CN108697127B - 用于解毒禾谷类谷物的谷蛋白的方法及其在医学领域的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于解毒禾谷类谷物的谷蛋白的改善的方法，这使得可能获得解毒面粉，其谷蛋白毒性表位的抗原性减少直至0到20ppm的范围并且其能够有利地用于制备对消化道生态失调具有明显预防和/或治疗效果的食品(例如面包房产品，意大利面食或乳品)，所述消化道生态失调是由细菌或病毒传染物或者由具有强炎性或自免疫组分的病理学状况比如乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠易激综合征引起的。

Description

用于解毒禾谷类谷物的谷蛋白的方法及其在医学领域的应用
本发明涉及用于解毒禾谷类谷物的谷蛋白的改善的方法，其使得可能获得解毒面粉，其谷蛋白毒性表位的抗原性减少至0到20ppm的范围并且其能够有利地用于制备对消化道生态失调具有明显预防和/或治疗效果的食品(例如面包房产品，意大利面食或乳品)，所述消化道生态失调是由细菌或病毒传染物或者由具有强炎性或自免疫组分的病理学状况比如乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠易激综合征引起的。
谷蛋白是主要由蛋白质构成的食品复合物。醇溶谷蛋白占禾谷类颖果中存在的全部蛋白质级分的大约80％并且基于其在水醇溶液中的溶解度分为麦胶蛋白和麦谷蛋白。可溶于水醇溶液的麦胶蛋白是一般分为α、β、γ和ω(根据电泳淌度)的单体分子，其单体状态是由于不存在半胱氨酸残基(如ω-麦胶蛋白)或是由于仅存在分子内二硫醚键(其余麦胶蛋白)。
麦谷蛋白则是不溶于水醇溶液的聚合复合物，由通过分子间二硫醚桥稳定化的具有高(HMW-GS)和低(LMW-GS)分子量的亚单元构成。
麦胶蛋白和麦谷蛋白向面粉提供技术特性；麦胶蛋白有助于生面团的粘度，而麦谷蛋白则负责其弹性和韧性。
尤其是，麦谷蛋白聚合物的量和尺度与生面团的技术特性正相关。
因此，麦谷蛋白聚合物的这些特征取决于单独组分亚单元形成或多或少扩展的聚合物的能力。
尤其是，谷蛋白并非原样存在于禾谷类颖果中，而是后来才形成；作为蛋白质复合物的谷蛋白在水化和捏合机械作用之后形成，并且其是处理面粉和制备面包的必需要素，原因是其向生面团提供粘度和弹性。
熟知的是，在将水加至面粉的情况下，麦胶蛋白(通过单一蛋白质链形成)开始水合形成原纤维(小细纤维)，其向谷蛋白网格提供伸展性。同时，麦谷蛋白(包含数个蛋白质亚单元)也组装产生网格并形成稳定、高度粘着的结构，其向生面团提供稠度以及对伸展和弹性的一些抵抗。
发酵(leavening)的强度和程度从而取决于在面粉的麦胶蛋白与麦谷蛋白含量之间的比例。两类蛋白质的比率取决于所考虑的禾谷类品种并且向谷蛋白提供变形和抵御伸展的能力。
在机械捏合作用期间，麦胶蛋白原纤维和麦谷蛋白聚合物开始相互缠绕，形成包括淀粉颗粒、脂质、矿物盐、水和空气泡的三维网格，后者对此时加入的酵母的醇发酵很重要，并且其通过产生酒精和二氧化碳决定谷蛋白网格的扩展，所述网格扩展和伸展使得生面团体积增加。随后的烹饪决定蛋白质的变性/凝结，从而谷蛋白失去其伸展能力，不可逆地使得生面团的结构和形状稳定化。
作为蛋白质复合物，谷蛋白并不具有特别的营养特性，原因是其缺少必需氨基酸比如赖氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
膳食中不存在该化合物并不牵涉特定的营养风险。
另一方面，谷蛋白能够发挥毒性活性，尤其是关于肠粘膜的毒性活性；对小麦谷蛋白和对黑麦、大麦和燕麦的相应蛋白质的持久不耐受(比如触发细胞破坏性细胞因子的炎性级联)定义为乳糜泻。
最初，谷蛋白的毒性作用被认为是由麦胶蛋白α级分引起的；随后展示的是，ω麦胶蛋白和麦谷蛋白也能够导致肠粘膜损害，正如相似禾谷类的醇溶谷蛋白比如大麦(大麦胶蛋白)、黑麦(裸麦醇溶蛋白)和燕麦(燕麦蛋白)。
最近感兴趣的是研究α-麦胶蛋白的33个氨基酸的肽(称为33-mer)；所述肽能够抵御消化酶的蛋白水解作用、完整地达到肠粘膜，其中其具有对组织转谷氨酰胺酶的高亲和力，在敏感个体中产生强烈的免疫原性作用；作为肽的毒性表位的脱酰胺化的结果，该作用会取决于释放细胞破坏性炎性细胞因子的CD4T淋巴细胞的强烈活化(Shuppan D.et al.,2009)。
还展示的是，α-麦胶蛋白的其它毒性表位显然能够诱导源自乳糜泻患者肠粘膜外植体的肠上皮细胞的细胞凋亡。
于是，谷蛋白通过触发细胞因子的炎性级联和导致直接毒性效果而对肠粘膜具有有害效果。
大约30％的一般人群携带乳糜泻易感基因HLA-DQ2/8；然而，仅2-5％的这些个体实际上发展出乳糜泻，这表明额外的环境因素有助于该疾病的发展(Rossi M.et al.,2010)。影响乳糜泻发展的额外因素是未知的，但是它们能包括肠微生物丛的变化。实际上，某些研究显示乳糜泻患者具有与健康个体相比改变的粪便和十二指肠微生物丛的定性-定量组成，随后在用不含谷蛋白的膳食处理之后部分恢复。尤其是，最重要的变化涉及具有活跃乳糜泻的儿童和成人中厚壁菌门(Firmicutes)和朊细菌门(Proteobacteria)的量的变化(Sanchez E.et al.,2013；Wacklin P.et al.,2013)。其它研究已报告在具有活跃乳糜泻的患者中具有抗炎效果的保护性细菌比如双歧杆菌属(Bifidobacterium)浓度下降，和革兰氏阴性细菌比如类杆菌属(Bacteroides)和大肠杆菌(Escherichia coli)增加(Collado M.et al.,2009；Collado M.et al.,2008；Di Cagno R.et al.,2011)。
此外，受乳糜泻影响的儿童一般展示葡萄球菌(Staphylococcus spp.)(ColladoM.et al.,2009；Collado M.et al.,2008；Di Cagno R.et al.,2011，梭状芽胞杆菌(Clostridium spp)(Di Cagno R.et al.,2011；De Palma G.et al.,2010)增加和乳杆菌属(Lactobacillus spp)(Di Cagno R.et al.,2011,Sanz Y.et al 2007；Nadal M.etal.,2007)减少。此外，乳糜泻患者展示微生物丛在产生短链脂肪酸(SCFA)方面改变的组成和代谢功能(Di Cagno R.et al.,2011；Schippa S.et al.,2010)。研究展示，受乳糜泻影响的患者中的肠微生物组成与疾病的临床表现有关。在胃肠道症状存在下的患者中的肠菌丛被朊细菌门(Proteobacteria)支配，而在疱疹样皮炎患者或存在消化不良的个体(对照)的微生物丛中则厚壁菌门(Firmicutes)占优势(Wacklin P.et al.,2013)。
迄今，乳糜泻患者的唯一治疗是从膳食中完全排除谷蛋白。所谓"不含谷蛋白的"膳食减轻许多症状，但是研究令人惊讶地表明上述治疗并不能完全恢复健康受试者中存在的微生物丛特征(Wacklin P.et al.,2014)。
显示的是，膳食本身阻止按照普通微生物模型完全恢复。在经历不含谷蛋白的膳食的健康患者中，在革兰氏阳性与革兰氏阴性之间的精细平衡也被打破，其中有用细菌被机会致病菌病原体快速代替。长期结果能够导致免疫防御的减弱和慢性炎症状态。这产生的情况是，乳糜泻患者虽然坚持严格的无谷蛋白膳食但是仍暴露于炎症和感染风险，并且潜在能罹患相当令人不快的症状以及增加健康风险。
益生素在治理乳糜泻中的潜在应用得到一般与乳糜泻有关的消化道生态失调的支持，并且其角色是由于这些潜在有益的有益细菌(也即"益生素")保持肠屏障起作用并且调节免疫系统的先天、适应性应答。图1显示说明乳糜泻发病机理的模型。宿主的特定基因组成和环境因素能促进病理共生体的定殖并减少共生体，由此带来生态失调。生态失调能够有助于破坏肠道的稳态和免疫完整性，从而促进乳糜泻发作和使得发病机理恶化(CenitM.C.et al.,2015)。
