를 최소화하는 것인 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 개의 치료 방법은 통증 또는 염증 또는 이와 연관된 질환의 치료에 관계된 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서, 개의 치료 방법은 관절염 또는 관절염 질환의 치료에 관계된 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  4. 제2항에 있어서, 통증은 신경병성 통증, 종양 통증, 류마티스성 관절염과 연관되거나 류마티스성 관절염에 기인하는 통증, 골관절염과 연관되거나 골관절염에 기인하는 통증, 염증과 연관되거나 염증에 기인하는 통증, 및 소양증과 연관되거나 소양증에 기인하는 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하류 면역계 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성, 항체 의존성 세포 매개형 세포독성 및 항체 의존성 세포 발병기전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 바이러스 및 보체 캐스케이드의 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  7. SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의, 개 대상체의 통증 또는 염증 치료용 의약 제조를 위한 용도로서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때, 하류의 면역계 이펙터 기능의 활성화를 최소화하는 것인 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의, 개 대상체의 통증 또는 염증 치료용 의약 제조를 위한 용도.
  8. 제7항에 있어서, 통증은 신경병성 통증, 종양 통증, 류마티스성 관절염과 연관되거나 류마티스성 관절염에 기인하는 통증, 골관절염과 연관되거나 골관절염에 기인하는 통증, 염증과 연관되거나 염증에 기인하는 통증, 및 소양증과 연관되거나 소양증에 기인하는 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 하류 면역계 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성, 항체 의존성 세포 매개형 세포독성 및 항체 의존성 세포 발병기전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 바이러스 및 보체 캐스케이드의 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  11. 통증 또는 염증의 치료, 억제 또는 경감을 필요로 하는 개 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법은:
    - 통증 또는 염증의 치료 또는 예방에 특이적인 기능을 갖는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 제공하는 단계로서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 가지며, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 하류의 면역계 이펙터 기능을 활성화시키지 않는 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편을 제공하는 단계, 및
    - 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편의 치료적 유효량을 개 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 개 대상체에 있어서 통증 또는 염증을 치료, 억제 또는 경감하기 위한 방법.
  12. 제11항에 있어서, 통증은 신경병성 통증, 종양 통증, 류마티스성 관절염과 연관되거나 류마티스성 관절염에 기인하는 통증, 골관절염과 연관되거나 골관절염에 기인하는 통증, 염증과 연관되거나 염증에 기인하는 통증, 및 소양증과 연관되거나 소양증에 기인하는 통증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 하류 면역계 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성, 항체 의존성 세포 매개형 세포독성 및 항체 의존성 세포 발병기전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 바이러스 및 보체 캐스케이드의 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 1종의 진통제, NSAID, 오피오이드, 코르티코스테로이드 및 스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 추가 성분을 공동-투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 개의 치료 방법에 사용되기 위한, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편으로서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때, 하류의 면역계 이펙터 기능의 활성화를 매개하는 것인 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서, 치료 방법은 암 또는 악성 질환의 치료에 관계되 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 하류 면역계 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성, 항체 의존성 세포 매개형 세포독성 및 항체 의존성 세포 발병기전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원은 암 특이 항원인 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, 암 특이 항원은 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 바이러스 및 보체 캐스케이드의 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  21. 제19항에 있어서, 암 특이 항원은 단백질 CD2, CD4, CD8, CD20, EGFR, VEGFR 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편.
  22. SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의, 개 대상체의 통증 또는 염증 치료용 의약 제조를 위한 용도로서, 상기 중쇄의 아미노산 서열은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때, 하류의 면역계 이펙터 기능의 활성화를 매개하는 것인 항체, 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의, 개 대상체의 암 또는 악성 질환 치료용 의약 제조를 위한 용도.
  23. 제22항에 있어서, 하류 면역계 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성, 항체 의존성 세포 매개형 세포독성 및 항체 의존성 세포 발병기전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 표적 항원은 암 특이 항원인 것인 용도.
  25. 제24항에 있어서, 암 특이 항원은 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 바이러스 및 보체 캐스케이드의 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  26. 제24항에 있어서, 암 특이 항원은 단백질 CD2, CD4, CD8, CD20, EGFR, VEGFR 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  27. 개 대상체의 암 또는 악성 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은:
    - 암 또는 악성 질환의 치료 또는 예방에 특이적인 기능을 갖는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 제공하는 단계로서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 가지며, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 하류의 면역계 이펙터 기능을 활성화시키는 것인 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편을 제공하는 단계, 및
    - 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 개 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 개 대상체에 있어서 암 또는 악성 질환의 치료 또는 예방 방법.
