CN104869846B - 来自谷粒的谷蛋白的脱毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明的方法可以获得适用于制备从小麦制得的烘焙产品和意大利面食的谷蛋白脱毒面粉。使用所述方法，谷蛋白经历了结构变化，其在患有乳糜泄的病人中不会激活炎性细胞因子的级联。此外，这样的结构变化没有影响面粉形成面团的技术特性，因此可以制备脱毒的产品，味道和外观与地中海膳食中常用的那些相似，并且不仅打算将其用于患有谷蛋白不耐受的人群，而且打算用于整个人群。这样的脱毒产品在大部分人群中的广泛使用旨在以完全创新的方式致力于降低谷蛋白在人健康中的影响并且因此降低乳糜泄发病率。

Description

来自谷粒的谷蛋白的脱毒方法

本发明提出了一种用于来自谷粒的谷蛋白，特别是来自小麦颗粒的谷蛋白脱毒的方法，目的在于从小麦获得用于制备面包和意大利面食的脱毒面粉，优选适用于乳糜泻病人的营养补给，但其感官特征和其他方面对于全体人群的营养补给也是合适的。

技术说明

谷蛋白是主要由蛋白质组成的食品成分。醇溶谷蛋白占谷物颖果中存在的整个蛋白质部分的约80％并且主要由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白组成。

麦醇溶蛋白是通常归类为α、β、γ和ω(根据电泳迁移率)的单体分子，单体条件是由于不存在半胱氨酸支架，如在ω-麦醇溶蛋白的情况中，或是由于仅存在分子内二硫键(剩余的麦醇溶蛋白)。

然而，麦谷蛋白是复杂的聚合物，由高(HMW-GS)和低(LMW-GS)分子量的亚基组成，通过分子间二硫化物桥接来稳定。麦醇溶蛋白和麦谷蛋白赋予面粉技术特性；麦醇溶蛋白有助于面团的粘性，而麦谷蛋白负责面团的弹性和韧性。

特别地，麦谷蛋白聚合物的数量和大小与面团的技术特性成正相关。

因此，麦谷蛋白聚合物的这些特征取决于单独的亚基形成或多或少伸长的聚合物的能力。特别地，谷蛋白不存在于谷物颖果中，而是在稍后的时刻形成；作为蛋白质复合物的谷蛋白因面团的水合和捏合而形成，并且构成用于面粉和面包生产的必要成分，因为其赋予面团粘性和弹性。如已知的，当将水加入到面粉中时，麦醇溶蛋白(由单链蛋白质组成)开始彼此结合，形成细纤维(小而细的纤维)，其赋予谷蛋白物质可延展性。同时，麦谷蛋白(由不同的蛋白质亚基细成)也被此结合，形成较大尺寸的纤维并形成稳定且非常粘的结构，其赋予面团稠度和一定的耐延伸性。因此，面团的强度和发酵程度取决于面粉中麦醇溶蛋白和麦谷蛋白含量之间的比例。这两类蛋白质之间的关系取决于谷物的品种并且赋予谷蛋白变形和抵抗膨胀的能力。

在捏合的机械作用过程中，麦谷蛋白和麦醇溶蛋白的纤维的细纤维开始彼此缠绕，形成结合淀粉颗粒(图1)、脂质、矿物质、水和气泡的三维网，气泡是酵母酒精发酵非常重要的产物。将酵母加入面团时，酒精和二氧化碳的产生决定了谷蛋白网的膨胀，其变宽并且松弛，以增大所述面团的体积。随后的烹调决定了蛋白质并且因此决定了谷蛋白的变性/凝固，失去延伸的能力，以不可逆的方式稳定了面团的结构和形状。

作为蛋白质复合物的谷蛋白不具有特别的营养特性，因为其所含的必需氨基酸(如赖氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)很少。

