JP2019503170A - 穀粒由来のグルテンタンパク質を解毒する方法及びその医療分野における使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、前記グルテンタンパク質の毒性エピトープの抗原性が０〜２０ｐｐｍの範囲まで低減された解毒された穀粉が得られ、細菌又はウイルス性感染体による又はセリアック病疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び過敏性腸症候群などの強い炎症性又は自己免疫性要素を伴う病態による腸内細菌叢異常に対して明らかな予防及び／又は治療効果を有する食料品（例えば、ベーカリー製品、パスタ又は乳製品）の調製のために有利に使用できる、穀類粒由来のグルテンタンパク質を解毒するための改良された方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、前記グルテンタンパク質の毒性エピトープの抗原性が０〜２０ｐｐｍの範囲内へ低減された解毒された穀粉（flour）が得られ、細菌又はウイルス性感染体による又はセリアック病疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び過敏性腸症候群などの強い炎症性又は自己免疫性要素を伴う病態による腸内細菌叢異常に対して明らかな予防効果及び／又は治療効果を有する食料品（例えば、ベーカリー製品、パスタ又は乳製品）の調製のために有利に使用できる、穀粒由来のグルテンタンパク質を解毒するための、改良された方法に関する。

グルテンは、主にタンパク質からなる食料複合体である。プロラミン類は、穀類の穀果中に存在するタンパク質分画全体の約８０％を構成し、グリアジン及びグルテニンにおける含水アルコール溶液における溶解度に基づいて分類される。含水アルコール溶液中で溶解するグリアジンは、典型的にはアルファ、ベータ、ガンマ及びオメガ（電気泳動移動度に基づく）に分類される、単量体の分子である。ここで単量体の状態であることは、オメガ・グリアジンについてはシステイン残基が存在しないことに依るものであり、又は、その他のグリアジンについては分子内ジスルフィド結合のみが存在することによるものである。

一方、グルテニンは、含水アルコール溶液に非溶解性である高分子複合体であり、高分子量（ＨＭＷ−ＧＳ）及び低分子量（ＬＭＷ−ＧＳ）のサブユニットによって構成され、分子内ジスルフィド結合によって安定化する。

グリアジン及びグルテニンにより、技術的特性を有する穀粉が提供される。グリアジンは生地の粘度に寄与し、グルテニンは弾力性及び引張強度を付与する。

特に、グルテニンポリマーの量及びサイズは、生地の技術的特性と正の相関を示す。

よって、グルテニンポリマーのこれらの特性は、程度の差はあれ伸長したポリマーを形成する個々の成分サブユニットの能力に左右される。

グルテンは、特に、穀類の穀果などには存在しないが、後から形成される。タンパク質複合体としてのグルテンは、その後の水和及び混練時の機械的動作により形成され、生地に粘度及び弾力性を付与することから、穀粉の加工及びパン製造における必須要素である。

周知のように、水を穀粉に添加すると、グリアジン（単鎖タンパク質により形成される）が、水和を開始してフィブリル（小さくて細いファイバー）を形成し、グルテンメッシュに伸展性が付与される。同時に、グルテニン（いくつかのタンパク質サブユニットを含む）もまた会合し、メッシュを生じ、安定した高度に凝集した構造を形成し、それにより整合性及び伸長及び弾力性に対するある程度の抵抗性が生地に付与される。

よって、強度及び膨張度は、穀粉グリアジン及びグルテニン含量比率に左右される。前記二種のタンパク質の比は、考慮される穀類の種類によって変わり、変形性及び引き伸ばしに対する抵抗性を有するグルテンが提供される。

前記機械的混練動作時、グリアジンフィブリル及びグルテニンポリマーは、互いに絡み合って、デンプン顆粒、脂質、ミネラル塩、水及び気泡を内包する三次元メッシュを形成する。後者はその後添加される酵母のアルコール性発酵において非常に重要であり、アルコール及び二酸化炭素産生時に、伸展及び伸長して生地の体積を増加させるグルテンメッシュの伸展を決定付ける。その後の調理において、タンパク質及びグルテンなどの変性／凝固が決定付けられ、伸展する能力を失い、不可逆的に構造及び生地の形が安定化する。

タンパク質複合体としてのグルテンは、リジン、メチオニン及びトリプトファンといった必須アミノ酸が乏しいため、特別な栄養特性を有するものではない。

食事にこの化合物が含まれないことによる具体的な栄養リスクが必然的に生じることはない。

一方で、グルテンは、特に腸粘膜に対して毒性活性を呈する可能性がある。細胞障害性サイトカインの炎症性カスケードを引き起こすような、小麦グルテン及びライ麦、大麦、及びエンバクにおける関連タンパク質に対する永久的不耐性は、セリアック病として定義される。

当初、グルテンの前記毒性作用は、グリアジンのα分画によるものと思われた。後に、大麦（ホルデイン），ライ麦（セカリン）及びエンバク（アベニン）などの類似穀類のプロラミンと同様に、オメガ・グリアジン及びグルテニンもまた腸粘膜障害を生じさせ得ることが実証された。

３３−ｍｅｒとして知られるα−グリアジンの３３個のアミノ酸のペプチドの研究が、最近注目されている。前記ペプチドは、組織トランスグルタミナーゼに対して高い親和性を有し、腸粘膜全体に達すると、消化酵素のタンパク質分解作用に抵抗できる。前記ペプチドは、感受性を有する個体において強力な免疫原性作用を発揮する。当該作用は、前記ペプチドの毒性エピトープが脱アミド化されると、細胞障害性炎症性サイトカインを放出するＣＤ４Ｔリンパ球が強力に活性化されることで決定されるものと考えられる（Ｓｈｕｐｐａｎ Ｄ． ｅｔ ａｌ．，２００９）。

α−グリアジンの他の毒性エピトープが、セリアック病患者の腸粘膜の外植片に由来する腸細胞のアポトーシスを誘発できることも実証されている。

よって、グルテンは、前記サイトカインの炎症性カスケードを引き起こすことと直接的毒性作用を生じることの両方により、腸粘膜に対する有害な作用を有する。

一般集団の約３０％が、セリアック病感受性遺伝子ＨＬＡ−ＤＱ２／８を保有しているが、これらのうち２〜５％のみが実際にセリアック病を発症し、このことは本疾患の発症に付加的環境要因が寄与することを示唆している（Ｒｏｓｓｉ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２０１０）。セリアック病発症に影響する付加的要因は不明であるが、腸内微生物叢の変化が含まれ得る。実際、いくつかの研究では、健常個体と比較して、セリアック病に罹患している患者では糞便及び十二指腸内微生物叢の定性的／定量的組成に変化が認められ、グルテンフリー食での治療後に該組成が一部復活したことが明らかにされている。特に、活動性セリアック病の小児及び成人において、最も重要な変化はフィルミクテス門及びプロテオバクテリア門の量的変動に付随していた（Ｓａｎｃｈｅｚ Ｅ． ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｗａｃｋｌｉｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，２０１３）。その他の研究では、活動性セリアック病患者における、ビフィドバクテリウム属などの抗炎症性効果を有する保護性細菌の濃度の低下及びバクテロイデス属及び大腸菌などのグラム陰性細菌の増加について報告されている（Ｃｏｌｌａｄｏ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｃｏｌｌａｄｏ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｉ Ｃａｇｎｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

さらに、セリアック病に罹患した小児では、通常複数種のブドウ球菌の増加が見られる（Ｃｏｌｌａｄｏ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｃｏｌｌａｄｏ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｄｉ Ｃａｇｎｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ（Ｄｉ Ｃａｇｎｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｄｅ Ｐａｌｍａ Ｇ． ｅｔ ａｌ．，２０１０）及び ａ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ（Ｄｉ Ｃａｇｎｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｓａｎｚ Ｙ． ｅｔ ａｌ ２００７；Ｎａｄａｌ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２００７）。その上、セリアック病の患者は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生という点において微生物叢の組成及び代謝機能の変化を示した（Ｄｉ Ｃａｇｎｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓｃｈｉｐｐａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ある研究では、セリアック病に罹患した患者における腸内微生物組成が、前記疾患の臨床症状に関連していたことが実証された。消化管症状を有する患者の腸内細菌フローラは、プロテオバクテリア門が優勢であり、疱疹状皮膚炎の患者又は消化不良を伴う個体の微生物叢（対照）では、フィルミクテス門が主に認められる（Ｗａｃｋｌｉｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

これまで、セリアック病患者の唯一の治療は、食事からグルテンを完全に排除することであった。所謂「グルテンフリー」治療食は、前記症状の多くを緩和するが、驚くべきことに、そうした治療では、健常被験者に認められる微生物叢のプロファイルを完全に回復することは出来ないことが研究によって示唆されている（Ｗａｃｋｌｉｎ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

前記治療食自体は、正常な微生物モデルによる完全な回復を妨げるようである。グルテンフリー食を摂取した健常患者においても、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の繊細なバランスを取ることは難しく、急速に有用な細菌が日和見病原体に置き換わる。長期的な結果として、前記免疫防御の弱体化、そして慢性炎症状態が引き起こされ得る。これにより、セリアック病患者は、厳格なグルテンフリー食を厳守しながらも、炎症及び感染リスクにさらされ、健康リスクの増大と共に予想以上に不快な症状に苦しむ可能性がある状況が生じる。

