CN105358570A

CN105358570A - 含有非糖基化Fc的多肽

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Publication number: CN105358570A
Application number: CN201480027384.4A
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Inventors: G.肯南
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2034-03-14
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Abstract

本文提供了效应子功能缺少或高度降低但在N297处缺少糖基化时仍具高稳定性的变体人IgG1？Fe分子。此外，本文提供在哺乳动物细胞中表达时被糖基化的接头肽。IL-2结合三种跨膜受体亚单位：IL-2R-和IL-2Ry，两者在IL-2结合时一起活化细胞内信号传导事件；以及CD25(IL-2Ra)，其用来稳定IL-2和IL-2RBY之间的相互作用。IL-2RBY递送的信号包括PI3-激酶、Ras-MAP-激酶和STAT5途径的那些信号。

Description

含有非糖基化Fc的多肽

相关申请的交叉引用

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序列表的引用

本申请随电子格式的序列表一起提交。序列表以文本文件提供，名称为A-1892-WO-PCT_ST25.txt，创建于2014年3月13日，大小为57,344个字节。电子格式序列表中的信息据此全部以引用方式并入本文。

背景

IL-2结合三种跨膜受体亚单位：IL-2Rβ和IL-2Rγ，两者在IL-2结合时一起活化细胞内信号传导事件；以及CD25(IL-2Rα)，其用来稳定IL-2和IL-2Rβγ之间的相互作用。IL-2Rβγ递送的信号包括PI3激酶、Ras-MAP激酶和STAT5途径的那些信号。

T细胞需要表达CD25来响应通常存在于组织中的低浓度IL-2。表达CD25的T细胞包括抑制自体免疫炎症所必需的FOXP3+调节T细胞(Treg细胞)以及被活化来表达CD25的FOXP3-T细胞两者。FOXP3-CD25+T效应细胞(Teff)可为CD4+或CD8+细胞，两者均可促成炎症、自体免疫、器官移植排斥或移植物抗宿主疾病。IL-2刺激的STAT5信号传导对于正常T-reg细胞的生长和存活以及FOXP3高表达至关重要。

在共同拥有的WO2010/085495中，我们描述了用IL-2突变蛋白来优先扩增或者刺激Treg细胞。当施用给受试者时，Treg细胞的效应可用于治疗炎性疾病和自体免疫疾病。尽管其中所述的IL-2突变蛋白可用于在体内相比于Treg细胞优先扩增Teff细胞，但期望产生对人治疗剂而言具有最佳属性的IL-2突变蛋白。

概述

本文描述的是IL-2突变蛋白，其适于高产率生产性并具有优化的药理学活性。在尝试生产示例性IL-2突变蛋白基人治疗剂的过程中，出现多个出乎意料且不可预见的观察结果。本文所述的IL-2突变蛋白是所述尝试的结果。

本文所述的IL-2突变蛋白对IL-2具有最小数量的改变，从而减少了产生抗IL-2突变蛋白和/或内源性IL-2的免疫应答的可能性，但仍维持Treg的优先扩增和活化。此外，在某些实施方案中，当施用给受试者时，IL-2突变蛋白与增加血清半衰期的分子(例如抗体Fc)融合。IL-2突变蛋白具有短的血清半衰期(对于皮下注射为3至5小时)。本文所述的示例性IL-2突变蛋白Fc融合物在人体内的半衰期为至少1天、至少3天、至少5天、至少10天、至少15天、至少20天或至少25天。对IL-2突变蛋白的药代动力学的这种效应允许IL-2突变蛋白治疗剂可以降低或较低的频率给药。

此外，在产生药物大分子时，必须考虑大量产生大分子的能力，使聚集最小化并且使分子的稳定性最大化。IL-2突变蛋白Fc融合分子展示出此类属性。

另外，在某些实施方案中，IL-2突变蛋白Fc融合蛋白含有IgG1Fc区。当期望消除IgG1(例如ADCC活性)的效应子功能时，发现297位处天冬酰胺向甘氨酸的突变(N297G；EU编号方案)与导致非糖基化IgG1的其它突变相比可提供极大改善的纯化效率以及生物物理特性。在优选的实施方案中，将半胱氨酸工程改造到Fc中以允许存在二硫键，这增加了含有非糖基化Fc分子的稳定性。非糖基化Fc的有效性超过IL-2突变蛋白Fc融合范围。因此，本文提供了含有Fc的分子、Fc融合物和抗体，其包含N297G取代以及一个或多个额外残基对半胱氨酸的任选取代。

本发明的另一个方面包括糖基化肽接头。适于N-非糖基化的优选接头肽包括GGNGT(SEQIDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO:7)。

附图简述

图1：在短期刺激测定时，通过与IgG-Fc的C端融合的均二聚未以降低的效能并以对CD25的高亲和力来改变IL-2突变蛋白的活性。

图2A和图2B：测试具有所示突变并与Fc-异源二聚体一侧的C端融合的IL-2突变蛋白刺激T细胞中STAT5磷酸化的能力。这些突变蛋白还包含三个对CD25赋予高亲和力的突变(V69A、N71R、Q74P)。将它们的活性与不具有Fc融合物的IL-2的三种形式(开符号)比较：WTIL-2、HaWT(对CD25的高亲和力)(N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P)和HaD(对CD25的高亲和力以及减小的信号传导活性)(N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D)。显示出被门控FOXP3+CD4+和FOXP3-CD4+T细胞的磷酸-STAT5响应。

图3：T细胞亚群响应于与Fc-异源二聚体融合的IL-2突变蛋白的滴定的增殖。将融合蛋白的活性与不具有Fc融合物的IL-2的三种形式比较(开符号)：WTIL-2、HaWT(对CD25的高亲和力)(N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P)和HaD(对CD25的高亲和力以及减小的信号传导活性)(N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D)

图4：NK细胞响应于与Fc-异源二聚体融合的IL-2突变蛋白的滴定的增殖。将融合蛋白的活性与不具有Fc融合物的IL-2的三种形式比较(开符号)：WTIL-2、HaWT(对CD25的高亲和力)(N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P)和HaD(对CD25的高亲和力以及减小的信号传导活性)(N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D)

图5：T细胞亚群响应于与Fc-同源二聚体N297G融合的IL-2突变蛋白的滴定的增殖。将Fc突变蛋白的活性与WTIL-2(开环)和Fc.WT(闭环)比较。赋予对CD25高亲和力的突变(HaMut1)为V69A和Q74P。

图6：NK细胞响应于与Fc-同源二聚体N297G融合的IL-2突变蛋白的滴定的增殖。将Fc突变蛋白的活性与WTIL-2(开环)和Fc.WT(闭环)比较。

图7A和图7B：不具有赋予对CD25的高亲和力的突变的Fc.IL-2突变蛋白促进人源化小鼠中Treg扩增和FOXP3上调。

图8：Fc.IL-2突变蛋白的低周剂量(每只动物0.5μg)促进人源化小鼠中Treg扩增和FOXP3上调，相对于Fc.N88D和Fc.WT，观察到Fc.V91K具有更好的活性。

图9：Fc.V91K和Fc.N88D通过与CD25缔合而存留于活化的T细胞的表面上。

优选实施方案详述

本文中所用的章节标题仅用于组织目的且不应理解为对所述主题进行限制。本说明书主体内所引用的所有参考文献全文以引用方式明确并入。

来对于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化、蛋白质纯化等可使用标准技术。可实施根据生产厂家的说明书或者本领域通常使用的或者本发明所述的酶反应和纯化技术。酶促反应及纯化技术可根据制造商说明书来实施，或以本领域内常用方法来实施，或如本文所述来实施。参见，例如Sambrook等，2001，MolecularCloning:ALaboratoryManuel，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，coldSpringHarbor，N.Y.，其出于任何目的以引用方式并入本文。除非提供具体定义，否则结合本文所述分析化学、有机化学及医学及药物化学使用的命名及其实验室程序以及技术使用的命名为本技术领域内熟知且常用的术语。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。

IL-2

本文所述的IL-2突变蛋白为野生型人IL-2的变体。如本文所用，“野生型人IL-2”、“野生型IL-2”或“WTIL-2”应意味着具有以下氨基酸序列的多肽：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQSIISTLT

其中X为C、S、V或A(SEQIDNO:2)。

变体可在野生型IL-2氨基酸序列内包含一个或多个取代、缺失或插入。残基在本文中通过一个字母氨基酸代码接着IL-2氨基酸位置来指定，例如K35是SEQIDNO:2在35位处的赖氨酸残基。取代在本文中通过一个字母氨基酸代码接着IL-2胺基酸位置接着取代一个字母氨基酸代码来指定，例如K35A为SEQIDNO:2的35位处的离胺酸残基经丙胺酸残基的取代。

IL-2突变蛋白

本文中提供优先刺激T调节(Treg)细胞的人IL-2突变蛋白。如本文所用，“优先刺激T调节细胞”是指相对于CD3+FoxP3-T细胞，突变蛋白优先促进CD3+FoxP3+T细胞的增殖、存活、活化和/或功能。测量优先刺激Treg能力的方法可通过外周血白细胞的流式细胞术来测量，其中观察FOXP3+CD4+T细胞在总CD4+T细胞中的百分比的增加、FOXP3+CD8+T细胞在总CD8+T细胞中的百分比的增加，FOXP3+T细胞相对于NK细胞的百分比的增加和/或相对于在其它T细胞上的CD25表达增加FOXP3+T细胞表面CD25表达水平的更大的增加。Treg细胞的优先生长也可通过，可根据去甲基化FOXP3启动子DNA(即，Treg特异性去甲基化区域或TSDR)相对于从全血提取的DNA中的去甲基化CD3基因的增加的呈现来测定，如通过来自亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的聚合酶链反应(PCR)产物测序来检测(J.Sehouli等，2011，Epigenetics6:2,236-246)。

优先刺激Treg细胞的IL-2突变蛋白使受试者或外周血样中的CD3+FoxP3+T细胞相对于CD3+FoxP3-T细胞的比率增加至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1000％。

优选的IL-2突变蛋白包括但不限于包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列内的V91K或N88D取代的IL-2突变蛋白。示例性IL-2突变蛋白在SEQIDNO:1中示出。特别优选的是SEQIDNO:1中所示的包含C125A取代的氨基酸序列。尽管减少野生型IL-2序列的其它突变的数量是有利的，本发明包括除V91K或N88D取代之外也具有截短或额外插入、缺失或取代的IL-2突变蛋白，前提条件是所述突变蛋白维持优先刺激Treg的活性。因此，实施方案包括下述IL-2突变蛋白：其优先刺激Treg细胞并包含与SEQIDNO:2中所示氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的V91K或N88D的氨基酸序列。在特别优选的实施方案中，此类IL-2突变蛋白包含与SEQIDNO:2中所示氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

关于氨基酸序列，序列同一性和/或相似性可使用本领域所知的标准技术来测定，包括但不限于Smith和Waterman1981，Adv.Appl.Math.2:482的局部序列同一性算法、Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的序列同一性比对算法、Pearson和Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85:2444的相似性方法研究，这些算法的计算机化实施方式(WisconsinGenetics软件包，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、Devereux等，1984，Nucl.AcidRes.12:387-395描述的最佳拟合序列程序，优选使用默认设置或通过检测。优选地，通过FastDB基于以下参数计算百分比同一性：错配罚分1；空位罚分1；空位开放罚分0.33；和联接罚分30，"CurrentMethodsinSequenceComparisonandAnalysis,"MacromoleculeSequencingandSynthesis，SelectedMethodsandApplications，第127-149页(1988)，AlanR.Liss,Inc.