基于该假设，迄今已对随机选择的乳糜泻患者进行了三个研究，采用许多干预、用安慰剂作对照、按双盲程序进行。在这些干预中的一种当中，将婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)NLS给予未治疗的乳糜泻患者以评价益生素独立对无谷蛋白膳食的效果。该研究已显示的是，在未治疗的乳糜泻患者中，在给予婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)NLS之后某些胃肠道症状特别是消化不良和便秘的改善。此外，它并未改善腹泻或腹痛的情况，或修饰的肠渗透性或按照某些细胞因子和趋化因子的血清水平度量的促炎性状态(Smecuol E.et al.,2013)。又一干预研究分析了长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CECT 7347在无谷蛋白膳食的乳糜泻儿童中的影响，以便评价这些益生素双歧杆菌是否能改善无谷蛋白膳食的有效性。该研究揭示在给予长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)CECT 7347之后CD3+外周T淋巴细胞的减少和TNF-α血清水平降低的倾向以及粪便中脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)和sIgA的数量与用安慰剂处理的组相比显著降低(Olivares M.et al.,2014)。最近的时长3个月的研究评价了短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)BR03和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)B632菌株的组合与安慰剂相比在无谷蛋白膳食的乳糜泻儿童中的效果。该研究报告的是，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)菌株降低在无谷蛋白膳食的乳糜泻的儿童中促炎性TNF-α细胞因子的产生(Klemenak M.et al.,2015)。
益生素在预防和护理乳糜泻中用作治疗手段的局限在于，它们是微生物从而必须活着达到肠并且必须附着至肠细胞。此外，益生素是定殖可以为暂时的外源微生物并且在前述研究中获得的益生素的适度结果还能够解释为：商业制剂中存在的相对低的细菌数量，并且单独种类可能无法与包含超过40,000种不同种类的无数细菌的肠菌丛竞争。
出于下述需要产生本发明：也即需要能够产生地中海膳食的典型食品比如衍生自小麦的面包和意大利面食，其中存在的谷蛋白不仅是非免疫原性的并且实际上能够强化乳糜泻患者的肠微生物区系，充当有用微生物的保护剂直至微生物丛平衡恢复，其能够用于由弱有用微生物区系所产生的稳态的损失所引起的乳糜泻的预防和饮食治疗。
国际专利申请WO2014/053891描述了方法，用于解毒禾谷类谷物的谷蛋白，使得它们对乳糜泻患者呈非免疫原性并且将毒性表位的抗原性降低至60到40ppm(LamacchiaC.et al.,2016)。
本发明的作者已设计了用于解毒禾谷类谷物的谷蛋白的改善的方法，其旨在获得面粉，所述面粉不仅是解毒的并且其中蛋白质的抗原性进一步降低至0到20ppm，并且在消化道生态失调的预防和治疗性处理中具有治疗效果，所述消化道生态失调是在远为宽泛的患者范围内由作为发炎和/或感染的结果的弱有用微生物区系引起的。尤其是，本发明的作者已鉴定了谷蛋白能够达到的玻璃质转化状态，其借助根据本发明的处理在研磨之前水化的谷物的方法步骤的特定交替：快速的微波加热和蒸发包含于谷物中的游离水和结合水。
更特别地，通过快速微波加热的步骤与缓慢蒸发包含于谷物中的水的步骤的交替，可能解决制备含谷蛋白的面粉的问题，所述面粉除了对乳糜泻患者不呈免疫原性和毒性之外还展示谷蛋白毒性表位的抗原性降低至0到20ppm，并且能够出人意料地和令人惊讶地强化相同乳糜泻患者的有用肠微生物区系，恢复其平衡和预防在许多其它慢性病况中也存在的肠炎症的发作和/或永久化。
于是，通过本发明方法可能产生不同的食品(也即面包制备或面包房产品或意大利面食)，其能够用于预防和饮食治疗由弱益生微生物区系产生的稳态损失所引起的慢性肠炎性病理学状况比如乳糜泻，溃疡性结肠炎，克罗恩病，肠易激综合征。
因此，本发明涉及用于解毒禾谷类谷物的谷蛋白的方法，包括下述步骤：
a)用水将禾谷类谷物水化直至15至18％的谷物湿度；
b)通过电磁波优选微波或红外线处理水化谷物，处理时间和功率足以达到60至70℃的谷物温度；
c)暂停辐射直至达到50至60℃的温度并且同时的水蒸发具有与步骤a)相比14至16％的谷物湿度损失；
d)通过电磁波优选微波或红外线处理水化谷物，处理时间和功率足以达到80至90℃的谷物温度；
e)暂停辐射直至达到70至80℃的温度并且同时的水蒸发具有与步骤a)相比40至44％的谷物湿度损失；
f)通过电磁波优选微波或红外线处理水化谷物，处理时间和功率足以达到110至120℃的谷物温度；
g)暂停微波炉内的辐射直至达到80至90℃的温度并且同时的水蒸发具有与步骤a)相比50至60％的谷物湿度损失；
h)在室温下缓慢冷却解毒的谷物。
前述方法优选用微波进行，更特别用微波炉作为在水化谷物处理的不同步骤中发出所述微波的装置。
另选地，激光装置能够用于发出电磁波。
根据优选实施方式，根据本发明的方法包括额外步骤i)：研磨步骤h)的谷物以获得面粉或粗粒小麦粉。根据备择实施方式，根据本发明的方法包括额外步骤l)：用溶剂(也即氯化钠的水/盐水溶液)从步骤i)的面粉或粗粒小麦粉提取从而获得解毒的谷蛋白。
术语"环境温度"优选意指20℃至25℃的温度范围。
优选，谷物是禾谷类，更优选小麦、大麦、黑麦或燕麦。
在根据本发明的方法的步骤b)、d)、f)中重要的是在谷物内达到的温度，而不是电磁波的功率，其通过包含于谷物中的水允许在短时间内达到高温度。
示于图2的图像展示，微波本身并不决定谷蛋白的结构变化而是决定达到给定温度和湿度条件，尤其是在过程中暂停辐射-水蒸发的最后步骤(步骤g)中，其中谷物的湿度含量达到5-7％而温度达到大约100℃。从图2也很明显的是，仅在该步骤中，谷蛋白不再从谷物内的荧光抗体中完全可辨认。
上文描述的全部步骤是必需的：步骤a)水化谷物至15至18％的湿度使得种子可以蓄积必需的水量，其在热化过程中将电磁波优选微波转化为热能。
水分子能够在电场作用下旋转、振动和排列。在它们的运动中，它们与附近的分子碰撞并且这种分子摩擦导致受辐射物体的加热。
步骤b)用微波的随后辐射使得可以加热样品，其在第一辐射步骤中必须达到60至70℃的温度。湿度越高，则为了达到希望温度而在一定时间间隔内施用的功率必须越低。达到希望温度的时间间隔受待辐射的质量影响。
举例来说：施用750瓦的功率，湿度15-18％的100g谷物在1分钟内达到60-70℃的温度。
于是，湿度与所施用的功率反向相关，而辐射时间直接与待辐射样品的质量成比例。
暂停辐射-蒸发的步骤必须优选在微波炉中进行以允许下述过程：水从谷物最内层转移至周围和从周围转移至表面和从谷物表面转移至外部环境。该过程必须缓慢发生并且不将谷物暴露于用于加热的装置即微波炉的外部温度。这能导致的是，仅蒸发谷物表面的水而并未消除与分子结合的水部分。
辐射和暂停辐射-蒸发的步骤交替重复n次，直至获得谷蛋白的玻璃质转化状态，也即在确定的湿度和温度条件下谷蛋白变得塑性的状态(参见图3)。
各蛋白质具有其自身构象，也即特征的三维形状，其中能够鉴定不同水平的组织。如显示的，一级结构是多肽链中相互通过共价键联接的氨基酸的序列。下一个水平是二级结构，其在一级结构的氨基酸之间建立氢键的情况下形成，导致其扭转。蛋白质的三级结构由位于二级结构不同位点的氨基酸之间的相互作用产生，并且其大部分是由于在二级结构的α螺旋与折叠片层之间的接合片段中的多肽链的折叠。四级结构是多肽链中的两个(称为亚单元)一起结合和相互作用的方式的结果。本发明方法使得谷蛋白可以达到玻璃质转化状态，其中分子不振动、但是由于二级和三级结构的键断裂而移动并且分子变得塑性/橡胶态(Noel T.R.et al.,1995；Micard V.and Guilbert S.,2000)。
尤其是，结合相反电荷基团的氢键和离子键以及使得蛋白质可以保持其二级和三级构象的二硫醚键断裂，使得分子可以在空间中移动，修饰其二级和三级结构。
通过该过程变得塑性的谷蛋白将倾向于以非常规的方式聚集，因为它们在成熟谷物的蛋白体中以天然形式存在(Tosi P.et al.,2011)，如图4所示。图4显示，在用本发明方法处理之后，不仅蛋白质与它们自身的抗体不可辨认，并且蛋白质本身在所处理种子的蛋白体中的团聚相对对照种子来说也是明显的。尤其是，蛋白质并非如已经形成并经受高温的谷蛋白结构中那样通过共价键聚集(图5)(在炉中烹饪生面团，干燥意大利面食；Lamacchia C.et al.,2007；Gerrard J.A.,2000)，而是通过联接相反电荷基团的离子键聚集，所述电荷是在成熟谷物的蛋白体中以天然形式存在的分子二级和三级结构的改变所产生的。图5显示在还原条件下进行的凝胶电泳，其并未显示从对照种子和用本发明方法处理的种子的面粉提取的蛋白质的分子量有任何差异，这表明蛋白质不仅未发生一级结构变化，并且在根据本发明方法热处理之后种子蛋白体中的可视团聚不可能是通过共价、二酪氨酸和/或异肽键作用(Gerrard J.A.,2000；Lamacchia C.et al.,2007；Tilley K.A.etal.,2001)。在该情况下应观察到蛋白质带向更高分子量移动。