腸内細菌叢異常（gut dysbiosis）が、セリアック病及び前記腸管バリア機能の維持及び免疫系の固有の適応応答の制御に潜在的に有益な細菌（すなわち「プロバイオティクス」）による役割に通常関連することから、セリアック病疾患の管理におけるプロバイオティクスの使用には可能性があると考えられる。図１は、セリアック病の発症機序を示す。宿主の特異的な遺伝構造及び環境要因は、病原性共生生物のコロニー化を促進し、共生生物を減少させて、細菌叢異常を決定付けうる。細菌叢異常は、腸の恒常性及び免疫完全性を阻害することにより、セリアック病の増悪を促進し、発症機序を悪化させることに寄与し得る（Ｃｅｎｉｔ Ｍ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．，２０１５）。この仮定に基づいて、無作為に選抜されたセリアック病患者に対する多くの介入について、３つのプラセボ対照二重盲検比較試験が行われた。介入の一つにおいて、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＮＬＳを未治療のセリアック病患者へ投与し、グルテンフリー食とは無関係にプロバイオティクスの効果を評価した。この試験では、未治療のセリアック病患者において、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＮＬＳ投与後に、いくつかの消化管症状、具体的には消化不良及び便秘が改善した。そして、下痢又は腹痛の状態は改善されないか、いくつかのサイトカイン及びケモカインの血清濃度として測定される腸管透過性又は好炎症性状態については変化が認められた（Ｓｍｅｃｕｏｌ Ｅ． ｅｔ ａｌ．，２０１３）。介入に関する別の試験では、プロバイオティックビフィズス菌がグルテンフリー食の有効性を改善可能かどうかを評価するために、グルテンフリー食を摂取した小児のセリアック病に対するビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＣＥＣＴ ７３４７の影響を分析した。この試験では、プラセボ治療群と比較して、ＣＤ３＋末梢Ｔリンパ球の減少、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ） ＣＥＣＴ ７３４７投与後のＴＮＦ−ａの血清濃度の低下傾向、及びバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）の菌数及び糞便中ｓｌｇＡの大幅な低下（Ｏｌｉｖａｒｅｓ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２０１４）が見られた。最近の３ヶ月試験では、グルテンフリー食を摂取したセリアック病小児におけるビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＢＲ０３株及びビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２株の組み合わせの効果が、プラセボ群との比較により評価された。前記試験では、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）が、グルテンフリー食を摂取したセリアック病小児における好炎症性ＴＮＦ−ａサイトカインの産生を低減させることが報告された（Ｋｌｅｍｅｎａｋ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

セリアック病の予防及び治療におけるプロバイオティクスの治療的使用の限界は、微生物が生きた状態で腸へ到達及び腸細胞に付着しなければならないという事実に帰する。さらに、プロバイオティクスはコロニー化が一過性となり得る外来性微生物である。上述の試験で得られたプロバイオティクスのささやかな結果は、市販品に存在する細菌の数が比較的少ないこと、又個々の菌種が、４０，０００以上の異なる菌種に属する無数の細菌を含む腸内細菌フローラと競争できるものではないであろうことによっても説明可能である。

本発明はこうした要求から生じた。当該要求はすなわち、小麦由来のパンやパスタといった地中海食に特有の食料品を生産することの要求であり、ここで当該小麦に含まれるグルテンが、非免疫原性であるのみならず、微生物叢のバランスが回復されるまで実際に有用な微生物に対する保護剤として機能してセリアック病患者の腸内細菌フローラを強化することもでき、弱い有用な細菌叢により作られる恒常性が喪われることにより起こるセリアック病の予防及び食餌療法に使用可能であることである。

国際特許出願ＷＯ２０１４／０５３８９１には、穀類粒由来のグルテンタンパク質を解毒（detoxification）し、セリアック病患者に対して当該グルテンタンパク質を非免疫原性化し、毒性エピトープの抗原性を６０〜４０ｐｐｍの範囲内へ低減する方法が記載されている（Ｌａｍａｃｃｈｉａ Ｃ． ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

本願発明者は、穀粒由来のグルテンタンパク質を解毒し、解毒されているのみならず、前記タンパク質の抗原性がさらに０〜２０ｐｐｍの範囲内まで低減され、幅広い患者における炎症及び／又は感染の結果としての弱い有用な細菌フローラにより生じる腸内細菌叢異常の予防及び治療における治療効果を有する穀粉を得るための、改良された方法を考案した。特に本願発明者は、本発明により、製粉前に水和した穀粒を加工する方法の工程（急速なマイクロ波加熱、及び、遊離水及び穀粒に含まれる結合水の蒸発）を交互に行うよう特定すること（specific alternation）によって、グルテンタンパク質が到達可能なガラス転移状態（state of vitreous transition）を特定した。

より詳細には、急速にマイクロ波加熱する工程、及び、穀粒に含まれる水を低速で蒸発させる工程を交互に行うことにより、セリアック病患者に対して非免疫原性かつ非毒性であることに加え、毒性エピトープの抗原性が０〜２０ｐｐｍの範囲内へ低減されたグルテンを含む穀粉を生産し、以って、穀粉の生産における課題を解決可能であり、前記グルテンは驚くべき予測不可能な形で、セリアック病患者の有用な腸内細菌叢を強化し、該細菌叢のバランスを回復し、その他多数の慢性状態においても存在する腸管炎症の増悪及び／又は永続化の予防を可能とする。

このように、本発明の方法により、弱いプロバイオティクス細菌フローラにより生じる恒常性の喪失に起因する、セリアック病疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群などの慢性腸管炎症性病態に対する予防及び食餌療法に使用可能な、様々な食料品（すなわちパン製造若しくはベーカリー製品又はパスタ）を生産可能である。

したがって、本発明は、穀類の穀粒に由来するグルテンを解毒する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
ａ）穀粒を水で水和させて（hydrating）前記穀粒の含水率（humidity degree）を１５％〜１８％とすること、
ｂ）前記穀粒の温度が６０℃〜７０℃に達するのに必要な電力で、所与の時間、電磁波、好ましくはマイクロ波又は赤外線によって、前記水和した穀粒を処理すること、
ｃ）５０℃〜６０℃の温度に達するまで前記照射を一時中断し、同時に起こる水分蒸発によって前記穀粒の含水率を工程ａ）と比較して１４％〜１６％減少させること、
ｄ）前記穀粒の温度が８０℃〜９０℃に達するのに必要な電力で、所与の時間、電磁波、好ましくはマイクロ波又は赤外線によって、前記水和した穀粒を処理すること、
ｅ）７０℃〜８０℃の温度に達するまで前記照射を一時中断し、同時に起こる水分蒸発によって前記穀粒の含水率を工程ａ）と比較して４０％〜４４％減少させること、
ｆ）前記穀粒の温度が１１０℃〜１２０℃に達するのに必要な電力で、所与の時間、電磁波、好ましくはマイクロ波又は赤外線によって、前記水和した穀粒を処理すること、
ｇ）８０℃〜９０℃の温度に達するまで前記照射を一時中断し、同時に起こる水分蒸発によって前記穀粒の含水率を工程ａ）と比較して５０％〜６０％減少させること、及び
ｈ）室温で前記解毒された穀粒を低速冷却すること。

上述の方法は、好ましくはマイクロ波を使用して行い、より具体的には、水和した穀粒の異なる加工工程において、マイクロ波を放射する装置として電子レンジを用いる。

レーザー装置を使用して電磁波を放射することも可能である。

好ましい実施形態によれば、本発明に係る前記方法は、工程ｈ）の前記穀粒を製粉して穀粉又はセモリナを得る追加工程ｉ）を含む。ある選択的実施形態によれば、本発明に係る前記方法は、工程ｉ）の前記穀粉又はセモリナを溶媒（すなわち水／塩化ナトリウムの生理食塩水）で抽出して解毒グルテンを得る追加工程ｌ）を含む。

用語「大気温度」は、好ましくは２０℃〜２５℃の範囲内の温度を意味する。好ましくは、前記穀粒は、穀類、より好ましくは小麦、大麦、ライ麦、又はエンバクの穀粒である。

本発明に係る前記方法の工程ｂ）、ｄ）、及びｆ）において、重要なことは、前記穀粒内で到達する温度であり、電磁波の力ではなく、穀粒に含まれる水を介して短時間で高温に到達することである。

図２に示す画像は、前記マイクロ波自体ではなく、むしろ、特に前記穀粒の含水量が５〜７％に到達し、温度が約１００℃に達するプロセスの照射−水分蒸発中断の最終工程（工程ｇ）における所定の温度及び含水率条件の達成により前記グルテンタンパク質の構造上の変化を決定することを示す。本工程のみで、グルテンタンパク質は、穀粒内の前記蛍光抗体からはもはや認識されなくなることが、図２から簡単に理解される。

