CN105331585A - 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞 - Google Patents

携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及携带PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞。本发明还提供了一种利用嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞作为载体来分泌表达程序性死亡配体1(PD-L1)的阻断剂的方法，以提高嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞的抗肿瘤作用。

Description

携带PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
技术领域
本发明属于免疫治疗领域，更具体地，本发明涉及携带PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞。
背景技术
免疫效应细胞(如T淋巴细胞)在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。目前，基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意。近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(TCellReceptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CART淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。
嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134等的胞内信号区。
胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CART淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CART可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应。
随后发展的第二代CART淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CART在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
近些年发展的第三代CART淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CART在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。
尽管免疫效应细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但是其在实体瘤中的疗效仍不显著，免疫效应细胞在肿瘤组织内的存活率较差、活性不高。因此，本领域仍然需要进行进一步的研究，以期进一步提高免疫效应细胞对于肿瘤免疫治疗的疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供携带PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞。
在本发明的第一方面，提供一种嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，它携带或表达PD-L1(程序性死亡配体1)阻断剂(Blocker)。
在一个优选例中，所述的PD-L1阻断剂包括(但不限于)：
可溶性PD-1(sPD-1)；
可溶性PD-1与hIgG4e1-Fc的CH3结构域的融合肽；
可溶性PD-1与hIgG4e1-Fc的融合肽；或
特异性抗PD-L1抗体。
在另一优选例中，所述的可溶性PD-1包括：信号肽和胞外区；较佳地，所述的信号肽是如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码而成的；较佳地，所述的胞外区是如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列编码而成的。
在另一优选例中，所述的hIgG4e1-Fc的CH3结构域是如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列编码而成的；和/或
所述的hIgG4e1-Fc的序列是第288位由Ser突变为Pro的。
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤高表达的抗原的抗体。
在另一优选例中，所述的胞内信号区包括(但不限于)：CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，4-1BB(CD137)，CD134，CD40的胞内信号区序列或Myd88，或其组合。
在另一优选例中，所述的跨膜区包括(但不限于)：CD8(如CD8α)跨膜区，CD28跨膜区。
在另一优选例中，所述的胞外抗原结合区和跨膜区之间，还包括铰链区；较佳地，该铰链区包括：CD8(如CD8α)铰链区。
在另一优选例中，所述的肿瘤高表达的抗原包括(但不限于)：EGFR，GPC3，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20，ASGPR1，EGFRvIII，de4EGFR，CD19，CD33，IL13R，LMP1，PLAC1，NY-ESO-1，MAGE4，MUC1，MUC16，LeY，CEA，CAIX，CD123。
在另一优选例中，所述的特异性结合肿瘤高表达的抗原的抗体是：单链抗体或结构域抗体。
在另一优选例中，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞，Treg细胞。