因此，在经处理种子的蛋白体中观察到的团聚不可能是共价的，也即并非通过形成共价键而获得。
根据本发明的方法在环境温度缓慢冷却的步骤h)使得分子可以以该非常规团聚状态结晶。
本改善方法的关键点由下述代表：
1)水的使用发挥双重功能。第一是在热化过程中将电磁波优选微波转化为热能。第二是使得谷蛋白可以达到玻璃质转化状态，该状态使得其塑化，缓慢蒸发并且随之还携带部分键合水。
使用微波是特别优选的，原因是它们并不是离子化辐射，它们不能破坏键。于是其唯一功能是让水分子振动和在短时间内产生热。
3)产生热也具有双重功能。其使得游离水和键合水可以蒸发，并且在成熟谷物蛋白体以天然形式封闭的谷蛋白达到蛋白质不振动但移动的状态。
该运动通过氢桥和离子键断裂成为可能，其导致蛋白质本身的二级和三级结构变化，使得它们塑化(图3)。该变化明白地导致蛋白质电荷暴露，对应的事实是该过程处理的谷蛋白变得可溶于水。蛋白质二级和三级结构损失所导致的电荷暴露导致在相同蛋白体中存在的具有不同电荷的蛋白质之间的团聚。图6图示地显示的情况是，在应用本发明方法之前谷蛋白以其天然三维结构封闭在小麦谷物蛋白体中。在应用本发明方法之后，蛋白质达到玻璃质转化状态，变得塑性、失去其三维结构。该变化导致蛋白质电荷暴露，对应的事实是经该过程处理的谷蛋白变得可溶于水。蛋白质二级和三级结构损失所导致的电荷暴露导致在相同蛋白体中存在的不同电荷的蛋白质之间的团聚。可以假设麦胶蛋白(-)+LMW(+)，白蛋白(+)+麦胶蛋白(-)，球蛋白(+)+麦胶蛋白(-)，示于图6描述的图像中。
为了进一步确认上述假设，除了图21小图a)中的解毒过程6个步骤A-F的免疫荧光分析，小图b)通过使用'Image J'软件(http：//imagej.nih.gov/ij)显示上述步骤的图像阈值化分析。小图c)显示各步骤的麦胶蛋白蛋白质级分和在70％EtOH中提取的对照重量面粉(CWF)的SDS-PAGE结果。小图d)显示概览表：得自显微图像步骤分析的相对MGV值(平均灰度值)和光密度(OD)的相对SDS-PAGE表达的麦胶蛋白蛋白质级分的％降低。从小图b)说明的6个步骤A-F的图像分析可能肉眼观察到各步骤中有规律的亮度降低，其是由于0610抗体标记的荧光，其识别麦胶蛋白蛋白质级分和LMW-GS。该降低由小图c)表中报告的平均灰度值分析确认，其中已进行各步骤的比较。各步骤中有规律的和有意义的降低代表蛋白质的结构变化，其不再被抗体识别。降低有规律的原因是各步骤对应温度和湿度值，精确蛋白质类在此开始其结构变化，即从固体"转变"胶状/塑化状态。换言之，各蛋白质类将展示其自身的基于其化学结构的相对玻璃质转变温度(Tg)，在此温度之上聚合物链将自动移动并修饰构象。特别地，在较低温度(50-65℃)即在过程的开始步骤中，白蛋白、球蛋白和LMW蛋白质将首先与HMWs一起遭遇变化(如Lamacchia C.et al.,2007的观察)；在约70℃的温度麦胶蛋白将首先开始改变其结构构象并且将在过程的最终步骤结束(80-90℃)。为了展示该事件，用乙醇从谷物提取的麦胶蛋白的SDS-PAGE分析已在任何步骤过程中进行。尤其是SDS-PAGE分析显示在步骤A至F中的和关于对照的带降低，显示在天然构象中不含有用半胱氨酸残基来构造链间二硫醚键的麦胶蛋白如何由于导致半胱氨酸残基暴露的构象变化而在过程的中间和最终步骤期间牵涉该类型的键。
可能观察到，带降低(OD)与在过程6个步骤期间通过显微技术观察到的亮度降低(MGV)是不可比拟的，从而确认谷蛋白对0610抗体的交叉反应性降低是由于蛋白质构象变化和/或表位覆盖，其是由在过程步骤期间蛋白质间的强烈团聚引起的(如图4所示)，所述团聚是通过相反电荷基团的离子键连接而非通过共价键产生的，所述电荷在随着玻璃质转变的三级结构变化之后发生的(参见图5和21)。
4)缓慢冷却，其允许新蛋白质结构以该新状态保持结晶。
本发明也涉及用根据本发明的方法可获得的已解毒的谷物，面粉或粗粒小麦粉或谷蛋白。面粉或粗粒小麦粉能够是小麦，黑麦，大麦或燕麦并且它们是在额外步骤i)的研磨之后可获得的。谷蛋白能够是小麦，黑麦，大麦或燕麦，其是在额外步骤l)的用溶剂从面粉和/或从粗粒小麦粉提取之后可获得的。
在本发明的上下文中术语"解毒的"在提及面粉或粗粒小麦粉的情况下，意指毒性谷蛋白表位的水平降低至0到20ppm。这使得可能出于法律的全部意图将这些面粉或粗粒小麦粉视为"不含谷蛋白"，尽管其中仍存在谷蛋白。
本发明涉及包含小麦面粉、小麦粗粒小麦粉、大麦或燕麦的食品，其选自面包、意大利面食、面包房产品、早餐谷类和啤酒。
另选地，本发明涉及乳品(也即酸奶，冰激凌，发酵牛奶，奶酪，莫泽雷勒干酪，油脂，奶油，意大利乳清干酪)，能够向其中加入根据本发明方法步骤l)获得的解毒谷蛋白。
尤其是，根据本发明方法步骤l)获得的解毒谷蛋白能够有利地用作制备食品的增稠剂，所述食品不仅是乳品并且还是其它类别的产品比如冷切食品、冰激凌、婴儿食品、酱料和汁液。因此，所述食品也包括在本发明的保护范围内，因为它们期望用于需要不含谷蛋白的或低乳糖的膳食的那些个体的群体。
简言之，第一优势是从按照本发明方法制备的粗粒小麦粉和面粉可能产生用于乳糜泻患者的食品，其具有降低至0到20ppm的毒性谷蛋白表位抗原性，具有与地中海膳食一般使用的那些味道和外观相当的感官特征，但是还治疗乳糜泻患者的肠微生物区系，恢复其平衡并保护它，和强化有用的微生物区系。
因此，本发明还涉及解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉或谷蛋白或基于它们之一的或补充了它们之一的食品，其用于医学领域以预防或治疗消化道生态失调。
第二优势是从这样制备的谷物、粗粒小麦粉、面粉或谷蛋白，可能产生用于全部那些病理学状况的饮食治疗的食品，在所述病理学状况中肠微生物丛的改变增加对炎性和/或自免疫性的慢性肠病发展出易感性的风险，所述病理学状况的非全面实例选自乳糜泻，溃疡性结肠炎，克罗恩病，和肠综合征，以及全身性代谢病比如肥胖、I型糖尿病或II型糖尿病。
根据本发明的额外实施方式，这些解毒的面粉和粗粒小麦粉，或解毒的谷蛋白或通过它们的应用获得的食品，能够有利地用作益生微生物比如属于乳杆菌属(Lactobacilli)的那些例如嗜酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)(尤其是如果加入用于乳糖不耐受患者的乳品中)的保护剂和/或关于革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌的抗微生物剂。优选，所述革兰氏阴性细菌属于沙门氏菌属(Salmonella)，更优选属于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)而所述革兰氏阳性细菌属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，更优选属于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)种类。
本发明现将通过非限制性示例描述，基于下述实例中和附图中指出的结果，其中：
-图1显示乳糜泻(MC)发病机理的示例性图解。
-图2显示小麦切片(1μM)，涉及在用抗体06010标记之后的处理方法步骤，所述抗体识别麦胶蛋白和低分子量麦谷蛋白(LMW-GS)的蛋白部分。小图A：步骤b；小图B：步骤c；小图C：步骤d；小图D：步骤e；小图E：步骤f；小图F：步骤g，属于根据本发明的方法。
-图3代表在根据本发明方法热处理之前和之后的蛋白质结构。
-图4显示小麦切片(1μm)，对照和在本发明方法处理之后。(1)对照小麦切片，具有非均质的蛋白基质(Pb 1)；(2)在处理之后的小麦切片，具有均质和汇合的蛋白基质(Pb2)。应用于6个不同种子(每种子4个切片)的无参数Friedman检验探测到在对照种子中和在处理之后的样品种子中两类蛋白体(Pb1和Pb2)之间的高度显著差异。