上記全工程が必要とされる。工程ａ）で含水率１５〜１８％の範囲となるよう前記穀粒を水で水和させることにより、熱化プロセスにおいて、種子が、電磁波好ましくはマイクロ波を熱エネルギーへ変換するのに必要な水の量を蓄積することができる。

水分子は、電界の作用下で、回転、振動、及び整列することができる。水分子の動きにおいて、隣接する分子が衝突し、この種の分子摩擦により照射された質量部分が熱を出す。

その後のマイクロ波による照射工程ｂ）により、第一の照射工程において温度が６０〜７０℃に必達し、サンプルを加熱することが出来る。含水率が高いほど、所望の温度に到達する一定期間において適用するパワーが低くなる。

所望の温度に到達する期間は、照射を受ける質量の関数となる。

例えば、含水率１５％〜１８％の穀粒１００ｇは、７５０ワットのパワーを引加することにより１分間で、６０℃〜７０℃の温度に達する。

このように、含水率は引加するパワーに反比例するが、照射時間は照射を受けるサンプルの質量に直接比例する。

照射−蒸発を中断する工程は、好ましくは電子レンジ内で、穀粒の最内部の層から外縁へ、外縁から表面へ、及び穀粒の表面から外部環境へ、水が移動するプロセスが可能となるように実施する必要がある。前記プロセスは、穀粒を加熱に使用する装置（すなわち電子レンジ）の外部温度にさらすことなく、ゆっくりと行わなくてはならない。こうすることにより、前記分子に結合した水の部分を除去することなく、穀粒表面の水の蒸発のみ生じさせることが出来る。

照射工程及び照射−蒸発を中断する工程を、グルテンタンパク質のガラス転移状態、すなわち含水率及び温度の所定の条件においてグルテンタンパク質が可塑性になる状態が達成されるまで、交互にｎ回繰り返す（図３を参照）。各タンパク質は、各レベルの構造が特定可能な、独自の立体構造、すなわち特徴的な三次元形状を有する。図示されるように、一次構造は、ポリペプチド鎖における互いに共有結合で結合したアミノ酸の配列により与えられる。次のレベルは、一次構造のアミノ酸の間に水素結合が確立されねじれが生じることによって形成される、二次構造である。タンパク質の三次構造は、前記二次構造上の異なる点に位置するアミノ酸間の相互作用によって生じ、主に前記αヘリックスと前記二次構造の折り畳まれたシートとの間の接合部セグメントにおけるポリペプチド鎖の折り畳みによるものである。四次構造は、サブユニットと呼ばれる２以上のポリペプチド鎖が互いに結合し相互作用した結果である。本発明の方法により、グルテンタンパク質は、分子が振動せずに前記二次構造及び三次構造の結合が切断されることによって移動し、分子が可塑性／弾性となる、ガラス転移状態に到達することが可能となる（Ｎｏｅｌ Ｔ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｍｉｃａｒｄ Ｖ．及びＧｕｉｌｂｅｒｔ Ｓ．，２０００）。特に、反対の荷電を有する基を結合させる水素結合及びイオン結合のみならず、タンパク質が二次及び三次立体構造を維持することを可能とするジスルフィド結合が切断されることで、分子が空間中で動くことが可能となり、二次構造及び三次構造が改変される。

図４に示すように、このプロセスにより可塑性となったグルテンタンパク質は、成熟した穀粒のタンパク質粒において天然型で存在するため、従来にない形態で凝集することになる（Ｔｏｓｉ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，２０１１）。図４は、本発明の方法による処理の後に、タンパク質が自身の抗体によって認識可能でないのみならず、処理種子のタンパク質粒におけるタンパク質自体の凝集が、対照種子と比較して明らかであることを示す。特に、前記タンパク質は、既に形成され高温に晒されたグルテンの構造に生じるような共有結合（オーブンによる生地の調理、パスタの乾燥；Ｌａｍａｃｃｈｉａ Ｃ． ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｇｅｒｒａｒｄ Ｊ．Ａ．，２０００）によって凝集することはないが（図５）、成熟した穀粒のタンパク質粒において天然型で存在する場合の分子の二次構造及び三次構造の変化によって生じる、反対の荷電を有する基を結合するイオン結合によって、凝集する。図５は、還元条件下で実施したゲル電気泳動により、対照種子及び本発明の方法によって処理した種子の穀粉から抽出したタンパク質の分子量に差が認められないことを示し、前記タンパク質が一次構造の変化を受けないのみならず、本発明の方法に係る熱処理後の種子のタンパク質粒における可視的凝集が共有結合、ジチロシン及び／又はイソペプチド結合によるものではないことを強調している（Ｇｅｒｒａｒｄ Ｊ．Ａ．，２０００；Ｌａｍａｃｃｈｉａ Ｃ． ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｔｉｌｌｅｙ Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，２００１）。この場合、高分子量方向へのタンパク質のバンドシフトが、観察されるはずであった。よって、前記処理種子のタンパク質粒に認められた凝集は、共有結合性ではあり得ず、すなわち共有結合の形成によって成るものではない。

本発明に係る前記方法における大気温度で低速冷却を行う工程ｈ）により、分子が従来にない凝集状態で結晶化することが可能となる。
この改良された方法の重要な点を以下に示す。

１）二つの機能を果たす水の使用。一つ目の機能は、熱化プロセスにおいて、電磁波、好ましくはマイクロ波を、熱エネルギーへ変換することである。二つ目の機能は、ゆっくりと蒸発し、結合水の一部をグルテンタンパク質に保持させつつ、当該タンパク質を、ガラス転移状態、可塑性となる状態へ到達させることである。

マイクロ波は電離放射線ではなく、結合を切断不可能であることから、マイクロ波の使用は、特に好ましい。これにより、マイクロ波の機能は、水分子を振動させることと短時間で熱を生成することのみとなる。

３）二つの機能を果たす熱の生成。熱により、遊離水及び結合水を蒸発させ、天然型の成熟した穀粒のタンパク質粒に内包されるグルテンタンパク質を、振動せずに移動する状態へ到達させる。

この移動は、タンパク質の二次構造及び三次構造自体を生じさせる水素架橋及びイオン結合を切断して当該タンパク質を可塑性とすることにより可能となる（図３）。この変化が明らかに前記タンパク質による電荷の露出を引き起こすことは、このプロセスを経たグルテンが水に溶解性となる事実によって示される。タンパク質の二次構造及び三次構造の喪失による電荷の露出により、同じタンパク質粒中に存在する異なる電荷のタンパク質同士の凝集が生じる。図６は、本発明の方法を適用する前に、天然型三次元構造を想定した小麦穀粒のタンパク質粒にグルテンタンパク質を内包した場合について模式的に示す。本発明の方法を適用した後に、前記タンパク質はガラス転移状態に達し、三次元構造を喪失して可塑性になる。この変化が前記タンパク質による電荷の露出を引き起こすことは、このプロセスを経たグルテンが水に溶解性となる事実によって示される。タンパク質の二次構造及び三次構造の喪失による電荷の露出により、同じタンパク質粒中に存在する異なる電荷のタンパク質同士の凝集が生じる。図６に示す画像に示されるように、グリアジン（−）＋ＬＭＷ（＋）、アルブミン（＋）＋グリアジン（−）、グロブリン（＋）＋グリアジン（−）と仮説を立てられる。

上記仮説を確認するために、図２１のパネルａ）における前記解毒プロセスの６つの工程Ａ−Ｆの免疫蛍光分析に加え、パネルｂ）で、「Ｉｍａｇｅ Ｊ」ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を用いた上記工程の画像閾値分析を示す。パネルｃ）は、７０％ＥｔＯＨで抽出した各工程に対するグリアジンタンパク質分画及び対照重量穀粉（ＣＷＦ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。パネルｄ）は、顕微鏡画像工程の分析から得られたＭＧＶの値（平均グレー値）の低下率（％）、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで表されたグリアジンタンパク質分画に対する光学濃度（ＯＤ）をまとめた表を示す。パネルｂ）に示される６つの工程Ａ−Ｆの画像分析から、グリアジンタンパク質分画及びＬＭＷ−ＧＳを認識する０６１０抗体のマーキングによる蛍光である輝度が、各工程で規則的に低下していくことが、肉眼で観察できる。この低下は、パネルｃ）に記載の表に報告される平均グレー値の分析により確認され、各工程を比較した。この各工程における規則的かつ有意な低下は、もはや抗体によって認識されない前記タンパク質の構造変化を表している。低下が規則的である理由は、精密なタンパク質クラスがその構造変化、すなわち固体から弾性／可塑性状態への「転移」を示す温度及び含水率の値に、各工程で対応するからである。換言すると、各タンパク質クラスは、その化学構造に基づく相対的ガラス転移温度（Ｔｇ）を表すものであり、該温度を超えると、高分子鎖が自由に移動し、前記立体構造は改変する。特に、低い温度（５０〜６５℃）、すなわち前記プロセスの工程の開始時には、アルブミン、グロブリン、及びＬＭＷタンパク質が、ＨＭＷタンパク質とともに変化に最初に直面することとなる（Ｌａｍａｃｃｈｉａ Ｃ． ｅｔ ａｌによる観察、２００７）。約７０℃の温度では、グリアジンは、最初に立体構造を変化させ、前記プロセスの最終工程において変化が終了する（８０〜９０℃）。この事象を実証するために、各工程プロセスにおいて、エタノール抽出された穀粒由来のグリアジンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、工程Ａ〜Ｆにおける対照に比してのバンドの低下が特に示され、これは天然の立体構造においては中間鎖ジスルフィド結合の生成に利用可能なシステイン残基を表さないグリアジンが、如何に、システイン残基の露出を生じる立体配座の変化による前記プロセスの中間及び最終工程の間に、この種の結合に関係するかを示す。