在本发明的另一方面，提供一种核酸构建物，其编码用于修饰免疫效应细胞的融合多肽，所述的核酸构建物包括顺序连接的：PD-L1阻断剂编码序列，胞外抗原结合区编码序列，跨膜区和胞内信号区编码序列；其中所述胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤高表达的抗原的抗体。
在一个优选例中，所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间，以连接肽编码序列连接；和/或。
所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间，还包括核糖体跳跃序列(F2A)。
在另一优选例中，所述的连接肽是(GlyGlyGlyGlySer)3。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含编码所述的核酸构建物。
在本发明的另一方面，提供一种病毒，所述的病毒包含所述的表达载体。
在本发明的另一方面，提供所述的核酸构建物、或包含该核酸构建物的表达载体或病毒的用途，用于制备靶向肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞。
在一个优选例中，所述的免疫效应细胞是表达PD-1的免疫效应细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其包括：所述的嵌合受体修饰的免疫效应细胞。
在本发明的另一方面，提供PD-L1阻断剂的用途，用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，增加免疫效应细胞的抗肿瘤作用。
在一个优选例中，所述的PD-L1阻断剂包括(但不限于)：
可溶性PD-1；
可溶性PD-1与hIgG4e1-Fc的CH3结构域的融合肽；
可溶性PD-1与hIgG4e1-Fc的融合肽；或
特异性抗PD-L1抗体。
在另一优选例中，所述的肿瘤是表达(或高表达)PD-L1的肿瘤。
在本发明的另一方面，提供一种制备嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞的方法，所述的方法包括：将所述的核酸构建物转入免疫效应细胞中。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、人源可溶性PD-1(sPD-1)、sPD-1-CH3、sPD-1-Fc融合蛋白示意图。
图2、sPD-1-Fc与M27-CAR融合蛋白示意图。其中，VL和VH分别表示单链抗体M27(即Y022单链抗体，它可特异性识别抗原EGFRvIII及过量表达的EGFR，参见中国专利申请号：201510431481.6)的轻链可变区和重链可变区。CAR区中，4-1BB-CD3ζ简称为BBZ，CD28-CD3ζ简称为28Z，CD28-4-1BB-CD3ζ简称为28BBZ。
图3、sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27CART细胞的阳性率。
图4、sPD-1-CH3/sPD-1-Fc在感染T细胞&上清中的表达。其中，lysis表示裂解液，supernatant表示上清液。
图5、肿瘤细胞系中EGFR287-302表位的暴露情况。
图6、PD-L1以及EGFR在各种肿瘤细胞系中的表达情况分析。
图7、sPD-1-Fc-F2A-M27CART细胞对U87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27的杀伤效果。图中，M27-28Z、M27-BBZ、M27-28BBZ表示转入了仅表达M27-28Z、M27-BBZ、M27-28BBZ的T淋巴细胞的实验结果；FC-28Z、FC-BBZ、FC-28BBZ表示转入了表达sPD-1-Fc-F2A-M27-28Z、sPD-1-Fc-F2A-M27-BBZ、sPD-1-Fc-F2A-M27-28BBZ的T淋巴细胞的实验结果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，提出一种通过阻断表达于免疫效应细胞的程序性死亡配体-1(PD-L1)的受体PD-1与肿瘤细胞表达的程序性死亡配体-1的结合，从而提高免疫效应细胞在肿瘤中的存活及功能的方法。
如本发明所用，所述的“肿瘤高表达的抗原”是指嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞所靶向的抗原，该抗原在肿瘤或细胞中高表达。较佳地，该“肿瘤高表达的抗原”是肿瘤相关抗原，例如选自(但不限于)：EGFR，GPC3，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20，ASGPR1，EGFRvIII，de4EGFR，CD19，CD33，IL13R，LMP1，PLAC1，NY-ESO-1，MAGE4，MUC1，MUC16，LeY，CEA，CAIX(碳酸酐酶IX)，CD123。
本发明中，多种本领域已知的肿瘤均可包含在本发明中，只要该肿瘤表达(或高表达)程序性死亡配体-1，且表达正常组织中低表达的肿瘤相关抗原(肿瘤高表达的抗原)。例如，所述的肿瘤包括(但不限于)：肝癌、肺癌、恶性胶质瘤、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌、口腔鳞癌、胃癌、前列腺癌、脑肿瘤、卵巢癌、骨肿瘤、结肠癌、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、肠肿瘤、肾肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤、食管癌、胸腺间皮瘤、胰腺癌、白血病、头颈部肿瘤、宫颈癌、黑色素瘤、阴道上皮癌、胆囊癌、恶性纤维组织细胞瘤。