-图5显示蛋白质级分的提取和通过SDS-PAGE分离，在还原条件下进行。道1，从来自对照种子的面粉提取的麦胶蛋白，其并未进行本发明的热处理；道2，从来自用本发明方法处理的种子的面粉提取的麦胶蛋白；道3，从来自对照种子的面粉提取的HMW-GS和麦胶蛋白，其并未进行本发明的热处理；道4，从来自用本发明方法处理的种子的面粉提取的HMW-GS和麦胶蛋白；道5，从来自对照种子的面粉提取的麦谷蛋白，其并未进行本发明的热处理；道6，从来自用本发明方法处理的种子的面粉提取的麦谷蛋白；道7，从来自对照种子的面粉提取的总蛋白质，其并未进行本发明的热处理；道8，从来自用本发明方法处理的种子的面粉提取的总麦谷蛋白。
-图6显示假设，其关于在相同蛋白体中存在的且具有不同电荷的蛋白质之间的团聚。
-图7显示ELISA测试的概览直方图，使用单克隆抗体R5Ridascreen麦胶蛋白，在对照面粉和在根据国际专利申请WO2014/053891的方法处理之后的样品上进行，与本发明方法比较。
-图8显示对照小麦(对照小麦)和在本发明描述的方法处理之后(处理小麦)的切片，其横向切割和通过SEM-Immunogold检查，用0610抗体和γ-麦胶蛋白免疫标记。1.用0610抗体标记的对照小麦；2.在用抗体抗γ-麦胶蛋白标记之后的对照小麦；3.用0610抗体标记的处理小麦；4.用抗体抗γ-麦胶蛋白标记的处理小麦。图中的箭头代表通过EDS分析(能量散射光谱)检测的银颗粒(AgNp)。
-图9显示对照(对照小麦)和在根据本发明方法处理之后(处理小麦)的小麦切片(1μm)，用0610抗体、HMW-G和γ-麦胶蛋白标记。1.用0610抗体标记的对照小麦；2.用γ-麦胶蛋白抗体标记之后的对照小麦；3.用抗体HMW-GS标记的对照小麦；4.用0610抗体标记的处理小麦；5.用抗体γ-麦胶蛋白标记之后的处理小麦；6.用抗体HMW-GS标记之后的处理小麦。
-图10显示比色分析，用在对照种子和在处理之后种子的切片中缀合的单克隆抗体R5-HRP进行。1.对照种子的子糊粉；2.在根据本发明方法处理之后的种子的子糊粉；3.对照种子的皱褶；4.在根据本发明方法处理之后的种子的皱褶。图中的条对应100μm。
-图11显示在加入对照面包和处理面包(0.8g/l)之后嗜酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)在盐水溶液中死亡的动力学分析。线代表通过Weibull分布的最佳拟合。
-图12显示金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在盐水溶液中生命计数，加入对照面包或处理面包(0.2、0.4或0.8g/l)。平均值±标准偏差。符号"＊"和"＊＊"指出显著差异(单向ANOVA和Tukey检验)。
-图13显示沙门氏菌属(Salmonella sp.)在盐水溶液中的生命计数，加入0.8g/l的对照面包或处理面包。平均值±标准偏差。
-图14显示主要组分分析，涉及在6小时发酵之后的SCFA和FISH结果。小图A)变量的投影；小图B)情况的投影。样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，乳糜泻供体的阴性对照；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。变量：1，Bif164；2，Erec482；3，Bac；5，lab158；AC：乙酸；BUT：丁酸；PROP：丙酸。
-图15显示主要组分分析，涉及在24小时发酵之后的SCFA和FISH结果。小图A)变量的投影；小图B)情况的投影。样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，乳糜泻供体的阴性对照；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。变量：1，Bif164；2，Erec482；3，Bac；5，lab158；AC：乙酸；BUT：丁酸；PROP：丙酸。
-图16显示主要组分分析，涉及在48小时发酵之后的SCFA和FISH结果。小图A)变量的投影；小图B)情况的投影。样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，乳糜泻供体的阴性对照；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。变量：1，Bif164；2，Erec482；3，Bac；5，lab158；AC：乙酸；BUT：丁酸；PROP：丙酸。
-图17显示从模型系统的三个不同容器(V1、V2和V3)的培养肉汤获得的细菌组，其模拟在健康志愿者中加入(A)对照面包和(B)处理面包之前(SS1)和之后(SS2)的结肠部分。结果报告为两个模型系统的数据平均值±SEM(n＝2)。
-图18显示从模型系统的三个不同容器(V1、V2和V3)的培养肉汤获得的细菌组，其模拟在(A)健康患者和(B)乳糜泻患者中加入处理面包之前(SS1)和之后(SS2)的结肠部分。结果报告为两个模型系统的数据平均值±SEM(n＝2)。
-图19显示从模型系统的三个不同容器(V1、V2和V3)的培养肉汤获得的短链脂肪酸SCFA，其模拟在健康志愿者中加入(A)对照面包和(B)处理面包之前(SS1)和之后(SS2)的结肠部分。结果报告为两个模型系统的数据平均值±SEM(n＝2)。
-图20显示从模型系统的三个不同容器(V1、V2和V3)的培养肉汤获得的短链脂肪酸SCFA，其模拟在(A)健康患者和(B)乳糜泻患者中加入处理面包之前(SS1)和之后(SS2)的结肠部分。结果报告为两个模型系统的数据平均值±SEM(n＝2)。
-图21，小图a)显示相对在缀合0610抗体之后的处理步骤的软小麦切片(1μm)，所述抗体识别麦胶蛋白和LMW-GS的蛋白级分。(A)步骤b；(B)步骤c；(C)步骤d；(D)步骤e；(E)步骤f；(F)步骤g；小图b)显示上述步骤的图像阈值化分析，通过应用Image J软件；小图c)显示麦胶蛋白和在70％EtOH中提取的有关重量对照面粉(CWF)的蛋白级分的SDS-PAGE分析。(A)步骤b的麦胶蛋白；(B)步骤c的麦胶蛋白；(C)步骤d的麦胶蛋白；(D)步骤e的麦胶蛋白；(E)步骤f的麦胶蛋白；(F)步骤g的麦胶蛋白；小图d)说明相对得自显微技术图像步骤分析的MGV值(平均灰度值)和光密度(OD)的相对SDS-PAGE表达的麦胶蛋白蛋白级分的％降低的概览表。
实施例
实施例1：在用根据本发明的方法处理之后谷蛋白抗原性的降低
在对小麦谷物进行根据本发明的解毒方法之后，面粉上谷蛋白毒性表位的抗原性的降低用官方方法测试(用抗体R5的ELISA测试)，所述方法被隔绝耳(barred ear)实验室用来识别期望用于乳糜泻患者的面粉和产品中的谷蛋白。
尤其是，通过醇溶液从面粉提取预先用Mendez混合物变性的谷蛋白，并根据R5夹心ELISA方法测试(参见图7)，采用识别被发现在谷蛋白中重复的毒性肽序列QQPFP的单克隆抗体R5。图7，(小图A)显示用R5 Ridascreen麦胶蛋白的ELISA测试的概览直方图，采用国际专利申请WO2014/053891描述的方法处理的样品，与本发明方法比较(小图B)。偶然地，用国际专利申请WO2014/053891描述的方法处理的来自谷物的面粉样品展示毒性表位QQPFP抗原性的降低，范围是60至40ppm(小图A，图7；Lamacchia C.et al.2016)。与之相对，用本发明方法处理的来自谷物的面粉则显示毒性表位抗原性的显著降低，低至13.83±7.22ppm，使得这些面粉可以出于法律的全部意图被视为"不含谷蛋白的"面粉，尽管其中仍存在谷蛋白。
根据本发明改善禾谷类谷物谷蛋白的解毒在于谷蛋白毒性表位的抗原性降低至0到20ppm，使其对乳糜泻患者显著更为安全。该降低是不可能通过国际专利申请WO2014/053891的方法实现的，原因是在该方法中微波步骤持续120秒、随后在环境温度缓慢冷却，这并未确保蛋白质完全修饰为塑性形式；而根据本发明描述的方法步骤则其完全实现。
根据本发明的方法诱导的变化使得谷蛋白抗原性降低成为可能，从而它们甚至不再能够被其本身的抗体识别。为了将其展示，将对照种子(CWS)和处理种子(TWS)的三份样品横向切割，并通过Immunogold(图8)、免疫荧光(图9)和比色显微技术(图10)检查，采用麦胶蛋白级分的三种特异性单克隆抗体：
-IFRN 0610：识别许多麦胶蛋白的共同表位(QQSF)的单克隆抗体；
-LMW-GS：识别γ麦胶蛋白级分中存在的重复区域(PEQPFPQGC)的鼠单克隆抗体；
-R5：识别谷蛋白中重复存在的高毒性序列QQPFP的单克隆抗体R5。