膳食中这种化合物的缺失不涉及任何特定的营养风险。

另一方面，谷蛋白能够产生毒性活性，特别是针对肠粘膜；因此，将小麦的谷蛋白以及黑麦、大麦和燕麦的相应蛋白质的永久性不耐受性(其能够产生炎性细胞因子的炎性级联)定义为乳糜泻。

最初，认为谷蛋白的毒性作用归因于α麦醇溶蛋白部分；随后证明了甚至ω麦醇溶蛋白和麦谷蛋白以及相关谷物的醇溶谷蛋白(如大麦(ordeine)、黑麦(黑麦醇溶蛋白(secaline))和燕麦(燕麦碱(avenine)))，也能够诱发肠粘膜的损伤。

最近关注的是所述α-麦醇溶蛋白的33个氨基酸的肽(称为33-mer)的研究；所述肽能够抵抗到达完整肠粘膜(肠粘膜对组织谷氨酰胺转移酶具有高亲和性)的消化酶的蛋白水解活性，其在处于风险的个体中发挥出有效的致免疫作用；将来自肽的毒性表位脱氨基后，通过释放炎性细胞因子的TCD4的淋巴细胞的强烈激活，将会决定这种作用(Shuppan等，2009)。

此外，已经显示出α-麦醇溶蛋白的其他毒性表位能够诱发源自乳糜泄病人的肠粘膜外植体的肠上皮细胞的凋亡。

因此，谷蛋白通过激活细胞因子的炎性级联，并且通过引起直接的毒性作用，发挥对肠粘膜的有害作用。乳糜泄的膳食治疗最初是基于在出现不耐受症状(如腹痛、腹胀、胃炎、口疮性口炎、心境障碍、头痛等)时，从膳食中完全排除所有谷物和含有谷蛋白的食物(尤其是面包和意大利面食，这些是公知的从小麦获得的产品，以及其他地中海营养补给的食物)；如果存在典型的损伤，这种治疗允许病人获得症状的减轻和肠粘膜结构的恢复。然而，这种治疗涉及时间持续的困难性，因为这对病人的膳食形成了巨大的限制，并且因此对涉及食物的社会活动形成了巨大的限制；为了解决这些问题，决定为谷蛋白不耐受人群生产无谷蛋白食物，或其中谷蛋白不会激活炎性反应的食物，使得病人通过食用味道和外观部分类似面包和意大利面食的食物来具有正常的生活方式。

目前，已知一些部分消除谷蛋白毒性作用的方法。

尚未显示出所需效果的试验阶段的方法通过遗传操作形成了脱毒的小麦，即，以这样的方式修饰为不含控制谷蛋白毒性表位(其可以刺激淋巴T细胞)产生的免疫原性序列。

这种方法的第一个限制在于鉴别控制谷蛋白的主要结构内含有的免疫活性肽编码的所有基因序列(目前约四十个，位于两条不同染色体的六个基因座上)；此外，这种方法不能确保有某种结果，因为存在具有尚未获知的编码其他毒性表位的基因序列的高可能性。

另一个限制是缺乏消费者长时间消费“遗传修饰”产品的信心，并且因此，这样的产品难以进入通常目的在于整个人群的市场。

然而，现有技术的另一种方法提供了使用酶(Rizzello等，2007)，其是面粉制备过程中添加的细菌来源的内肽酶的补充，能够发酵谷蛋白，并且特别是所述的33-mer片段。这种方法的限制在于是非常昂贵的，因为其涉及使用纯化的酶；潜在的用途仅在打算用于乳糜泄病人的食物中，并且因为高的生产成本，因此变得非常昂贵。

这种方法的第二个限制在于这些酶的使用导致谷蛋白网络的破坏，并且因此面团失去技术特性，不能用于面包或意大利面食中的转化过程，并且因此必须借助技巧，使此类物质(树胶、多糖、预糊化淀粉、琼脂等)结构化。