术语“嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞(或简称嵌合抗原受体免疫效应细胞)”是本领域公知的，其是利用基因改造技术表达抗原(如肿瘤抗原)特异性嵌合受体的免疫效应细胞，能靶向性发挥杀伤作用。所述的免疫效应细胞例如包括T细胞，NK细胞，NKT细胞，调节性T细胞(Regulatorycell，简称Treg)。常规的制备“嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞”的方法是本领域技术人员已知的，包括让其表达胞内共刺激细胞分子胞内结构域，例如CD28(较佳地包括CD28a，CD28b)，CD137，CD27，CD3ζ(较佳地为CD3ζ细胞内域)，CD8，CD19，CD134，CD20，FcεRIγ中的一种或多种。通过它们与相应配体结合，激活免疫效应细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长免疫细胞的存活时间。
免疫效应细胞在肿瘤组织内的存活率较差、活性不高的一个很重要的原因可能是因为实体瘤细胞或其他细胞表达PD-L1从而影响嵌合抗原修饰的免疫效应细胞(如CART细胞)的存活。肿瘤细胞通过高表达PD-L1分子，与免疫效应细胞上的受体PD-1结合，传递负调控信号，导致肿瘤抗原特异性T细胞的诱导凋亡和免疫无能，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤。
PD-1/PD-L1作为免疫球蛋白超家族协同刺激分子的重要成员，参与自身免疫、移植免疫以及肿瘤免疫等机体免疫调节过程。PD-1是一种主要表达于活化免疫效应细胞(如T淋巴细胞)上的抑制性受体，与其配体PD-L1结合，可使得免疫效应细胞的活化和增殖被显著抑制，并调节细胞因子的表达和分泌。PD-L1则广泛表达于多种免疫细胞、上皮细胞以及肿瘤细胞上，PD-L1在多种肿瘤中均过量表达。目前诸多研究表明，多种人类肿瘤大量表达的PD-L1分子与患者临床病理特征及预后紧密相关，成为肿瘤检出和预后判断的新的生物学指标。
因此，本发明人设想，如果能够通过嵌合抗原修饰的免疫效应细胞分泌表达PD-L1的可溶性受体或抗体或其他阻断剂，那么就有可能增加嵌合抗原修饰的免疫效应细胞在实体瘤内的存活及功能。基于该设想，本发明人进行了进一步验证，证明了在免疫效应细胞上表达PD-L1的可溶性受体(sPD-1)，可以起到较好的抗肿瘤活性。
作为本发明的优选方式，本发明的嵌合抗原受体的一种结构示意图见图1，依次(较佳地为从N端到C端)包括：程序性死亡配体-1阻断剂，胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区。
所述的程序性死亡配体-1(PD-L1)阻断剂可以是多种能够下调、阻断、阻滞、抑制PD-L1的物质，只要其能够阻止或竞争性干扰PD-L1与表达于免疫效应细胞的PD-1相互作用。作为本发明的优选方式，所述的程序性死亡配体-1阻断剂包括但不限于：sPD-1；sPD-1与hIgG4e1-Fc的CH3结构域的融合肽；sPD-1与hIgG4e1-Fc的融合肽；或特异性抗PD-L1抗体。
作为本发明的优选方式，所述胞外抗原结合区包含特异性识别肿瘤高表达的抗原的抗体，较佳地为单链抗体。更优选地，所述嵌合抗原受体的胞外抗原结合区通过CD8铰链区与CD8或者CD28的跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。
嵌合抗原受体的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。人CD8蛋白是异二聚体形态，由αβ或者γδ两条链组成。在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自CD8α或者CD28的跨膜区。此外，CD8α铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将嵌合抗原受体CAR的胞外抗原结合区和胞内信号区连接起来。
胞内信号区可以选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137(4-1BB)，CD134蛋白的胞内信号区，及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转导区。CD3δZ是截短的不具有ITAM基序的CD3ζ序列，在本发明实践中一般作为阴性对照的构建。FcεRIγ主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外如前所述，CD28，CD137，CD134是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起免疫效应细胞(主要是T淋巴细胞)的持续增殖，并能够提高免疫效应细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR免疫效应细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
本发明的嵌合抗原受体多肽可以选自按如下方式顺序连接：
胞外抗原结合区-CD8跨膜区-4-1BB-CD3ζ，
胞外抗原结合区-CD28a-CD28b-CD3ζ，
胞外抗原结合区-CD28a-CD28b-4-1BB-CD3ζ，
及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表CD28分子的胞内信号区。
本发明也包括编码所述嵌合抗原受体的核酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明还提供了包含上述嵌合抗原受体的核酸的载体。本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其它可用于将外源基因转导入免疫效应细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