图8显示对照小麦(对照)和在根据本发明的方法处理之后的小麦(处理)的横向切割的切片，并且通过SEM-Immunogold检查，用0610抗体和γ-麦胶蛋白免疫标记。用Student's T检验来比较从5个切片获得的值，所述切片来自5个不同对照和处理种子。对所述2类抗体观察到的差异被发现是高度显著的(p<0.001)。对于抗体0610，处理种子与对照种子相比获得89％的降低，而与抗体γ-麦胶蛋白相比获得87.5％的降低。
图9显示对照(对照)和在根据本发明方法处理之后(处理)的小麦切片(1μm)，用0610抗体、HMW-G和γ-麦胶蛋白标记。用Imagej软件分析三份不同样品(各种子3个切片)，其来自对照种子和在处理之后的种子的样品。对于各图像，将其转化为灰度等级，获得各自的MGVs(平均灰度值)。对于0610抗体，在处理的种子中观察到与对照种子相比91.7％的降低并且观察到与抗体γ-麦胶蛋白相比90.6％的降低。此后，进行双向Anova检验，采用两类变量的分解假设(样品类型和处理类型)。在所分析的参数中，种子经历的处理类型是最重要的因素。发现所获得的数据是高度显著的(p<0.001)。
图10显示用单克隆抗体R5-HRP进行的比色分析，其缀合在对照种子和在处理之后的种子的切片中。用Imagej软件分析三份不同样品(各种子3个切片)，其来自对照种子和在处理之后种子的样品。对于各图像，将其转化为二进制格式的灰度等级，获得各自的MGVs(平均灰度值)。与对照种子相比，在处理之后的种子中在子糊粉区域水平观察到89.2％的降低，而在褶皱水平观察到82％的降低。此后进行双向Anova检验，采用两种变量的分解假设(样品类型和处理类型)。在分析的参数中，种子经历的处理类型是最重要的因素。发现所获得的数据是高度显著的(p<0.001)。
实施例2：体外研究：用根据方法处理的面粉制备的消化面包关于嗜酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)的保护性效果以及关于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的抗微生物效果。
如下表1所示进行两个不同系列的实验。
尤其是，向生理学溶液的等分试样(NaCl 0.9％)(50ml)补充对照面包或面包(其面粉衍生自研磨用上述方法修饰谷蛋白的种子)的不同等分试样，根据Maccaferri S.etal.(2012)描述的程序在适当条件下体外消化，脱水，和于8log ufc/ml接种；然后分析样品以周期地评价生命计数：在MRS琼脂(嗜酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis))或TSA(病原体)上平板接种，在37℃温育2-4天。在厌氧条件下分析乳酸细菌。
表1
Figure BDA0001696978080000181
表2显示嗜酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)死亡动力学的Weibull分布的适应性参数(平均值±标准值)。对于各参数，字母指出显著差异(ANOVA和Tukey检验，P<0.05)。死亡动力学显示向下的曲线，其形状参数>1。
表2
Figure BDA0001696978080000182
Figure BDA0001696978080000191
在对照面包中和处理面包中加入盐水溶液均对曲线形状无影响。另一方面，面包类型对细菌群体的死亡动力学有显著效果，在使用采用面粉制备的面包的情况下其于0.4g/l从67.46延长至80.53和于0.8g/l从70.28延长至93.96，所述面粉来自用上述方法处理的种子。
用面粉(其种子用预先描述的方法处理)制备的面包对死亡动力学有效果但对形状参数无效果的原因是在死亡曲线的最末部分可能的死亡率降低，其展示为在加入对照面包和处理面包(0.8g/l)之后嗜酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)在盐水溶液中的死亡动力学，示于图11。各线代表通过Weibull公式的最佳拟合。
进行第二试验来确定处理面包的浓度是否能导致或产生对嗜酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和对动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)的有害效果；以用于第一实验的量(0.8g/l)和更高的浓度(5.0g/l)加入盐水溶液从而模拟面包由于在肠中缓慢通过的局部增加。生命计数不受消化面包的浓度影响而死亡动力学显示与图11所示相似的趋势。
最后，给盐水溶液接种革兰氏阳性或革兰氏阴性病原物(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的结果示于图12，其显示加入对照面包或处理面包(0.2、0.4或0.8g/l)的盐水溶液中的生命计数。平均值±标准偏差。符号"＊"和"＊＊"鉴定显著差异(单向ANOVA和Tukey检验)。
对于加入0.8g/l用面粉(其种子根据描述的方法处理)制备的面包的样品观察到显著差异，与加入对照面包的样品相比其显示低1-log的生命计数速率。在沙门氏菌属(Salmonella sp.)存在下，在相同样品中在7天之后观察到3-log的降低，而对照面包确定1-log的降低(图13)。
实施例3：研究：在模拟结肠远端部分的模型系统中，恢复乳糜泻患者肠菌丛平衡的治疗效果。
评价对照面包和面粉(其种子根据本发明方法处理)制备的面包，在批料发酵培养物中进行(pH受控的模型系统，其模拟结肠远端部分以允许研究单一化合物或纤维的效果)。
粪便样品得自三位健康人类志愿者(两位男性、一位女性，年龄30至38岁；BMI：18.5-25)，其未患已知代谢性和胃肠道疾病(例如糖尿病，溃疡性结肠炎，克罗恩病，肠易激综合征，消化性溃疡和癌症)。向全部健康供体给予标准问卷以收集有关健康状况、药物使用、临床既往症，和在供体被要求提供粪便样品之前的生活方式的信息。对于乳糜泻供体(两位女性、一位男性，年龄30至38；BMI 18.5-25)，在各情况下获得书面知情同意并且研究由the Research Ethics Committee of the University of Reading,UK批准(UREC 15/20:为人类结肠体外模型系统供给的粪便样品收集中心)。收集自健康供体和乳糜泻供体的全部粪便样品是就地收集的，保存在厌氧箱中(10％H2-10％CO2-80％N2)和在收集之后不晚于15分钟使用。将样品稀释1:10(w/v)于厌氧PBS溶液(0.1M磷酸缓冲溶液，pH 7.4)和匀化2分钟。
向在批料培养中用于培养物发酵的预灭菌容器(280ml)中填充45ml结肠的模型复合物生长培养基(Tejero-Sarinena S.,et al.,2012)。
此后，将容器连接至于37℃的循环水浴，注射贫O2的N2气以使其在接种之前厌氧。用NaOH或HCl溶液将pH缓冲至6.7和6.9，使用pH-计(Electrolab260；Electrolab Ltd，Tewkesbury，United Kingdom)。然后向培养基加入5ml如上述制备的粪便匀化物和1ml消化面包。
对于各供体，制备3个不同容器：
-阴性对照(其中未加入消化面包)对于健康受试者称为A而对于乳糜泻受试者称为D；
-加入对照面包的容器对于健康受试者称为B而对于乳糜泻受试者称为E；
-加入用面粉(其种子用上述方法处理)制备的面包的容器对于健康受试者称为C而对于乳糜泻受试者称为F。
分析批料培养物48小时，在接种时和在6、24和48小时之后抽取必需的样品，通过荧光原位杂交(FISH)评价微生物丛并用高效液相色谱(HPLC)确定短链脂肪酸(SCFA)。图14、15和16显示主要组分分析的结果，涉及在发酵6、24和48小时之后SCFA和FISH的结果。
得自FISH和SCFA实验的结果被标准化为相对阴性对照t0(接种)的增加/减少，以排除供体类型带来的可变性；因此，结果显示相对实验开始的系统调节并且应理解为微生物群体的或微生物代谢产物的增加(正值)或减少(负值)。增加/减少参照阴性对照的接种(log细胞/ml)。
此外，通过ANOVA检验分析各参数以鉴定显著差异；将使用同质性组的途径用作额外手段来建立随时间的可能趋势。下表3显示在6、24和48小时发酵之后双歧杆菌的FISH数据的同质性组单向ANOVA检验的结果。
表3
同质性组
6小时 I II III
样品 FISH
E 0.147100 ＊＊＊＊
F 0.264242 ＊＊＊＊
D 0.489640 ＊＊＊＊