前記バンド低下（ＯＤ）が、前記プロセスの６つの工程時に観察される輝度低下（ＭＧＶ）に相当するものではないことが顕微鏡手法により観察可能であり、これによって、前記プロセス工程時にタンパク質間の強い凝集によって起こり（図４を参照）、共有結合ではなくガラス転移に続く三次構造の変化後に起こる反対荷電基を結合するイオン結合によって生じる、前記タンパク質の立体配座の変化及び／又はエピトープの被覆により、０６１０抗体に対するグルテンタンパク質の交差反応性が低下することが確認される（図５及び図２１を参照）。

４）ゆっくりと冷却することにより、新しいタンパク質構造は新しい状態で結晶化したままでいることが出来る。

本発明はまた、本発明に係る前記方法によって得られる解毒された穀粒、穀粉又はセモリナ又はグルテンに関する。穀粉又は前記セモリナは、小麦、ライ麦、大麦、又はエンバクであってよく、それらは前記追加工程ｉ）の製粉後に得られる。グルテンは、小麦、ライ麦、大麦、又はエンバクであってよく、前記追加工程１）における穀粉及び／又はセモリナから溶媒で抽出した後に得られる。

本発明の文脈における用語「解毒された」は、穀粉又はセモリナに言及する場合、毒性グルテンエピトープのレベルが０〜２０ｐｐｍの範囲内に低減されていることを意味する。これにより、グルテンが穀粉又はセモリナの中に存在していても、あらゆる目的においてこれらが「グルテンフリー」であるとみなすことが可能となる。

本発明は、パン、パスタ、ベーカリー製品、朝食用シリアル、及びビールから選択される、小麦粉、小麦セモリナ、大麦、又はエンバクを含む食料品に関する。

本発明はまた、本発明の方法の工程ｌ）によって得られた前記解毒グルテンを添加可能な乳製品（すなわちヨーグルト、アイスクリーム、発酵乳、チーズ、モッツアレラ、バター、クリーム、リコッタ）に関する。

特に、本発明の方法の工程１）に従って得られた前記解毒グルテンを、乳製品のみならず、コールドカット、アイスクリーム、ベビーフード、ソース、及びジュースなどのその他のカテゴリーの製品といった食料品の調製用の増粘剤として、有利に使用可能である。

したがって、グルテンフリー又は低ラクトース治療食を要する個人の集団のための用途が意図されている限り、かかる食料品は本発明の保護範囲に含まれる。

簡潔に述べると、本発明の方法に従って生産されるセモリナ及び穀粉において、第一の有利な点は、毒性グルテンエピトープの抗原性が０〜２０ｐｐｍの範囲内に低減され、前記地中海食に広く使用される食品と味及び外観の点で同等の感覚刺激性特性を有し、またセリアック病患者の腸内細菌フローラに対する治療として、腸内細菌フローラのバランスを回復し、保護し、有用な細菌フローラを強化する、セリアック病患者のための食品を生産可能なことである。

よって、本発明はさらに、腸内細菌叢異常の予防又は治療のために医療分野で使用される、前記食品に基づく又は前記食品を添加した解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、若しくはグルテン又は食料品に関する。

前記生産された穀粒、セモリナ、穀粉、又はグルテンにおいて、第二の有利な点は、炎症性疾患及び／又は自己免疫性の慢性腸疾患の感受性を生じさせるリスクが腸内微生物叢の変化により高まる全ての病態（非包括的な例として、肥満、１型糖尿病、又は２型糖尿病などの全身代謝性疾患に加えてセリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、及び腸症候群からなる群から選択される病態）のための食餌療法用の食品を生産可能になることである。

本発明のさらなる実施形態によれば、これら解毒された穀粉及びセモリナ又はその使用により得られる解毒されたグルテンもしくは食料品を、前記ラクトバチルス属に属するプロバイオティクス微生物、例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（特にラクトース不耐症患者用の乳製品に添加する場合）に対する保護剤及び／又はグラム陰性及び／又はグラム陽性細菌に対する抗菌剤として有利に使用することができる。前記グラム陰性細菌は、好ましくはサルモネラ属、さらに好ましくはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）種であり、前記グラム陽性細菌は、好ましくはブドウ球菌属、さらに好ましくは黄色ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）である。