一个可用算法的实例为PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对从一组相关序列创建多个序列比对。其也可绘制用于创建所述比对的显示聚类关系的树状图。PILEUP采用Feng&Doolittle，1987，J.Mol.Evol.35:351-360的渐进式比对方法的简化形式；所述方法与Higgins和Sharp，1989，CABIOS5:151-153所述的方法类似。可用的PILEUP参数包括3.00的默认缺口权重、0.10的默认缺口长度和加权末端缺口。

另一可用算法的实例为BLAST算法，描述于：Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215:403-410；Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402；以及Karin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5787。特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序，其得自Altschul等，1996，MethodsinEnzymology266:460-480。WU-BLAST-2使用若干检索参数，其中大部分检索参数设定为默认值。可调节参数以下面的值设定：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，代码阈值(T)＝II。HSPS和HSPS2参数为动态值，并且通过程序本身根据特定序列的组成和被检索的关注序列所针对的特定数据库的组成来确立；然而，可调节所述值来提高灵敏性。

另外的可用算法为空位BLAST，如Altschul等，1993，Nucl.AcidsRes.25:3389-3402所报道。空位BLAST使用BLOSUM-62取代得分：阈值T参数设定为9；触发无缺口延伸的两命中点法(two-hitmethod)，空位长度k要求支出10+k的代价；X_u设定为16，以及X_g针对数据库检索阶段设定为40并且针对输出阶段设定为67。空位比对通过对应于约22比特的得分来触发。

虽然引入氨基酸序列变化的位点或区域可以预定，但突变本身不需要预定。例如，为了优化指定位点的突变的性能，可在目标密码子或区域处进行随机诱变并且针对期望活性的最佳组合筛选表达的IL-2突变蛋白。在具有已知序列之DNA中的预定位点处进行取代突变的技术为人们所熟知，例如，M13引物诱变和PCR诱变。例如，可使用本文所述的测定方法来筛选突变体。

氨基酸取代通常为单一残基；插入通常接近约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基，但可容许大得多的插入。缺失的范围在约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基的范围内，但在某些情况下缺失可大得多。

取代、缺失、插入或者其任何组合可用于达成最终衍生物或变体。通常，对少数氨基酸进行这些变化以使分子的改变最小化，具体为抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可容许更大的改变。保守取代通常根据表1所示的以下图表进行。

表1

通过选择比表1中所示取代较不保守的取代来进行功能或免疫学特性的实质变化。例如，可进行更显著影响以下性质的取代：改变区域中的多肽主链的结构，例如α-螺旋或β-片状结构；靶点处分子的电荷或疏水性；或侧链容积。通常预期产生多肽性质的最大变化的取代为下述那些，其中(a)亲水性残基，(例如丝氨酰或苏氨酰基)取代为疏水性残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)(或经其取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代为任何其它残基(或经其取代)；(c)具有正电性侧链的残基，(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基取代为负电性残基取代(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)(或经其取代)；或(d)具有庞大侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代为不具有侧链的残基(例如甘氨酸)(或经其取代)。

变体通常呈现与天然类似物相同的定性生物活性并将引发相同的免疫应答，但变体也可经选择以根据需要来改变IL-2突变蛋白的特性。或者，变体可经设计以使得IL-2突变蛋白的生物活性得到改变。例如，糖基化位点可如本文中所论述来改变或去除。

具有延长的血清半衰期的IL-2突变蛋白

由于本文中所提供的IL-2突变蛋白相比于(例如)Teff或NK细胞优先扩增Treg，因此期望施用给患者时其安全性与野生型IL-2或PROLEUKIN不同。与野生型IL-2或PROLEUKIN相关的副作用包括流感样症状、发冷/僵直、关节痛、发烧、皮疹、瘙痒症、注射部位反应、低血压、痢疾、恶心、焦躁不安、混乱和抑郁。本文中所提供的IL-2突变蛋白可经改变以包括延长突变蛋白的血清半衰期的分子或与其融合，而不增加该半衰期延长可增加患者中副作用或不良事件的可能性或强度的风险。此类具有延长的血清半衰期的突变蛋白的皮下给药可允许持久靶标覆盖以及较低全身性最大暴露(C_max)。延长的血清半衰期可允许突变蛋白的较低或较少频率给药方案。

本文提供的IL-2突变蛋白的血清半衰期可通过基本上任何本领域内已知的方法来延长。此类方法包括改变IL-2突变蛋白的序列以包括与新生Fcγ受体结合或与具有延长的血清半衰期的蛋白质例如IgG或人血清白蛋白结合的肽。在其它实施方案中，IL-2突变蛋白与赋予融合分子延长的半衰期的多肽融合。此类多肽包括IgGFc或其它与新生的Fcγ受体、人血清白蛋白结合的多肽，或与具有延长的血清半衰期的蛋白质结合的多肽。在优选的实施方案中，IL-2突变蛋白与IgGFc分子融合。

IL-2突变蛋白可与IgGFc区的N端或C端融合。如实施例中所示，与IgGFc区的C端融合与在IgGFc区的N端融合相比更大程度上保持了IL-2突变蛋白的活性。

本发明的一个实施方案涉及二聚体，所述二聚体包含两个通过融合IL-2突变蛋白与抗体的Fc区产生的Fc-融合多肽。例如，可通过如下方式制备二聚体：将编码融合蛋白的基因融合物插入适当表达载体中，在用重组表达载体转化过的宿主细胞中表达该基因融合物，并使所表达的融合蛋白组装成极为类似抗体的分子，随后在Fc部分之间形成链间键，由此得到二聚体。

如本文所使用，术语“Fc多肽”或“Fc区”包括源于抗体Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。也包括含有促进二聚化的铰链区的此类多肽的截短形式。在某些实施方案中，Fc区包含抗体CH2和CH3域。连同延长的血清半衰期，包含Fc部分的融合蛋白(和由其形成的寡聚物)提供了有利于在蛋白A或蛋白G柱上经由亲和层析纯化的优点。优选的Fc区衍生自人IgG，其包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本文中，Fc中的特定残基通过位置来识别。所有Fc位置基于EU编号系统。

抗体的Fc部分的一个功能是当抗体与其靶点结合时与免疫系统通信。这被称为“效应子功能”。通信导致抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)。ADCC和ADCP通过Fc和免疫系统细胞表面上的Fc受体结合来介导。CDC通过Fc与补体系统的蛋白例如C1q结合介导。

IgG亚类介导效应子功能的能力有所不同。例如，在介导ADCC和CDC方面，IgG1比IgG2和IgG4更优异。因此，在不期望效应子功能的实施方案中，可优选IgG2Fc。然而，已知含有IgG2Fc的分子相比于含有IgG1Fc的分子，更难生产并且具有不太有吸引力的生物物理属性，例如较短的半衰期。

抗体的效应子功能可通过在Fc中引入一个或多个突变来增加或降低。本发明的实施方案包括IL-2突变蛋白Fc融合蛋白，其具有工程改造后增加效应子功能的Fc(U.S.7,317,091和Strohl，Curr.Opin.Biotech.，20:685-691，2009；两者全文以引用方式并入本文)。具有增加的效应子功能的示例性IgG1Fc分子包括具有以下取代的那些：

S239D/I332E

S239D/A330S/I332E

S239D/A330L/I332E

S298A/D333A/K334A

P247I/A339D

P247I/A339Q

D280H/K290S

D280H/K290S/S298D

D280H/K290S/S298V

F243L/R292P/Y300L

F243L/R292P/Y300L/P396L

F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L

G236A/S239D/I332E

K326A/E333A

K326W/E333S

K290E/S298G/T299A

K290N/S298G/T299A

K290E/S298G/T299A/K326E

K290N/S298G/T299A/K326E

增加含有IgGFc蛋白质的效应子功能的另一个方法为通过减少Fc的岩藻糖基化。从附接到Fc上的双触角复合型寡糖上去除核心岩藻糖极大地增加了ADCC效应子功能而不改变抗原结合或CDC效应子功能。已知若干种减少或消除含有Fc分子例如抗体的岩藻糖基化的方法。这些包括在哺乳动物细胞系中的重组表达，所述哺乳动物细胞系包括FUT8敲除细胞系、变体CHO系Lec13、大鼠杂交瘤细胞系YB2/0、包含特异性针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系，和共表达β-1，4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基α-甘露糖苷酶II的细胞系。或者，含有Fc的分子可在非哺乳动物细胞例如植物细胞、酵母或原核细胞例如大肠杆菌中表达。

在本发明的优选实施方案中，IL-2突变蛋白Fc融合蛋白包含工程改造后降低效应子功能的Fc。具有降低的效应子功能的示例性Fc分子包括具有以下取代的那些：

N297AorN297Q(IgG1)

L234A/L235A(IgG1)

V234A/G237A(IgG2)

L235A/G237A/E318A(IgG4)

H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2)

C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1)

C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgG1)

L234F/L235E/P331S(IgG1)

S267E/L328F(IgG1)

已知人IgG1在N297(EU编号系统)含有糖基化位点并且糖基化作用有助于IgG1抗体的效应子功能。示例性IgG1序列提供于SEQIDNO:3中。小组使N297发生突变以尝试制备非糖基化抗体。此类突变重点在于用生理化学性质类似于天冬酰胺的氨基酸例如麸酰胺酸(N297Q)或用模拟不具有极性基团的天冬酰胺的丙氨酸(N297A)取代N297。

如本文所用，“非糖基化抗体”或“非糖基化fc”是指Fc的297位处残基的糖基化状态。抗体或其他分子在一或多个其它位点处可含有糖基化但仍可被视为非糖基化抗体或非糖基化Fc融合蛋白。

在我们尝试制备IgG1Fc无功能的效应子的过程中，发现人IgG1的氨基酸N297突变为甘氨酸，即N297G，提供了与其它氨基酸在其残基上的取代相比，大大优异的纯化效率和生物物理特性。参见实施例8。因此，在优选的实施方案中，IL-2突变蛋白Fc融合蛋白包含具有N297G取代的人IgG1Fc。包含N297G取代的Fc可用于任何其中分子包含人IgG1Fc的背景中，并且不限于使用IL-2突变蛋白Fc融合的背景中。在某些实施方案中，抗体包含具有N297取代的Fc。

包含具有N297G突变的人IgG1Fc的Fc也可包含另外的插入、缺失和取代。在某些实施方案中，人IgG1Fc包含N297G取代并且与SEQIDNO:3中所示氨基酸序列具有至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。在特别优选的实施方案中，C端赖氨酸残基被取代或缺失。含有N297G取代和C端赖氨酸缺失的人IgG1的氨基酸序列在SEQIDNO:4中示出。

含有非糖基化IgG1Fc的分子与含有糖基化IgG1Fc的分子相比显示出更低的稳定性。Fc区可进一步工程改造以增加非糖基化分子的稳定性。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸被取代为半胱氨酸以形成呈二聚体状态的二硫键。SEQIDNO:3中所示的氨基酸序列残基V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332可被半胱氨酸取代。在优选的实施方案中，特定的残基对经取代以使得其优先彼此形成二硫键，从而限制或防止二硫键错配(scrambling)。优选的对包括但不限于A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C以及V323C和I332C。

本文提供其中残基V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332中的一个多个被半胱氨酸取代的含有Fc的分子。优选的含有Fc的分子包括A287C和L306C、V259C和L306C、R292C和V302C或V323C和I332C取代的那些。

示例性含有Fc的分子包括：

具有N297G、A287C、L306C取代和C端K缺失的人IgG1Fc

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNCKTKPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO：39)

具有N297G、A259C、L306C取代和C端K缺失的人IgG1Fc

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPECTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHFALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO：40)

具有N297G、R292C、V302C取代和C端K缺失的人IgG1Fc

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQIDNO：41)

具有N297G、A287C、V306C取代的人IgG1Fc

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNCkTKPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：42)

具有N297G、V259C、L306C取代的人IgG1Fc

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPECTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVCTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG5FFLYSKLTVDK5RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK5LSLSPGK(SEQIDNO：43)

具有N297G、R292C、V302C取代的人IgG1Fc

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO：44)

可对IgG1Fc进行的其它突变包括有利于在含Fc多肽中形成异源二聚体的那些。在一些实施方案中，Fc区经工程改造以产生当在细胞中共表达时有利于两个不同含Fc多肽链的异源二聚体形成的“凸起”和“孔洞”。U.S.7,695,963。在其它实施方案中，Fc区经改变以当在细胞中共表达时使用静电牵引促进异源二聚体形成而阻碍两个不同含Fc多肽的同源二聚体形成。WO09/089,004，其以引用的方式全文并入本文中。优选的异源二聚体Fc包括其中Fc的一条链含有D399K和E356K取代并且Fc的另一条链含有K409D和K392D取代的那些。在其它实施方案中，Fc的一条链含有D399K、E356K和E357K取代，并且Fc的另一条链含有K409D、K392D和K370D取代。

