ITUB20159442A1 - Metodo di detossificazione delle proteine del glutine dalle granaglie dei cereali e relativi usi in campo medico - Google Patents

Metodo di detossificazione delle proteine del glutine dalle granaglie dei cereali e relativi usi in campo medico Download PDF

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Description

METODO DI DETOSSIFICAZIONE DELLE PROTEINE DEL GLUTINE DALLE GRANAGLIE DEI CEREALI E RELATIVI USI IN CAMPO MEDICO
La presente invenzione si riferisce ad un metodo migliorato per la detossificazione delle proteine del glutine dalla granella di cereali che consente di ottenere farine e glutine detossificati con una riduzione dell'antigenicità degli epitopi tossici delle proteine del glutine fino ad un intervallo compreso tra 0 e 20 ppm e tale da potere essere vantaggiosamente impiegate per la preparazione di prodotti alimentari (i.e. prodotti da forno, pane, pasta o prodotti lattiero caseari) aventi un conclamato effetto preventivo e/o terapeutico per le disbiosi intestinali provocate da agenti infettivi batterici o virali o da patologie con una forte componente infiammatoria o autoimmunitaria come la celiachia, la colite ulcerosa, il morbo di Crohn e la sindrome dell'intestino irritabile.
Il glutine è un complesso alimentare costituito principalmente da proteine. Le prolammine costituiscono circa l'80% dell'intera frazione proteica presente nella cariosside dei cereali e sono classificate, sulla base della loro solubilità in soluzioni idroalcoliche in gliadine e glutenine. Le gliadine, solubili in soluzioni idroalcoliche, sono molecole monomeriche tipicamente classificate in alfa, beta, gamma e omega (in base alla mobilità elettroforetica) per le quali la condizione monomerica è dovuta all'assenza di residui cisteinici, come nel caso delle omega-gliadine, o alla presenza di soli legami disolfuro intra-molecolari (le rimanenti gliadine).
Le glutenine, invece, sono un complesso polimerico, insolubile in soluzioni idroalcoliche costituito da subunità ad alto (HMW-GS) e a basso (LMW-GS) peso molecolare, stabilizzato da ponti disolfuro intermolecolari .
Le gliadine e le glutenine conferiscono alle farine le proprietà tecnologiche; le gliadine contribuiscono alla viscosità dell'impasto, mentre le glutenine sono responsabili dell'elasticità e della tenacità dello stesso.
In particolare, la quantità e le dimensioni dei polimeri gluteninici sono positivamente correlate con le proprietà tecnologiche degli impasti.
Queste caratteristiche dei polimeri gluteninici dipendono perciò dalla capacità delle singole subunità componenti di formare polimeri più o meno estesi.
Il glutine, in particolare, non è presente in quanto tale nella cariosside dei cereali, ma si forma in un momento successivo; il glutine come complesso proteico si forma in seguito all'idratazione e all'azione meccanica dell'impasto e costituisce un elemento essenziale per la lavorazione delle farine e per la panificazione in quanto conferisce viscosità ed elasticità all'impasto.
Come è noto, nel momento in cui si aggiunge acqua alla farina, le gliadine (formate da un'unica catena proteica) cominciano ad idratarsi formando delle fibrille (fibre piccole e sottili) che conferiscono estensibilità alla rete glutinica. Contemporaneamente, anche le glutenine (composte da diverse subunità proteiche) si assemblano, dando origine ad una rete e formando una struttura, stabile e molto coesiva, che dona all'impasto consistenza ed una certa resistenza all'estensione ed elasticità.
La forza e il grado di lievitazione dell'impasto dipende quindi dalla proporzione tra il contenuto in gliadine e glutenine della farina. Il rapporto tra le due classi di proteine dipende dalla varietà di cereale considerata e conferisce al glutine la capacità di deformarsi e di resistere alla distensione.
Durante l'azione meccanica di impastamento, le fibrille di gliadina e i polimeri di glutenina cominciano ad intrecciarsi tra loro, formando una maglia tridimensionale che ingloba granuli di amido, lipidi, sali minerali, acqua e bollicine d'aria, queste ultime molto importanti per la fermentazione alcolica dei lieviti che poi vengono aggiunti e che, attraverso la produzione di alcol ed anidride carbonica, determinano l'espansione delle maglie del glutine, che si allargano e distendono facendo crescere il volume dell'impasto. La successiva cottura determina la denaturazione/coagulazione delle proteine e così il glutine, perdendo la capacità di estendersi, stabilizza in maniera irreversibile la struttura e la forma dell'impasto,
Il glutine come complesso proteico non ha proprietà nutritive particolari, in quanto è povero di amminoacidi essenziali quali la lisina, metionina e triptofano.
L'assenza di questo composto nella dieta non comporta alcun rischio nutrizionale specifico.
D'altro canto, il glutine è in grado di svolgere attività tossica in particolare nei confronti della mucosa intestinale; l'intolleranza permanente al glutine di frumento ed alle corrispondenti proteine della segale, orzo ed avena, tale da attivare la cascata infiammatoria delle citochine citolesive, è definita celiachia.
Inizialmente, l'azione tossica del glutine si pensava fosse da attribuire alla frazione alfa della gliadina; successivamente si è dimostrato che anche le omega gliadine e le glutenine sono in grado di indurre danno alla mucosa intestinale, così come anche le prolammine di cereali affini quali orzo (ordeine), segale (secaline) ed avena (avenine).
Di recente interesse è lo studio di un peptide di 33 aminoacidi delle alfa-gliadine detto 33-mer; detto peptide è in grado di resistere all'azione proteolitica degli enzimi digestivi raggiungendo integro la mucosa intestinale dove, avendo un'elevata affinità per la transglutaminasi tessutale, esercita una potente azione immunogena nei soggetti sensibili; tale azione sarebbe determinata, in seguito alla deamidazione degli epitopi tossici del peptide, da un'intensa attivazione dei linfociti TCD4 che rilasciano citochine infiammatorie citolesive (Shuppan D. et al., 2009).
È stato inoltre dimostrato che altri epitopi tossici dell'alfa-gliadina sarebbero in grado di indurre apoptosi di enterociti provenienti da espianti di mucosa intestinale di soggetti celiaci.
Il glutine esercita, quindi, un effetto dannoso sulla mucosa intestinale sia attivando la cascata infiammatoria delle citochine, sia provocando un effetto tossico diretto.
Circa il 30% della popolazione generale è portatore dei geni di suscettibilità della malattia celiaca, HLA-DQ2/8; tuttavia, solo il 2-5% di questi individui andrà a sviluppare la malattia celiaca, il che suggerisce come i fattori ambientali aggiuntivi contribuiscano allo sviluppo della malattia (Rossi M. et al., 2010). I fattori addizionali che influenzano lo sviluppo della malattia celiaca sono sconosciuti, ma potrebbero includere alterazioni nel microbiota intestinale. In effetti, alcuni studi hanno dimostrato come i pazienti con malattia celiaca in corso presentassero una composizione quali-quantitativa alterata del microbiota fecale e duodenale rispetto agli individui sani, in seguito parzialmente ripristinata dopo il trattamento con una dieta priva di glutine. In particolare, i cambiamenti più importanti riguardavano le variazioni in quantità di Firmicutes e Proteobacteria in bambini e adulti con malattia celiaca attiva (Sanchez E. et al., 2013; Wacklin P. et al., 2013). Altri studi hanno riportato una diminuzione nella concentrazione di batteri protettivi con effetti antiinfiammatori, come Blfidobacterium, ed aumento dei batteri Gram-negativi, come Bacteroides ed Escherichia coli nei pazienti con malattia celiaca attiva (Collado M. et al., 2009; Collado M. et al., 2008; Di Cagno R. et al., 2011).
Inoltre, nei bambini affetti da celiachia si riscontra generalmente un aumento di Staphylococcus spp. (Collado M. et al., 2009; Collado M. et al., 2008; Di Cagno R. et al., 2011, Clostridium spp (Di Cagno R. et al,, 2011; De Palma G. et al,, 2010) ed una diminuzione di Lactobacillus spp (Di Cagno R. et al., 2011, Sanz Y. et al 2007; Nadal M. et al,, 2007), Sono stati inoltre riscontrati in pazienti con malattia celiaca una composizione ed una funzione metabolica alterata del microbiota in termini di produzione di acidi grassi a catena corta (SCFA)(Di Cagno R, et al,, 2011; Schippa S, et al., 2010). Uno studio ha dimostrato come la composizione microbica intestinale nei pazienti affetti da malattia celiaca fosse associata con la manifestazione clinica della malattia. La flora intestinale nei pazienti in presenza di sintomi gastrointestinali è dominata da Proteobacteria, mentre il microbiota di pazienti con dermatite erpetiforme o di individui che vivono in dispepsia (controlli) hanno visto il prevalere di Firmicutes (Wacklin P, et al,, 2013).