本発明を、下記実施例及び以下の図面に示される結果に基づいて、以下非限定的描写により記載する。

図１は、セリアック病疾患の発症機序の説明図である（ＭＣ）。 図２は、グリアジン及び低分子量グルテニン（ＬＭＷ−ＧＳ）のタンパク質分画を認識する０６０１０抗体によるマーキング後の処理方法の工程に関連する小麦の切片（１μΜ） を示す。パネルＡ：工程ｂ；パネルＢ：工程ｃ；パネルＣ：工程ｄ；パネルＤ：工程ｅ；パネルＥ：工程ｆ；パネルＦ：本発明に係る前記方法の工程ｇ 図３は、本発明の方法に係る加熱処理前後のタンパク質構造を示す。 図４は、対照及び本発明の方法の処理後の小麦切片（Ιμｍ）を示す。（１）非均一タンパク質マトリックスの対照小麦切片（Ｐｂ１）；（２）均一及びコンフルエントなタンパク質マトリックスの処理後の小麦切片（Ｐｂ２）。６つの異なる種子（各種子につき４切片）に実施したｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｆｒｉｅｄｍａｎ検定により、前記対照及び処理後サンプルの種子における二種類のタンパク質粒（Ｐｂｌ及びＰｂ２）の顕著な違いを検出した。 図５は、タンパク質分画の抽出及び還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離を示す。レーン１、本発明の加熱処理を実施しなかった対照種子由来の穀粉から抽出したグリアジン；レーン２、本発明の方法で処理した種子由来の穀粉から抽出したグリアジン；レーン３、本発明の加熱処理を実施しなかった対照種子由来の穀粉から抽出したＨＭＷ−ＧＳ及びグリアジン；レーン４、本発明の方法で処理した種子由来の穀粉から抽出したＨＭＷ−ＧＳ及びグリアジン；レーン５、本発明の加熱処理を実施しなかった対照種子由来の穀粉から抽出したグルテニン；レーン６、本発明の方法で処理した種子由来の穀粉から抽出したグルテニン；レーン７、本発明の加熱処理を実施しなかった対照種子由来の穀粉から抽出した総タンパク質；レーン８、本発明の方法で処理した種子由来の穀粉から抽出した総グルテニンタンパク質。 図６は、同じタンパク質粒に存在する電荷が異なるタンパク質間の凝集に係る仮説を示す。 図７は、対照穀粉及び本発明の方法と比較のため国際特許出願ＷＯ２０１４／０５３８９１の方法により処理したサンプルとをモノクローナル抗体 Ｒ５ Ｒｉｄａｓｃｒｅｅｎ ＧｌｉａｄｉｎでＥＬＩＳＡアッセイしたヒストグラムの要約を示す。 図８は、横方向にカットして、０６１０抗体及びγ−グリアジンで、ＳＥＭ−免疫金標識、免疫マーキングを行って観察した、対照小麦（対照）及び本発明に記載の方法による処理後（処理済）の切片を示す。１．０６１０抗体でマーキングした対照；２．抗γ−グリアジン抗体でマーキング後の対照；３．０６１０抗体でマーキングした処理済サンプル；４．抗γ−グリアジン抗体でマーキングした処理済サンプル。図中の矢印は、ＥＤＳ（Ｅｎｅｒｇｙ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（エネルギー分散分光法））分析により検出した銀粒子（ＡｇＮｐ）を示す。 図９は、前記０６１０抗体、ＨＭＷ−Ｇ ｅ γ−グリアジンでマーキングした、対照（対照）及び本発明の方法による処理後（処理済）の小麦（１μｍ）切片を示す。１．０６１０抗体でマーキングした対照；２．γ−グリアジン抗体でマーキングした対照；３．抗体ＨＭＷ−ＧＳでマーキングした対照；４．０６１０抗体でマーキングした処理済サンプル；５．抗体γ−グリアジンでマーキングした処理済サンプル；６．抗体ＨＭＷ−ＧＳでマーキングした処理済サンプル。 図１０は、対照及び処理後種子の切片に対して、Ｒ５−ＨＲＰ複合モノクローナル抗体を用いて行った比色分析を示す。１．対照種子のサブアリューロン；２．本発明の方法による処理後種子のサブアリューロン；３．対照種子のヒダ；４．本発明の方法による処理後種子のヒダ。図中の縮尺バーは１００μｍに相当する。 図１１は、対照パン及び改変されたパン（０．８ｇ／ｌ）の両方を添加した後の生理食塩水中でのラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の死滅時の動態解析を示す。各線は、Ｗｅｉｂｕｌｌ分布による最適フィッティングを示す。 図１２は、対照パン又は処理済パン（０．２，０．４又は０．８ｇ／ｌ）を添加した後の生理食塩水における黄色ブドウ球菌の生菌数を示す。平均値±標準偏差。記号「＊」及び「＊＊」は、有意差（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの（Ｔｕｋｅｙ’ｓ）検定）があることを示すものである。 図１３は、０．８ｇ／ｌの対照パン又は改変されたパンを添加した生理食塩水における、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．の生菌数を示す。平均値±標準偏差。 図１４は、６時間発酵後のＳＣＦＡ及びＦＩＳＨの結果に関する主要成分の分析を示す。パネルＡ）変数の投影；パネルＢ）ケースの投影。サンプル：Ａ…陰性対照の健常ドナー；Ｂ…健常ドナー＋対照パン；Ｃ…健常ドナー＋改変されたパン；Ｄ…陰性対照のセリアック病ドナー；Ｅ…セリアック病ドナー＋対照パン；Ｆ…セリアック病ドナー＋改変されたパン。変数：１，Ｂｉｆｌ６４；２，Ｅｒｅｃ４８２；３，Ｂａｃ；５，ｌａｂｌ５８；ＡＣ：酢酸；ＢＵＴ：酪酸；ＰＲＯＰ：プロピオン酸。 図１５は、２４時間の発酵後のＳＣＦＡ及びＦＩＳＨの結果に関する主要成分の分析を示す。パネルＡ）変数の投影；パネルＢ）ケースの投影。サンプル：Ａ…陰性対照の健康なドナー；Ｂ…健康なドナー＋対照パン；Ｃ…健康なドナー＋改変されたパン；Ｄ…陰性対照のセリアック病ドナー；Ｅ…セリアック病ドナー＋対照パン；Ｆ…セリアック病ドナー＋改変されたパン。変数：１，Ｂｉｆｌ６４；２，Ｅｒｅｃ４８２；３，Ｂａｃ；５，ｌａｂｌ５８；ＡＣ：酢酸；ＢＵＴ：酪酸；ＰＲＯＰ：プロピオン酸。 図１６は、４８時間の発酵後のＳＣＦＡ及びＦＩＳＨの結果に関する主要成分の分析を示す。パネルＡ）変数の投影；パネルＢ）ケースの投影。サンプル：Ａ…陰性対照の健康なドナー；Ｂ…健康なドナー＋対照パン；Ｃ…健康なドナー＋改変されたパン；Ｄ…陰性対照のセリアック病ドナー；Ｅ…セリアック病ドナー＋対照パン；Ｆ…セリアック病ドナー＋改変されたパン。変数：１，Ｂｉｆｌ６４；２，Ｅｒｅｃ４８２；３，Ｂａｃ；５，ｌａｂｌ５８；ＡＣ：酢酸；ＢＵＴ：酪酸；ＰＲＯＰ：プロピオン酸。 図１７Ａは、対照パンを付与する前（ＳＳＩ）及び付与した後（ＳＳ２）の健常人の結腸部分をシミュレートしたモデル系の三つの異なる容器（ＶＩ、Ｖ２、及びＶ３）の培養ブロスから回収した菌を示す。二つのモデル系のデータ平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として結果を報告する。 図１７Ｂは、改変されたパンを付与する前（ＳＳＩ）及び付与した後（ＳＳ２）の健常人の結腸部分をシミュレートしたモデル系の三つの異なる容器（ＶＩ、Ｖ２、及びＶ３）の培養ブロスから回収した菌を示す。二つのモデル系のデータ平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として結果を報告する。 図１８Ａは、改変されたパンを付与する前（ＳＳＩ）及び付与した後（ＳＳ２）の健常人の結腸部分をシミュレートしたモデル系の三つの異なる容器（ＶＩ、Ｖ２、及びＶ３）の培養ブロスから回収した菌を示す。二つのモデル系のデータ平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として結果を報告する。 図１８Ｂは、改変されたパンを付与する前（ＳＳＩ）及び付与した後（ＳＳ２）のセリアック病患者の結腸部分をシミュレートしたモデル系の三つの異なる容器（ＶＩ、Ｖ２、及びＶ３）の培養ブロスから回収した菌を示す。二つのモデル系のデータ平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として結果を報告する。 図１９は、健常人における（Ａ）対照パン及び（Ｂ）改変されたパンを付与する前（ＳＳＩ）及び付与した後（ＳＳ２）の結腸部分をシミュレートしたモデル系の三つの異なる容器（ＶＩ、Ｖ２、及びＶ３）の培養ブロスから回収した短鎖脂肪酸ＳＣＦＡ菌を示す。二つのモデル系のデータ平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として結果を報告する。 図２０は、（Ａ）健常患者及び（Ｂ）セリアック病患者における改変されたパンを付与する前（ＳＳＩ）及び付与した後（ＳＳ２）の結腸部分をシミュレートしたモデル系の三つの異なる容器（ＶＩ、Ｖ２、及びＶ３）の培養ブロスから回収した短鎖脂肪酸ＳＣＦＡ菌を示す。二つのモデル系のデータ平均±ＳＥＭ（ｎ＝２）として結果を報告する。 図２１において、パネルａ）は、グリアジン及びＬＭＷ−ＧＳのタンパク質分画を認識する０６１０抗体に複合した後の処理工程に関する軟小麦切片（１μｍ）を示す。（Ａ）工程ｂ；（Ｂ）工程ｃ；（Ｃ）工程ｄ；（Ｄ）工程ｅ；（Ｅ）工程ｆ；（Ｆ）工程ｇ。パネルｂ）は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いた前記工程の画像閾値分析を示す。パネルｃ）は、７０％ＥｔＯＨで抽出したグリアジン及び関連する対照重量穀粉（ＣＷＦ）のタンパク質分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（Ａ）工程ｂのグリアジン；（Ｂ）工程ｃのグリアジン；（Ｃ）工程ｄのグリアジン；（Ｄ）工程ｅのグリアジン；（Ｅ）工程ｆのグリアジン；（Ｆ）工程ｇのグリアジン。パネルｄ）は、顕微鏡画像工程の分析から得られたＭＧＶの値（平均グレー値）の低下率（％）、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで表されるグリアジンタンパク質分画の光学濃度（ＯＤ）の低下率をまとめた表を示す。

実施例１：本発明に係る方法による処理後のグルテンタンパク質の抗原性の低減
本発明に係る解毒方法に小麦穀粒を供した後、当該穀粉におけるグルテンタンパク質の毒性エピトープの抗原性の低減について、穀粉及びセリアック病患者用の製品中のグルテン認識のための、ｂａｒｒｅｄ ｅａｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに採用された公式方法（抗体Ｒ５によるＥＬＩＳＡアッセイ）を用いて、試験を行った。

特に、Ｍｅｎｄｅｚ ｃｏｃｋｔａｉｌで事前に変性したグルテンタンパク質を穀粉からアルコール溶液を用いて抽出し、グルテンタンパク質に繰り返し認められる毒性ペプチド配列ＱＱＰＦＰを認識するモノクローナル抗体Ｒ５を用いたＲ５サンドイッチＥＬＩＳＡ法（図７を参照）により、試験を行った。図７（パネルＡ）は、本発明の方法（パネルＢ）との比較のために国際特許出願ＷＯ２０１４／０５３８９１に記載の方法で処理したサンプルをＲ５ Ｒｉｄａｓｃｒｅｅｎ ＧｌｉａｄｉｎでＥＬＩＳＡアッセイしたヒストグラムの要約を示す。ここで、国際特許出願ＷＯ２０１４／０５３８９１に記載の方法で処理した穀粒由来の穀粉サンプルは、毒性エピトープＱＱＰＦＰの抗原性が６０〜４０ｐｐｍの範囲に低減していた（パネルＡ、図７；Ｌａｍａｃｃｈｉａ Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２０１６）。一方、本発明の方法で処理した穀粒由来の穀粉は、１３．８３＋７．２２ｐｐｍという毒性エピトープ抗原性の有意な低下を示し、グルテンが依然として含まれるものの、すべての法目的において「グルテンフリー」穀粉として解される小麦となっている。

本発明に係る穀粒由来のグルテンタンパク質の解毒における改善は、グルテンの毒性エピトープの抗原性を０〜２０ｐｐｍの範囲に低減し、セリアック病患者にとってグルテンタンパク質をより安全にすることからなる。この低減は、国際特許出願ＷＯ２０１４／０５３８９１の方法では達成されなかった。これは、本発明に記載の方法の工程によって完全に達成される、タンパク質を可塑性とする改変の完了が、当該方法における１２０秒間のマイクロ波工程の後に大気温度で低速冷却することでは確実ではなかったことによる。