B 0.604836 ＊＊＊＊
A 0.632162 ＊＊＊＊
C 0.700706 ＊＊＊＊
24小时
E 0.371967 ＊＊＊＊
F 0.490137 ＊＊＊＊
D 0.507300 ＊＊＊＊
A 0.716912 ＊＊＊＊
B 0.734684 ＊＊＊＊
C 0.909206 ＊＊＊＊
48小时
E 0.273558 ＊＊＊＊
A 0.654479 ＊＊＊＊
F 0.681301 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
D 0.707120 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
B 0.715355 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
C 0.925907 ＊＊＊＊
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包
样品之间的差异在6小时之后或在24小时之后并不显著。与之相反，在48小时之后观察到两个统计学组：第一组仅由样品E组成(乳糜泻供体+对照面包)而第二组由全部其它样品组成。
样品E并未展示双歧杆菌群体的任何显著增加(增加0.27-log细胞/ml)，这可能是由于面包对微生物区系所产生的负面效果，而其它样品中产生0.7至0.9log细胞/ml的增加。实际上，有意义的数据在于样品F与健康受试者样品同属一组，这意味着用面粉(其种子已用上述方法处理)制备的面包的有益效果，能够恢复双歧杆菌群体中的普通趋势。
表4和5显示在6、24和48小时发酵之后涉及细菌组Erec482(Franks A.H.et al.,1998)、Bac303(Manz W.et al.,1996)的FISH数据(log细胞/ml)的同质性组单向ANOVA检验结果。采用期望用于16S RNA特定区域(Langendijk P.S.et al.,1995)的合成寡核苷酸探针鉴定细菌组，所述探针是用荧光染料Cy3标记的，如probeBase(http://www.microbial-ecology.net/probebase)中所报告。
表4
Figure BDA0001696978080000221
Figure BDA0001696978080000231
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。
表5
同质性组
6小时 I II III IV
样品 FISH
A -0.094164 ＊＊＊＊
D -0.043412 ＊＊＊＊
E 0.080924 ＊＊＊＊
B 0.106672 ＊＊＊＊
C 0.133569 ＊＊＊＊
F 0.176720 ＊＊＊＊
24小时
D -0.189282 ＊＊＊＊
E -0.172388 ＊＊＊＊
F 0.028873 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
A 0.414786 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
B 0.433302 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
C 0.636738 ＊＊＊＊
48小时
B -0.330564 ＊＊＊＊
F -0.313381 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
E -0.307379 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
D -0.193349 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
C -0.110862 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
A -0.034976 ＊＊＊＊
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。
统计学分析展示样品的连续分布，具有2-4个重叠的同质性组，取决于时间和微生物类型。样品的统计学分布随时间变化；然而，生命计数的增加/减少(-0-33-0,26log细胞/ml)的绝对值大小适中。加入面包对细菌组Chis150(Franks A.H.et al.,1998)的效果示于下表6。
表6
同质性组
6小时 I II III
样品 FISH
B -0.266858 ＊＊＊＊
A -0.180315 ＊＊＊＊
C -0.103523 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
D 0.153936 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
F 0.171644 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
E 0.316956 ＊＊＊＊
24小时
C -0.162934 ＊＊＊＊
F -0.120933 ＊＊＊＊
A -0.083551 ＊＊＊＊
B -0.030945 ＊＊＊＊
E 0.072539 ＊＊＊＊
D 0.096110 ＊＊＊＊
48小时
A -0.305986 ＊＊＊＊
C -0.234457 ＊＊＊＊
B 0.060428 ＊＊＊＊
D 0.166901 ＊＊＊＊
F 0.190838 ＊＊＊＊
E 0.216414 ＊＊＊＊
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。
在6小时之后，观察到样品的连续分布，具有2个明确界定的组(1st组包括A和B样品；2nd组包括样品E)和中间类别(样品C，D，F)。最后，样品E(乳糜泻供体+对照面包)并不在统计学上不同于样品D和F(阴性对照和乳糜泻供体+"处理"面包)也在统计学上不同于健康供体的样品。然而，在样品F和D中观察到向样品C的统计学位移。该变化在24和48小时之后并未观察到。乳酸菌展示随时间的特征趋势，示于下表7，其说明在6、24和48小时发酵之后Lab 158的FISH数据(log细胞/ml)的同质性组单向ANOVA检验的结果。
表7
同质性组
6小时 I II III
样品 FISH
F -0.639714 ＊＊＊＊
E -0.565338 ＊＊＊＊
D -0.327822 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
C -0.122414 ＊＊＊＊
A 0.001010 ＊＊＊＊
B 0.038547 ＊＊＊＊
24小时
E -0.591904 ＊＊＊＊
F 0.014006 ＊＊＊＊
D 0.015039 ＊＊＊＊
A 0.165791 ＊＊＊＊
C 0.267343 ＊＊＊＊
B 0.288811 ＊＊＊＊
48小时
E -0.526397 ＊＊＊＊
D -0.289074 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
F -0.022714 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
A 0.135032 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
B 0.188054 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
C 0.304061 ＊＊＊＊
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。
在6小时发酵之后，在样品E和F的乳酸菌群体中观察到降低(0.57-0.64log细胞/ml)。在24小时之后，在样品E中但未在样品F中观察到该负面趋势，在样品F中乳酸菌群体增加并显示与健康受试者相似的趋势，这指出用谷蛋白修饰面粉制备的面包的有意义且有益的效果。
在48小时之后，它们的分布是连续的；尤其是，样品F位于在健康受试者与样品E之间的中间组中。
细菌组Eu(Eub338I，Eub338II，Eub338III(一起使用)(Daims H.et al.,1999)的统计学结果显示恒定分布，不同样品之间不存在显著差异。
下表8显示在6、24和48小时发酵之后Eu的FISH数据(log细胞/ml)的同质性组单向ANOVA检验的结果。