Ad oggi, l'unico trattamento per i pazienti celiaci è la completa esclusione del glutine dalla dieta. Una dieta cosiddetta gluten-free allevia molti dei sintomi, ma sorprendentemente gli studi suggeriscono come siffatto trattamento non consenta di ripristinare completamente i profili del microbiota presente nei soggetti sani (Wacklin P. et al., 2014).
Sembra che sia la dieta stessa ad impedire il completo ripristino secondo i normali modelli microbici. Anche nei pazienti sani sottoposti ad una dieta priva di glutine il delicato equilibrio tra gram-positivi e gram-negativi viene meno, con i batteri utili rapidamente sostituiti da patogeni opportunisti. Il risultato a lungo termine può portare ad un indebolimento delle difese immunitarie e ad uno stato di infiammazione cronica. Questo crea una situazione in cui i pazienti celiaci, pur rispettando una rigorosa dieta priva di glutine risultano ancora esposti al rischio di infiammazione ed infezioni, e potenzialmente potrebbero soffrire di sintomi piuttosto spiacevoli oltre ad un aumento dei rischi per la salute.
L'uso potenziale di probiotici nella gestione della malattia celiaca è supportato dalla disbiosi intestinale generalmente associata alla celiachia e al ruolo attribuito a questi batteri potenzialmente benefici (cioè, "probiotici") nel mantenere funzionante la barriera intestinale e regolano la risposta innata ed adattativa del sistema immunitario. La Figura 1 mostra un modello che illustra la patogenesi della malattia celiaca. Lo specifico corredo genetico dell'ospite e fattori ambientali potrebbero promuovere la colonizzazione di patobionti e ridurre simbionti, determinando in tal modo la disbiosi. La disbiosi può contribuire ad interrompere 1'omeostasi e l'integrità immunitaria dell'intestino, favorendo così l'insorgenza della malattia celiaca e aggravando la patogenesi (Cenit M.C. et al., 2015).
Sulla base di questa ipotesi, fino ad oggi sono stati condotti tre studi su altrettanti interventi su pazienti celiaci scelti a caso, controllati con placebo in doppio cieco. In uno di questi interventi è stato somministrato Bifidobacterium infantis NLS a pazienti celiaci non trattati per valutare l'effetto del probiotico indipendentemente dalla dieta gluten-free. Questo studio ha riscontrato un miglioramento in alcuni sintomi gastrointestinali, specificamente indigestione e costipazione, in pazienti con malattia celiaca non trattati dopo la somministrazione di Bifidobacterium infantis NLS. Inoltre, non ha migliorato la situazione della diarrea o dei dolori addominali, né modificato la permeabilità intestinale o lo stato pro-infiammatorio misurato come nei livelli sierici di alcune citochine e chemochine (Smecuol E. et al., 2013). Un altro studio su interventi ha analizzato l'influenza di Bifidobacterium longum CECT 7347 nei bambini celiaci con una dieta priva di glutine, al fine di valutare se questi batteri bifidi probiotici potrebbero migliorare l'efficacia della dieta gluten-free. Questo studio ha rivelato una diminuzione del linfociti T periferici CD3+ ed una tendenza alla riduzione dei livelli sierici di TNF-α: dopo la somministrazione di Bifidobacterium longum CECT 7347 e anche una rilevante riduzione del numero di Bacteroides fragilis e slgA nelle feci rispetto al gruppo trattato con placebo (Olivares M. et al., 2014). Uno studio recente durato tre mesi ha valutato l'effetto della combinazione dei ceppi Bifidobacterium breve BRQ3 e Bifidobacterium breve B632, rispetto al placebo, in bambini con celiachia a dieta gluten-free. Lo studio ha riportato che ceppi di Bifidobacterium breve diminuiscono la produzione delle citochine pro-infiammatorie TNF-a in bambini con celiachia con una dieta priva di glutine (Klemenak M. et al., 2015).
Le limitazioni nell'utilizzo dei probiotici come terapia nella prevenzione e cura della celiachia risiedono nel fatto che si tratta di microorganismi che devono arrivare vivi nell'intestino e che devono aderire alle cellule intestinali. I probiotici, inoltre, sono microorganismi esogeni la cui colonizzazione potrebbe essere transitoria e i modesti risultati dei probiotici ottenuti negli studi sopra citati possono essere spiegati anche dal relativo ridotto numero di batteri presenti nelle preparazioni commerciali ma anche dal fatto che singole specie non possono essere in grado di competere con la flora intestinale composta da miriadi di batteri appartenenti ad oltre 40.000 specie diverse.
Da questa necessità - ossia poter produrre prodotti alimentari tipici della dieta mediterranea, quali pane e pasta derivati dal frumento nei quali il glutine presente, non solo non sia immunogenico, ma sia in grado di rafforzare la microflora intestinale del paziente celiaco agendo come agente protettivo nei confronti dei microorganismi utili fino a ripristinare l'equilibrio del microbiota, che possano essere utilizzati, nella prevenzione e nella terapia dietetica della celiachia, causate da perdita dell'omeostasi generata da una microflora utile debole - nasce questa invenzione.
La domanda di brevetto internazionale WO2014/053891 descrive un metodo di detossificazione delle proteine del glutine dalle granaglie dei cereali tale da renderle non immunogeniche per i celiaci e ridurre 1'antigenicità degli epitopi tossici fino ad un intervallo compreso tra 60 e 40 ppm (Lamacchia C. et al., 2016).
L'autore della presente invenzione ha ora messo a punto un metodo migliorato per la detossificazione delle proteine del glutine dalle granaglie dei cereali volto ad ottenere farine non solo detossificate, ma farine in cui 1'antigenicità delle proteine è ulteriormente ridotta fino ad un intervallo compreso tra 0 e 20 ppm, e con effetto terapeutico nella prevenzione e nel trattamento terapeutico delle disbiosi intestinali causate da una microflora utile debole in seguito ad infiammazione e/o infezione in una gamma di pazienti molto più ampia. In particolare, l'autore della presente invenzione ha individuato uno stato di transizione vetrosa che le proteine del glutine riescono a raggiungere mediante una peculiare alternanza di fasi del metodo di trattamento della granella idratata prima della molitura secondo la presente invenzione: riscaldamento rapido alle microonde ed evaporazione dell'acqua libera e legata contenuta nella granella.
Più in particolare, attraverso l'alternanza delle fasi di riscaldamento rapido alle microonde e di evaporazione lenta dell'acqua contenuta nella granella, è possibile risolvere il problema della produzione di farine con glutine che - oltre a non essere immunogenico e tossico per il celiaco - presenta una riduzione dell'antigenicità degli epitopi tossici del glutine fino ad un intervallo compreso tra 0 e 20 ppm ed è in grado di rafforzare in modo sorprendente e inatteso la microflora intestinale utile dello stesso paziente celiaco, ripristinandone l'equilibrio e prevenendo 1'insorgenza e/o il perpetuarsi dell'infiammazione intestinale presente anche in numerose altre condizioni croniche.
Quindi attraverso il metodo della presente invenzione è possibile produrre diversi prodotti alimentari (i.e. prodotti della panificazione, da forno o pasta) che possono essere utilizzati nella prevenzione e nella terapia dietetica di patologie croniche infiammatorie intestinali come celiachia, colite ulcerosa, morbo di Crohn, sindrome del colon irritabile causate da perdita dell'omeostasi generata da una microflora probiotica debole.
Forma pertanto oggetto della presente invenzione un metodo di detossificazione del glutine dalla granella di cereali, comprendente le seguenti fasi:
a) idratazione della granella con acqua fino al raggiungimento di un grado di umidità della granella compreso tra il 15 e il 18%
b) trattamento della granella idratata con onde elettromagnetiche, preferibilmente microonde o infrarossi, per un tempo e una potenza tale da raggiungere una temperatura della granella compresa tra 60 e 70°C;
c) sospensione dell'irraggiamento fino ad una temperatura compresa tra 50 e 60°C e contemporanea evaporazione dell'acqua con una perdita di umidità della granella di grado compreso tra il 14 e il 16% rispetto alla fase a);
d) trattamento della granella idratata con le onde elettromagnetiche, preferibilmente microonde o infrarossi, per un tempo e una potenza tale da raggiungere una temperatura della granella compresa tra 80 e 90°C;
e) sospensione dell'irraggiamento fino ad una temperatura compresa tra 70 e 80°C e contemporanea evaporazione dell'acqua con perdita dell'umidità della granella di grado compreso tra il 40 e il 44% rispetto alla fase a);
f) trattamento della granella idratata con le onde elettromagnetiche, preferibilmente microonde o infrarossi, per un tempo e una potenza tale da raggiungere una temperatura della granella compresa tra 110 e 120<0>C;
g) sospensione dell'irraggiamento all'interno del forno a microonde fino ad una temperatura tra 80 e 90°C e contemporanea evaporazione dell'acqua con perdita dell'umidità della granella di grado compreso tra 50 e 60% rispetto alla fase a);
h) raffreddamento lento a temperatura ambiente della granella detossificata.