  28. 제27항에 있어서, 하류 면역계 이펙터 기능은 보체 의존성 세포독성, 항체 의존성 세포 매개형 세포독성 및 항체 의존성 세포 발병기전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 표적 항원은 암 특이 항원인 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 암 특이 항원은 시토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 바이러스 및 보체 캐스케이드의 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 암 특이 항원은 단백질 CD2, CD4, CD8, CD20, EGFR, VEGFR 및 HER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 개의 질병을 치료하는데 사용되기 위한 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편으로서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때 C1q에 결합하지 않는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것이고 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있는 것인 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편.
  33. 제32항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것인 항체 또는 융합 단백질 또는 결합 단편.
  34. 제32항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것인 항체 또는 융합 단백질 또는 결합 단편.
  35. 개에 있어서 통증 및/또는 염증과 관련된 질환 치료용 의약을 제조하는데 있어서의 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의 용도로서, 상기 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때 C1q에 결합하지 않는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것이고 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있는 것인 개에 있어서 통증 및/또는 염증과 관련된 질환 치료용 의약을 제조하는데 있어서의 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편의 용도.
  36. 제35항에 있어서, 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것인 용도.
  37. 제35항에 있어서, 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:15로 이루어진 군으로부터 선택된의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것인 용도.
  38. 개에 있어서 통증 또는 염증을 치료, 억제 또는 경감시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
    - 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 제공하는 단계로서, 상기 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편이 그의 표적 항원에 결합할 때 C1q에 결합하지 않는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것이고 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있는 것인 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편을 제공하는 단계, 및
    - 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편의 치료적 유효량을 개 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것인 개에 있어서 통증 또는 염증을 치료, 억제 또는 경감시키기 위한 방법.
  39. 제38항에 있어서, 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것인 방법.
  41. 개에게 치료적으로 투여되어 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 재조합 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편으로서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편의 불변 도메인은 C1q 보체에 결합하지 않는 것이고, 상기 불변 도메인의 중쇄는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 A, SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 D 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 개의 탈글리코실화된 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 B를 포함하는 것인 재조합 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편.
  42. 제41항에 있어서, 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 갖는 것인 재조합 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편.
  43. 개에게 치료적으로 투여되어 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 재조합 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편으로서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편은 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편에 대한 C1q 보체 결합 및 결합된 보체 의존성 세포독성에 의해 특징지어지는 면역 반응을 매개하는 것이고, 상기 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편의 중쇄는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 B, SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 C 또는 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 개의 탈글리코실화된 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 아이소타입 C를 포함하는 것인 재조합 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 결합 단편.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편 및 적어도 1종의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 의약 조성물.
  45. 제41항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체, 융합 단백질 또는 결합 단편을 인코딩하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  46. 소스 혼합물로부터 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 아이소타입 A의 개의 중쇄 불변 도메인; 또는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 아이소타입 D의 개의 중쇄 불변 도메인을 포함하는 면역글로불린 또는 개 유래 면역글로불린 또는 융합 단백질의 정제 방법으로서, 상기 방법은:
    (i) 표적 면역글로불린 또는 융합 단백질을 포함하는 소스 혼합물을 제공하는 단계,
    (ii) 상기 소스 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하는 단계;
    (iii) 상기 소스 혼합물을 소수성 상호작용 크로마토그래피 처리하는 단계; 및
    (iv) 상기 소스 혼합물을 크기 배제 크로마토그래피 처리하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것인 개 유래 면역 글로불린 또는 면역글로불린 또는 융합 단백질의 정제 방법.
  47. 소스 혼합물로부터 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 아이소타입 A의 개의 중쇄 불변 도메인; 또는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 아이소타입 D의 개의 중쇄 불변 도메인을 포함하는 면역글로불린 또는 개 유래 면역글로불린 또는 융합 단백질의 정제 방법으로서, 상기 방법은:
    (i) 표적 면역글로불린 또는 융합 단백질을 포함하는 소스 혼합물을 제공하는 단계,
    (ii) 상기 소스 혼합물을 캡토어드히어(captoadhere) 친화성 교환 크로마토그래피 처리하는 단계; 및
    (iii) 상기 소스 혼합물을 음이온 교환 크로마토그래피 처리하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것인 개 유래 면역 글로불린 또는 면역글로불린 또는 융합 단백질의 정제 방법.
  48. 개를 치료하는데 사용되기 위한 것인 제46항 또는 제47항의 정제 방법으로 생산된 항체 또는 융합 단백질.
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