本发明还提供了嵌合抗原修饰的免疫效应细胞，其被转导有编码所述的嵌合抗原受体的核酸或被转导有上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的Nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(SleepingBeautysystem)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[DaviesJK.，etal.CombiningCD19redirectionandalloanergizationtogeneratetumor-specifichumanTcellsforallogeneiccelltherapyofB-cellmalignancies.CancerRes，2010，70(10):OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的免疫效应细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养免疫效应细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因免疫效应细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)，且能够在肿瘤组织中有效存活。因此本发明的编码嵌合抗原受体的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因免疫效应细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以携带外源的细胞因子的编码序列；所述的细胞因子包括但不限于：IL-12，IL-15或IL-21等。这些细胞因子具有免疫调节或抗肿瘤的活性，能增强效应T细胞及活化的NK细胞的功能，或直接发挥抗肿瘤作用。因此，本领域技术人员可以理解，这些细胞因子的运用有助于所述的免疫细胞更好地发挥作用。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达除了上述嵌合受体以外的另一种嵌合受体，该受体不含有CD3ζ，但含有CD28的胞内信号结构域、CD137的胞内信号结构域或者这两者的组合。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达趋化因子受体；所述的趋化因子受体包括但不限于CCR2。本领域技术人员可以理解，所述的CCR2趋化因子受体可以使得体内的CCR2与之竞争性结合，对于阻断肿瘤的转移是有利的。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达能降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白。本领域技术人员可以理解，竞争性阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用，有利于恢复抗肿瘤T细胞反应，从而抑制肿瘤生长。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达安全开关；较佳地，所述的安全开关包括：iCaspase-9，truncatedEGFR或RQR8。
本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞可以应用于制备药物组合物或诊断试剂。所述的组合物除了包括有效量的所述免疫细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，可有效地增加嵌合抗原修饰的免疫效应细胞在肿瘤内的存活及功能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、可溶性sPD-1-Fc结合嵌合抗原(EGFRVIII)受体的重组慢病毒载体PRRLSIN-cPPT.EF-1α-sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27-CAR构建
1、设计人源sPD-1、sPD-1-CH3及sPD-1-Fc序列
(1)人源sPD-1等序列设计
如图1所示，人源sPD-1蛋白含PD-1的信号肽及胞外结构域。人源sPD-1-CH3蛋白含PD-1的信号肽、胞外结构域，并通过linker结合hIgG4e1-Fc的CH3结构域。人源sPD-1-Fc融合蛋白保留PD-1的信号肽及胞外结构域，并通过linker融合hIgG4e1-Fc结构域以增加其稳定性。hIgG4e1-Fc是S288P突变的，从而可以降低hIgG4e1-Fc在人体内引起的补体依赖的细胞毒性(CDC)以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。hIgG4e1-Fc序列见Invivogen公司的pFUSE-hIgG4e1-Fc1质粒(http://www.invivogen.com/pfuse-higg4e1-fc)。
PD-1DNA序列参考PubmedNucleotide数据库，PD-1对应编号NM_005018.2；PD-1的信号肽(1-20氨基酸)及胞外段(21-170氨基酸)参考Uniprot数据库。
PD-1信号肽序列：
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGG(SEQIDNO:1)；
PD-1胞外段序列：
CCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTG(SEQIDNO:2)。
(2)人源sPD-1-CH3序列设计
sPD-1通过linker与hIgG4e1-Fc中的CH3结构域，linker序列为TATGGT。CH3结构域序列参考pFUSE-hIgG4e1-Fc1质粒。
CH3结构域的DNA序列：
GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQIDNO:3)
(3)人源sPD-1-Fc序列设计
sPD-1通过linker与hIgG4e1-Fc结构域连接，linker序列为TATGGT。hIgG4e1-Fc结构域序列参考pFUSE-hIgG4e1-Fc1v01质粒。
hIgG4e1-Fc结构域的DNA序列(下划线为构成S288P突变的位点)：
CCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQIDNO:4)