Il metodo sopra menzionato viene preferibilmente condotto utilizzando microonde, più specificatamente utilizzando un forno a microonde come dispositivo di emissione delle stesse nelle diverse fasi di trattamento della granella idratata.
Alternativamente per l'emissione delle onde elettromagnetiche è possibile utilizzare un dispositivo laser.
Secondo una forma preferita di realizzazione il metodo secondo l'invenzione comprende un'ulteriore fase i) di molitura della granella della fase h) per ottenere la farina o la semola. Secondo una forma alternativa di realizzazione, il metodo secondo la presente invenzione prevede un'ulteriore fase 1) di estrazione con solvente (i.e. acqua/soluzione salina di cloruro di sodio) dalle farine o semole della fase i) per ottenere il glutine detossificato .
Per temperatura ambiente si intende preferibilmente un intervallo di temperatura tra i 20-25°C.
Preferibilmente, la granella è di cereali, ancora preferibilmente di frumento, orzo, segale o avena.
Nelle fasi b), d), f) del metodo secondo l'invenzione è importante la temperatura raggiunta all'interno della granella, non la potenza delle onde elettromagnetiche che, attraverso l'acqua contenuta nella granella, permettono di raggiungere alte temperature in breve tempo.
Le immagini illustrate nella Figura 2 dimostrano che non sono le microonde in sé a determinare il cambiamento della struttura della proteine del glutine, quanto piuttosto il raggiungimento di determinate temperature e condizioni di umidità in particolare nell'ultima fase di sospensione dell'irraggiamentoevaporazione dell'acqua, (fase g) del processo) in cui il contenuto di umidità della granella ha raggiunto 5-7% e la temperatura raggiunge circa i 100°C. Dalla Figura 2 risulta altresì evidente come, solo in questa fase, le proteine del glutine non siano più totalmente riconoscibili dagli anticorpi fluorescenti all'interno della granella.
Tutte le fasi precedentemente descritte sono necessarie: 1'idratazione della granella fino ad un'umidità compresa tra il 15 e il 18% della fase a) consente al seme di accumulare la quantità di acqua necessaria per trasformare le onde elettromagnetiche, preferibilmente le microonde, in energia termica in un processo di termalizzazione,
Le molecole di acqua, infatti, possono ruotare, vibrare e allinearsi sotto l'azione dei campi elettrici. Nel loro movimento collidono con le molecole vicine e questa specie di sfregamento molecolare produce il riscaldamento della massa irraggiata.
Il successivo irraggiamento della fase b) con le microonde permette il riscaldamento del campione che nella prima fase di irraggiamento deve raggiungere una temperatura compresa tra i 60 e 70°C. Maggiore è il grado di umidità, minore dovrà essere la potenza applicata in un certo intervallo di tempo per raggiungere la temperatura desiderata. L'intervallo di tempo per raggiungere la temperatura desiderata sarà funzione della massa da irraggiare.
A titolo di esempio: 100 g di granella con umidità del 15-18% raggiungeranno la temperatura di 60-70°C in 1 minuto applicando una potenza di 750 watt.
Quindi mentre il grado di umidità è inversamente correlato alla potenza da applicare, il tempo di irraggiamento è direttamente proporzionale alla massa del campione da irraggiare.
La fase di sospensione dell'irraggiamento-evaporazione è da compiersi preferibilmente all'interno del forno a microonde per consentire un processo di trasferimento dell'acqua dallo strato più interno della granella alla periferia e dalla periferia alla superficie e dalla superficie della granella all'ambiente esterno. Il processo deve avvenire lentamente e non esponendo la granella alla temperatura esterna del dispositivo che si utilizza per il riscaldamento, i.e. il forno a microonde. Questo potrebbe causare solo un'evaporazione dell'acqua sulla superficie della granella, non consentendo l'eliminazione di una parte dell'acqua legata alle molecole.
Le fasi di irraggiamento e di sospensione dell'irraggiamento-evaporazione vanno ripetute n volte, in maniera alternata, fino al raggiungimento dello stato di transizione vetrosa delle proteine del glutine, cioè lo stato in cui, in determinate condizioni di umidità e temperatura, le proteine del glutine diventano plastiche (vedere Figura 3).
Ogni proteina ha una propria conformazione, cioè una forma tridimensionale caratteristica nella quale si possono individuare diversi livelli di organizzazione. Come illustrato, la struttura primaria è data dalla sequenza di amminoacidi nella catena polipeptidica, uniti l'uno all'altro da legami covalenti. Il livello successivo è la struttura secondaria, che si forma quando tra gli amminoacidi della struttura primaria si instaurano legami idrogeno che ne causano la torsione. La struttura terziaria di una proteina è prodotta dall'interazione tra amminoacidi posti in punti diversi della struttura secondaria ed è dovuta soprattutto ai ripiegamenti della catena polipeptidica nei tratti di raccordo tra le alfa eliche e i foglietti ripiegati della struttura secondaria. La struttura quaternaria è il risultato del modo in cui due o più catene polipeptidiche, chiamate subunità, si legano insieme e interagiscono tra di loro. Il metodo della presente invenzione consente alle proteine del glutine di raggiungere uno stato di transizione vetrosa in cui le molecole non vibrano, ma si muovono grazie alla rottura dei legami della struttura secondaria e terziaria e le molecole diventano plastico/gommose (Noel T.R. et al., 1995; Micard V. e Guilbert S., 2000).
In particolare, i legami idrogeno e i legami ionici che uniscono gruppi con carica opposta, ma anche i legami disolfuro che permettono alle proteine di mantenere la loro conformazione secondaria e terziaria, si rompono permettendo alle molecole di muoversi nello spazio, modificando la loro struttura secondaria e terziaria. Le proteine del glutine rese plastiche da questo processo tenderanno ad aggregarsi in maniera non convenzionale, perché presenti in forma nativa in corpi proteici della granella matura (Tosi P. et al., 2011) come illustrato nella Figura 4. La Figura 4 mostra infatti che dopo il trattamento mediante il metodo dell'invenzione non solo le proteine non sono riconoscibili dai propri anticorpi, ma è evidente un'aggregazione delle proteine stesse nei corpi proteici dei semi trattati rispetto ai semi controllo. In particolare, le proteine si aggregheranno non mediante legami covalenti (Figura 5), come accade in una struttura del glutine già formata e sottoposta ad alte temperature (cottura dell'impasto nel forno, essiccazione della pasta; Lamacchia C. et al., 2007; Gerrard J.A., 2000), ma mediante legami ionici che uniscono gruppi con carica opposta generati dal cambiamento della struttura secondaria e terziaria della molecola quando presente in forma nativa nei corpi proteici della granella matura. La Figura 5 illustra un gel di elettroforesi condotto in condizioni riducenti che non mostra differenze nei pesi molecolari delle proteine estratte dalle farine dei semi controllo e semi trattati con il metodo della presente invenzione, evidenziando che le proteine non solo non subiscono modifiche nella struttura primaria, ma anche che 1'aggregazione visibile nei corpi proteici dei semi dopo trattamento termico secondo il metodo della presente invenzione non può essere attraverso legami di tipo covalente, ditirosinico e/o isopeptidico (Gerrard J.A., 2000; Lamacchia 0. et al., 2007; Tilley K.A. et al., 2001). Infatti, in questo caso si sarebbe dovuto osservare uno spostamento delle bande proteiche verso pesi molecolari più alti.
Pertanto, l'aggregazione osservata nei corpi proteici dei semi trattati, non può essere di tipo covalente, cioè non si esplica mediante la formazione di legami covalenti.
La fase h) di raffreddamento lento a temperatura ambiente del metodo secondo l'invenzione, permette alle molecole di cristallizzare in questo stato di aggregazione non convenzionale.
I punti chiave di questo metodo migliorato sono rappresentati da:
1) uso dell'acqua, che svolge una doppia funzione. La prima è quella di trasformare le onde elettromagnetiche, preferibilmente le microonde, in energia termica in un processo di termalizzazione. La seconda è permettere alle proteine del glutine di raggiungere uno stato di transizione vetrosa, uno stato che le rende plastiche, evaporando lentamente e trascinando con sé anche una parte dell'acqua legata. L'uso delle microonde è particolarmente preferito, poiché non essendo radiazioni ionizzanti non sono in grado di spezzare legami. Quindi, la loro unica funzione è quella di permettere alle molecole di acqua di vibrare e di generare calore in breve tempo.
3) generazione del calore che ha anch'esso una duplice funzione. Permette, all'acqua libera e legata di evaporare, e alle proteine del glutine, racchiuse nei corpi proteici della granella matura in forma nativa, di raggiungere uno stato in cui le proteine non vibrano, ma si muovono.