表8
同质性组
6小时 I II
样品 FISH
B -0.132923 ＊＊＊＊
A -0.061032 ＊＊＊＊
C 0.056311 ＊＊＊＊
F 0.238798 ＊＊＊＊
D 0.336604 ＊＊＊＊
E 0.435467 ＊＊＊＊
24小时
A 0.274960 ＊＊＊＊
B 0.488056 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
C 0.496600 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
F 0.599021 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
D 0.720836 ＊＊＊＊
E 0.825880 ＊＊＊＊
48小时
C -0.197966 ＊＊＊＊
B -0.005315 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
A 0.102244 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
D 0.265949 ＊＊＊＊ ＊＊＊＊
F 0.345989 ＊＊＊＊
E 0.434101 ＊＊＊＊
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。
用相同途径来分析SCFA(短链脂肪酸)的结果。SCFA一般显示结果的离散分布，具有明确界定的统计学组和显著的差异。结果说明于下表9、10和11。
表9显示在24和48小时之后丁酸的同质性组单向ANOVA检验；指出与阴性对照相比的平均增加(mM)。
表9
同质性组
24小时 I II III IV V VI
样品 SCFA
C 43.3736 ＊＊＊＊
A 45.3854 ＊＊＊＊
D 52.3644 ＊＊＊＊
F 52.3767 ＊＊＊＊
E 62.2977 ＊＊＊＊
B 174.0981 ＊＊＊＊
48小时
A 43.8577 ＊＊＊＊
F 52.9641 ＊＊＊＊
E 57.6583 ＊＊＊＊
D 61.8410 ＊＊＊＊
C 62.4645 ＊＊＊＊
B 258.4700 ＊＊＊＊
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。
表10显示在24和48小时之后丙酸的同质性组单向ANOVA检验；指出与阴性对照相比的平均增加(mM)。
有关丙酸，其在健康供体样品中的增加较小(在24小时和48小时之后)，而在乳糜泻供体样品中其浓度增加23-37mM。
表10
Figure BDA0001696978080000271
Figure BDA0001696978080000281
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。
表11显示在24和48小时之后丁酸的同质性组单向ANOVA检验；指出与阴性对照相比的平均增加(mM)。
表11
Figure BDA0001696978080000282
样品：A，阴性对照健康供体；B，健康供体+对照面包；C，健康供体+处理面包；D，阴性对照乳糜泻供体；E，乳糜泻供体+对照面包；F，乳糜泻供体+处理面包。
在24小时之后，在阴性对照D中丁酸增加17mM，这记录最大增加，随后是其它两种乳糜泻供体样品(分别是E中7.6mM和F中4.1mM)；在48小时之后的结果显示有意义的趋势，原因是样品F显示与健康供体样品相似的特征，具有4.28mM的丁酸净增加。
图15、16和17显示通过主要组分分析研究来自健康供体和乳糜泻供体的批料培养物的全局差异；SCFA的结果和FISH的结果全部用作输入；对于每一次分析，进行不同的分析。
在6小时之后，在多因素空间中能鉴定出两个统计学组：第一个由健康受试者样品(A、B和C)组成而第二个是样品E和F。
乳糜泻供体的阴性对照(样品D)位于空间的不同区域(图14)。
在24小时之后，空间分布剧烈变化(图15)；来自健康供体的组分裂为两个亚组，原因是样品B位移至空间的不同区域，但是有意义结果牵涉样品F，其从乳糜泻受试者样品占据的因子区域移出并且向健康受试者A和C样品的区域移动。在48小时之后观察到相似效果(图16)。
实施例4：在模拟结肠近端、横贯和远端部分的模型系统中，研究在健康患者和乳糜泻患者中改善肠菌丛组成和代谢的治疗效果。
对照面包和处理面包(其谷物已根据本发明的谷蛋白表位解毒方法处理)的效果已评价，在模拟人结肠近端、横贯和远端部分的三步连续发酵培养物中进行(分别是容器1、2和3)。
粪便样品得自两位健康志愿者和两位乳糜泻志愿者(年龄30至50岁的男性和女性；BMI：18,5-25)，其未患已知的代谢疾病或胃肠道疾病(比如糖尿病，溃疡性结肠炎，克罗恩病，过敏性结肠综合征，消化性溃疡和癌症)，其在移植粪便样品之前6个月并未服用任何益生素或益生元补充以及抗生素。
在要求粪便样品之前，将标准问卷提供给健康供体以收集健康状态、药物服用、病史和生活方式信息。研究已由The University of Roehampton Research EthicsCommittee(UREC 15/20)批准。
粪便样品储存在厌氧罐(AnaeroJarTM 2,5L,Oxoid Ltd)中，其包括气体再生试剂盒(AnaeroGenTM，Oxoid)以便在室内产生厌氧条件。将20g等分试样的各样品稀释于100ml厌氧PBS溶液(0.1M磷酸溶液，pH 7.4，w/w)中并匀化2分钟(Stomacher 400,Seward,WestSussex,UK)。
在其制备的15分钟内将样品加入厌氧发酵罐。理化结肠条件在三步连续系统中重复，所述系统具有渐增体积且串联的三个玻璃发酵罐。在该研究中首次使用小规模形式的Macfarlane et al.(1998)验证的系统，其中结肠的近端部分由容器1(V1，80ml)代表，结肠的横贯部分由容器2(V2，100ml)代表，而远端部分由容器3(V3，120ml)代表，在生长培养基中接种20％(w/v)健康志愿者和乳糜泻志愿者的粪便匀化物。生长培养基含有下述成分：淀粉，5g/l；粘蛋白，4g/l；酪蛋白，3g/l；胨水，5g/l；胰蛋白胨水，5g/l；胆汁盐，0.4g/L；酵母提取物，4.5g/l；FeSO4，0,005g/l；NaCl，4.5g/l；KCl，4.5g/l；KH2PO4，0.5g/l；MgSO4x7H2O，1.25g/l；CaCl2x 6H2O，0.15g/l；NaHCO3，1.5g/l；吐温80，1mL；氯化高铁血红素，0.05g/l；和半胱氨酸HCl，0.8g/l。
在接种之后，将细菌群体作为批料培养物稳定化24小时。在24小时之后(T0)，模型系统运行8个完整体积循环以使得可以实现稳态(SS1)(通过SCFA特征的稳定化证实(+/-5％))。
考虑到模型系统的工作体积(300ml)和保留时间(48小时，流速6.25ml/hr)，根据Maccaferri S.et al.(2012)公开的程序在适宜条件下体外消化的对照或处理面包(3.75ml)每日加入容器V1当中。将面包加入系统，再进行8个完整体积循环直至实现稳态2(SS2)。
移除4.5mL等分试样并在SS1(T0日)和SS2(T30日)分析。
在模拟三部分结肠的模型系统中细菌组成的变化已通过FISH分析来评价(图17和18)，而微生物区系代谢的变化已通过用高效液相色谱(HPLC)测定短链脂肪酸(SCFA)来评价(图19和20)。
图17描述的对照面包对健康志愿者的效果结果显示乳杆菌属/肠球菌属(Lactobacillus/Enterococcus spp.)(通过探针Lab158检测)(容器V1和V2)，类杆菌属(Bacteroides)-普雷沃氏菌属(Prevotella)组(V2)(通过探针Bac303检测)和梭状芽胞杆菌(Clostridium)集群XIVa+b(V1)(通过探针Erec482检测)数量有意义的减少。
在模型系统的全部步骤已观察到总细菌减少趋势，即使这种差异并未如此显著产生。那么，对照面包对粪便微生物区系的调节和组成并无正面影响。
与之相反，给予根据本发明方法处理的面包导致双歧杆菌在乳糜泻志愿者和健康志愿者中均显著增加(通过探针Bif164检测)。
特别地，在乳糜泻受试者中已分别观察到双歧杆菌在模型系统的第2步(容器2)中从8.42至8.90Log CFU/ml的显著增加(P<0.05)以及在容器3中从8.60至9.20Log CFU/ml的显著增加(P<0.05)。