本発明に係る方法によって生じる変化により、グルテンタンパク質の抗原性の低減が可能となり、当該タンパク質は、自身に対する抗体にさえも認識されることはない。これを実証するために、対照種子（ＣＷＳ）及び処理種子（ＴＷＳ）の三つのサンプルを横方向に切断し、グリアジン分画に対する三つの特異的モノクローナル抗体を用いて、免疫金標識（図８）、免疫蛍光（図９）、及び比色分析顕微鏡法（図１０）によって観察した：
ＩＦＲＮ ０６１０…多くのグリアジンに共通するエピトープ（ＱＱＳＦ）を認識するモノクローナル抗体。
ＬＭＷ−ＧＳ…γグリアジン分画に存在する繰り返しドメインを認識するマウスモノクローナル抗体（ＰＥＱＰＦＰＱＧＣ）。
Ｒ５…グルテンタンパク質に繰り返し存在する強毒性配列ＱＱＰＦＰを認識するモノクローナル抗体Ｒ５。

図８は、横方向に切断して、０６１０抗体及びγ−グリアジンで、ＳＥＭ−免疫金標識、免疫マーキングを行って観察した、本発明に係る方法による対照小麦（対照）及び処理後（処理済）の切片を示す。５つの異なる対照及び処理種子由来の５つの切片に対して得られた値を、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ−ｔｅｓｔ）で比較した。２種類の抗体に認められた差異には大きな有意差があった（ｐ＜０．００１）。抗体０６１０を用いた場合、対照種子との比較で、処理種子において８９％の低減が得られ、抗体γ−グリアジンとの比較で、８７．５％の低減が得られた。

図９は、０６１０抗体，ＨＭＷ−Ｇ及びγ−グリアジンでマーキングした、対照（対照）及び本発明の方法による処理後（処理済）の小麦（１μｍ）切片を示す。対照及び処理済種子のサンプル由来の３つの異なるサンプル（各種子につき３切片）を、Ｉｍａｇｅｊソフトウェアを用いて分析した。各画像をグレースケールに変換し、それぞれの平均グレー値（ＭＧＶ）を得た。０６１０抗体を用いた場合、処理種子では、対照種子と比較して９１．７％の低下及び抗体γ−グリアジンと比較して９０．６％の低下が認められた。その後、２つの変数（サンプルの種類及び処理の種類）に対する分解仮説を用いて二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ Ａｎｏｖａ）検定を実施した。分析したパラメーターのうち、種子を供した処理の種類が、最も重要な要因であった。得られたデータは非常に有意であった（ｐ＜０．００１）。

図１０は、対照及び処理後種子の切片に対して、Ｒ５−ＨＲＰ複合モノクローナル抗体を用いて行った比色分析を示す。対照及び処理済種子のサンプル由来の３つの異なるサンプル（各種子につき３切片）を、Ｉｍａｇｅｊソフトウェアを用いて分析した。各画像をバイナリ・フォーマットでグレースケールに変換し、それぞれの平均グレー値（ＭＧＶ）を得た。処置後の種子では、対照種子と比較して、サブアリューロン領域のレベルでは８９．２％の低下が認められ、折り畳みレベルでは８２％の低下が認められた。その後、２つの変数（サンプルの種類及び処理の種類）に対する分解仮説を用いて二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ Ａｎｏｖａ）検定を実施した。分析したパラメーターのうち、種子を供した処理の種類が、最も重要な要因であった。得られたデータは、非常に有意であった（ｐ＜０．００１）。

実施例２：消化された、本願発明に係る方法に従って処理した穀粉で作製したパンの、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）に対する予防効果及び黄色ブドウ球菌及びサルモネラ・ティフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に対する抗菌作用のインビトロ試験

２種類の一連の実験を下記表１に示すように実施した。
特に、対照パン、又は、グルテンを上記方法で改変し、Ｍａｃｃａｆｅｒｒｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ．（２０１２）に記載の手順に従って適切な条件でインビトロで消化し、脱水し、８ｌｏｇ ｕｆｃ／ｍｌで接種した種子を製粉した穀粉のパンの、異なるアリコートに、生理食塩液のアリコート（ＮａＣｌ ０．９％）（５０ ｍｌ）を添加した。そして生菌数を定期的に評価するために、ＭＲＳ寒天にラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）及びビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）又はＴＳＡ（病原体）を播種した後、３７℃で２〜４間培養して、サンプルを分析した。乳酸菌は嫌気性条件下で分析した。

表２は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の死滅動力学に対するＷｅｉｂｕｌｌ分布のフィットネスパラメーターを示す（平均±標準値）。各パラメーターにおいて、文字は有意差を示す（ＡＮＯＶＡ及びテューキーの検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔ）、Ｐ＜０．０５）．死滅動力学では、形状係数＞１の下向き曲線が示された。

前記対照パン及び改変されたパンの両方への生理食塩水の添加は、曲線の形状に影響しなかった。一方、パンの種類は、細菌の集団の死滅動力学に有意に影響し、前記方法で処理した種子の穀粉で作製したパンを用いた場合、０．４ｇ／ｌで６７．４６〜８０．５３の延長及び０．８ｇ／ｌで７０．２８〜９３．９６の延長がみられた。

前記方法で処理した種子の穀粉で作製したパンの、形状係数ではなく死滅動力学に対する影響は、死亡曲線の最終部分において死亡率が低下しうることによるものであり、このことは図１１に示す、対照パン及び処理済パン（０．８ｇ／ｌ）両方の添加後の、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）の生理食塩水中での死滅動力学により示唆される。各線は、Ｗｅｉｂｕｌｌの式による最適フィッティングを示す。第二の試験を行い、改変されたパンの濃度がラクトバチルス・アシドフィルス（ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））及びビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）の両方に有害な作用を生じる又は及ぼすかどうかを決定した。生理食塩水を、第一の実験で使用した量（０．８ｇ／ｌ）でより高い濃度（５．０ｇ／ｌ）で添加し、腸をゆっくりと通過させることによりパンが局所的に増加する様をシミュレートした。生菌数は、消化されたパンの濃度に影響されず、死滅動力学は図１１に示す結果と類似した傾向を示した。

最後に、生理食塩水に、グラム陽性病原体又はグラム陰性病原体（黄色ブドウ球菌及びサルモネラ・ティフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））を接種した。黄色ブドウ球菌について、対照パン又は処理済パンを添加した生理食塩水中の生菌数（０．２，０．４又は０．８ｇ／ｌ）の結果を図１２に示す。平均値±標準偏差。記号「＊」及び「＊＊」は、有意差（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ及びテューキーの（Ｔｕｋｅｙ’ｓ）検定）があることを示すものである。

前記方法に従って処理した種子の穀粉で作製したパンを０．８ｇ／ｌで添加したサンプルにおいて、有意差を認め、対照パンを添加したサンプルと比較して、生菌数の割合が１−ｌｏｇ低下していた。サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）の存在下で、７日後の同じサンプルにおいて３−ｌｏｇの低下が認められたが、対照パンでは１−ｌｏｇの低下であった（図１３）。

実施例３：結腸遠位部をシミュレートしたモデル系でのセリアック病患者の腸内細菌フローラのバランスの回復における治療効果の試験
対照パン及び本発明の方法に従って処理した種子の穀粉で作製したパンの両方についてアセスメントを、バッチ発酵培養（各化合物又はファイバーの効果を検討する結腸遠位部をシミュレートしたｐＨ調節モデル系）で行った。

公知の代謝性疾患及び消化器疾患（例えば、糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、消化性潰瘍、及びガン）を免れている３名のヒト健常人（男性２名、女性１名、３０〜３８歳；ＢＭＩ：１８．５〜２５）から、糞便サンプルを得た。健常ドナー全員に標準的な質問を行い、健康状態、薬の使用、病歴、糞便サンプルの提供を依頼される以前のライフスタイルについて、情報を収集した。セリアック病ドナー（女性２名、男性１名、３０〜３８；ＢＭＩ：１８．５〜２５）については各ケースで同意書を得た。試験は、英国レディング大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｅａｄｉｎｇ、ＵＫ）の倫理審査委員会（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された（ＵＲＥＣ １５／２０：ヒト結腸のインビトロモデル系のための糞便サンプル収集センターへ寄贈）。健常ドナー及びセリアック病ドナーからその場で収集したすべての糞便サンプルを嫌気性キャビネット（１０％ Ｈ_２−１０％ ＣＯ_２−８０％ Ｎ_２）で保存し、収集後１５分以内に使用した。サンプルを１：１０（ｗ／ｖ）に、嫌気性ＰＢＳ溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で希釈し、２分間ホモジナイズした。事前に滅菌したバッチ培養の培養物の発酵用の容器（２８０ｍｌ）に、４５ｍｌの結腸のモデル複合体成長培地（Ｔｅｊｅｒｏ−Ｓａｒｉｎｅｎａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２）を入れた。その後、容器を３７℃の循環水槽に接続し、Ｏ_２を含まないＮ_２ガスを注入し、接種前に嫌気性とした。ｐＨを、ｐＨ計とＮａＯＨ溶液又はＨＣ１溶液を用いて６．７〜６．９へ中和した（Ｅｌｅｃｔｒｏｌａｂ２６０；Ｅｌｅｃｔｒｏｌａｂ Ｌｔｄ．、テュークスベリ、英国）。培養培地へ、上記で作製した５ｍｌの糞便ホモジネート及び１ｍｌの消化されたパンを添加した。
各ドナーに対し、３種類の容器を準備した：
健常被験者用の陰性対照Ａ、及びセリアック病被験者用の陰性対照Ｄ（消化したパンを添加）；
健常被験者の対照パン添加容器Ｂ、及び、セリアック病被験者用の対照パン添加容器Ｅ；
健常被験者用の前記方法で処理した種子の穀粉で作製したパンを添加した容器Ｃ、及び、セリアック病被験者用の前記方法で処理した種子の穀粉で作製したパンを添加した容器Ｆ。