Questo movimento è permesso dalla rottura di ponti idrogeno e legami ionici che causano il cambiamento della struttura secondaria e terziaria delle proteine stesse rendendole plastiche (Figura 3), Questa modifica porta evidentemente ad una esposizione di cariche da parte delle proteine, giustificato dal fatto che il glutine con questo processo diventa solubile in acqua. L'esposizione delle cariche dovuta ad una perdita della struttura secondaria e terziaria delle proteine porta ad un'aggregazione tra le proteine presenti nello stesso corpo proteico e con carica differente. La Figura 6 mostra schematicamente l'ipotesi in cui prima dell'applicazione del metodo della presente invenzione le proteine del glutine sono racchiuse in corpi proteici della granella di frumento assumendo la loro struttura tridimensionale nativa. Successivamente all'applicazione del metodo della presente invenzione, le proteine raggiungono lo stato di transizione vetrosa, divengono plastiche perdendo la loro struttura tridimensionale. Questa modifica porta ad una esposizione di cariche da parte delle proteine, giustificato dal fatto che il glutine con questo processo diventa solubile in acqua. L'esposizione delle cariche dovuta ad una perdita della struttura secondaria e terziaria delle proteine porta ad un'aggregazione tra le proteine presenti nello stesso corpo proteico e con carica differente. Si potrebbe ipotizzare gliadina (-) LMW (+), albumina (+) gliadina (-), globulina (+) gliadina (-) come rappresentato nell'immagine.
4) dal raffreddamento lento, che permette alla nuova struttura proteica di rimanere cristallizzata in questo nuovo stato.
Costituisce altresì oggetto della presente invenzione una granella, una farina o una semola detossificata o glutine detossificato ottenibili mediante il metodo secondo l'invenzione. La farina o la semola possono essere di frumento, segale, orzo o avena e sono ottenibili dopo la molitura prevista dalla fase aggiuntiva i). Il glutine può essere di frumento, segale, orzo o avena, ottenibile dopo estrazione con solvente dalle farine e/o dalle semole prevista dalla fase aggiuntiva 1).
Con il termine "detossificato " nel contesto della presente invenzione quando riferito a farine o semole, si intende un livello di epitopi tossici del glutine ridotto fino ad un intervallo compreso tra 0 e 20 ppm. Ciò consente di potere considerare a tutti gli effetti di legge queste farine o semole "gluten free", ancorché il glutine sia ancora presente al loro interno.
L'invenzione è riferita ad un prodotto alimentare comprendente farina di grano, semola di grano, orzo o avena, scelto tra pane, pasta, prodotti da forno, cereali da prima colazione e birra.
Alternativamente, l'invenzione si riferisce a prodotti lattiero caseari (i.e. yogurt, gelati, latti fermentati, formaggi, mozzarelle, burro, panna, ricotta) a cui può essere aggiunto il glutine detossificato ottenuto secondo la fase 1) del metodo dell'invenzione .
In particolare, il glutine detossificato ottenuto secondo la fase 1) del metodo dell'invenzione può essere vantaggiosamente utilizzato come addensante per la preparazione di prodotti alimentari, non solo lattiero caseari, ma anche in altre categorie di prodotti come salumi, gelati, alimenti per l'infanzia, salse e sughi. Pertanto anche tali prodotti alimentari rientrano nell'ambito di protezione della presente invenzione in quanto destinati a quelle popolazioni di soggetti per le quali è consigliata una dieta gluten free o povera di lattosio.
In sintesi un primo vantaggio è che dalle semole e dalle farine prodotte in accordo al metodo secondo l'invenzione si riuscirà a produrre alimenti per i celiaci con antigenicità degli epitopi tossici del glutine ridotta tra 0 e 20 ppm, con caratteristiche organolettiche equivalenti per gusto ed aspetto a quelli comunemente utilizzati nell'alimentazione mediterranea, ma anche terapeutici nei confronti della microflora intestinale del paziente celiaco, ripristinandone l'equilibrio, nonché proteggendo e rinforzando la microflora utile.
Pertanto formano ulteriore oggetto della presente invenzione la granella, la farina, la semola o il glutine detossificati o un prodotto alimentare a base di una di esse o addizionato con una di esse per l'uso in campo medico.
Secondo una forma particolarmente preferita di realizzazione dell'invenzione, tali prodotti alimentari o la granella o le farine e le semole detossificate o il glutine detossificato sono impiegati per l'uso nella prevenzione o nel trattamento delle disbiosi intestinali.
Un secondo vantaggio è che dalla granella, dalle semole, dalle farine, o dal glutine così prodotti si riuscirà a produrre alimenti per la terapia dietetica di tutte quelle patologie in cui l'alterazione del microbiota intestinale aumenta il rischio di sviluppare una suscettibilità verso malattie croniche intestinali di natura infiammatoria e/o autoimmune, scelte in maniera esemplificativa e non esaustiva dal gruppo che consiste in malattia celiaca, colite ulcerosa, morbo di Crohn, e sindrome dell'intestino, nonché malattie metaboliche sistemiche come l'obesità, il diabete di tipo 1 o il diabete di tipo 2.
Secondo un'ulteriore forma di realizzazione dell'invenzione tali farine e semole detossificate, o glutine detossificato o prodotti alimentari ottenuti mediante il loro utilizzo, possono essere vantaggiosamente utilizzati come agenti protettivi nei confronti di microrganismi probiotici come quelli appartenenti al genere Lactobacilli, quali ad esempio Lactobacillus acidophilus (in particolare se addizionati in prodotti lattiero caseari per i pazienti con intolleranze al lattosio) e/o come agenti antimicrobici nei confronti di batteri Gram-negativi e/o Gram-positivi, Preferibilmente, detti batteri Gramnegativi appartengono al genere Salmonella, ancora preferibilmente alla specie Salmonella typhimurium e detti batteri Gram-positivi appartengono al genere Staphylococcus ancora preferibilmente alla specie Staphylococcus aureus.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, sulla base delle risultanze indicate nei seguenti esempi e nelle figure allegate, in cui:
- la Figura 1 mostra uno schema illustrativo della patogenesi della malattia celiaca (MC).
- la Figura 2 mostra le sezioni di grano tenero (1 μΜ) relative alle fasi del metodo di trattamento dopo marcatura con anticorpo 0610 che riconosce le frazioni proteiche delle gliadine e delle glutenine a basso peso molecolare (LMW-GS). Pannello A; Fase B; pannello B: Fase C; pannello C: Fase D; pannello D: Fase E; pannello E: Fase F; pannello F: Fase G del metodo secondo l'invenzione.
- la Figura 3 rappresenta la struttura della proteina prima e dopo il trattamento termico secondo il metodo della presente invenzione.
- la Figura 4 mostra le sezioni di grano tenero (lpm) controllo e dopo trattamento del metodo della presente invenzione. (1) Sezione di grano tenero controllo, con una matrice proteica non omogenea (Pb 1); (2) Sezione di grano tenero dopo il trattamento, con una matrice proteica omogenea e confluente (Pb 2). Il test di Friedman non parametrico applicato a 6 semi differenti (4 sezioni per ciascun seme) ha rilevato differenze altamente significative tra i due tipi di corpi proteici (Pbl e Pb2) nei semi dei campioni controllo e dopo trattamento.
la Figura 5 mostra l'estrazione delle frazioni proteiche e la separazione attraverso SDS-PAGE in condizioni riducenti. Corsia 1, gliadine estratte da farina proveniente da semi controllo, che non hanno subito il trattamento termico della presente invenzione; corsia 2, gliadine estratte da farine provenienti da semi trattati con il metodo della presente invenzione; corsia 3, HMW-GS e gliadine estratte da farina proveniente da semi controllo, che non hanno subito il trattamento termico della presente invenzione; corsia 4, HMW-GS e gliadine estratte da farine provenienti da semi trattati con il metodo della presente invenzione; corsia 5, glutenine estratte da farina proveniente da semi controllo, che non hanno subito il trattamento termico della presente invenzione; corsia 6, glutenine estratte da farine provenienti da semi trattati con il metodo della presente invenzione; corsia 7, proteine totali estratte da farina proveniente da semi controllo, che non hanno subito il trattamento termico della presente invenzione; corsia 8, proteine totali glutenine estratte da farine provenienti da semi trattati con il metodo della presente invenzione.
- la Figura 6 mostra un'ipotesi di aggregazione tra le proteine presenti nello stesso corpo proteico e con carica differente.
- la Figura 7 mostra gli istogrammi riassuntivi del saggio ELISA con anticorpo monoclonale R5 Ridascreen Gliadin condotto su campioni di farina controllo e dopo trattamento secondo il metodo della domanda internazionale di brevetto WO2014/053891 a confronto con il metodo della presente invenzione.
la Figura 8 mostra le sezioni di grano tenero controllo (Controllo) e dopo trattamento (Trattato) del metodo descritto nella presente invenzione, tagliate trasversalmente, ed esaminate attraverso SEM-Immunogold, immunomarcate con anticorpo 0610 e ygliadina. 1. Controllo marcato con anticorpo 0610; 2. Controllo dopo marcatura con anticorpo anti γ gliadina; 3. Trattato marcato con anticorpo 0610; 4. Trattato marcato con anticorpo anti γ-gliadina. Le frecce in figura rappresentano le particelle di argento (AgNp) rilevate attraverso analisi EDS (Energy Dispersive Spectroscopy) .