现有技术中已知的另一种方法是在赖氨酸甲酯的存在下使用微生物酶(谷氨酰胺转移酶)，以通过脱酰胺作用使小麦麦醇溶蛋白中存在毒性表位脱毒(Gianfrani等，2007)。这种方法与之前的方法相比，具有优势，保存了谷蛋白网络并且因此维持了面粉的技术特性。这种方法的限制在于非常昂贵，因为其涉及使用纯化的酶；潜在的用途仅在打算用于乳糜泄病人的食物中，并且因为高的生产成本，因此变得非常昂贵。

另一个重要限制是脱毒取决于毒性蛋白和微生物酶的浓度，以及反应的动力学。出于这些原因，实验不可能获得特定的结果。

解决谷蛋白不耐受问题的替代方案是可以使用连蛋白(zonulin)的抑制剂(Fasano，2008)，连蛋白是一种似乎在改变肠渗透性中起着关键作用的蛋白质。

然而，这种方法忽视了毒性麦醇溶蛋白的传递只通过胞内途径(其可以通过连蛋白的抑制剂阻断)是不会发生而是通过胞外途径发生的事实。

由于这种需要，即，生产地中海饮食的典型食物，如源自小麦的面包和意大利面食，其中谷蛋白对于乳糜泻病人是无毒的，并且对于风味和外观，可以被整个人群消费，因此形成了本发明。

本发明的目的是通过提出一种谷蛋白的脱毒方法来克服所述的现有技术缺陷，特别是来自小麦谷粒以及其他谷物谷粒的谷蛋白，通过在经历水合处理后，将这些谷粒暴露于微波。

实际上，本发明的目的特别在于解决打算用于乳糜泻病人的食物、面包和意大利面食生产的技术问题，以及使面粉失去有毒的谷蛋白作用，而没有失去其形成面团的技术特性。

更特别地，本发明通过用微波处理成熟谷粒，主要是想要解决具有脱毒谷蛋白的面粉的生产技术问题，同时，所述面粉适用于意大利面食、面包的技术生产以及从小麦生产烘焙产品，而没有失去谷蛋白网络的形成。

最后，本发明通过从谷蛋白的有毒表位脱毒的面粉的生产并且因此食品(如，面包和意大利面食)的生产，目的在于生产源自小麦并且味道和外观与地中海营养补给中常用的那些相当的食品，其通过及时以及被大部分人群，不仅是乳糜泻人群的使用，确定了人群中乳糜泻发病率的降低并且因此还确定了用于乳糜泻人群的特定食品的生产的经济影响。

使用根据权利要求1的脱毒方法已经实现了这一目的。

附图简述

现在将以说明性的方式而不是限制，特别参照附图，来描述本发明，其中：

图1显示了在捏合的机械作用过程中，从麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的结合，结合了淀粉颗粒并且在水的存在下形成的三维网络；