2、sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc与M27-CAR连接
将sPD-1、sPD-1-CH3或sPD-1-Fc与M27-CAR连接，具体如下：
(1)以包含sPD-1-Fc序列的质粒T-sPD-1-Fc质粒(购自上海捷锐生物工程有限公司)为模板，以上游引物5’-tttACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGCCC-3’(SEQIDNO:5)，下游引物5’-CACCAGGGTTTGGAACTGG-3’(SEQIDNO:6)PCR扩增获得sPD-1序列①，其中双下划线为F2A重叠序列。
(2)以T-sPD-1-Fc质粒为模板，以上游引物5’-tttACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGCCC-3’(SEQIDNO:7)，下游引物5’-CACCAGGGTTTGGAACTGGC-3’(SEQIDNO:8)进行PCR扩增获得sPD-1序列②(紫色为linker，蓝色为CH3重叠序列)；以上游引物5’-TATGGTGGGCAGCCCCGAGAGCCACAG-3’(SEQIDNO:9)，下游引物TTTACCCGGAGACAGGGAG-3’(SEQIDNO:10)进行PCR扩增获得CH3片段③，其中双下划线为F2A重叠序列。
(3)以T-sPD-1-Fc质粒为模板，以上游引物5’-tttACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGCCC-3’(SEQIDNO:11)，下游引物5’-TTTACCCGGAGACAGGGAG-3’(SEQIDNO:12)扩增获得sPD-1-Fc片段④，其中双下划线为F2A重叠序列。
(4)分别以pWPT-mcherry-F2A-M27-28Z/BBZ/28BBZ三种质粒(购自上海锐劲生物技术有限公司，质粒名称中“/”表示前后肽段之间“或”的关系，下同)。其中28Z/BBZ/28BBZ简称为CAR)为模板，以上游引物5’-GTGAAACAGACTTTGAATTTT-3’(SEQIDNO:13)，以下游引物5’-CTATGTTGCTCCTTTTACGCTA-3’(SEQIDNO:14)，PCR扩增获得F2A-M27-28Z/BBZ/28BBZ片段(⑤/⑥/⑦)。
(5)将等摩尔量的各片段①+⑤/⑥/⑦、②+③+⑤/⑥/⑦、④+⑤/⑥/⑦分别进行拼接，以上游引物5’-tttACGCGTCCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGCAGATCCCACAGGCGCCC-3’(SEQIDNO:15)，下游引物5’-CTATGTTGCTCCTTTTACGCTA-3’(SEQIDNO:16)扩增获得sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27-28Z/BBZ/28BBZ片段。其中，sPD-1-Fc与M27-CAR融合蛋白的示意图如图2。
PCR扩增条件：预变性：94℃，4min；变性：94℃，20s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，1000bp/min(kod-plus)；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。
核酸片段的拼接：将待拼接片段按等摩尔量加入并进行拼接。拼接条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，1000bp/min；进行6-8个循环，然后总延伸68℃，10min。然后补充等体积的含有上游引物和下游引物的PCR混合体系，进行PCR。PCR条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，1000bp/min；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。
3、重组慢病毒载体PRRLSIN-cPPT.EF-1α-sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27-CAR构建
前文中sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27-28Z/BBZ/28BBZ片段5’端带有MluI酶切位点，3’端带有SalI酶切位点。通过MluI和SalI双酶切，连入同样双酶切的pRRLSIN-cPPT.EF-1α载体(购自addgene，参见中国专利申请号201510481235.1)中，构建成功的表达sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc蛋白及各嵌合抗原受体的慢病毒载体。
综上所述，通过核糖体跳跃序列F2A将靶向EGFR287-302的M27-CAR分别与sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc连接，获得双顺子基因。通过限制性酶切位点MluI和SalI将含有双顺反子目的基因的片段连接到同样经MluI和SalI双酶切的pRRLSIN-cPPT.EF-1α载体中成功构建重组目的表达载体，构建成功的重组慢病毒载体通过测序鉴定。测定正确后进行慢病毒包装。
实施例2、慢病毒制备及T淋巴细胞嵌合抗原受体表达
1、慢病毒制备、浓缩、滴定
1)以1.2×107的密度接种培养至第6～10代的293T细胞于15cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染，培养基为含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM。
2)分别将目的基因质粒PRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP(Mock)10.8μg或PRRLSIN-cPPT.EF-1α-sPD-1/sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27-CAR10.8μg分别与包装质粒pRsv-REV12.4μg、RRE-PMDLg12.4μg、Vsvg4.8μg溶入800μL空白DMEM培养液，混匀；