- la Figura 9 mostra le sezioni di grano tenero (1 pm) controllo (Controllo) e dopo trattamento (Trattato) secondo il metodo della presente invenzione, marcate con 1'anticorpo 0610, HMW-G e γ-gliadina. 1. Controllo marcato con anticorpo 0610; 2. Controllo dopo marcatura con anticorpo anti γ gliadina; 3. Controllo marcato con anticorpo HMW-GS; 4. Trattato marcato con anticorpo 0610; 5, Trattato dopo marcatura con 1'anticorpo ygliadina; 6. Trattato dopo marcatura con 1'anticorpo HMW-GS.
- la Figura 10 mostra l'analisi colorimetrica eseguita con 1'anticorpo monoclonale R5-HRP coniugato, in sezioni di semi controllo e dopo trattamento. 1. Subaleurone del seme controllo; 2. Sub-aleurone del seme dopo trattamento secondo il metodo della presente invenzione; 3. Piega del seme controllo; 4. Piega del seme dopo trattamento secondo il metodo della presente invenzione. Le barre in figura corrispondono a 100 pm. - la Figura 11 mostra l'analisi cinetica di morte di Lactobacillus acidophilus in soluzione salina dopo l'aggiunta sia del pane controllo che del pane modificato (0,8 g/1). Le linee rappresentano il migliore adattamento attraverso l'equazione di Weibull. - la Figura 12 mostra la conta vitale di Staphylococcus aureus in soluzione salina addizionata con il pane controllo o il pane trattato (0,2, 0,4 o 0,8 g/1). I valori medi ± deviazione standard, I simboli e "**" individuano le differenze significative (ANOVA ad una via e test di Tukey).
- la Figura 13 mostra la conta vitale di Salmonella sp. in soluzione salina addizionata con 0,8 g/1 di pane controllo o pane modificato. I valori medi ± deviazione standard.
la Figura 14 mostra l'analisi delle componenti principali relative ai risultati degli SCFA e FISH dopo 6 ore di fermentazione. Pannello A) Proiezione delle variabili; pannello B) Proiezione dei casi. Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controllo negativo di donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato. Variabili: 1, Bifl64; 2, Erec482; 3, Bac; 5, labl58; AC: acido acetico; BUT: acido butirrico; PROP : propionico.
la Figura 15 mostra l'analisi delle componenti principali relativi ai risultati degli SCFA e FISH dopo 24 ore di fermentazione. Pannello A) Proiezione delle variabili; pannello B) Proiezione dei casi. Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controllo negativo di donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato . Variabili : 1, Bif164; 2, Erec482; 3, Bac; 5, labl58; AC: acido acetico; BUT: acido butirrico; PROP: propionico.
la Figura 16 mostra l'analisi delle componenti principali relative ai risultati degli SCFA e FISH dopo 48 ore di fermentazione. Pannello A) Proiezione delle variabili; pannello B) Proiezione dei casi. Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controllo negativo di donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato. Variabili: 1, Bifl64; 2, Erec4S2; 3, Bac; 5, labl58; AC : acido acetico; BUT ; acido butirrico,-PROP : propionico.
ESEMPI
ESEMPIO 1: Riduzione dell'antigenicità delle proteine del glutine dopo trattamento con il metodo secondo 1 'invenzione
Dopo avere sottoposto la granella di frumento al metodo di detossificazione secondo l'invenzione è stata verificata la riduzione dell'antigenicità degli epitopi tossici delle proteine del glutine sulle farine utilizzando il metodo ufficiale (Saggio ELISA con anticorpo R5) adottato dai laboratori spiga barrata per il riconoscimento del glutine in farine e prodotti destinati ai celiaci.
In particolare, le proteine del glutine previamente denaturate con il cocktail Mendez sono state estratte dalle farine mediante soluzione alcolica e testate secondo il metodo R5 sandwich ELISA (vedere Figura 7) utilizzando 1' anticorpo monoclonale R5 che riconosce la sequenza peptidica tossica QQPFP, che si ritrova ripetuta nelle proteine del glutine. La Figura 7, (pannello A) mostra gli istogrammi riassuntivi del saggio ELISA con R5 Ridascreen Gliadin, dei campioni trattati con il metodo descritto nella domanda di brevetto internazionale WO2014/053891 a confronto con il metodo della presente invenzione (pannello B). Per inciso, i campioni di farina provenienti dalla granella trattata con il metodo descritto nella domanda di brevetto internazionale WO2014/053891 presentavano una riduzione dell' antigenicità dell'epitopo tossico QQPFP compresa nell' intervallo tra 60 e 40 ppm (pannello A, Figura 7; Lamacchia C. et al. 2016). Invece, le farine provenienti dalla granella trattata con il metodo della presente invenzione mostrano una significativa riduzione dell'antigenicità dell'epitopo tossico fino a 13,83+7,22 ppm, permettendo a queste farine di essere considerate, a tutti gli effetti di legge, farine "gluten free ", ancorché il glutine sia ancora presente al loro interno.
Il miglioramento del metodo di detossificazione delle proteine del glutine dalle granaglie dei cerali secondo la presente invenzione consiste proprio nella riduzione dell'antigenicità degli epitopi tossici del glutine fino ad un intervallo compreso tra 0 e 20 ppm, rendendole molto più sicure per i celiaci. Questa riduzione non era raggiungibile attraverso il metodo di cui alla domanda di brevetto internazionale WO2014/053891 a causa del fatto che in questo metodo il passaggio alle microonde per 120 sec, seguito da raffreddamento lento a temperatura ambiente, non assicura la completa modifica delle proteine nella forma plastica, che invece viene raggiunta totalmente grazie alle fasi del metodo descritte nella presente invenzione.
I cambiamenti indotti dal metodo secondo la presente invenzione permettono la riduzione dell'antigenicità delle proteine del glutine tale da non essere più riconoscibili anche dai propri anticorpi. A dimostrazione di ciò, tre campioni di semi controllo (CWS) e trattati (TWS) sono stati tagliati trasversalmente, ed esaminati attraverso la tecnica di microscopia ad immunogold (Figura 8), ad immunofluorescenza (Figura 9) e colorimetrica (Figura 10) utilizzando tre anticorpi monoclonali specifici per la frazione di gliadine:
- IFRN 0610, anticorpo monoclonale che riconosce un epitopo (QQSF) comune a molte gliadine;
- LMW-GS, anticorpo monoclonale murino, che riconosce un dominio ripetitivo presente nella frazione di γ gliadina (PEQPFPQGC);
- R5, anticorpo monoclonale R5 riconosce la sequenza QQPFP altamente tossica, che è presente ripetuta nelle proteine del glutine.
La Figura 8 mostra le sezioni di grano tenero controllo (Controllo) e dopo trattamento (Trattato) con il metodo secondo la presente invenzione, tagliate trasversalmente, ed esaminate attraverso SEM-Immunogold, immunomarcate con anticorpo 0610 e ygliadina. Sono stati confrontati attraverso il T-test di Student i valori ottenuti in 5 sezioni provenienti da 5 semi differenti Controllo e Trattato. Le differenze riscontrate con i due tipi di anticorpo sono risultate altamente significative, (p<0,001). Con 1'anticorpo 0610, si è ottenuto un decremento percentuale nei semi trattati pari all'89% rispetto ai semi controllo ed un decremento pari all'87,5% nei confronti dell'anticorpo γ gliadina.
La Figura 9 mostra le sezioni di grano tenero (1 pm) controllo (Controllo) e dopo trattamento (Trattato) secondo il metodo della presente invenzione, marcate con 1'anticorpo 0610, HMW-G e γ-gliadina. Tre campioni differenti (3 sezioni per ciascun seme) provenienti da campioni di seme controllo e dopo trattamento sono stati analizzati attraverso il software Imagej. Per ciascuna immagine, convertita in scala di grigio, sono stati ottenuti i rispettivi valori di MGV (mean grey value), Con 1'anticorpo 0610, si è osservato un decremento percentuale pari al 91,7% nei semi trattati rispetto ai semi controllo ed un decremento pari al 90,6% nei confronti dell' anticorpo γ gliadina, In seguito, per tali dati si è effettuato il test Anova a due vie, con ipotesi di decomposizione per due variabili (tipo di campione e tipologia del trattamento). Fra i parametri analizzati, la tipologia del trattamento subito dal seme è stato il fattore più importante. I dati ottenuti sono risultati altamente significativi, (p<0,001).