バッチ培養物を４８時間分析し、接種時及び６時間後，２４時間時間後及び４８時間後に、蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の決定による微生物叢の評価に必要なサンプルを採取した。図１４、図１５、及び図１６は、６時間、２４時間、及び４８時間の発酵後のＳＣＦＡ及びＦＩＳＨの結果に関する主要成分の分析結果を示す。

ＦＩＳＨ及びＳＣＦＡ実験で得られた結果を、陰性対照のｔ０（接種時）における増加／減少を基準とし、ドナーのタイプによるばらつきを排除した。それにより結果は、実験開始時に比しての系の変化を示し、微生物の集団又は微生物の代謝産物の増加（正の値）又は減少（負の値）として読み取れる。上記増加／減少を、陰性対照の接種（ｌｏｇ細胞／ｍｌ）とする。

その上、各パラメーターをｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定により分析することにより有意差を特定し、ホモジネート群に対する本手法の使用を、経時的傾向を確立する追加的手段として適用した。以下の表３は、６、２４、及び４８時間の発酵後のビフィズス菌のＦＩＳＨデータにおける、ホモジネート群のＡＮＯＶＡ検定結果を示す。

サンプル間の違いは、６時間後と２４時間後のいずれにおいても有意ではなかった。

一方、４８時間後には２つの統計群が認められた。第一の群は特定のサンプル（対照パンの場合のセリアック病ドナー）のみからなり、第二の群はその他すべてのサンプルからなっていた。

サンプルＥは、おそらく細菌フローラに対するパンの負の効果により、ビフィズス菌集団にいかなる有意な増加も生じなかった（０．２７−ｌｏｇ細胞／ｍｌの増加）が、他のサンプルでは、０．７〜０．９ｌｏｇ細胞／ｍｌの増加が認められた。実際のところ、興味深いデータが得られたのは、健常被験者のサンプルと共にサンプルＦであり、前記方法で処理された穀粉で作製したパンがビフィズス菌集団における正常な傾向を回復させるという有用な効果が示唆された。

表４及び表５は、６時間、２４時間、及び４８時間の発酵（ｌｏｇ細胞／ｍｌ）後の前記細菌群Ｅｒｅｃ４８２（Ｆｒａｎｋｓ Ａ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，１９９８），Ｂａｃ３０３（Ｍａｎｚ Ｗ． ｅｔ ａｌ．，１９９６）に関するＦＩＳＨデータに対する、ホモジネート群のｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定結果を示す。Ｔｈｅ細菌群を、ｐｒｏｂｅＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｅｃｏｌｏｇｙ．ｎｅｔ／ｐｒｏｂｅｂａｓｅ）に報告されている蛍光染料Ｃｙ３でマーキングした１６Ｓ ＲＮＡの特定の領域（Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋ Ｐ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，１９９５）用の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて特定した。

統計分析により、２つ〜４つの重複するホモジネート群で、時間及び微生物の種類に依存するサンプルの連続分布が強調された。前記サンプルの統計分布は、時間経過と共に変化したが、生菌数の増加／減少（−０−３３−０，２６ｌｏｇ細胞／ｍｌ）は、絶対値では中程度であった。

細菌群Ｃｈｉｓｌ５０（Ｆｒａｎｋｓ Ａ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，１９９８）へのパンの添加効果を以下の表６に示す。

６時間後では、サンプルの連続分布が、２つの明確に定義された群（サンプルＡ及びサンプルＢを擁する第一の群；サンプルＥを含む第二の群）及び中間クラス（サンプルＣ、サンプルＤ、サンプルＦ）において認められた。最終的に、サンプルＥ（対照パンの場合のセリアック病ドナー）は、サンプルＤ及びサンプルＦ（陰性対照及び「改変された」パンの場合のセリアック病ドナー）との統計的差異は認められず、健常ドナーのサンプルとの統計的差異も認められなかった。しかしながら、サンプルＦ及びサンプルＤでは、サンプルＣに比しての統計的変化が認められた。この変化は、２４時間後及び４８時間後では認められなかった。

乳酸菌は、以下の表７に示すように、経時的に特徴的傾向を示した。６時間、２４時間、及び４８時間の発酵後のＬａｂ １５８のＦＩＳＨデータにおけるホモジネート群のｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定結果を示す（ｌｏｇ細胞／ｍｌ）。

６時間の発酵後、サンプルＥ及びサンプルＦ（０．５７−０．６４ｌｏｇ細胞／ｍｌ）の乳酸菌集団において減少が認められた。２４時間後、サンプルＥではこの負の傾向が認められたが、サンプルＦでは認められず、乳酸菌集団が増加し、健常被験者におけると類似した傾向が見られた。このことは、グルテンタンパク質が改変された小麦粉で作製されたパンに興味深く且つ有用な効果があることを示唆する。

４８時間後、上記の分布には連続性があった。特に、サンプルＦは、健常被験者とサンプルＥとの間の中間群に位置していた。

細菌群Ｅｕ（Ｅｕｂ３３８ Ｉ，Ｅｕｂ３３８ ＩＩ，Ｅｕｂ３３８ ＩＩＩ（併せて使用）（Ｄａｉｍｓ Ｈ． ｅｔ ａｌ．，１９９９）の統計的結果は、分布が一定であり、異なるサンプル間で有意差は認められなかった。

以下の表８は、６時間、２４時間、及び４８時間の発酵後のＥｕのＦＩＳＨデータにおける、ホモジネート群のｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定結果を示す。

同じ手法を、ＳＣＦＡ（短鎖脂肪酸）の結果の分析に用いた。ＳＣＦＡでは概して、明確に区切られた統計群ごとに結果が分かれて分布しており、有意差が認められた。以下の表９、表１０、及び表１１に結果を示す。

表９は、２４時間後及び４８時間後の酪酸のホモジネート群のｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定を示す。陰性対照に比しての増加平均を示す（ｍＭ）。

表１０は、２４時間後及び４８時間後のプロピオン酸のホモジネート群のｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定を示す。陰性対照に比しての増加平均を示す（ｍＭ）。

プロピオン酸では、健常ドナーのサンプルにおける増加は（２４時間後及び４８時間後の両方において）小さいが、セリアック病ドナーのサンプルにおける濃度は、２３〜３７ｍＭ増加した。

表１１は、２４時間後及び４８時間後の酪酸のホモジネート群のｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定を示す。陰性対照に比しての増加平均を示す（ｍＭ）。

２４時間後では、陰性対照Ｄでは、酪酸が１７ｍＭ増加し、これは最も高い増加として記録され、これにセリアック病ドナーの他の２つのサンプルが続いた（それぞれＥ，７．６ｍＭ及びＦ，４．１ｍＭ）。４８時間後の結果は、興味深い傾向を示し、サンプルＦは、酪酸の純増が４．２８ｍＭである健常ドナーのサンプルと類似のプロファイルを示した。

図１５、図１６、及び図１７は、主要成分の分析により、健常ドナー及びセリアック病ドナー由来のバッチ培養物に関連する全体的な差異を研究したものである。前記ＳＣＦＡ及びＦＩＳＨの結果をすべてインプットした。解析は各分析ごとに行った。

６時間後では、２つの統計群を多元的空間で特定出来た。一つ目は健常被験者由来のサンプル（Ａ、Ｂ、及びＣ）からなり、二つ目はサンプルＥ及びサンプルＦからなるものであった。

セリアック病ドナーの陰性対照（サンプルＤ）は、前記空間の異なる領域に位置していた（図１４）。

２４時間後では、前記空間の分布が劇的に変化した（図１５）。サンプルＢが異なる空間領域にシフトしたため、健常ドナー由来の群は２つの小群に分かれた。サンプルＦは、セリアック病被験者のサンプルによって占められた分割領域からシフトし、前記健常被験者Ａ及びＣのサンプルの領域に移動しており、興味深い結果となった。４８時間後にも類似の効果が認められた（図１６）。

実施例４：結腸の近位部、横断部、及び遠位部をシミュレートしたモデル系を用いた、健常患者及びセリアック病の腸内フローラの組成及び代謝の改善における治療効果の研究

結腸の近位部、横断部、及び遠位部（それぞれ容器１、容器２、及び容器３）をシミュレートした三段階連続発酵培養により、対照及び本発明の前記グルテンエピトープ解毒方法に従って処理した穀粒による改変されたパンの効果を評価した。

既知の代謝性疾患又は消化器疾患（糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群、消化性潰瘍、及びガンなど）に罹患していない、糞便サンプル取り出し前の６ヶ月以内にいかなるプロバイオティクス又はプレバイオティクスサプリメント及び抗体も摂取していない２名の健常者ボランティア及び２名のセリアック病患者ボランティア（３０〜５０歳代の男性及び女性；ＢＭＩ：１８，５〜２５）から、糞便サンプルを得た。