3)将60μgPEI(1μg/μl)溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)，室温孵育5min。
4)转染复合物的形成：将质粒混合液加入PEI混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，室温下孵育20min。
5)将转染复合物1.6ml滴加入含11mlDMEM培养基的10cm培养皿中(无需换液)。
6)4-5h小时后，用10％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液。
7)37℃孵育72h，收集病毒液上清。
8)5XPEG8000NaCl配制：称取NaCl8.766g、PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121℃30min湿热灭菌30min；保存在4℃。
9)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
10)每30ml过滤后的病毒初始液，加入5XPEG-8000NaCl母液7.5ml；
11)每20～30min混合一次，共进行3-5次；
12)4℃放置过夜；
13)4℃，4000g，离心20min；
14)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
15)加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
16)集中后的病毒悬液分装成200μl每份，保存在成品管中。储存在-80℃；
17)有限稀释法感染293T细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度：
18)以2×105细胞数目接种293T细胞于6孔培养板，1ml/孔；按0.6μl/ml加入初始浓度10ug/μl的polybrene溶液，终浓度6ug/ml；37℃，5％CO2培养1小时，培养液为含10％胎牛血清的DMEM；
19)加10μL/孔的病毒浓缩液5倍稀释，3个梯度，37℃，5％CO2培养；
20)感染72h后，胰酶消化(30s)293T细胞，加1mlDMEM(10％FBS)终止消化，将细胞悬液转移入2ml离心管中(二等分)，5000rpm，离心5min，弃上清；PBS洗两次；
21)一组+PE-SA(对照)。PE-SA1:50稀释，每个离心管内加入50μl稀释后的PE-SA，吹散，冰上孵育45min；PBS(1％NBS)洗两次后，加入400μlPBS(1％NBS)，转移至流式管中；PE-SA全称为溴化乙锭标记的链霉素(Ethidiumbromidelabeledstreptomycin)，用于结合生物素标记的重组EGFR-VIII蛋白。
22)一组+EGFRvIII-biotin(25μg/ml)。每个管内加入50μlEGFRvIII-biotin(25μg/ml，购自上海锐劲生物技术有限公司)，冰上孵育45min，PBS(1％NBS)洗两次后，加入1:50稀释的PE-SA溶液，冰上孵育45min；PBS(1％NBS)洗两次后，加入400μlPBS(1％NBS)，转移至流式管中。流式细胞仪检测PE通道，以阳性率为5～20％的细胞数为宜，计算滴度(U/mL)＝细胞数目×阳性率/病毒体积。EGFRvIII-biotin为亲和素标记的重组EGFR-vIII蛋白(biotinylatedrecombinantEGFRvIIIproteins)，用于结合感染嵌合抗原受体慢病毒后T细胞表面的M27scFV。
2、慢病毒转导T淋巴细胞――CAR阳性的T淋巴细胞的制备
1)T淋巴细胞活化：以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养基液培养，并按照磁珠:细胞比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen)和终浓度300U/mL的重组人IL-2(上海华新生物高技术有限公司)刺激培养48h；
2)Retronectin包被24孔板：每孔加入380μl5μg/ml的Retronectin溶液(PBS)，4℃孵育过夜；
3)去除24孔板中的Retronectin溶液(PBS)，1mlPBS洗两次；
4)在感染前1h补加终浓度为10μg/mL的polybrene以提高感染效率，将细胞接种于包被了Retronectin的24孔板内，每孔细胞数目3×105，培养液体积600μl；
5)按照MOI＝10在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，32℃，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中；
6)扩增培养：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度300U/mL的重组人IL-2。
3、T淋巴细胞嵌合抗原受体表达
人T淋巴细胞采用αCD3/αCD28磁珠刺激48h后采用高滴度的慢病毒以MOI＝10离心感染。感染后第7天通过EGFRvIII-biotin+PE-SA流式检测慢病毒感染T淋巴细胞阳性率。
1)慢病毒感染的T淋巴细胞在培养第7天，取1×106的T细胞，二等分于2ml离心管内；
2)4℃，5000rpm，离心5min，弃上清，PBS洗两次；
3)一组+PE-SA(对照)。PE-SA1:50稀释，每个离心管内加入50μl稀释后的PE-SA，吹散，冰上孵育45min；PBS(1％NBS)洗两次后，加入400μlPBS(1％NBS)，转移至流式管中；
4)一组+EGFRvIII-biotin(25μg/ml)。每个管内加入50μlEGFRvIII-biotin(25μg/ml)，冰上孵育45min，PBS(1％NBS)洗两次后，加入1:50稀释的PE-SA溶液，冰上孵育45min；PBS(1％NBS)洗两次后，加入400μlPBS(1％NBS)，转移至流式管中。流式细胞仪检测PE(FL2)通道。