La Figura 10 mostra l'analisi colorimetrica eseguita con 1'anticorpo monoclonale R5-HRP coniugato, in sezioni di semi controllo e dopo trattamento. Tre campioni differenti (3 sezioni per ciascun seme) provenienti da campioni di seme controllo e dopo trattamento sono stati analizzati attraverso il software Imagej. Per ciascuna immagine, convertita in scala di grigio, in formato binario, sono stati ottenuti i rispettivi valori di MGV (mean grey value). Si è osservato un decremento percentuale pari all'89,2% nel seme dopo il trattamento rispetto al seme controllo, a livello della regione subaleuronica, ed un decremento pari all'82% a livello della piega. Successivamente per tali dati si è effettuato il test Anova a due vie, con ipotesi di decomposizione per due variabili (tipo di campione e tipologia del trattamento). Fra i parametri analizzati, la tipologia del trattamento subito dal seme è stato il fattore più importante. I dati ottenuti sono risultati altamente significativi (p<0,001).
ESEMPIO 2: Studio in vitro sull'effetto protettivo del digerito di pane preparato con le farine trattate secondo il metodo nei confronti del Lactobacillus acidophilus e sull'effetto antimicrobico nei confronti dello Staphylococcus aureus e della Salmonella Typhimurium .
Due diverse serie di esperimenti sono stati eseguiti, come riportato nella seguente Tabella 1.
In particolare, le aliquote di soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) (50 mi) sono state integrate con differenti aliquote di pane controllo o pane la cui farina deriva dalla molitura dei semi il cui glutine è stato modificato con il metodo precedentemente descritto, digerito in vitro in condizioni opportune secondo le procedure descritte da Maccaferri S. et al. (2012) disidratato ed inoculato a 8 log ufc/ml; i campioni sono stati quindi analizzati per valutare periodicamente la conta vitale mediante piastramento su MRS agar (Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium animalis) o TSA (patogeni) ed incubati a 37°C per 2-4 giorni. I batteri lattici sono stati analizzati in condizioni anaerobiche.
Tabella 1
Esperimenti Bersagli Campioni Durata
Cinetica di Lactobaccilus Soluzione 7 giorni morte salina e (conta dei acidophilus campioni microrganismi addizionati ogni 6-10 ore) con 0,4 o 0,8 Bifidobacterium g/1 di pane
controllo o
animalis pane preparato
con farina
proveniente da
semi trattati
secondo il
metodo della
presente
invenzione
Effetto della Lactobacillus Soluzione 24 ore concentrazione salina e
acidophilus campioni
addizionati
con 0,8 o 5
Bifidobacterium g/1 di pane
controllo o
animalis pane preparato
con farina
proveniente da
semi trattati
secondo il
metodo della
presente
invenzione
Patogeni Salmonella Soluzione 7 giorni salina e (conta dei Typhimurium campioni microrganismi addizionati dopo 1 e 7 con 0,2, 0,4, giorni) Staphylococcus o 0,8 g/1 di
pane controllo
aureus o pane
preparato con
farina
proveniente da
semi trattati
secondo il
metodo della
presente
invenzione
1DEC/P 12501T La Tabella 2 riporta i parametri di adattamento per l'equazione di Weibull per la cinetica di morte di Lactobacillus acidophilus (valori medi ± standard). Per ciascun parametro le lettere indicano le differenze significative (ANOVA e test di Tukey, P <0,05). La cinetica di morte ha mostrato una curva verso il basso con un parametro di forma > 1.
Tabella 2
Campione log NQ* Δ P d.t. R Controllo 8,43±0,14A 17,99±0,90A 1,62±0,ISA 67,46±2,06A 0,995 0,4 g/1
Detox 8,38±0,13A 17,43±2,06A 1,40±0,14A 80,53±2,03B 0,994 0,4 g/1
Controllo 8,19±0,12A 23,40±2,00B 1,94±0,20A 70,28±2,63A 0,993 0,8 g/1
Detox 8,56±0,14A 17,57±2,70A 1,27±0,17A 93,96±4,00C 0,990 0,8 g/1
L'aggiunta della soluzione salina sia nel pane controllo che nel pane modificato non ha inciso sulla forma della curva. D'altro canto, il tipo di pane ha esercitato un effetto significativo sulla cinetica di morte della popolazione batterica; infatti questa è stata prolungata da 67,46 a 80,53 a 0,4 g/1 e da 70,28 a 93,96 a 0,8 g/1 quando è stato utilizzato il pane preparato con farina i cui semi sono stati trattati con il metodo precedentemente descritto.
L'effetto del pane preparato con farina i cui semi sono stati trattati con il metodo precedentemente descritto, sulla cinetica di morte, ma non sul parametro di forma, è una conseguenza di una probabile riduzione della mortalità nell'ultima parte della curva di morte, come suggerito dalle cinetiche di morte di Lactobacillus acidophilus in soluzione salina dopo l'aggiunta sia del pane controllo che del pane trattato (0,8 g/1) riportate in Figura 11. Le linee rappresentano il migliore adattamento attraverso l'equazione di Weibull. Un secondo test è stato eseguito per determinare se la concentrazione di pane modificato potesse causare o esercitare un effetto dannoso sia su Lactobacillus acidophilus che su Bifidobacterium animalis; la soluzione salina è stata aggiunta con la quantità utilizzata per il primo esperimento (0,8 g/1) e con una concentrazione più elevata (5,0 g/1) per simulare un aumento locale del pane dovuto ad un transito lento nell'intestino. La conta vitale non è stata influenzata dalla concentrazione del pane digerito e la cinetica di morte ha mostrato un andamento simile a quello riportato in Figura 11.
Infine, la soluzione salina è stata inoculata con un patogeno Gram positivo o un Gram negativo (Staphylococcus aureus e Salmonella Typhimurium); i risultati per lo Staphylococcus aureus sono riportati nella Figura 12 che mostra le conte vitali in soluzione salina addizionata con il pane controllo o il pane trattato (0,2, 0,4 o 0,8 g/1). I valori medi ± deviazione standard. I simboli e "**" individuano le differenze significative (ANOVA ad una via e test di Tukey).
Una differenza significativa è stata riscontrata per il campione addizionato con 0,8 g/1 di pane preparato con farina i cui semi sono stati trattati secondo il metodo descritto, che ha mostrato un tasso di conta vitale più basso di 1-log rispetto al campione a cui è stato aggiunto il pane controllo. In presenza di Salmonella sp. è stata riscontrata una riduzione pari a 3-log nello stesso campione dopo 7 giorni, mentre il pane controllo ha determinato una riduzione di 1-log (Figura 13).
ESEMPIO 3: Studio sull’effetto terapeutico nel ripristino dell'equilibrio della flora intestinale del paziente celiaco in sistemi modello che simulano la parte distale del colon,
È stato valutato l'effetto sia del pane controllo che del pane preparato con farina i cui semi sono stati trattati secondo il metodo della presente invenzione, nelle colture di fermentazione in batch (sistemi modello a pH controllato che simulano la parte distale del colon che consentono di studiare l'effetto di singoli composti o di fibre).
I campioni fecali sono stati ottenuti da tre volontari sani umani (due maschi, una femmina, di età tra i 30 e 38 anni; BMI: 18,5-25) esenti da malattie metaboliche e gastrointestinali note (ad esempio diabete, colite ulcerosa, morbo di Crohn, sindrome del colon irritabile, ulcera peptica e cancro). A tutti i donatori sani è stato somministrato un questionario standard per raccogliere informazioni sullo stato di salute, il consumo di droga, anamnesi clinica, e lo stile di vita prima che al donatore fosse stato chiesto di fornire un campione fecale. Per i donatori celiaci (due femmine, un maschio, di età dai 30 ai 38 anni; BMI: 18,5-25) è stato ottenuto in ogni caso un consenso informato scritto e lo studio è stato approvato dal Comitato Etico di Ricerca dell'Università di Reading, UK (UREC 15/20: centro di raccolta di donazione dei campioni di feci per i sistemi modello in vitro del colon umano). Tutti i campioni fecali raccolti dai donatori sani e celiaci sono stati raccolti in loco, conservati in un armadio anaerobico (10% H2-10% CO2-80% N2)e utilizzati entro un massimo di 15 minuti dopo la raccolta. I campioni sono stati diluiti 1:10 (w/v) in una soluzione di PBS anaerobica (soluzione 0,1 M di tampone fosfato, pH 7,4) ed omogeneizzati per 2 minuti. I recipienti di fermentazione delle colture in batch culture (280 mi) precedentemente sterilizzati sono stati riempiti con 45 mi di un terreno modello complessato di crescita del colon (Tejero-Sarinena S., et al., 2012).
In seguito, i recipienti sono stati collegati ad un bagnetto di acqua circolante a 37°C ed è stato immesso il gas N2privo di 02per renderli anaerobici prima dell'inoculazione. Il pH è stato tamponato a 6,7 e 6,9 utilizzando un pH-metro con soluzioni di NaOH o HC1 (Electrolab260; Electrolab Ltd, Tewkesbury, Regno Unito). Al mezzo colturale sono stati aggiunti, quindi, 5 mi di omogenato fecale, preparati come descritto in precedenza, ed 1 mi di digerito di pane.