在某些实施方案中，IL-2突变蛋白Fc融合蛋白可有利地为单体的，即仅含有单一IL-2突变蛋白分子。在此类实施方案中，融合蛋白的Fc区可包含一个或多个有利于异源二聚体形成的突变。融合蛋白与Fc区共表达，所述Fc区具有与IL-2突变蛋白Fc融合多肽中的那些交互的突变但缺乏IL-2突变蛋白。当两个含有Fc的多肽形成异源二聚体时，所得的蛋白质仅包含单一IL-2突变蛋白。

产生单体IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的另一方法为融合IL-2突变蛋白和单体Fc，即不会二聚化的Fc区。稳定单体Fc包含阻止二聚化和稳定单聚形式中分子的突变。优选的单体Fc公开于WO2011/063348中，其全文以引用方式并入本文。在某些实施方案中，IL-2突变蛋白Fc融合蛋白包含在392位和409位含有带负电荷的氨基酸以及在Y349、L351、L368、V397、L398、F405或Y407处的苏氨酸取代的Fc。

在某些实施方案中，IL-2突变蛋白Fc融合蛋白包含介于Fc和IL-2突变蛋白之间的接头。许多不同的接头多肽为本领域所知并且可用于IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的背景中。在优选的实施方案中，IL-2突变蛋白Fc融合蛋白包含一个或多个在Fc与IL-2融合蛋白之间由GGGGS(SEQIDNO:5)、GGNGT(SEQIDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO:7)组成的肽的拷贝。在一些实施方案中，Fc与IL-2融合蛋白之间的多肽区包括GGGGS(SEQIDNO:5)、GGNGT(SEQIDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO:7)的单个拷贝。如本文所示，接头GGNGT(SEQIDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO:7)在合适的细胞中表达时被糖基化并且此类糖基化可助于稳定呈溶液形式和/或体内施用时的蛋白质。因此，在某些实施方案中，IL-2突变蛋白融合蛋白包含Fc区与IL-2突变蛋白域之间的糖基化接头。

预期该糖基化接头在放置于多肽的环境中时是有用的。本文所提供包含在多肽的氨基酸序列中插入GGNGT(SEQIDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO:7)或在多肽的氨基酸序列中置换一个或多个氨基酸的多肽。在优选的实施方案中，GGNGT(SEQIDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO:7)被插入多肽三级结构的环中。在其它实施方案中，环的一个或多个氨基酸被GGNGT(SEQIDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO:7)所置换。

Fc的C端部分和/或IL-2突变蛋白的氨基端部分可包含一个或多个突变，所述突变在哺乳细胞中表达时改变IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的糖基化特性。在某些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含T3取代，例如T3N或T3A。IL-2突变蛋白还可包含S5取代，例如S5T

IL-2突变蛋白和IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的共价修饰包括于本发明的范围内，并且通常(但不总是)为翻译后修饰。例如，通过使IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的特异性氨基酸残基与能够与选定侧链或N端或C端残基反应的有机衍生剂反应将IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的共价修饰的若干类型引入分子中。

使最常间的半胱氨酰残基与α-卤代乙酸盐(和对应的胺，例如氯乙酸或氯乙酰胺)反应，从而得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基也衍生自与溴代三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙酰酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的反应。

组氨酰残基衍生自与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下的反应，因为所述试剂对组氨酰侧链具有相对特异性。对溴苯酰甲基溴也是可用的；该反应优选在0.1M的二甲胂酸钠中在pH6.0下进行。

赖氨酰基和氨基端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。使用这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效应。其它适于使含α-氨基的残基衍生化的试剂包括酰亚胺酯，诸如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮；以及与乙醛酸的转氨酶催化反应。

精氨酰残基通过与一个或几个常规试剂反应来修饰，这些试剂包括苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化由于胍官能团的高pK_a而需要反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。

酪氨酰残基的特异修饰已得到了广泛的研究，其中尤其关注通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应而向酪氨酰残基中引入光谱标记。最常见的是，将N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。酪氨酰残基用¹²⁵I或¹³¹I碘化来制备标记的蛋白质以用于放射性免疫测定，上述氯胺T方法是适合的。

羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R'—N＝C＝N--R')反应来选择性地修饰，其中R和R'可任选地为不同的烷基基团，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰基和谷氨酰残基可通过与铵离子反应而转化成天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。

利用双官能剂的衍生化可用于使抗原结合蛋白与用于各种方法的水不溶性载体基质或表面交联。常用的交联剂包括例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如与4-叠氮基水杨酸形成的酯)、同双官能酰亚胺酯(包括二琥珀酰亚氨基酯，诸如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯))以及双官能马来酰亚胺(诸如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷)。诸如3-[(对叠氮苯基)二硫代]丙亚氨酸甲酯的衍生化试剂产生在存在光的情况下能够形成交联的光可活化的中间体。或者，采用反应性水不溶基质诸如溴化氰活化的碳水化合物和反应性底物(例如，如在美国专利号3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440中所述)进行蛋白固定。

谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基往往去酰胺化分别形成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。或者，这些残基在适度的酸性条件下去酰胺化。这些残基的任一形式均落在本发明的范围内。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins:StructureandMolecularProperties，W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，1983，第79-86页)，N端胺的乙酰基化及任何C端羧基的酰胺化。

包含于本发明的范围内的IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的另一种共价修饰形式包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域中所知的，糖基化模式可取决于蛋白质的序列(例如，特定糖基化氨基酸残基的存在与否，下面讨论)，或产生所述蛋白质的宿主细胞或生物体。特定表达系统将于下文中讨论。

多肽的糖基化为N-连接或O-连接。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺酰残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺酰-X-丝氨酸和天冬酰胺酰-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺酰侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列的任一者的存在均会产生潜在糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者与羟氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸)，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

宜通过改变氨基酸序列以使IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白含有一或多个上述三肽序列(对于N-连接糖基化位点)来将糖基化位点添加至IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白中。可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至起始序列或经这些残基取代来进行改变(对于O-连接糖基化位点而言)。为了方便起见，优选通过DNA水平的改变，特别是通过使编码靶多肽的DNA在预选碱基处突变以使得生成将翻译成期望氨基酸的密码子来改变IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白氨基酸序列。

增加IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白上的碳水化合物部分的数量的另一方式是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。这些工序的优点在于其不需要在宿主细胞内产生具有糖基化能力(针对N-连接糖基化和O-连接糖基化)的蛋白质。根据所用偶合模式，可将糖连接至(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基(诸如半胱氨酸的巯基)、(d)游离羟基(诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基)、(e)芳族残基(诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基)或(f)谷氨酰胺酰基的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO87/05330和Aplin和Wriston，1981,CRCCrit.Rev.Biochem.，第259-306页。

起始IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白上存在的碳水化合物部分的去除可以化学方式或以酶促方式完成。化学去糖基化需要将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物中。此处理会导致除连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或所有糖裂解，同时保留多肽完整性。化学去糖基化由Hakimuddin等，1987，Arch.Biochem.Biophys.259:52和由Edge等，1981，Anal.Biochem.118:131描述。可使用多种内切和外切糖苷酶来酶促裂解多肽上的碳水化合物部分如Thotakura等，1987，Meth.Enzymol.138:350描述。可使用化合物衣霉素来防止潜在糖基化位点的糖基化如Duskin等，1982，J.Biol.Chem.257:3105描述。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。

IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的另一共价修饰类型包括以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所阐述的方式将IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白与各种非蛋白质性聚合物(包括但不限于各种多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)连接。此外，可在IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的各个位置处进行氨基酸取代以有利于添加聚合物例如PEG。因此，本发明的实施方案包括PEG化的IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白。相比于非PEG化的蛋白质，此类PEG化的蛋白质可具有延长的半衰期和/或减小免疫原性。

编码IL-2突变蛋白和IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的多核苷酸

本发明涵盖编码IL-2突变蛋白和IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的核苷酸。本发明的各方面包括编码本文所述的氨基酸序列的多核苷酸变体(例如，由于简并性)。在优选的实施方案中，由分离的核苷酸编码的多肽为IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的组分。

对应于本文所述的氨基酸序列的核苷酸序列(其待用作核苷酸分离的探针或引物或用作数据库检索的查询序列)可从氨基酸序列通过“回译”获得。可采用熟知的聚合酶链反应(PCR)程序来分离或扩增编码IL-2突变蛋白和IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的DNA序列。采用界定DNA片段的组合的末端的寡核苷酸作为5'和3'引物。所述寡核苷酸可另外含有限制性核酸内切酶的识别位点，以有利于将扩增的DNA片段组合插入表达载体中。PCR技术描述于Saiki等，Science239:487(1988)；RecombinantDNAMethodology；Wu等编，AcademicPress，Inc.，SanDiego(1989)，第189-196页；和PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications，Innis等编，AcademicPress，Inc.(1990)。

本发明的核酸分子包括呈单链及双链形式的DNA和RNA，以及相应的互补序列。就从天然来源分离的核酸而言，“分离的核酸”是已与自其分离核酸的生物体的基因组中存在的相邻遗传序列分离的核酸。在以酶促方式自模板或以化学方式合成的核酸(例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸)而言，例如，应理解自此类方法得到的核酸为分离的核酸。分离的核酸分子是指呈单独片段形式或作为较大核酸构建体组分的核酸分子。在一个优选的实施方案中，核酸基本上不含污染性内源物质。核酸分子优选衍生自至少分离一次的基本上纯化形式的DNA或RNA，所述DNA或RNA的数量或浓度使得能通过标准生物化学方法(例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY(1989)中所概述的那些)鉴定、操纵及回收其组分核苷酸序列。此类序列优选以未经通常存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子间断的开放阅读框形式提供和/或构建。非翻译DNA序列可位于开放阅读框的5'或3'处，其中其不干扰编码区的操纵和表达。

本发明的变体通常系通过使用盒式或PCR诱变或其它本领域所熟知的技术进行编码IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的DNA中的核苷酸的位点特异性诱变以产生编码该变体的DNA，并随后在本文中所概述的细胞培养物中表达重组DNA来制备。然而，IL-2突变蛋白和IL-2突变蛋白Fc融合蛋白可通过使用已确立的技术进行体外合成来制备。通常所述变体呈现与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如Treg扩增，但所述变体也可选择具有如将在下文中更充分概述的经修饰的特性的变体。

本领域的技术人员应了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，其全部编码本发明的IL-2突变蛋白及IL-2突变蛋白Fc融合蛋白。因此，已鉴定特定氨基酸序列，本领域的技术人员可通过简单地以不会改变所编码的蛋白质的氨基酸序列的方法来修饰一个或多个密码子序列来制备任何数量的不同核酸。

本发明还提供包含至少一个上述多核苷酸的呈质粒、表达载体、转录或表达盒的形式的表达系统及构建体。此外，本发明提供包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。

通常，任何宿主细胞中所用的表达载体都将包含维持质粒以及克隆与表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施方案中，此类序列(统称为“旁侧序列”)通常包括下列一个或多个核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、包含供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、供插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区和可选择标记元件。这些序列的每一者均在下文中讨论。

任选地，载体可包含“标签”-编码序列，即，位于IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白编码序列的5'或3'端的寡核苷酸分子；所述寡核苷酸序列编码polyHis(例如hexaHis(SEQIDNO:21))的，或另一“标签”例如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc，存在用于其的市售抗体。此标签通常在多肽表达时与多肽融合，并且可用作亲和纯化或检测宿主细胞中的IL-2突变蛋白的方式。亲和纯化可例如通过使用针对标签的抗体作为亲和基质进行的管柱层析来实现。任选地，随后可用各种方法(例如使用某些用于裂解的肽酶)从纯化的IL-2突变蛋白和IL-2突变蛋白Fc融合蛋白去除该标签。

旁侧序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即，来自与宿主细胞物种或品系不同的物种)、杂交体(即，来自多个来源的旁侧序列的组合)，合成或天然旁侧序列。因此，旁侧序列的来源可为任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或非脊椎动物生物体或任何植物，前提是旁侧序列可在宿主细胞机构中起作用，并且可由宿主细胞机构活化。