图2显示了从不同样品(A、B、C、D、E、F、G、H)提取的麦醇溶蛋白的电泳谱，其中样品A和B用本发明的脱毒方法处理；

图3显示了通过SE-HPLC分析的脱毒粗粒小麦粉的蛋白质谱(图3a是可溶性蛋白质，图3b是不溶性蛋白质)；

图4显示了一张图，所述图显示了在乳糜泻病人的肠黏膜产生的T淋巴细胞系中的干扰素的产生；

图5显示了在微波处理成熟谷粒后形成的谷蛋白网络(a)和天然形成的谷蛋白网络(b)；

图6显示了脱毒处理后有毒表位的遮掩模式，如产生了在肠水平下谷氨酰胺转移酶不可接近和/或不可识别的麦醇溶蛋白连接位点，谷氨酰胺转移酶在乳糜泻病症中诱导免疫应答。

发明描述

在本发明中，描述了提供谷蛋白(特别是来自小麦谷粒的)脱毒的方法。

通过谷蛋白的有毒表位脱毒来制备所述面粉的方法包括以下阶段：

A)用自来水将谷粒(特别是小麦的谷粒)水合约1小时；对于100克成熟谷粒，加入500ml水。这个阶段是引发谷蛋白脱毒的化学反应功能所需的。

B)除去水。通过用筛网排水来进行这一阶段，以保留谷粒并除去水。

C)使用1000瓦的功率，将水合的谷粒微波处理两分钟。在这个阶段，重要的不是烤箱中的温度，而是通过谷粒中所含水引发脱毒反应的电磁波的功率。

D)在室温(20-22℃)下将用微波处理过的谷物谷粒冷却。

上述所有阶段都是必须遵循的：谷粒水合一小时使得种子累积在电磁波的存在下引发谷蛋白脱毒反应所需的水量。

根据之前描述的程序施用的1000瓦的功率持续两分钟足以使得水累积的能量促进通过细胞代谢(过氧化物酶、脂肪氧合酶等)产生单态氧基、羟基或氢。小麦种子内部的这些高反应性化合物通过分子间键和/或分子内键涉及位于颖果以外的其他部分中的谷蛋白(糊粉层中存在的蛋白质颗粒和胚乳中存在的蛋白质颗粒)的聚合反应，并具有构象变化。

缓慢冷却至约20℃的温度使得通过电磁波和水的作用引发的化学反应完成。

本发明中所说明的方法是基于最近的研究的分析，其中Lamacchia和其他人(2010)报道了当将高温施加于小麦的颖果时，蛋白质经历了与仅有谷蛋白组成的模型系统中看到的那些不相似的变化(Schofield等，1983；Singh和MacRitchie，2004)，也不同于干燥循环过程中意大利面食中看到的那些。

特别地，白蛋白和球蛋白没有结合在高分子量的聚合物中，而是凝结并与麦醇溶蛋白相互作用，形成麦醇溶蛋白和白蛋白中间分子量的聚集物，并且球蛋白显示为新的峰，称为“中间蛋白质”(IP)峰。

ω-麦醇溶蛋白参与这些变化表明蛋白质之间的相互作用不仅通过二硫键的形成来进行，而且还通过涉及酪氨酸残基的共价键的形成来进行。

研究者Lamacchia和其他人(2010)解释了这种现象是基于以下事实：在小麦的颖果中，尚未形成谷蛋白并且谷蛋白沉积在不同的蛋白质颗粒中(Rubin等，1992，Krishnan等，1986；Lending等，1989)。

在最近的研究中，Tosi和其他人(2009)证实了实际上HMW在小麦颖果的最内层(胚乳)中含量特别大并且实际上在糊粉下的层中部存在，然而糊粉下的层中富含麦醇溶蛋白和LMW。

在小麦颖果的所有发育阶段中维持这种沉积模式，甚至在蛋白质颗粒合并并且形成淀粉基质后继续。

因此，当蛋白质颗粒在颖果中时，蛋白质颗粒中的谷蛋白的分离以及研磨前这个阶段中高温的施用，允许这些蛋白质经历结构变化，使得它们不再被肠谷氨酰胺转移酶识别，由此阻断大量炎性细胞因子的产生。

水合并且接受了微波处理的谷粒产生了引发谷蛋白聚合的水基团。

由于在这些蛋白质颗粒内彼此非常接近，根据它们存在于其中的颗粒蛋白质的类型，使得各种类别之间容易相互作用的事实，当谷蛋白在蛋白质颗粒中分离时，似乎更有利于这种聚合；在空泡蛋白质颗粒(糊粉层)的情况中，我们可以在麦醇溶蛋白、LMW和白蛋白/球蛋白之间具有相互作用，在内质类型(胚乳层)的蛋白质颗粒的情况中，我们只可以具有HMW之间的相互作用。

通过水和通过电磁波诱导的聚合不决定游离硫氢基团的丢失，游离硫氢基团是谷蛋白形成必需的，导致蛋白质网络，尽管构象(图5a)不同于天然形成的谷蛋白网络(图5b)(由于上述的不同聚集物的相互作用)，但这确保了最终产品中小麦粉转化的适当技术特性。