Per ciascun donatore sono stati preparati 3 diversi recipienti:
- controllo negativo (in cui non è stato aggiunto il digerito di pane) denominato A per i soggetti sani e D per i soggetti celiaci;
- recipiente addizionato con pane controllo denominato B per i soggetti sani ed E per i soggetti celiaci;
- recipiente addizionato con pane preparato con farina i cui semi sono stati trattati con il metodo precedentemente descritto denominato C per i soggetti sani ed F per i soggetti celiaci.
Le colture in batch sono state analizzate per 48 ore, prelevando al momento dell'inoculo e dopo 6, 24 e 48 ore di tempo i campioni necessari per la valutazione del microbiota tramite ibridazione mediante fluorescenza in situ (FISH) e la determinazione di acidi grassi a catena corta (SOFÀ) attraverso l'uso della cromatografia liquida ad alta affinità (HPLC).Le Figure 14, 15 e 16 illustrano i risultati delle analisi delle componenti principali relative ai risultati degli SOFÀ e FISH dopo 6, 24 e 48 ore di fermentazione.
I risultati ottenuti dagli esperimenti di FISH e SCFA sono stati standardizzati come aumento/diminuzione riferiti al tO (inoculo) del controllo negativo, per escludere la variabilità dovuta al tipo di donatore; pertanto, i risultati mostrano la modifica del sistema rispetto all'inizio dell'esperimento e dovrebbero essere letti come incremento (valori positivi) o diminuzione (valori negativi) della popolazione microbica o dei prodotti del metabolismo microbico. L'incremento/decremento è riferito all'inoculo del controllo negativo (log cellule/ml).
Inoltre, ogni parametro è stato analizzato attraverso il test ANOVA per individuare le differenze significative; l'utilizzo dell'approccio per gruppi omogenei è stato utilizzato come strumento aggiuntivo per stabilire un possibile andamento nel tempo.
La seguente Tabella 3 mostra i risultati del test ANOVA ad una via per gruppi omogenei sui dati FISH di bifidobatteri dopo 6, 24 e 48 ore di fermentazione.
Tabella 3
Gruppi
omogenei
6 ore I II III Campione FISH
E 0,147100
F 0,264242
D 0,489640
B 0,604836
A 0,632162
C 0,700706
24 ore
E 0,371967
F 0,490137
D 0,507300
A 0,716912
B 0,734684
C 0,909206
48 ore
E 0,273558
A 0,654479
F 0,681301
D 0,707120
B 0,715355
C 0,925907
Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo;
F, donatori celiaci pane modificato
Le differenze tra i campioni non erano significative né
dopo 6 ore, né dopo 24 ore. Invece, dopo 48 ore sono
stati riscontrati due gruppi statistici: il primo
gruppo era costituito dal solo campione E (donatore
celiaco con pane controllo) ed il secondo gruppo da
tutti gli altri campioni.
Il campione E non mostrava un aumento significativo della popolazione dei bifidobatteri (aumento 0,27-log cellule/ml), probabilmente dovuto ad un effetto negativo esercitato dal pane sulla microflora, mentre negli altri campioni si verificava un aumento da 0,7 a 0,9 log cellule/ml. Il dato interessante risiedeva proprio nell'inclusione del campione F con i campioni del soggetto sano, suggerendo un effetto benefico del pane preparato con farina i cui semi erano stati trattati con il metodo precedentemente descritto, in grado di ripristinare un trend normale nella popolazione dei bifidobatteri.
Le Tabelle 4 e 5 mostrano i risultati dei testi ANOVA ad una via per gruppi omogenei sui dati FISH relativi ai gruppi batterici Erec482 (Franks A.H» et al,, 1998), Bac303 (Manz W, et al., 1996) dopo 6, 24 e 48 ore di fermentazione (log cellule/ml). I gruppi batterici sono stati identificati utilizzando sonde oligonucleotidiche sintetiche destinate a regioni specifiche del 16S RNA (Langendijk P.S. et al., 1995) marcate con il colorante fluorescente Cy3 come riportato in probeBase (http;//www.microbial-ecology.net/probebase) .
Tabella 4
Gruppi
omogenei
6 ore I II III Campione FISH
B 0, 001945
A 0, 087913
C 0, 130655
E 0, 159812
D 0, 370D65
F 0, 382277
24 ore
F -0, 065175
A 0, 077214
E 0,169113
C 0, 286015
D 0, 443906
B 0, 481756
4 8 ore
D -0, 017101
C 0, 051435
F 0, 064366
A 0, 150569
E 0, 223303
B 0,267762
Campioni; A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato.
Tabella 5
Gruppi
omogenei
6 ore I II III IV Campione FISH
A -0,094164
D -0,043412
E 0,080924
B 0,106672
C 0,133569 it**it
F 0,176720
24 ore
D -0,189282
E -0,172388
F 0,028873
A 0,414786
B 0,433302
C 0,636738
48 ore
B -0,330564
F -0,313381
E -0,307379
D -0,193349
C -0,110862
A -0,034976
Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato.
L'analisi statistica ha evidenziato una distribuzione continua dei campioni, con 2-4 gruppi omogenei sovrapposti, in dipendenza del tempo e del tipo di microrganismi .
La distribuzione statistica dei campioni cambiava nel corso del tempo; tuttavia, l'aumento/diminuzione della conta vitale (-0-33-0,26 log cellule/ml) erano di entità moderata in valori assoluti.
L'effetto dell'aggiunta di pane sui gruppi batterici ChislSO (Franks A.H. et al., 1998) è riportato nella seguente Tabella 6.
Tabella 6
Gruppi
omogenei
6 ore I II III
Campione FISH
B -0,266858
A -0,180315
C -0,103523 ★ ★★ kkkk
D 0,153936 kkkk kkkk F 0,171644 kkkk kkkk E 0,316956 kkkk 24 ore
C -0,162934
F -0,120933 kkkk
A -0,083551 kkkk
B -0,030945 kkkk
E 0,072539 kkkk
D 0,096110 kkkk
48 ore
A -0,305986 kkkk
C -0,234457 kkkk
B 0,060428 kkkk
D 0,166901 kkkk
F 0,190838 kkkk
E 0,216414 kkkk
Campioni; A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato.
Dopo 6 ore si riscontrava una distribuzione continua dei campioni con 2 gruppi ben definiti (1° gruppo con i campioni A e B; 2° gruppo contenente il campione E) ed una classe intermedia (campioni C, D, F). Inoltre, il campione E (donatore celiaco con pane controllo) non era statisticamente differente dai campioni D ed F (controllo negativo e donatore celiaco con pane ''modificato") anche statisticamente differente dai campioni di donatori sani. Tuttavia, nei campioni F e D si osservava uno shift statistico verso il campione C. Questo cambiamento non si riscontrava dopo 24 e 48 ore. I batteri lattici presentavano un andamento caratteristico nel tempo, come riportato nella seguente Tabella 7 che illustra i risultati del test ANOVA ad una via per gruppi omogenei sui dati FISH di Lab 158 dopo 6, 24 e 48 ore di fermentazione (log cellule/ml).
bella 7
Gruppi
omogenei
6 ore I II III Campione FISH
F -0,639714
E -0,565338
D -0,327822
C -0,122414
A A 0,001010
B 0,038547
24 ore
E -0,591904
F 0,014006
D 0,015039
A 0,165791
C 0,267343
B 0,288811
48 ore
E -0,526397
D -0,289074
F -0,022714
A 0,135032
B 0,188054
C 0,304061
Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato.
Dopo 6 ore di fermentazione si osservava una diminuzione della popolazione lattica nei campioni E ed F (0,57-0,64 log cellule/ml). Dopo 24 ore, questo trend negativo si riscontrava nel campione E, ma non nel campione F, in cui la popolazione lattica aumentava e mostrava un trend simile a quello dei soggetti sani, suggerendo un effetto interessante e benefico del pane preparato con farina le cui proteine del glutine sono state modificate. Dopo 48 ore si distribuivano in maniera continua; il campione F, in particolare, si posizionava in un gruppo intermedio tra i soggetti sani ed il campione E.
I risultati statistici per i gruppi batterici Eu (Eub338 I, Eub338 II, Eub338 III (utilizzati insieme) (Daims H. et al., 1999), mostravano una distribuzione costante, senza differenze significative tra i diversi campioni.
La Tabella 8 mostra i risultati del test ANOVA ad una via per gruppi omogenei sui dati FISH di Eu dopo 6, 24 e 48 ore di fermentazione (log cellule/ml).