5)通过FlowJo软件确定不同嵌合抗原受体转导的CAR阳性的T细胞的阳性率。
sPD-1-CH3/sPD-1-Fc-F2A-M27CART细胞的阳性率结果如图3所示。表达sPD-1-CH3-M27-28Z的CART(T-CH3-28Z)细胞阳性率为66.8％，sPD-1-CH3-M27-BBZ(T-CH3-BBZ)为66.3％，sPD-1-CH3-M27-28BBZ(T-CH3-28BBZ)为64.1％，sPD-1-Fc-M27-28Z(T-Fc-28Z)为71.7％，sPD-1-Fc-M27-BBZ(T-Fc-BBZ)为70.6％，sPD-1-Fc-M27-28BBZ为81.9％，表达对照Mock的T细胞(T-Mock)阳性率为88.4％。
4、sPD-1-CH3/sPD-1-Fc在感染T细胞&上清中的表达
收集前文慢病毒感染T细胞后的细胞及上清，上清中蛋白采用proteinA/G进行免疫沉淀，蛋白变性后通过免疫印迹法检测sPD-1-CH3/sPD-1-Fc在感染T细胞上清中的表达。
sPD-1-CH3/sPD-1-Fc在感染后的T细胞&上清中的表达结果如图4。sPD-1-CH3/sPD-1-Fc均可以在感染后的T细胞上清及细胞中检测出来。
实施例3、EGFR287-302抗原表位在肿瘤细胞系上的暴露情况
流式检测U87、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、CAL27、A431、MDA-MB-468细胞系中肿瘤特异性表位EGFR287-302表位的暴露情况。流式检测采用的CH12抗体(参见中国专利ZL200810038848.8)可以特异性针对EGFR287-302表位。
1)用6cm平皿培养如下的肿瘤细胞：U87、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27、MDA-MB-468。
2)用10mM的EDTA消化处理细胞，吹散细胞于2MlEP管，3000～4000rpm离心5min。1％NPBS重悬细胞，2×106/管，分管，实验同型对照及检测样品，2mL1％NPBS，3000～4000rpm离心5min；
3)加一抗CH12抗体20μg/mL，同型对照抗体为正常人IgG1抗体，20μg/mL100μL/样；涡旋充分(45s)，冰浴45min；
4)去游离一抗：2mL1％NPBS，3000～4000rpm离心5min，涡旋充分，重复一次；
5)加二抗：羊抗人IgG-FITC:1:50，100μL/EP；冰浴45min；
6)去游离二抗：1％NPBS，3000-4000rpm离心5min，涡旋充分，重复一次；
7)加200～500μL1％NPBS，重悬细胞，转至流式管中，上机检测。
流式检测结果如图5。从检测结果可以看出，U87细胞表达正常水平的EGFR，抗体CH12与该细胞不结合；而在EGFR、EGFR-VIII过表达的时候CH12可以与细胞结合。图5中的CAL27、A431、MDA-MB-468为高表达EGFR的肿瘤细胞，其细胞表面也可以检测出EGFR287-302表位的暴露。
实施例4、PD-L1在肿瘤细胞系中的表达水平
接种恶性胶质瘤细胞U87、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、皮肤鳞状细胞癌A431、口腔鳞癌细胞CAL27、乳腺癌细胞MDA-MB-468、人永生化表皮细胞HACAT于60cm培养皿中，用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，采用免疫印迹法检测各肿瘤细胞中的PD-L1表达情况。
检测结果如图6，表明在各种不同的肿瘤中，PD-L1均有表达。
实施例5、体外毒性实验
分别按效靶比3:1、1:1、1:3检测表达sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-28Z、sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-BBZ、sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-28BBZ及感染空载体Mock的T淋巴细胞对U87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27的体外杀伤效果，共培养18h。具体如下：
1)靶细胞：分别接种50μL2×105/mL的U87、U87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27、MDA-MB-468于96/孔板；
2)效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3加T-Mock、M27-CART细胞(分别为M27-28ZCART细胞、M27-BBZCART细胞或M27-28BBZCART细胞)、sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27CART细胞(分别为sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-28ZCART细胞、sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-BBZCART细胞或sPD-1-CH3/Fc-F2A-M27-28BBZCART细胞)；
3)各组均设4个复孔，取4个复孔的平均值。检测时间为第18h。
其中各实验组和各对照组如下：
各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的CTL；
对照组1：靶细胞最大释放LDH；
对照组2：靶细胞自发释放LDH；
对照组3：效应细胞自发释放LDH；
4)检测方法：采用CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(Formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