在健康受试者中，已观察到在容器3中双歧杆菌数量从7.90至8.40Log CFU/ml的显著增加(P<0.05)(图18)。
另外，在乳糜泻志愿者中已分别观察到在全部容器中梭状芽胞杆菌(Clostridium)集群从8.85至9.50Log CFU/ml(P<0.05)；从9.1至9.60Log CFU/ml(P<0,01)和从9至9.50Log CFU/ml(P<0.05)的显著增加。
在全部细菌组中和在全部容器中的总体增强趋势在健康和乳糜泻受试者均已被检测到，无任何显著差异。
在模型系统的全部三个不同容器中SCFA已在SS1和SS2通过HPLC测量(图19和20)。在全部容器中，给予对照面包诱导乙酸(V1和V2)和丙酸酯(V1)的显著降低，和丁酸的增加(图19)。
在健康受试者中，处理面包的发酵分别导致在V1中从28.80至22.10mM(P<0.01)，在V2中从44.40至56.94mM(P<0.01)和在V3中从46至76.50mM(P<0.001)的显著乙酸产生。另外已观察到，在V1中从70.46至89.81mM(P<0.05)的显著丙酸浓度增加，和在V3中40.35至77.09mM(P<0.05)的显著丁酸浓度增加。在乳糜泻志愿者中，已分别观察到在容器1中从45.10至69.20mM(P<0.01)和在容器2中从50.80至70.20mM(P<0.05)的显著丙酸水平增加。
此外已检测到，在容器1中从41.20至89mM(P<0.01)的显著乙酸浓度增加(图20)。
从结果推断出的是，处理面包的体外发酵诱导乙酸和丙酸浓度增加的结肠微生物丛调节，而对于健康受试者中的对照面包则并未观察到该调节。
在胃肠道细菌中制备乙酸和丙酸最为已知的代谢途径涉及多糖代谢。
乙酸产生主要经过果糖-6-磷酸酯磷酸转酮酶的代谢途径通过双歧杆菌实现，并且所述酸的主要产生严格与细菌增强相关(Miller T.L.et al.,1996)。
根据Hosseini E.et al.(2011)，丙酸可以通过可发酵碳水化合物经过两种代谢途径产生。第一种途径预见琥珀酸在脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)和丙酸杆菌属(Propioni bacterium spp.)存在下脱羧，而第二种途径预见丙烯酸的代谢途径，其中在梭菌属的一些集群存在下丙酮酸通过乳酸脱氢酶还原为乳酸。在处理面包发酵期间，观察到双歧杆菌、类杆菌属(Bacteroides)和直肠假杆菌(E.rectale)组的显著增加。
处理面包显示微生物丛组成的正面调节以及在健康供体和乳糜泻供体两者中SCFA浓度的增加。
随后，处理面包的发酵在下述方面产生正面调节：在健康受试者和乳糜泻受试者中的产双歧杆菌效果和在乳糜泻受试者中的梭状芽胞杆菌XIVa+b的生长数量。
尽管在健康受试者中乙酸和丙酸水平在容器1中降低，但是乙酸水平在容器V2和V3中显著增加，并且丁酸水平在容器V3中增加。另外，对于乳糜泻受试者已观察到在容器V1中高浓度的乙酸和丙酸，和在容器V2中高浓度的丙酸。
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Claims (19)

1.用于解毒禾谷类谷物的谷蛋白的方法，包括下述步骤：
a)用水将禾谷类谷物水化直至15至18％的谷物湿度；
b)通过电磁波处理水化谷物，处理时间和功率足以达到60至70℃的谷物温度；
c)暂停辐射直至达到50至60℃的温度并且同时的水蒸发具有与步骤a)相比14至16％的谷物湿度损失；
d)通过电磁波处理水化谷物，处理时间和功率足以达到80至90℃的谷物温度；
e)暂停辐射直至达到70至80℃的温度并且同时的水蒸发具有与步骤a)相比40至44％的谷物湿度损失；
f)通过电磁波处理水化谷物，处理时间和功率足以达到110至120℃的谷物温度；
g)暂停辐射直至达到80至90℃的温度并且同时的水蒸发具有与步骤a)相比50至60％的谷物湿度损失；
h)在室温下缓慢冷却解毒的谷物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述电磁波是微波或红外线。
3.根据权利要求2的方法，其中在使用微波的情况下处理水化谷物的步骤在微波炉中进行。
4.根据权利要求1的方法，还包括步骤i)：研磨在步骤h)中获得的谷物以获得解毒的面粉或粗粒小麦粉。
5.根据权利要求4的方法，还包括在步骤i)中获得的解毒的面粉或粗粒小麦粉的谷蛋白的溶剂提取步骤。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中禾谷类选自小麦，大麦，orzo，黑麦或燕麦。
7.通过根据权利要求1-6中任一项的方法可获得的解毒的谷物，面粉，粗粒小麦粉或谷蛋白，其中毒性谷蛋白表位的水平被减少至0到20ppm的范围。
8.包含根据权利要求7的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉或谷蛋白的食物，选自面包、意大利面食、早餐禾谷类、啤酒、乳品、酱料、婴儿食品和意大利腊肠。
9.包含根据权利要求7的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉或谷蛋白的食物，选自面包房产品、冰激凌和汁液。
10.根据权利要求7的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉或谷蛋白或者根据权利要求8的食物用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗消化道生态失调。
11.根据权利要求7的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉或谷蛋白或者根据权利要求8的食物用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗炎性或自免疫性的慢性肠病，其选自乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠易激综合征。
12.根据权利要求7的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉或谷蛋白或者根据权利要求8的食物用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗选自肥胖、I型糖尿病和II型糖尿病的全身性代谢病。
13.根据权利要求7的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉或谷蛋白的非治疗用途，其用作对抗革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抗微生物剂。
14.根据权利要求13的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉、谷蛋白或食物的用途，其中所述革兰氏阴性细菌属于沙门氏菌属(Salmonella)而所述革兰氏阳性细菌属于葡萄球菌属(Staphylococcus)。
15.根据权利要求13的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉、谷蛋白或食物的用途，其中所述革兰氏阴性细菌属于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)而所述革兰氏阳性细菌属于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
16.根据权利要求7的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉或谷蛋白的非治疗用途，其用作有用益生素种类的保护剂。
17.根据权利要求16的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉、谷蛋白或食物的用途，其中所述益生素种类属于乳杆菌属(Lactobacilli)。
18.根据权利要求16的解毒的谷物、面粉、粗粒小麦粉、谷蛋白或食物的用途，其中所述益生素种类属于嗜酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
19.根据权利要求7的解毒的谷蛋白用作制备食物的增稠剂的用途。
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