Tabella 8
Gruppi
omogenei
6 ore I II Campione FISH
B -0,132923
A -0,061032
C 0,056311
F 0,238798
D 0,336604
E 0,435467
24 ore
A 0,274960
B 0,488056
C 0,496600
F 0,599021
D 0,720836
E 0,825880
48 ore
C -0,197966
B -0,005315
A 0,102244
D 0,265949
F 0,345989
E 0,434101
Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato.
Lo stesso approccio è stato utilizzato per analizzare i risultati degli SCFA (acidi grassi a catena corta). Gli SCFA mostravano in generale una distribuzione discreta dei risultati con gruppi statistici ben definiti e differenze significative. I risultati sono illustrati nelle seguenti Tabelle 9, 10 e 11.
La Tabella 9 mostra i risultati del test ANOVA ad una via per gruppi omogenei dell'acido butirrico dopo 24 e 48 ore; viene indicato l'incremento medio rispetto al controllo negativo (mM) .
Tabella 9
Gruppi
omogenei
24 ore I II III IV V VI Campione SCFA
C 43,3736
A 45,3854
D 52,3644
F 52,3767
E 62,2977
B 174,0981
48 ore
A 43,8577
F 52,9641
E 57,6583
D 61,8410
C 62,4645
B 258,4700
Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato.
La Tabella 10 mostra i risultati del test ANOVA ad una via per gruppi omogenei dell'acido propionico dopo 24 e 48 ore; viene indicato l'incremento medio rispetto al controllo negativo (mM). Per quanto riguarda l'acido propionico, l'aumento era modesto nei campioni dei donatori sani (sia dopo 24 ore che 48 ore), mentre la sua concentrazione aumentava di 23-37 mM nei campioni dei donatori celiaci.
Tabella 10
Gruppi omogenei
24 ore I II III IV V VI Campione SCFA
B -4,30662
A -0,75728
C 0,96521
D 23,15887
E 31,18544
F 32,70900
48
ore
A 0,39286
B 1,71661
C 4,68863
D 22,58833
F 37,1D872
E 37,45659
Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato.
La Tabella 11 mostra i risultati del test ANOVA ad una
via per gruppi omogenei dell'acido butirrico dopo 24 e
48 ore; viene indicato l'incremento medio rispetto al
controllo negativo (mM) .
Tabella 11
Gruppi omogenei
24 ore I II III IV V VI Campione SCFA
C -3, 63255
B -0,38556
A 2,43478
F 4,07283
E 7,59356
D 17,42258
48 ore
A 2,24822
B 4,01809
F 4,27836
C 6,58688
E 10,66568
D 15,03661
Campioni: A, controllo negativo donatori sani; B, donatori sani pane controllo; C, donatori sani pane modificato; D, controlli negativi donatori celiaci; E, donatori celiaci pane controllo; F, donatori celiaci pane modificato.
Dopo 24 ore l'acido butirrico aumentava di 17 mM nel
controllo negativo D, che registrava il maggior
incremento, seguito dagli altri due campioni dei
donatori celiaci (rispettivamente E, 7, 6 mM, ed F, 4, 1
mM) ; i risultati dopo 48 ore mostravano un trend
interessante, in quanto il campione F mostrava un
profilo simile ai campioni dei donatori sani, con un
incremento netto di acido butirrico di 4,28 mM.
Le Figure 15, 16 e 17 mostrano lo studio delle differenze globali relative alle colture in batch provenienti dai donatori sani e celiaci attraverso una analisi delle componenti principali; i risultati degli SCFA e della FISH sono stati tutti utilizzati come input; per ogni tempo di analisi è stata eseguita un'analisi differente. Dopo 6 ore, nello spazio multifattoriale si potevano individuare due gruppi statistici; il primo costituito dai campioni dei soggetti sani (A, B e C) ed il secondo dai campioni E ed F. Il controllo negativo dei donatori celiaci (campione D) era situato in una diversa regione dello spazio (Figura 14).
Dopo 24 ore la distribuzione dello spazio cambiava drasticamente (Figura 15); il gruppo proveniente dai donatori sani si suddivideva in due sottogruppi, perché il campione B si spostava in una regione diversa dello spazio, ma il risultato interessante riguardava il campione F che si spostava dalla regione fattoriale occupata dai campioni dei soggetti celiaci e si spostava verso la regione dei campioni dei soggetti sani A e C. Un effetto simile si rilevava dopo 48 ore (Figura 16).
BIBLIOGRAFIA
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Claims (17)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la detossificazione del glutine dalla granella di cereali, comprendente le seguenti fasi: a) idratazione della granella con acqua fino al raggiungimento di un grado di umidità della granella compresa tra il 15 e il 18%; b) trattamento della granella idratata con le onde elettromagnetiche per un tempo e una potenza tale da raggiungere una temperatura della granella compresa tra 60 e 70<0>C; c) sospensione dell'irraggiamento fino ad una temperatura compresa tra 50 e 60°C e contemporanea evaporazione dell'acqua con perdita di umidità della granella di grado compreso tra il 14 e il 16% rispetto alla fase a); d) trattamento della granella idratata con le onde elettromagnetiche per un tempo e una potenza tale da raggiungere una temperatura della granella compresa tra 80 e 90°C; e) sospensione dell'irraggiamento fino ad una temperatura compresa tra 70 e 80°C e contemporanea evaporazione dell'acqua con perdita dell'umidità della granella di grado compreso tra il 40 e il 44% rispetto alla fase a); f) trattamento della granella idratata con le microonde per un tempo e una potenza tale da raggiungere una temperatura della granella compresa tra 110 e 120<0>C; g) sospensione dell'irraggiamento fino ad una temperatura compresa tra 80 e 90°C e contemporanea evaporazione dell'acqua con perdita dell'umidità della granella di grado compreso tra il 50 e il 60% rispetto alla fase a); h) raffreddamento lento a temperatura ambiente della granella detossificata.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui dette onde elettromagnetiche sono microonde o infrarossi.
  3. 3. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 1 o 2, in cui quando si impiegano microonde le fasi di trattamento della granella idratata avvengono in forno a microonde.
  4. 4. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3, comprendente una ulteriore fase i) di molitura della granella ottenuta nella fase h) per l'ottenimento della farina o della semola detossificata.
  5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, ulteriormente comprendente la fase di estrazione con solventi del glutine dalle farine o semole detossificate ottenute nella fase i).
  6. 6. Metodo secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui i cereali sono scelti tra frumento, orzo, segale o avena.
  7. 7. Granella, farina, semola o glutine detossificati ottenibili mediante il metodo secondo ognuna delle rivendicazioni 1-6.
  8. 8. Prodotto alimentare comprendente granella, farina, semola, o glutine detossificati secondo la rivendicazione 7, scelto tra pane, pasta, prodotti da forno, cereali per prima colazione, birra, gelati, prodotti lattiero caseari, salse, sughi, alimenti per l'infanzia e salumi.
  9. 9. Granella, farina, semola, o glutine detossificati secondo la rivendicazione 7 o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 8, per l'uso in campo medico.
  10. 10. Granella, farina, semola, o glutine detossificati o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 9, per l'uso nella prevenzione o nel trattamento delle disbiosi intestinali.
  11. 11. Granella, farina, semola, o glutine detossificati o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 9, per l'uso nella prevenzione o nel trattamento delle malattie croniche intestinali infiammatorie e autoimmuni, scelte dal gruppo che consiste in malattia celiaca, colite ulcerosa, morbo di Crohn, e sindrome dell'intestino irritabile.
  12. 12. Granella, farina, semola, o glutine detossificati o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 9, per l'uso nella prevenzione o nel trattamento delle malattie sistemiche metaboliche scelte tra obesità, diabete di tipo 1 e diabete di tipo 2.
  13. 13. Granella, farina, semola, o glutine detossificati o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 9, per l'uso come antimicrobico nei confronti di batteri Gramnegativi e Gram-positivi.
  14. 14. Granella, farina, semola, o glutine detossificati o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 13, in cui detti batteri Gram-negativi appartengono al genere Salmonella, preferibilmente alla specie Salmonella Typhimurium e detti batteri Gram-positivi appartengono al genere Staphylococcus, preferibilmente alla specie Staphylococcus aureus.
  15. 15. Granella, farina, semola, o glutine detossificati o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 9, per l'uso come agente protettivo nei confronti di specie probiotiche utili.
  16. 16. Granella, farina, o semola, o glutine detossificati o prodotto alimentare secondo la rivendicazione 15, in cui dette specie probiotiche appartengono al genere Lactobacilli, preferibilmente alla specie Lactobacillus acidophilus.
  17. 17. Uso del glutine detossificato secondo la rivendicazione 7, come addensante per la preparazione di prodotti alimentari.
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MARIA F. MAZZEO ET AL: "Biochemical modifications of gliadins induced by microbial transglutaminase on wheat flour", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - GENERAL SUBJECTS, vol. 1830, no. 11, 1 November 2013 (2013-11-01), pages 5166 - 5174, XP055075842, ISSN: 0304-4165, DOI: 10.1016/j.bbagen.2013.07.021 *

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