可用于载体中的旁侧序列可通过本领域中熟知的若干种方法中的任一种获得。通常，本文中可用的旁侧序列预先已通过定位和/或限制性内切核酸酶消化加以鉴定，因此可使用适当限制性内切核酸酶将其从适当组织来源中分离。在一些情况下，旁侧序列的全核苷酸序列可能是已知的。在本文中，可使用本文所述的用于核酸合成或克隆的方法合成旁侧序列。

不管已知全部或仅一部分的旁侧序列，均可使用聚合酶链反应(PCR)，和/或通过用合适的探针(诸如寡核苷酸和/或来自相同物种或另一物种的旁侧序列片段)筛检基因组文库来获得所述旁侧序列。如果旁侧序列是未知的，则可从可能含有例如编码序列或甚至另一种或多种基因的较大DNA片段中分离出含有旁侧序列的DNA片段。分离可如下实现：通过限制性内切核酸酶消化产生适当DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化(柱色谱法(Chatsworth,CA))加以分离；或技术人员已知的其它方法来实现分离。实现此目的的合适的酶的选择对于本领域的技术人员所而言是显而易见的。

复制起点通常为商购获得的原核表达载体的一部分，并且该起点有助于载体在宿主细胞中的扩增。如果所选载体不含复制起点位点，则可根据已知序列化学合成并与该载体连接。例如，来自质粒pBR322(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)的复制起点可用于大多数革兰氏阴性细菌，并且各种病毒起点(即SV40、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)或乳头状瘤病毒例如HPV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体无需复制组分起点(例如，通常仅适用SV40起点，因为其也包含病毒早期启动子)。

转录终止序列通常位于多肽编码区末端的3'处，用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列为富含G-C的片段，随后为多聚T序列。尽管该序列易于由文库克隆或甚至作为载体的一部分收购获得，但其也可使用核酸合成方法(诸如本文所述的方法)容易地合成。

可选择标记基因编码在选择性培养基中生长的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白质。典型的选择标记基因编码这样的蛋白质，其(a)赋予原核宿主细胞抗生素或其他毒素，例如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素抗性；(b)补足细胞的营养缺陷型缺陷；或(c)提供从复合培养基或界定培养基无法获得的关键营养素。特异性可选择标记为卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利地，还可使用新霉素抗性基因进行原核与真核宿主细胞的选择。

可使用其它可选择基因来扩增要表达的基因。扩增是基因在继代重组细胞的染色体内连续复制的过程，所述基因对于生长或细胞存活的关键蛋白质的产生而言是必要的。哺乳动物细胞的合适的可选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶基因。使哺乳动物细胞转化体处于选择压力下，其中由于载体中存在可选择基因，因此仅所述转化体唯一适于存活。通过在连续增加培养基中选择剂浓度的条件下培养经转化的细胞来施加选择压力，从而引起可选择基因与编码另一基因(例如IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白)的DNA扩增。因此，自扩增的DNA合成增加量的多肽，例如IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白。

核糖体结合位点通常是mRNA转移启始所必需的，并且通过Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)表征。该元件通常位于启动子的3’和待表达多肽的编码序列的5'。在某些实施方案中，一个或多个编码域可操作地与内部核糖体结合位点(IRES)连接，使得两个开放阅读框从单个RNA转录物翻译。

在一些情况下，例如当需要在真核宿主细胞表达系统中进行糖基化时，可操纵各种前置序列或前导序列以改良糖基化或产率。例如，可改变特定信号肽的肽酶切割位点，或添加前导序列，这也可影响糖基化。最终的蛋白质产物可能在-1位(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个可能末完全移除的易于表达的其它氨基酸。例如，最终的蛋白质产物可能具有一个或两个存在于肽酶切割位点的氨基酸残基，其与氨基末端连接。或者，如果酶在成熟多肽内的某些酶切割位点处切割，则使用此类区域可能产生呈略微截短形式之所需多肽。

本发明的表达和克隆载体通常包含被宿主生物识别并且可操作地与编码IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的分子连接的启动子。启动子是位于控制结构基因的转录的结构基因起始密码子(通常在约100bp至1000bp内)上游(即5')的未转录序列。启动子通常归类为两类之一：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子为应答培养条件的一些改变(例如，养分的存在或不存在或温度变化)而引发DNA在其控制下大量转录，另一方面，组成型启动子均一地转录与其可操作连接的基因，即，对基因表达具有极少控制或无控制。由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子为人们所熟知。

与酵母宿主一起使用的合适的启动子为本领域所熟知。酵母增强了可有利地与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适的启动子为本领域所熟知，且包括但小限于从诸如下列病毒的基因组获得的启动子：多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子、例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。

值得关注的其它启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon，1981，Nature290:304-310)；CMV启动子(Thornsen等，1984，Proc.Natl.Acad.U.S.A.81:659-663)；在劳氏肉瘤病毒的3'长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等，1980，Cell22:787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调控序列Prinster等，1982，Nature296:39-42)；和原核启动子例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。以下表现组织特异性并且已用于转基因动物中的动物转录控制区也值得关注：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell38:639-646；Ornitz等，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald，1987，Hepatology7:425-515)；在胰岛β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature315:115-122)；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell38:647-658；Adames等，1985，Nature318:533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.7:1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell45:485-495)；在肝中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，GenesandDevel.1:268-276)；在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.5:1639-1648；Hammer等，1987，Science253:53-58)；在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，GenesandDevel.1:161-171)；在骨髓细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature315:338-340；Kollias等，1986，Cell46:89-94)；在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2-基因控制区(Sani，1985，Nature314:283-286)；以及在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science234:1372-1378)。

可在载体中插入增强子序列以增强高等真核生物的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，通常为约10-300个碱基对长，其作用于启动子以增强转录。增强子的取向和位置相对独立，已发现其位于位置转录单元的5'和3'。已知可自哺乳动物基因获得的若干增强子序列(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白质和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域中已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子为用于活化真核启动子的示例性增强元件。虽然增强子可能位于载体中编码序列的5'或3'端，但其通常位于启动子的5'位点。可将编码适当的天然或异源信号序列的序列(前导序列或信号肽)结合到表达载体中，以促进IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于供产生蛋白质的宿主细胞的类型，并且异源信号序列可置换天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中起作用的信号肽的实例包括以下：美国专利号4,965,195中所述的白介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等，1984,Nature312:768中所述的白介素-2受体的信号序列；欧洲专利号0367566中所述的白介素-4受体信号肽；美国专利号4,968,607中所述的I型白介素-1受体信号肽；欧洲专利号0460846中所述的II型白介素-1受体信号肽。

当将载体整合至宿主细胞基因组中时，所述载体可含有一个或多个有助于表达的元件。实例包括EASE元件(Aldrich等2003BiotechnolProg.19:1433-38)和基质附着区(MAR)。MAR介导染色质的组织结构并且隔离整合的载体不受“位置”效应影响。因此，MAR在当载体用来产生稳定的转染子时尤其有用。许多天然的和合成的含有MAR的核酸为本领域已知，例如美国专利号6,239,328；7,326,567；6,177,612；6,388,066；6,245,974；7,259,010；6,037,525；7,422,874；7,129,062。

所提供的表达载体可由起始载体(例如市售载体)构建。此类载体可能含有或可能不含所有所需旁侧序列。如果本文所述的一个或多个旁侧序列已不存在于载体中时，则其可独立获得并连接到载体中。用于获得各旁侧序列的方法为本领域技术人员所熟知。

在已构建载体且已将编码IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的核酸分子插入所述载体的适当位点中后，可将所完成载体插入核实的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。可通过众所周知的方法，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术，将表达载体转化至所选宿主细胞中。所选方法将部分取决于待使用的宿主细胞类型。这些方法和其它合适的方法为本领域的技术人员所熟知，并且描述于例如Sambrook等，2001中，见上文。

当在适当条件下培养时，宿主细胞将合成IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白，随后可从培养基(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生所述蛋白质的宿主细胞中(如果未分泌)收集。适当宿主细胞的选择取决于多种因素，诸如所需表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)以及折叠成生物活性分子的容易度。宿主细胞可是为真核的或原核的。

可用作宿主以供表达的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，并且包括但不限于可得自美国模式培养物保藏所(ATCC)的永生化细胞系，并且本领域中已知的表达系统中所用的任何细胞系可用于制备本发明的重组多肽。通常，用包含编码所需IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。其中可采用的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞及哺乳动物来源的确立细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞COS-7系(ATCCCRL1651)(Gluzman等，1981，Cell23:175)，L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL163)，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物(例如VeggieCHO和生长于无血清培养基中的相关细胞系)(Rasmussen等，1998，Cytotechnology28:31)，HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系，和衍生自非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCCCCL70)的CVI/EBNA细胞系(如McMahan等，1991，EMBOJ.10:2821所述)、人胚胎肾细胞(例如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞、人Colo205细胞，其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、衍生自初生组织体外培养的细胞株、初生外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。任选地，当期望在各种信号转导或报告基因测定中使用多肽时，可使用诸如HepG2/3B、KB、NIH3T3或S49的哺乳动物细胞系用于多肽表达。

或者，可在诸如酵母的低等真核生物或在诸如细菌的原核生物中产生多肽。合适的酵母包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克鲁维酵母菌株(Kluyveromycesstrains)、假丝酵母(Candida)或任何能表达异源多肽的酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)或任何能表达异源多肽的细菌菌株。如果多肽是在酵母或细菌中得到，则有利的是例如通过适当位点的磷酸化或糖基化来修饰其中所产生的多肽，以获得功能性多肽。可使用已知的化学或酶促方法完成此类共价连接。

所述多肽也可将本发明的分离核酸与一或多个昆虫表达载体中的合适控制序列可操作地连接并采用昆虫表达系统来产生。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如Invitrogen，SanDiego，Calif.，U.S.A.(试剂盒)，并且此类方法为本领域中所熟知，如Summers和Smith，TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.1555(1987)，以及Luckow和Summers，Bio/Technology6:47(1988)中所描述。也可采用无细胞翻译系统并使用衍生自本文所公开的核酸构建体的RNA来产生多肽。与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当克隆和表达载体由Pouwels等(CloningVectors:ALaboratoryManual，Elsevier，NewYork，1985)进行了描述。包含优选可操作地连接至至少一个表达控制序列的本发明分离核酸的宿主细胞是“重组宿主细胞”。

在某些方面，本发明包括编码如下人IL-2突变蛋白的分离的核酸，其优先刺激T调节细胞并且包含V91K取代和与SEQIDNO:1中所示氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。分离的核酸可编码本文所述的任何示例性IL-2突变蛋白。

也包括编码本文所述的任何示例性IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的分离的核酸。在优选的实施方案中，抗体的Fc部分和人IL-2突变蛋白在单个开放阅读框内编码，任选地在Fc区和IL-2突变蛋白之间编码接头。

在另一方面，本文提供包含可操作地连接至启动子的上述IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白-编码核酸的表达载体。

另一方面，本文中提供包含编码上述IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的分离核酸的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，或可为真核细胞例如哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

在另一个方面，本文提供制备人IL-2突变蛋白的方法。所述方法包括在其中表达可操作地连接至人IL-2突变蛋白的启动子的条件下培养宿主细胞。随后，从所述培养物中收集人IL-2突变蛋白。所述IL-2突变蛋白可从培养基和/或宿主细胞溶解物中收集。

在另一个方面，本文提供制备人IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的方法。所述方法包括在其中表达可操作地连接至人IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的启动子的条件下培养宿主细胞。随后，从所述的培养物中收集人IL-2突变蛋白Fc融合蛋白。所述人IL-2突变蛋白Fc融合蛋白可从培养基和/或宿主细胞溶解物中收集。

药物组合物

在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的IL-2突变蛋白以及药学上有效的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在某些实施方案中，IL-2突变蛋白属于IL-2突变蛋白Fc融合蛋白的范围。本发明的药物组合物包含但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

优选地，调配材料在所用剂量和浓度下对接受者无毒性。在具体实施方案中，提供包含治疗有效量的含有IL-2突变蛋白的治疗分子(例如IL-2突变蛋白Fc融合物)的药物组合物。