5)细胞毒性计算公式为：
sPD-1-Fc-F2A-M27CART细胞对U87-EGFR、U87-EGFRvIII、A431、CAL27的杀伤效果如图7。结果显示，表达CH3的M27-28ZT细胞对U87-VIII、U87-ER及A431细胞的杀伤作用明显优于M27-28ZT细胞；表达sPD-1-Fc的M27-28Z/BBZT细胞对U87-ER细胞的杀伤能力要显著地优于不表达sPD-1-Fc的M27-28Z/BBZT细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (20)

1.一种嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其携带PD-L1阻断剂。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的PD-L1阻断剂包括：
可溶性PD-1；
可溶性PD-1与hIgG4e1-Fc的CH3结构域的融合肽；
可溶性PD-1与hIgG4e1-Fc的融合肽；或
特异性抗PD-L1抗体。
3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的可溶性PD-1包括：信号肽和PD-1胞外区；较佳地，所述的信号肽是如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码而成的；较佳地，所述的PD-1胞外区是如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列编码而成的。
4.如权利要求2所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的hIgG4e1-Fc的CH3结构域是如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列编码而成的；和/或所述的hIgG4e1-Fc的序列是第288位由Ser突变为Pro的。
5.如权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤高表达的抗原的抗体。
6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的胞内信号区包括：CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，4-1BB，CD134，CD40的胞内信号区序列或Myd88，或其组合。
7.如权利要求6所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的跨膜区包括：CD8跨膜区，CD28跨膜区。
8.如权利要求5所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的肿瘤高表达的抗原包括：EGFR，GPC3，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20，ASGPR1，EGFRvIII，de4EGFR，CD19，CD33，IL13R，LMP1，PLAC1，NY-ESO-1，MAGE4，MUC1，MUC16，LeY，CEA，CAIX，CD123。
9.如权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，其特征在于，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞，Treg细胞。
10.一种核酸构建物，其编码用于修饰免疫效应细胞的融合多肽，所述的核酸构建物包括顺序连接的：PD-L1阻断剂编码序列，胞外抗原结合区编码序列，跨膜区和胞内信号区编码序列；其中所述胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤高表达的抗原的抗体。
11.如权利要求10所述的核酸构建物，其特征在于，所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间，以连接肽编码序列连接；和/或。
所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间，还包括核糖体跳跃序列。
12.一种表达载体，其包含编码权利要求11所述的核酸构建物。
13.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求12所述的表达载体。
14.权利要求10的核酸构建物、或包含该核酸构建物的表达载体或病毒的用途，用于制备靶向肿瘤的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞。
15.权利要求1-9任一所述的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物组合物。
16.一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其特征在于，其包括：权利要求1-9任一所述的嵌合受体修饰的免疫效应细胞。
17.PD-L1阻断剂的用途，其特征在于，用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞，增加免疫效应细胞的抗肿瘤作用。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述的PD-L1阻断剂包括：
可溶性PD-1；
可溶性PD-1与hIgG4e1-Fc的CH3结构域的融合肽；
可溶性PD-1与hIgG4e1-Fc的融合肽；或
特异性抗PD-L1抗体。
19.如权利要求1、权利要求11、权利要求14、权利要求15或权利要求16，其特征在于，所述的肿瘤是表达PD-L1的肿瘤。
20.一种制备嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：将权利要求10所述的核酸构建物转入免疫效应细胞中。
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