通过电磁波促进的由水基团引起的谷蛋白聚合在这些谷蛋白之间产生了共价键的形成。蛋白质颗粒内部的谷蛋白之间这些键的形成允许一种毒性表位的遮掩，如图6中所示，使得在肠水平下谷氨酰胺转移酶不能接近和/或不能识别麦醇溶蛋白的攻击位点，谷氨酰胺转移酶在乳糜泄病症中诱导免疫应答。

通过可以测定谷蛋白指数的测试强调了脱毒面粉的谷蛋白的结构变化，评价了谷蛋白指数的强度。

脱毒面粉的谷蛋白完全通过设备的栅格，经历了谷粒成分的浸出，显示出谷蛋白中结构变化的存在。

在图2和3中更好地分析了脱毒面粉的谷蛋白的这些结构变化；图2显示了从用本发明的脱毒方法处理的不同谷粒样品提取的麦醇溶蛋白的蛋白质模式的变化(A和B-硬质小麦粗粒小麦粉)，与其他未处理样品进行比较(C、D、E-硬质小麦粗粒小麦粉，F、G、H-软质小麦粉)，麦醇溶蛋白是在醇中可溶的含有在肠中识别的有毒表位的谷蛋白。

电泳条带强度的降低表示麦醇溶蛋白的定性和定量变化。

定量是因为大部分由于微波处理诱导的聚合过程，有70％变得不溶于乙醇溶液中，并且因此在电泳凝胶上不可检测。

定性是因为少数可见条带仍然是最低分子量的麦醇溶蛋白聚集物(通过微波，其经历了聚合)并且因此在乙醇溶液中可提取并且在凝胶电泳上可检测，但根据体外进行的免疫发现仍然是无毒的(图4)。

在另一方面，图3a和3b显示了两张各自表示通过SE-HPLC的从脱毒谷粒(具有深灰色阴影的曲线)和未处理谷粒(具有浅灰色阴影的曲线)提取的可溶性和不溶性蛋白质的蛋白质谱；图3a表示两个主峰，右侧的一个表示高分子量的聚合物(HMW和LMW)；左侧的一个表示麦醇溶蛋白的寡聚物和单体；图显示了本发明的脱毒处理后，谷蛋白溶解度的降低。

图3b表示脱毒面粉中两个峰的增加，表示脱毒处理后不溶性蛋白质的增加。

谷蛋白的这些结构变化，由于谷氨酰胺转移酶攻击位点的遮掩，使谷蛋白失去了毒性(图6)并且由于保持了游离硫氢基团，使得保持了面团的技术特异性，游离硫氢基团是谷蛋白网络形成必需的(图5a和5b)。

关于处理过的面粉中存在的谷蛋白毒性的丧失，图4显示了乳糜泄病人的免疫细胞淋巴细胞(T细胞)的测试图；在这张图中，表示了从乳糜泄病人的肠粘膜获取的T淋巴细胞系中的干扰素-γ的产生；已经证明了细胞系对来自用谷氨酰胺转移酶组织脱氨基后的六倍体小麦的麦醇溶蛋白(胰蛋白酶消化物Pepto-PT)是高度反应性的，同时观察到了对从浓度50和100mg/ml处理的面粉A和B提取的麦醇溶蛋白的任何免疫反应性。

最后，关于保持脱毒面粉的技术特性，我们知道在用水捏合中，面粉吸收水分，引起麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的结合，并且因此形成谷蛋白网络，这影响用于夹带气体的粘弹性物质的形成。

通过这种方法脱毒的面粉保持了捏合面团的能力，因为其没有失去在游离半胱氨酸二硫化物基团之间形成键的能力(图5a和5b)，该能力是形成网络必需的；使用脱毒面粉获得的面团保持了可延伸的特征，如已知的，这主要是由于麦醇溶蛋白引起的，由于通过共价键形成了蛋白质颗粒的聚集物，部分失去了弹性和粘性。