在某些实施方案中，药物组合物可含有调节、维持或保持例如组合物的pH、同渗容摩、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透性的调配材料。在此类实施方案中，合适的调配材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；增量剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖；和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分了量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必太、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如普卢兰尼克(pluronic)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲通(triton)、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙伯(tyloxapal))；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES，18"版，(A.R.Genrmo等)，1990，MackPublishingCompany。

在某些实施方案中，本领域的技术人员将根据例如预期施用途径、递送形式和所需剂量来确定最佳药物组合物。参见例如REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES，见上文。在某些实施方案中，此类组合物可影响本发明的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清涂速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可为水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载剂可为注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其可能会补充有肠胃外施用的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水为其它例示性媒介物。在具体实施方案中，药物组合物包含pH值约为7.0-8.5的Tris缓冲液，或pH值约为4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并且还可包括山梨糖醇或其合适的替代物。在本发明的某些实施方案中，Il-2突变蛋白组合物可通过将具有期望纯度的所选组合物与任选的(REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES，见上文)混合成冻干饼或水溶液的形式来制备以供储存。此外，在某些实施方案中，IL-2突变蛋白产物可使用适当赋形剂(例如蔗糖)调配为冻干产物。

本发明的药物组合物可选择肠胃外递送。或者，可选择用于吸入或通过消化道(例如口服)递送的组合物。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。调配组分优地以施用部位可接受的浓度提供。在某些实施方案中，使用缓冲液将组合物的pH值维持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。

当预期肠胃外施用时，可以不含热原的肠胃外可接受的水溶液形式提供用于本发明的治疗组合物，其包含存于药学上可接受媒介物中的期望IL-2突变蛋白。特别合适的肠胃外注射用媒介物为无菌蒸馏水，其中将IL-2突变蛋白组合物调配为无菌等渗溶液，并适当保存。在某些实施方案中，制备可涉及用诸如可注射微球体、生物易蚀性粒子、聚合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体的试剂调配所需分子，这些调配物可使可经由积存注射递送的产物控制释放或持续释放。在某些实施方案中，也可使用透明质酸，其具有在循环中促进持续释放时间的作用。在某些实施方案中，可用可植入药物递送装置引入IL-2突变蛋白组合物。

其它药物组合物对本领域的技术人员而言显而易见，包括涉及IL-2突变蛋白组合物的呈持续递送或受控递送调配物的调配物。本领域的技术人员也已知用于调配多种其它持续或控制递送方式(例如脂质体载体、生物易蚀性微粒或多孔珠粒和积存注射)的技术。参见例如国际专利申请号PCT/US93/00829，其以引用的方式并入，并描述了用于递送药物组合物的多孔聚合微粒的控制释放。持续释放制剂可包括半渗透性聚合物基质，其呈成形制品形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号EP058481所公开，两者以引用的方式并入)、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers2:547-556)，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15:167-277和Langer，1982,Chem.Tech.12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，1981，见上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号EP133,988)。持续释放组合物还可包括可通过本领域中已知的若干种方法中的任一种制备的脂质体。参见例如Eppstein等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688-3692；欧洲专利申请公开号EP036,676；EP088,046和EP143,949，这些文献以引用的方式并入。

用于体内施用的药物组合物通常是以无菌调配物的形式提供。可通过用无菌滤过膜过滤实现灭菌。当将组合物冻干时，可在冻干和复原之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或溶液形式储存。通常将肠胃外组合物置于具有无菌存取口的容器中，例如静脉注射溶液袋或具有可经皮下注射针穿透的塞子的小瓶。

本发明的各方面包括自缓冲IL-2突变蛋白调配物，其可用作药物组合物，如国际专利申请WO06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述，其全文以引用方式并入本文。

如上所讨论，某些实施方案提供IL-2突变蛋白组合物，特别是药物Il-2突变蛋白Fc融合蛋白，其除IL-2突变蛋白组合物外包含一种或多种赋形剂，例如在此章节和本文其它地方说明性描述的那些。就此而言，赋形剂可用于本发明中用于多种目的，例如调节调配物的物理、化学或生物特性，例如调节粘度，和/或调节本发明的过程以改善有效性和/或稳定此类调配物和过程，以抵抗由于例如在生产、运输、储存、使用前的准备、施用期间及其后存在的应力而发生的降解及腐败。

可获得多种关于就此而言有用的蛋白质稳定及调配材料及方法的说明，例如Arakawa等，"Solventinteractionsinpharmaceuticalformulations"，PharmRes.8(3):285-91(1991)；Kendrick等，"Physicalstabilizationofproteinsinaqueoussolution"，RATIONALDESIGNOFSTABLEPROTEINFORMULATIONS:THEORYANDPRACTICE，Carpenter和Manning编，PharmaceuticalBiotechnology.13:61-84(2002)，和Randolph等，"Surfactant-proteininteractions"，PharmBiotechnol.13:159-75(2002)，其各自以引用方式全文并入本文中；特别是以与本发明的自缓冲蛋白质调配物的赋形剂及其方法有关的部分、特别是关于用于兽医和/或人医学用途的蛋白质药品及方法的部分并入本文中。

可根据本发明的某些实施方案使用盐以例如调节调配物的离子强度和/或等渗性和/或改善蛋白质或本发明组合物的其它成分的溶解性和/或物理稳定性。

众所周知，离子可通过结合至蛋白质表面上的带电荷残基并通过屏蔽蛋白质中的带电荷且具极性基团并减小其静电相互作用、吸引及排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的自然状态。离子也可通过与蛋白质的变性肽连接(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电荷极性基团的离子相互作用也可减小分子间静电相互作用，并从而防止或减少蛋白质聚集和不溶性。

离子物质对蛋白质的效应显著不同。已开发可用于调配本发明的药物组合物的许多分类等级的离子及其对蛋白质的效应。一实施例为Hofmeister系列，其根据离子溶质和极性非离子溶质对蛋白质在溶液中的构象稳定性的效应对其进行分级。稳定溶质被称为“亲液的(kosmotropic)”。去稳定溶质被称为“离液的(chaotropic)”。亲液剂(kosmotrope)常以高浓度(例如>1摩尔硫酸铵)以使得蛋白质从溶液中沉淀(“盐析”)。离液剂(chaotrope)通常用于使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子“盐溶”和“盐析”的相对有效性界定其在Hofmeister系列中的位置。

游离氨基酸可根据本发明的各种实施方案用于IL-2突变蛋白调配物中作为增量剂、稳定剂和抗氧化剂以及其它标准用途。可使用赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸稳定调配物中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼结构和特性。精氨酸可用于抑制在液体和冻干调配物两者中的蛋白质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。

多元醇包括糖(例如甘露糖醇、蔗糖和山梨醇)和多元醇(例如甘油和丙二醇)以及出于本文讨论的目的聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇为亲液的。它们是在液体及冻干调配物两者中用于保护蛋白质免于物理及化学降解过程的稳定剂。多元醇也可用于调节调配物的张力。

本发明的选择实施方案中有用的多元醇特别为甘露醇，其常用于确保呈冻干调配物的饼的结构稳定性。其确保饼的结构稳定性。其通常与冷冻保护剂如蔗糖一起使用。山梨醇和蔗糖是其中用于调节张力以及用作稳定剂以在运输期间抵抗冻-融应力或在制备过程中制备散料的优选试剂。还原糖(其含有游离醛或酮基团，例如葡萄糖及乳糖)可糖化表面离氨酸和精氨酸残基。因此，其通常不属于根据本发明使用的优选多元醇。此外，就此而言在酸性条件下水解成果糖喝葡萄糖且由此导致糖化的形成此类反应性物质的糖(例如蔗糖)也不属于本发明的优选多元醇。PEG可用于稳定蛋白质并用作冷冻保护剂，并且就此而言可用于本发明。

IL-2突变蛋白调配物的实施方案还包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附于表面上并易于变性，并由此在气体-液体、固体-液体及液体-液体界面处聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些不利的相互作用通常与蛋白质浓度成反并且通常因物理搅拌(例如在产品运输和处理期间所产生的那些)而加剧。

表面活性剂常规地用于防止、最小化或降低表面吸附。就此而言，本发明的可用表面活性剂包括聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的其它脂肪酸酯和泊洛沙姆188。

表面活性剂也通常用于控制蛋白质的构象稳定性。就此而言，表面活性剂的用途具有蛋白质特异性，因为任何给定表面活性剂通常将稳定一些蛋白质并使其它蛋白质去稳定。

聚山梨醇酯易于氧化降解并且常常以供应状态含有引起蛋白质残基侧链(特别甲硫氨酸)氧化的足量过氧化物。因此，应小心使用聚山梨醇酯，并且在使用时，应采用其最低有效浓度。就此而言，聚山梨醇酯例示赋形剂应以其最低有效浓度使用的一般规则。

IL-2突变蛋白调配物的实施方案还包含一种或多种抗氧化剂。在某种程度上可，可通过维持适当程度的环境氧气及温度并通过避免暴露于光下来防止药物调配物中蛋白质的不利氧化。也可用抗氧化剂赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。就此而言，其中可用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗蛋白质调配物的抗氧化剂优选为水溶性的并在产品的整个贮存期限期间维持其活性。就此而言，EDTA是根据本发明的优选抗氧化剂。

抗氧化剂可损坏蛋白质。例如，诸如谷胱甘肽的还原剂特别可破坏分子内的二硫键。因此，用于本发明的抗氧化剂是经选择以特别消除或充分降低自身损坏调配物中的蛋白质的可能性。

根据本发明的调配物可包括为蛋白质辅因子并且是形成蛋白质配位络合物所必需的金属离子，例如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子也可抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。

可用镁离子(10-120mM)来抑制天冬氨酸异构化成异天门冬氨酸。Ca⁺²离子(最多100mM)能增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²可使rhDNase去稳定。类似地，Ca⁺²和Sr⁺²可稳定因子VIII，其可因Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²、Cu⁺²和Fe⁺²而去稳定，并且其聚集可因Al⁺³离子而增加。

IL-2突变蛋白调配物的实施方案还包含一种或多种防腐剂。当开发涉及自同一容器提取一次以上的多剂量肠胃外调配物时，防腐剂是必需的。其主要作用是抑制微生物生长并在药物产品的储存寿命或使用期限期间确保产品无菌性。常常使用的防腐剂包括苄醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂具有较长的与小分子肠胃外剂一起使用的历史，但包含防腐剂的蛋白质调配物的研发可具挑战性。防腐剂对蛋白质几乎总是具有去稳定效应(聚集)，并且这也成为限制其在多剂量蛋白质调配物中的使用的主要因素。迄今，大多数蛋白质药物已经调配仅用于一次性使用。然而，当多剂量调配物成为可能时，其具有方便患者及提高可销售性的额外优势。一个良好的实例为人生长激素(hGH)的多剂量调配物，其中保存调配物的开发已导致更便利的多次使用注射笔呈递的商业化。目前市场上可获得至少四种含有hGH的保存调配物的此类笔装置。Norditropin(液体，NovoNordisk)、NutropinAQ(液体，Genentech)&Genotropin(冻干--双室药筒，Pharmacia&Upjohn)含有苯酚，而Somatrope(EliLilly)是用间甲酚调配的。

在保存剂型的调配及开发期间需要考虑若干方面。药物产品中的有效防腐剂浓度必须进行优化。这需要在所述剂型中以赋予抗微生物有效性而不会使蛋白质稳定性受损的浓度范围测试给定防腐剂。

正如可预料的，开发含有防腐剂的液体调配物比冻干调配物更具挑战。冷冻-干燥产品可在不存在防腐剂的情况下冻干并在使用时利用含有稀释剂的防腐剂复原。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，从而使相关稳定性风险显著最小化。对于液体调配物，应在整个产品储存寿命(约18个月至24个月)内维持防腐剂有效性和稳定性。需要注意的很重要的一点是应在含有活性药物和所有赋形剂组份的最终调配物中展示防腐剂有效性。

IL-2突变蛋白调配物通常将尤其针对具体施用途径和方法、具体施用剂量及施用频率、具体疾病的具体治疗、利用生物有效性和持久性的范围来设计。从而可根据本发明设计调配物用于通过任何合适的途径，包括但不限于经口、经耳、经眼部、经直肠和经阴道以及通过肠胃外途径(包括静脉内和动脉内注射，肌内注射及皮下注射)递送。

一旦已调配药物组合物后，就可将其以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或脱或冻干粉末形式储存于无菌小瓶中。可将此类调配物以即用形式或以在施用之前复原的形式(例如冻干)储存。本发明也提供产生单一剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性调配物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器及冻干剂注射器(lyosyringe))的试剂盒。

要采用的包含IL-2突变蛋白的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域的技术人员将理解，用于治疗的适当剂量水平部分取决于所递送的分子、使用IL-2突变蛋白所针对的适应症、施用途径和患者的体格(体重、体表或器官尺寸)和/或状况(年龄和一般健康状况)。在某些实施方案中，临床医师可滴定剂量，并改变施用途径以获得最佳治疗效果。根据上述因素，典型的剂量范围为约0.1μg/kg至约1mg/kg或更高。在具体实施方案中，剂量范围可从0.5μg/kg至约100μg/kg，任选地从2.5μg/kg至约50μg/kg。

治疗有效量的IL-2突变蛋白优选降低疾病症状的严重性，增加无疾病症状期的频率及持续时间，或预防因感病性所致的损伤或残疾。

可使用医学装置施用药物组合物。使用医疗装置施用药物组合物的实例描述于美国专利号4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851和5,399,163中，其全部以引用方式并入本文中。

治疗自体免疫或炎性疾病的方法

在某些实施方案中，本发明的IL-2突变蛋白用来治疗自体免疫或炎性疾病。在优选的实施方案中，使用IL-2突变蛋白Fc融合蛋白。

特别适用于用本文所公开的IL-2突变蛋白治疗的疾病包括但不限于炎症、自体免疫疾病、特应性疾病、副肿瘤性自体免疫疾病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年型关节炎、幼年型类风湿性关节炎、少关节性幼年型类风湿性关节炎、多关节性幼年型类风湿性关节炎、全身性幼年型类风湿关节炎、幼年型强直性脊柱炎、幼年型肠病性关节炎、幼年型反应性关节炎、幼年型赖特(Reiter)综合征，SEA综合征(血清阴性、肌腱端病、关节病综合征)、幼年型皮肌炎、幼年型牛皮癣性关节炎、幼年型硬皮病、幼年型全身性红斑狼疮、幼年脉管炎、少关节性类风湿性关节炎、多关节性类风湿性关节炎、全身性类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、赖特综合征、SEA综合征(血清阴性、肌腱端病、关节病综合征)、皮肌炎、牛皮癣性关节炎、硬皮病、脉管炎、肌炎、多发性肌炎、皮肌炎、结节性多动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬化症、原发性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’ssyndrome)、牛皮癣、斑块状牛皮癣、滴状牛皮癣、反转型牛皮癣、脓疱性牛皮癣、红皮性牛皮癣、皮炎、特应性皮炎、动脉粥样硬化、狼疮、斯提耳病(Still’sdisease)、全身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、炎性肠病(IBD)、克罗恩病(Crohn’sdisease)、溃疡性结肠炎、乳糜泻、多发性硬化症(MS)、哮喘、COPD、鼻窦炎、鼻窦炎伴鼻息肉、嗜酸性食管炎、嗜酸性支气管炎、吉巴氏综合症综合征(Guillain-Barredisease)、I型糖尿病、甲状腺炎(例如格雷氏病(Graves’disease))、艾迪森氏病(Addison’sdisease)、雷诺氏现象(Raynaud’sphenomenon)、自体免疫肝炎、GVHD、移植排斥、肾损害、丙肝诱发的血管炎、自然性流产等等。

在优选的实施方案中，自体免疫或炎性疾病是狼疮、移植物抗宿主疾病、丙肝诱发的血管炎、I型糖尿病、多发性硬化症、自然性流产、特应性疾病和炎性肠疾病。

扩增Treg细胞的方法

IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白可用于在受试者或样品内扩增Treg细胞。本文提供增加Treg与非调节T细胞的比率的方法。所述方法包含使T细胞群体与有效量的人IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合物接触。所述比率可通过测定T细胞群体内的CD3+FOXP3+细胞与CD3+FOXP3-细胞的比率来测量。人血液中的典型Treg频率为总CD4+CD3+T细胞的5％至10％，然而，在上文所示疾病中此百分比可较低或较高。在优选的实施方案中，Treg的百分比增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1000％。Treg的最大倍数增加可针对特定疾病而变；然而，可通过IL-2突变蛋白治疗获得的最大Treg频率为总CD4+CD3+T细胞的50％或60％。在某些实施方案中，将IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白施用给受试者且受试者外周血内的调节T细胞(Treg)对非调节T细胞的比率增加。

由于IL-2突变蛋白及IL-2突变蛋白Fc融合蛋白相比于其它细胞类型优先扩增Treg，因此它们也可用于增加受试者外周血内调节T细胞(Treg)对自然杀伤(NK)细胞的比率。所述比率可通过测定CD3+FOXP3+细胞与CD16+和/或CD56+淋巴细胞(其为CD19-及CD3-)的比率来测量。

预期IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白Fc融合蛋白可对患者的疾病或病症具有治疗效应，而不会显著扩增患者外周血内Treg与非调节T细胞或NK细胞的比率。所述治疗效果可归因于IL-2突变蛋白或IL-2Fc融合蛋白在炎症或自体免疫部位的局部活性。

实施例

以下提供的实施例(实际的及预示性的)旨在示出本发明的具体实施方案或特征，而不是为了限制其范围。

实施例1--减少赋予对CD25高亲和力的突变数

IL-2突变蛋白对CD25具有升高的亲和力且具有减少的通过IL-2Rβγ的信号传导强度优先促进Treg生长和功能。为了降低潜在的免疫原性，寻求实现对CD25高亲和力所需的最小突变数。IL-2与其三种受体(PDB代码-2B5I)的复合物的晶体结构显示V69A及Q74P是定位于与CD25相互作用的螺旋结构中。这可解释V69A及Q74P通常在两次针对高CD25结合亲和力的独立IL-2诱变筛选中分离的原因(Rao等2005；Thanos等2006)。该实施例探究了Rao等筛选中所鉴定的IL-2突变蛋白“2-4”的其它突变中何者对增加上文利用单独V69A及Q74P所观测到的亲和力最重要。通过流式细胞术针对与活化T细胞表面上的CD25的结合筛选以下蛋白质。所有构建体也包括用于纯化及检测的C端FLAG及poly-His标签。特异性突变提供于括号中。

HaMut1D(V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO：8)

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

HaMut2D(N30S，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO：9)

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HaMut3D(K35R，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO：10)

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HaMut4D(T37A，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO：11)

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HaMut5D(K48E，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO：12)

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HaMut6D(E68D，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO：13)

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HaMut7D(N71R，V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO：14)

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HaMut8D(K35R，K48E，E68D，N88D，C125A)(SEQIDNO：15)

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HaMut7D以与初始分离物2-4”(～200pM)几乎相同的亲和力结合CD25，这指示突变N71R能够极大增加上文利用单独V69A、Q74P所观测到的亲和力(HaMut1D，～2nM)。其它构建体具有与HaMut1D类似或略高于其的亲和力，亲和力仅略高于WTIL-2的HaMut8D除外。

实施例2--与IgG1-Fc域融合以实现具有改善的半衰期的IL-2突变蛋白

为减少利用IL-2突变蛋白实现Treg富集所需的给药频率，评价IL-2与IgG1-Fc域之间的各种融合物。Fc域包含点突变来消除IgG1介导的效应子功能，例如靶细胞溶解。我们的研究中使用的Fc效应子功能突变为A327Q、AlaAla(L234A+L235A)或N297G。由于Treg选择性IL-2突变蛋白的IL-2效能具有部分降低，因此以不会显著影响IL-2R信号传导的方式使IL-2与Fc融合甚为重要。因此，测试IL-2突变蛋白的利用及不利用Fc融合物的IL-2R活化。

为测定通过Fc融合物的IL-2二聚化是否将因对IL-2R的增加的亲合力而提高IL-2R信号传导强度，使较弱IL-2突变蛋白(haD5)(US20110274650)与Fc的氨基端融合，通过GGGGS(SEQIDNO:5)接头序列分开。此突变蛋白具有3种影响IL-2R信号传导(E15Q、H16N、N88D)的突变、8种赋予对CD25的高亲和力(N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P)的突变(Rao等，2005)和防止半胱氨酸错配和聚集的C125S。以类似方式与融合Fc完全消除haD5的生物活性，而增强其与细胞表面CD25的高亲和力结合，很可能是由于因二聚化而增加的亲合力。

也使IL-2突变蛋白与Fc异源二聚体的N-或C端融合，从而使得Fc二聚体的仅一条链具有IL-2域。两个不对称Fc链之间的异源二聚体配对是通过一个Fc链上所引入的赖氨酸与另一Fc链上所引入的天冬氨酸之间的静电相互作用来促进。在一种构型优选的情况下，使IL-2突变蛋白haD6与一个Fc链或另一链的N端融合，从而得到两种称为haD6.FcDD和haD6.FcKK的蛋白质构建体。我们也用一个或两个GGGGS(SEQIDNO:5)接头使突变蛋白haMut7D和Fc-异源二聚体的C-端融合(FcKK(G4S)haMut7D,FcKK(G4S)2haMut7D)。在pSTAT5和T细胞增殖实验中，IL-2突变蛋白haD6与Fc异源二聚体的N端的融合导致相对于游离haD6损失部分活性。相比之下，haMut7D与Fc异源二聚体的C端利用一或两个GGGGS(SEQIDNO:5)连接体的融合不会改变haMut7D的效能。

也探究了IL-2突变蛋白和Fc同源二聚体的C-端的融合。在T75组织培养烧瓶中利用100ng/ml抗CD3(OKT3)以3亿个细胞/100ml活化总PBMC。在培养的第3天，洗涤细胞3次并静置在新鲜培养基中3天。然后利用IL-2变体以在1pM至10nM之间的10×剂量调节刺激细胞达50μl的最终体积。使用BDphosflow缓冲液试剂盒测量STAT5磷酸化的水平。简而言之，添加1ml的BD溶解/固定phosflow缓冲液以停止刺激。在37℃下将细胞固定20分钟并在冰上利用1xBDphosflowperm缓冲液透化，然后针对CD4、CD25、FOXP3及pSTAT5进行染色。

如图1中可见，突变蛋白haMut1D及haMut7D的生物活性不会因与Fc同源二聚体的C端融合而改变。因此，IL-2的N端与Fc的C端之间的融合不会使IL-2突变蛋白的激动剂活性受损，甚至在Fc.IL-2同源二聚体的背景中也如此。在这些构建体中，使用C125A突变代替C125S用于经改善的制备。

实施例3--调节IL-2突变蛋白效能以实现优先的Treg生长

初始IL-2突变蛋白组含有单独N88D或N88D以及1种或2种影响IL-2R信号传导的额外突变。设计第二组突变蛋白，全部具有单一点突变，目的是鉴定具有与N88D系列类似或略较强效的激动作用的突变蛋白。基于预测的IL-2Rβ-相互作用的氨基酸(晶体结构，PDB代码–2B5I)来鉴定一组24种信号传导突变。基于预测的在突变蛋白与IL-2Rβ之间的结合自由能的降低选择特定取代。采用EGAD计算算法(Handel’sLaboratory，UniversityofCalifornia,SanDiego，USA)来计算结合自由能。突变蛋白的结合自由能定义为ΔΔG_mut＝μ(ΔG_mut–ΔG_wt)。其中，μ(＝0.1，通常)是用于使结合亲和力的预测变化归一化以当与实验能相比时具有1的斜率的比例因子(Pokala和Handel2005)。解离的自由能(ΔG)定义为复合物(ΔG_结合)和自由状态(ΔG_自 _由)之间的能量差。针对每个取代计算解离能ΔGmut。

一组具有以下取(H16E、H16Q、L19K、D20R、D20K、D20H、D20Y、M23H、D84K、D84H、S87Y、N88D、N88K、N88I、N88H、N88Y、V91N、V91K、V91H、V91R、I92H、E95K、E95R或E95I)的IL-2突变蛋白被表达为与Fc异源二聚体的C端融合物形式。这些构建体也含有用于高CD25结合亲和力的haMut7突变(V69A、N71R、Q74P)及用于有效折叠的C125A。