特别地，部分弹性的失去是由于HMW亚单位之间通过涉及高分子量的蛋白质亚基的中心结构域的氨基酸的共价键的相互作用，从文献中的研究已知，其决定了面团的弹性。

由于它们之间的麦醇溶蛋白的相互作用，替代了面团弹性的丢失，因为麦醇溶蛋白的相互作用负责这种流变学特征。

本发明的其他优势

该方法的第一个优势是从那些谷粒和面粉，将可能产生用于乳糜泄人群的无毒食品，味道和外观的感官特征与地中海营养补给中常用的那些相当。

第二个优势是经济优势，由于所用的原料，小麦(意大利是全世界小麦的最大生产者之一)，替代了昂贵的玉米和全部结构化物质(tires、琼脂、明胶等)，而且对于使用，在实验过程中，只需自来水和电磁波持续短时间；因此，无谷蛋白产品现在将不再是昂贵的。

第三个优势是健康类型，因为小麦粉的淀粉低于玉米的(迄今为止用于生产无谷蛋白产品)并且因此所得到产品的特征在于更低的血糖指数，并且因此这样的产品对于除了乳糜泄以外还患有1型糖尿病的病人的进食是理想的，1型糖尿病是常常观察到的相关事件，因为两种疾病很可能共享共同的遗传物质。

第四个优势是程序的简单性，也易于适用其他谷粒，包括，例如，用于大麦生产啤酒，无有毒的ordeine(与小麦的麦醇溶蛋白相似的蛋白质)，或用于燕麦制备早餐产品，也不含有毒物质(与小麦的麦醇溶蛋白相似的蛋白质)。

第五个优势是通过及时并且被大量人群而不仅是乳糜泄人群的使用，由于脱毒产品较小的致免疫作用，确定了人群中乳糜泄发病率的降低。

已经针对说明性目的非限制地描述了本发明，而且应当理解本领域的专家可以进行变化和/或改变，而不脱离如所附权利要求所限定的保护范围。

Claims (11)

1.来自谷粒的谷蛋白的脱毒方法，其特征在于以下阶段：

A.用水水合谷粒，通过对于每100克谷粒使用500ml水在30分钟与3小时之间的时间范围内进行；

B.从谷粒除去水；

C.微波处理谷粒，使用750和1500瓦之间的功率，在一与三分钟之间的时间范围内进行；

D.冷却谷粒。

2.根据权利要求1的谷蛋白脱毒方法，其特征在于步骤A的时间范围为大约一小时。

3.根据权利要求1的谷蛋白脱毒方法，其特征在于使用1000瓦的功率将水合的谷粒微波处理两分钟。

4.根据权利要求1的谷蛋白脱毒方法，其特征在于在18℃与24℃之间的温度下进行谷粒的冷却阶段。

5.根据权利要求1至4任一项的方法的应用，用于小麦的谷蛋白有毒表位脱毒。

6.根据权利要求5获得的小麦的应用，用于生产用于乳糜泄人群和用于患有1型糖尿病的人群的粗粒小麦粉和面粉。

7.根据权利要求1至4任一项的方法的应用，用于大麦的谷蛋白有毒表位脱毒。

8.根据权利要求7获得的大麦的应用，用于生产不含有毒ordeine的啤酒。

9.根据权利要求1至4任一项的方法的应用，用于燕麦的谷蛋白有毒表位脱毒。

10.根据权利要求9获得的燕麦的应用，用于生产不含有毒燕麦碱的产品。

11.从根据权利要求1至4任一项中所述方法脱毒了谷蛋白的有毒表位的谷粒制得的面粉的应用，用于制备适用于乳糜泄人群并且味道和外观与地中海膳食中常用的食物相当的食物。