在实施例2的T细胞STAT5磷酸化测定中针对效能筛选所述组，并且发现H16E、D84K、V91N、V91K及V91R具有小于野生型IL-2且超过N88D的活性(图2)。

H16E、D84K、V91N、V91K和V91R具有小于野生型IL-2并超过N88D的活性。

也在T细胞及NK生长测定中测试所选突变蛋白。

对于T-细胞测定，利用100ngOKT3以3百万个/毫升活化总PBMC。在第2天，洗涤细胞3次并静置在新鲜培养基中5天。然后用CFSE标记细胞，并在24孔板中以50万个/孔于含有IL-2的培养基中进一步培养7天，然后进行FACS分析。T细胞亚群的增殖以CFSE稀释(中值CFSE荧光)呈现于图3中。

对于NK-细胞测定，在96孔板中以10万个/孔于含有IL-2的培养基中将MACS分类的CD16+NK细胞培养3天。在孵育的最后18小时期间每孔加入0.5μCi³的H-胸苷。结果在图4中示出。

突变体H16E、D84K、V91N、V91K和V91R突变体能以与WTIL-2类似的程度刺激Treg生长，但对其它T细胞的效力为约小10x(图3)，并且对NK细胞的效力为约小100x(图4)。

设计单独Fc.IL-2融合蛋白组，其中Fc异源二聚体与突变蛋白haMut7(V69A、N71R、Q74P、C125A)之间的距离因一系列个别氨基酸截短而减少。

Fc.haMut7Fc...TQKSLSLSPGKGGGGSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：22)

Trunc1Fc...TQKSLSLSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：23)

Trunc2Fc...TQKSLSLS-STKKTQLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：24)

Trunc3Fc...TQKSLSLS--TKKTQLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：25)

Trunc4Fc...TQKSLSLS---KKTQLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：26)

Trunc5Fc...TQKSLSLS----KTQLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：27)

Trunc6Fc...TQKSLSLS-----TQLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：28)

Trunc7Fc...TQKSLSLS------QLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：29)

Trunc8Fc...TQKSLSL-------QLQLEHLLLDLQMILN...haMut7(SEQIDNO：30)

Trunc1-Trunc4具有等于全长亲本构建体Fc.haMut7的效能，如图2、3及4所阐述通过STAT5磷酸化并通过T细胞及NK细胞增殖来测量。Trunc5和Trunc6刺激较弱反应，但相比于由N88D突变(haD及haMut7D)刺激的反应较强且与由V91K刺激的反应极为类似Trunc7相比于N88D突变蛋白较弱，且Trunc8具有极少活性。然而，当测试对NK细胞时，Trunc5和Trunc6为强于V91K的激动剂，这指示Treg选择性更容易利用信号传导突变而非近侧Fc域的空间位阻来实现。

实施例4--Fc同源二聚体的背景中的高CD25亲和力突变

赋予高CD25结合亲和力的突变被认为是有利的，因为它们增加了高CD25T细胞的趋向性，并且因为它们促进了长期CD25：：IL-2突变蛋白缔合和持久的信号传导。然而，减少突变数量可降低免疫原性潜力。N88D或V91K突变蛋白(具有及不具有haMut1高亲和力突变V69A及Q74P)表达为与Fc同源二聚体的C端的融合物形式并针对生物活性进行比较。在pSTAT5的刺激测定中，同源二聚化相对于单体突变蛋白对信号强度没有效应。高亲和力突变V69A和Q74P的逆转也不会影响pSTAT5信号传导。在T细胞生长测定中，高亲和力突变降低了对常规CD4T细胞和CD8T细胞的活性但未降低调节T细胞的活性(图5)。高亲和力突变也未改变NK细胞中的增殖反应(图6)。

为了测定高亲和力突变是否影响体内T细胞响应，我们利用Fc.IL-2突变蛋白融合蛋白向人源化小鼠(利用人CD34+造血干细胞复原的NOD.SCID.Il2rg裸小鼠)给药并监测Treg扩增。对7周龄NOD.SCID.Il2rg-裸(NSG)小鼠(JacksonLabs，BarHarbor，ME)辐照(180rad)并用94,000个人胎肝脏CD34⁺造血干细胞复原。在21周，基于嵌合百分比的均等分布(通过PBL的流式细胞术测定)将小鼠分成6组，在第0天和第7天通过皮下注射给予1μg的所示的Fc突变蛋白或PBS。在第11天，通过流式细胞术测定血液中的T细胞亚群频率。在每只动物1μg的低剂量下，高亲和力突变不会改善Treg扩增超过利用单独N88D或V91K突变所观察的情况(图7)。

Treg扩增是选择性的，这是由于FOXP3^-CD4⁺T细胞不会增加相对于总外周血白细胞(PBL，包括人B和T细胞的混合物)及小鼠髓样细胞的丰度。此外，在较高剂量时，高亲和力突变促进CD25⁺FOXP3^-T细胞的增加，因此降低了Treg的选择性。因此，在Fc同源二聚体的背景中，认为高亲和力突变对于促进优化Treg生长并非必需的。

Fc.WTIgG1Fc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(C125A)(SEQIDNO：16)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

GGGGS

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Fc.haMut1V91KIgG1Fc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(V69A，Q74P，V91K，C125A)(SEQIDNO：17)

GGGGS

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEALNLAPSKNFHLRPRDLISNINKIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

Fc.V91KIgG1Fc(N297G_delK)：：G45：：hulL-2(V91K，C125A)(SEQIDNO：18)

GGGGS

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINKIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

Fc.haMut1N88DIgG1Fc(N297G_delK)：：G45：：hulL-2(V69A，Q74P，N88D，C125A)(SEQIDNO：19)

GGGGS

Fc.N88DIgG1Fc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(N88D，C125A)(SEQIDNO：20)

GGGGS

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISDINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT

实施例5--Fc.IL-2突变蛋白的持久细胞表面CD25缔合

人源化小鼠研究的意外结果是，尽管其信号传导能力降低，但相对于Fc.WTIL-2突变蛋白诱导更稳健Treg富集。在1μg/小鼠的剂量下(图7)和在0.5μg/小鼠的较低剂量下(图8)观察到相对于利用Fc.WT所见的更高的Treg富集和FOXP3上调。此增加的体内效能可能是由于T细胞消耗减少所致，从而使得更多Fc.IL-2突变蛋白可用于持久信号传导。

然而，体外和体内PK研究未能展示Fc.V91K或Fc.N88D相对于Fc.WT在来自经活化T细胞培养物的上清液或来自给药小鼠的血清中的显著增加的持久性。由于Fc融合物具有两个IL-2突变蛋白域，因此增加的内体循环可因对CD25的增加的亲合力而导致持久细胞表面缔合。实际上，我们发现Fc.V91K和Fc.N88D比Fc.WT在融合蛋白的简短暴露后更有效地存留在先前活化的T细胞的表面上(图9)。

利用100ng/mlOKT3将原代PBMC预刺激2天。收集细胞，洗涤4次并在培养基中静置过夜。然后在37℃下使细胞与400pMFc.IL-2一起脉冲30分钟。脉冲后，在一次洗涤后收获T0的细胞，或用12ml温培养基额外洗涤3次并培养4个小时。为检测细胞缔合的Fc.IL-2，用抗人IgG-FITC(JacksonImmunoresearch)和抗-CD25-APC对细胞进行染色。

实施例6--融合序列优化

在小鼠临床前研究中，我们的Fc.IL-2突变蛋白在完整的分子的血清浓度仅与人Fc部分相比时显示差别暴露，这指示循环人Fc分解代谢物。为了优化我们的Fc.IL-2突变蛋白体内稳定性和药代动力学，我们对融合序列修饰表征在体循环中和在穿过网状内皮系统的循环期间其对Fc.IL-2突变蛋白的蛋白水解降解的影响。评价以下构建体的体外和体内蛋白水解降解。

(Ala_Ala)_G4S...TQKSLSLSPGKGGGGSAPTSSSTKKTQLQ...ha7N88D(SEQIDNO：31)

(N297G_delK)_G45...TQKSLSLSPG_GGGGSAPTSSSTKKTQLQ...ha1V91K(SEQIDNO：32)

(N297G_KtoA)_AAPT...TQKSLSLSPGA__APTSSSTKKTQLQ...ha1V91K(SEQIDNO：33)

(N297G_KtoA)_AAPA...TQKSLSLSPGA__APASSSTKKTQLQ...ha1V91K(SEQIDNO：34)

通过比较总人Fc随时间的浓度与完整Fc.IL-2突变蛋白随时间的浓度的定量免疫测定来测量稳定性。通过西部印迹分析并利用抗IL-2和抗人Fc抗体、接着免疫捕获分解代谢物来验证Fc.IL-2突变蛋白的蛋白水解，并通过质谱法来表征。来自体外和体内样品的(Ala_Ala)_G4S的质谱法表征鉴定Fc域的C端Lys为蛋白水解裂解位点。与具有C端赖氨酸的Fc构建体((Ala_Ala)_G4S)相比，Fc域((N297G_delK)_G4S和(N297G_KtoA)_AAPT)的C端赖氨酸的缺失或突变导致在37℃下在小鼠血清中的持久体外稳定性。该持久的体外血清稳定性转换为在小鼠中的较大暴露，如在Fc.IL-2突变蛋白血清浓度对时间曲线下的面积(AUC)测量。缺乏C-端Fc赖氨酸的Fc.IL-2突变蛋白的此持久稳定性也在来自食蟹猴和人的血清中在体外观察到。在37℃下IL-2的Thr-3至Ala的突变((N297G_KtoA)_AAPA)导致在小鼠血清中和在利用重组人组织蛋白酶D和L的单独孵育中的降低的体外稳定性(与(N297G_KtoA)_AAPT相比)。此降低的体外血清稳定性转换为(N297G_KtoA)_AAPA在小鼠体内的较低暴露(AUC)(与(N297G_KtoA)_AAPT相比)。来自体外和体内样品的(N297G_KtoA)_AAPA的分解代谢物的质谱法表征鉴定IL-2突变蛋白域的Lys8和Lys9为易于蛋白水解的残基，这在(N297G_KtoA)_AAPT的等效样品中未观察到。在来自食蟹猴和人的血清中体外观察到(N297G_KtoA)_AAPA相对于(N297G_KtoA)_AAPT在37℃下的降低的稳定性。

由于此区中糖基化的重要性并且为了潜在改善融合蛋白的制备性，改变融合序列以促进N-连接而非O-连接的糖基化，例如以下。

原始

IgG1Fc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(V91K，C125A)TQKSLSLSPGGGGGSAPTSSSTKKTQLQ(SEQIDNO：32)

改变后的

IgG1Fc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(T3N，V91K，C125A)TQKSLSLSPGGGGGSAPNSSSTKKTQLQ(SEQIDNO：35)

IgG1Fc(N297G_delK)：：G4S：：hulL-2(T3N，SST，V91K，C125A)TQKSLSLSPGGGGGSAPNSTSTKKTQLQ(SEQIDNO：36)

IgG1Fc(N297G_delK)：：GGNGT：：hulL-2(T3A，V91K，C125A)TQKSLSLSPGGGNGTAPASSSTKKTQLQ(SEQIDNO：37)

IgG1Fc(N297G_delK)：：YGNGT：：hulL-2(T3A，V91K，C125A)TQKSLSLSPGYGNGTAPASSSTKKTQLQ(SEQIDNO：38)

实施例7-食蟹猴PK/PD测定

标准IL-2免疫刺激疗法需要介于给药周期间的休药期(不暴露)来避免不期望的副作用。Treg扩增或刺激疗法可需要具有对于Treg刺激足够的持续谷药物水平(血清C_min)但具有低于导致免疫活化的药物水平的最大暴露(血清C_max)的持久暴露。此实施例展示半衰期延长的突变蛋白在食蟹猴中用于经延长靶标覆盖(血清C_min)时维持最大暴露(血清C_max)低于预期对于促炎性免疫活化必需的药物水平的给药策略。

食蟹猴分四组(A-D)以Fc.V91K(IgG1Fc(N297G_delK)::G4S::huIL-2(V91K,C125A)给药，其中三组(A-C)皮下给药和一组(D)静脉内给药。对于每一组，根据下文所概述的给药策略向四只首次用于生物实验的雄性食蟹猴给药。延长半衰期的突变蛋白的皮下给药可允许更大淋巴吸收，从而导致较低最大暴露(血清C_max)和/或更稳健的药理学反应(Treg扩增)。A组的给药策略包括三个在第1周期的第0天、第2天和第4天的连续10微克/千克剂量和在第14天的10微克/千克，从而允许与50微克/千克的较高初始剂量类似的持久靶标覆盖同时维持较低最大暴露(C_max)。B组的给药策略为在第0天家第14天给药的50微克/千克以供与A组比较。C组的给药策略为在第0天和第28天给药的50微克/千克。允许确定持续Treg富集是否需要谷覆盖或介于给药周期间的休药期是否有益。静脉内给药D组的给药策略为在第0天以50微克/千克给药，从而允许比较与皮下给药的最大暴露(血清_max)和Treg富集差异。

在以下时间点针对每一指定剂量组测量药代动力学(完整分子和总人Fc的定量免疫分析)、抗药物抗体、流出可溶性CD25和血清细胞因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-5、IL-4和IL-13)：

A组：给药前(第一周期；剂量1)、48(给药前第一周期；剂量2)、96(给药前第一周期；剂量3)、100、104、120、168、216、264、336(给药前第二周期)、340、344、360、408、456、504、576、672、744、840和1008小时。

B组：给药前(第一周期)、4、8、24、72、120、168、240、336(给药前第二周期)、340、344、360、408、456、504、576、672、744、840和1008小时。

C组：给药前(第一周期)、4、8、24、72、120、168、240、336、408、504、672(给药前第二周期)、676、680、696、744、792、840、912、1008、1080和1176小时。

D组：给药前(第一周期)、0.25、1、4、8、24、72、120、168、240、336、408、504和672小时。

在以下时间点针对每一指定剂量组测量药效学(外周血Treg、非调节CD4和CD8T细胞以和NK细胞的免疫表型分型和计数)：

A组：给药前(第一周期；剂量1)、96(给药前第一周期；剂量3)、168、336(给药前第二周期)、456和576小时。

B组：给药前(第一周期)、120、240、336(给药前第二周期)、456和576小时。

C组：给药前(第一周期)、120、240、672(给药前第二周期)、792和912小时。

D组：给药前(第一周期)、120和240。

针对所有动物和剂量组给药前和每个剂量组初始剂量后24小时评估血液学和临床化学。评价以下参数。

血液学:

●白细胞计数(全微分和绝对微分)

●红细胞计数

●血红蛋白

●血细胞比容

●红细胞平均血红蛋白，平均红细胞容积，红细胞平均血红蛋白浓度(计算值)

●绝对网织红细胞

●血小板计数

●血细胞形态

●红细胞分布宽度

●平均血小板体积

临床化学:

●碱性磷酸酶

●总胆红素(如果总胆红素超过1mg/dL，则使用直接胆红素)

●天冬氨酸氨基转移酶

●丙氨酸氨基转移酶

●γ谷氨酰转移酶

●尿素氮

●肌酸酐

●总蛋白

●白蛋白

●球蛋白和A/G(白蛋白/球蛋白)比率(计算值)

●葡萄糖

●总胆固醇

●三甘油酯

●电解质(钠、钾、氯)

●钙

●磷

实施例8–非糖基化IgG1Fc

天然存在的IgG抗体在重链(CH2)的恒定域2具有糖基化位点。例如，人IgG1抗体的糖基化位点位于位置Asn297(EU编号)处。迄今，制备非糖基化抗体的策略涉和用在物理-化学性质方面类似于Asn的氨基酸(例如Gln)或用模拟不具有极性基团的Asn侧链的Ala残基置换Asn残基。此实施例展示用甘氨酸置换Asn(N297G)的益处。N297GFc是具有更佳生物物理性质和制备性属性(例如在纯化期间的回收)的非糖基化分子。

Fc片段和IgG抗体的多个已知晶体结构的检查揭示了在糖基化的环区段周围、特别是在糖基化的位置Asn297处的相当大的构象柔性。在许多已知的晶体结构中，Asn297适于正向的主链二面角。Gly由于缺乏侧链原子而具有高的适应正向主链二面角的倾向性。因此，基于此构象和结构原因，相比于N297Q或N297A，Gly可为Asn的较好置换。

用Gly取代Asn297导致具有纯化过程中更多改善的回收(或效率)和生物物理特性的非糖基化分子。例如，来自蛋白质A库的回收百分比(最终产率)对于N297G突变而言为82.6％，与对于N297Q而言的45.6％和对于N297A而言的39.6％相比。SPHP柱分析揭示用N297Q和N297A突变蛋白更低的回收百分比，是因为拖尾峰，这指示高分子量聚集和/或错误折叠物质。在较大的2L规模运行下再次证实此结果。

在生物制药行业中，针对降低分子不适用于大规模生产和纯化的风险的多种属性来评价具有潜在大规模生产需求(例如可以药物形式出售)的分子。在制备性评估中，N297G揭示对pH变化的稳健性。N297G没有聚集问题；然而N297Q和N297A的聚集分别增加20％和10％。尽管N297G具有更佳的制备性特性，但在所有测试其的功能测定中其与N297Q和N297A类似。例如，在ADCC测定中，N297G缺乏细胞毒性，这与N297Q和N297A类似。

实施例9–稳定的非糖基化IgG1Fc

该实施例描述了通过引入工程改造的二硫键改善IgG抗体支架稳定性的方法。天然存在的IgG抗体是稳定的分子。然而，对于一些治疗应用，可能需要进行突变或产生非糖基化分子。例如，非糖基化IgG分子可用于需要避免ADCC和与Fcγ受体结合的治疗指征。然而，非糖基化IgG1具有比糖基化IgG1低得多的熔融温度(CH2域熔融温度降低约10℃；70℃至60℃)。观察到的更低的熔融温度负面地影响了非糖基化IgG1的各种生物物理特性。例如，非糖基化IgG1具有比糖基化IgG1在低pH下增加水平的聚集。

为了工程改造二硫键，基于结构的涉及C-α原子间的距离计算的基于结构的方法初始用于鉴定Fc区中用于突变成Cys的54个残基对。将这54个位点还进一步缩小到4个残基对(V259C-L306C、R292C-V302C、A287C-L306C和V323C-I332C)。所用的标准包括(i)CH2域内的位点；(ii)远离环、转角和碳水化合物；(iii)远离Fcγ受体和FcRn相互作用位点；(iv)溶剂可接触性(优选埋藏的位点)等。

在非糖基化N297GFc的背景中产生成对半胱氨酸取代。非还原肽图谱分析揭示4个工程改造的位点中的3个形成了如预料和在该背景下设计的二硫键。V259C-L306C突变没有正确地形成二硫键并导致与存在与CH2域中的天然的二硫键错配。其它三个设计R292C-V302C、A287C-L306C和V323C-I332C如预料地和设计地正确地形成了二硫键。向N297G突变加入二硫键比单独N297G突变导致约15C热稳定性改善。R292C-V302C、A287C-L306C和V323C-I332C二硫键变体中，当施用给大鼠时，R292C-V302C和A287C-L306C具有良好的药代动力学(t_1/2，分别在第11天和第9天)。这与我们在大鼠中针对先前所公开的CH2域二硫键L247C-K339C观察到的药代动力学特征形成对比(Gong等,J.Biol.Chem.2009284:14203-14210)，其具有5天的t_1/2。

对CH2域中的二硫键进行工程改造使得非糖基化分子的稳定性得以改善，与糖基化IgG1分子相当(通过差示扫描量热法测定的熔融温度改善10至15℃)。本文描述的工程改造的位点不会导致二硫键错配并且该二硫键以约100％的群体按照预期的形成。更重要的是，与CH2域中所公开的二硫键位点不同，本文所述的二硫键不会影响大鼠PK。

测定食蟹猴中稳定的非糖基化抗体的药代动力学(PK)特征图。具有N297G、A287C和L306C取代(Ab2-1)的IgG1抗体和具有N297G、R292C和V302C取代(Ab2-2)的IgG1抗体以5mg/kg皮下注射给蟹猴(N＝2)。在给药前、给药后0.5、2、8、24、48、96、168、336、504、672、840、1008、1176、1344、1512和1680小时采集血清样品。使用抗-huIgG夹心ELISA法测定样品的Ab2-1和Ab2-2抗体水平。为了测量PK研究样品中的血清huIgG水平，使用以下方法：用2μg/ml的抗-huFc抗体1.35.1(溶于PBS)涂覆1/2区域黑色板(Corning3694)，然后在4℃下孵育过夜。然后洗涤板，并在4℃下用I-Block^TM(AppliedBiosystems)封闭过夜。如果样品需要稀释，则用食蟹猴血清稀释。然后用1:20的1XPBS+1MNaCl+0.5％Tween20和1％BSA缓冲液(5％血清)稀释标准物和样品。洗涤板并将稀释的标准物和样品的50-μl样品转移到用抗体1.35.1涂覆的板中并在室温下孵育1.5小时。洗涤板，加入50μl100ng/ml的抗-huFc抗体21.1-HRP缀合物(溶于I-Block^TM+5％BSA)并孵育1.5小时。洗涤板，然后加入50μlPico底物，然后立即用光度计分析板。时间浓度数据使用非隔室模型方法通过(企业版5.1.1，2006，Corp.MountainView，CA)分析。

将食蟹猴中Ab2-1和Ab2-2抗体的PK暴露与仅包含N297G取代的IgG1抗体和包含N297G、L247C和K339C的IgG1抗体相比较。食蟹猴中Ab2-1和Ab2-2抗体的PK暴露比仅包含N297G取代的IgG1抗体和包含N297G、L247C和K339C的IgG1抗体都更高。另外，Ab2-2具有与亲本IgG1抗体相当的暴露和清除率。

Claims

1.一种多肽，其包含人IgG1抗体的Fc区，其中所述Fc区包含N297G突变并且所述人IgG1的Fc区包含与SEQIDNO:3中所示氨基酸序列至少90%的同一性。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述人IgG1的Fc区包含与SEQIDNO:3中所示氨基酸序列至少95%的同一性。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述人IgG1的Fc区包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列。

4.根据权利要求1或权利要求3所述的多肽，其中所述人IgG1的Fc区还包含一个或多个突变以使所述多肽稳定。

5.根据权利要求4所述的多肽，其中SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中所示一个或多个氨基酸被半胱氨酸所取代。

6.根据权利要求5所述的多肽，其中SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332被半胱氨酸所取代。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述Fc区包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中所示氨基酸序列内的A287C和L306C取代。

8.根据权利要求6所述的多肽，其中所述Fc区包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中所示氨基酸序列内的V259C和L306C取代。

9.根据权利要求6所述的多肽，其中所述Fc区包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中所示氨基酸序列内的R292C和V302C取代。

10.根据权利要求6所述的多肽，其中所述Fc区包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中所示氨基酸序列内的V323C和I332C取代。

11.一种抗体，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的Fc区。

12.一种Fc融合蛋白，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的Fc区。

13.一种核酸，其编码根据权利要求1-10中任一项所述的多肽。

14.一种表达载体，其包含根据权利要求13所述的核酸。

15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求13所述的核酸。

16.一种宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的表达载体。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。

18.一种多肽，其包含接头，其中所述接头为GGNGT(SEQIDNO:6)或YGNGT(SEQIDNO:7)。

19.根据权利要求18所述的多肽，其中所述接头包含N-糖基化。

20.根据权利要求18所述的多肽，其中所述接头插入或置换所述多肽结构中的环。

21.一种制备含有非糖基化IgG1Fc的分子的方法，所述方法包括：

a)在哺乳动物细胞培养物中表达编码根据权利要求1-10中任一项的多肽的核酸；和

b)从所述培养物中收获所述含有非糖基化IgG1Fc的分子。

22.一种制备在哺乳动物细胞中表达时非糖基化的含有IgG1Fc的分子的方法，所述方法包括使所述Fc区中针对N297的密码子突变为甘氨酸密码子的步骤。