糞便サンプル要請前に、健常ドナーに基本的な質問を行い、健康状態、薬の摂取、病歴、及びライフスタイルに関する情報を収集した。本研究は、ローハンプトン大学（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｅｈａｍｐｔｏｎ）倫理委員会（ＵＲＥＣ １５／２０）によって承認された。

糞便サンプルを、内部に嫌気性条件を作り出す目的でガス再生キット（ＡｎａｅｒｏＧｅｎＴＭ，Ｏｘｏｉｄ）を入れた嫌気性瓶（ＡｎａｅｒｏＪａｒＴＭ ２，５Ｌ，Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ）に保存した。各サンプルのアリコート２０ｇを、１００ｍｌの嫌気性ＰＢＳ溶液（０．１Ｍリン酸塩溶液、ｐＨ７．４、ｗ／ｗ）で希釈し、２分間ホモジナイズした（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ４００，Ｓｅｗａｒｄ，ウェスト・サセックス、英国）。

サンプルを、調製後１５分以内に、前記嫌気性ファーメンターへ添加した。体積が順に大きくなるように直列に連結した３つのガラスファーメンターからなる三段階連続システムで、物理化学的な結腸条件を繰り返した。本研究では最初にＭａｃｆａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）が検証した系の小規模なバージョンを使用した。当該系中、容器１（ＶＩ、８０ｍｌ）が前記結腸近位部を示し、容器２（Ｖ２、１００ｍｌ）が前記結腸横断部を示し、容器３（Ｖ３、１２０ｍｌ）が前記遠位部を示す。健常者及びセリアック病被験者の２０％（ｗ／ｖ）糞便ホモジネートを含む成長培地を接種した。成長培地には、以下の成分が含まれる：デンプン、５ｇ／ｌ；ムチン、４ｇ／ｌ；カゼイン、３ｇ／ｌ；ペプトン水、５ｇ／ｌ；トリプトン水、５ｇ／ｌ；胆汁酸塩、０．４ｇ／Ｌ；酵母エキス、４．５ｇ／ｌ；ＦｅＳ０_４、０，００５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、４．５ｇ／ｌ；ＫＣ１、４．５ｇ／ｌ；ＫＨ_２Ｐ０_４、０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳ０_４ｘ７Ｈ_２０、１．２５ｇ／ｌ；ＣａＣｌ_２ ｘ ６Ｈ_２０、０．１５ｇ／ｌ；ＮａＨＣ０_３、１．５ｇ／ｌ；Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍＬ；ヘミン、０．０５ｇ／ｌ；及びシステインＨＣ１、０．８ｇ／ｌ。

植え付け後、細菌の集団を、２４時間バッチ培養で安定化した。２４時間後（Ｔ０）、モデル系で８回分の全体積の安定状態（ＳＳＩ）が達成された（ＳＣＦＡプロファイルの安定化により検証（＋／−５％））。

前記モデル系の稼働容量（３００ｍｌ）及び保持時間（４８時間、流速６．２５ｍｌ／時）を踏まえ、Ｍａｃｃａｆｅｒｒｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ．（２０１２）に記載の手順による適切な条件でインビトロ消化された、対照パン又は改変されたパン（３．７５ｍｌ）を、容器ＶＩへ添加した。パンを系に添加し、さらに８回分の全体積の安定状態２（ＳＳ２）を達成した。

４．５ｍＬのアリコートを取り出し、ＳＳＩ（Ｔ０日目）及びＳＳ２（Ｔ_３０日目）のタイミングで分析した。

前記結腸の３部位をシミュレートしたモデル系の細菌組成の変化を、ＦＩＳＨ分析（図１７及び図１８）で評価し、前記細菌フローラの代謝の変化を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）（図１９及び図２０）の決定により評価した。

図１７に示す健常人に対する対照パンの効果の結果では、ラクトバチルス／エンテロコッカス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ／Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）（プローブＬａｂ１５８で検出）（容器ＶＩ及び容器Ｖ２）、バクテロイデス−プレボテーラ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ−Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）群（Ｖ２）（プローブＢａｃ３０３で検出）及びクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）クラスターＸＩＶａ＋ｂ（ＶＩ）（プローブＥｒｅｃ４８２で検出）の菌数が有意に減少した。

全細菌数減少の傾向が、前記モデル系のすべての工程で認められたが、こうした差異は有意なものでなかった。よって、対照パンは、糞便細菌フローラの調節及び組成に正の効果を及ぼさなかった。

一方、本発明の方法で処理したパンの投与により、セリアック病ボランティア及び健常ボランティアの両方で、ビフィズス菌（プローブＢｉｆｌ６４で検出）が有意に増加した。

特に、セリアック病被験者では、モデル系の第二工程（容器２）で８．４２Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌから８．９０Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）へ、容器３で８．６０Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌから９．２０Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）へ、それぞれビフィズス菌の有意な増加が認められた。

健常被験者では、容器３で７．９０Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌから８．４０Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）へとビフィズス菌数の有意な増加が認められた（図１８）。

さらに、セリアック病ボランティアでは、全容器においてそれぞれ、８．８５Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌから９．５０Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）へ、９．１Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌから９．６０Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ（Ｐ＜０．０１）へ、９Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌから９．５０Ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ（Ｐ＜０．０５）へ、クロストリジウムクラスターの有意な増加が認められた。

全細菌群及び全容器における全体的な増加傾向が、健常者被験者及びセリアック病被験者の双方で、有意差なく認められた。

前記モデル系の３種類の容器におけるＳＣＦＡを、ＳＳ１及びＳＳ２の時点でＨＰＬＣにより測定した（図１９及び図２０）。対照パンの投与により、酢酸塩（Ｖ１及びＶ２）及びプロピオン酸塩（Ｖ１）の有意な低下及び全容器での酪酸塩の上昇が誘発される（図１９）。

健常被験者において、改変されたパンを用いた培養では、Ｖ１で２８．８０ｍＭから２２．１０ｍＭ（Ｐ＜０．０１）へ、Ｖ２で４４．４０ｍＭから５６．９４ｍＭ（Ｐ＜０．０１）へ、Ｖ３で４６ｍＭから７６．５０ｍＭ（Ｐ＜０．００１）へと酢酸塩がそれぞれ有意に生産された。さらに、プロピオン酸塩濃度は、Ｖ１で７０．４６ｍＭから８９．８１ｍＭ（Ｐ＜０．０５）へ、酪酸塩濃度は、Ｖ３で４０．３５ｍＭから７７．０９ｍＭ（Ｐ＜０．０５）へと有意な増加が観察された。セリアック病ボランティアでは、プロピオン酸塩濃度は、容器１で４５．１０ｍＭから６９．２０ｍＭ（Ｐ＜０．０１）へ、容器２で５０．８０ｍＭから７０．２０ｍＭ（Ｐ＜０．０５）へとそれぞれ有意な増加が観察された。

さらに、容器１における酢酸塩濃度は、４１．２０ｍＭから８９ｍＭ（Ｐ＜０．０１）へと有意に増加した（図２０）。

健常被験者における対照パンでは認められなかった、酢酸塩及びプロピオン酸塩濃度の上昇を伴う結腸内微生物叢の調節が、前記改変されたパンを用いたインビトロ培養では誘発されたことが、上記結果から推測される。

酢酸塩及びプロピオン酸塩産生において、最も知られている消化器系細菌の代謝経路は、多糖類代謝に関係する。

酢酸塩産生は、主にビフィズス菌によるフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの代謝経路によって達成され、当該酸の主な産生は、細菌増強（bacteria enhancement）に厳密に相関する（Ｍｉｌｌｅｒ Ｔ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

Ｈｏｓｓｅｉｎｉ Ｅ． ｅｔ ａｌ．（２０１１）によると、プロピオン酸塩は、２つの代謝経路により発酵可能な炭水化物によって産生され得る。一つ目は、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）及びプロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）の存在下におけるコハク酸エステル脱炭酸を期するものであり、二つ目は、いくつかのクロストリジウムクラスターの存在下で、乳酸脱水素酵素によりピルビン酸塩が乳酸塩に還元される、アクリレートの代謝経路を期するものである。改変されたパンを用いた培養では、ビフィズス菌、バクテロイデス属、及びユーバクテリウム・レクタレ（Ｅ．ｒｅｃｔａｌｅ）群の有意な増加が観察された。

改変されたパンは、健常ドナー及びセリアック病ドナーの両方において、ＳＣＦＡ濃度を上昇させると共に、微生物叢の組成の正の調節を示した。

そして、改変されたパンを用いた培養により、健常被験者及びセリアック病被験者の双方におけるビフィドジェニック効果、及びセリアック病被験者におけるクロストリジウムＸＩＶａ＋ｂの増加数に対して、正の調節が生じる。

健常被験者において、容器１では酢酸及びプロピオン酸濃度が低下したが、容器Ｖ２及び容器Ｖ３では酢酸濃度は大幅に上昇し、また容器Ｖ３では酪酸濃度が上昇した。さらに、セリアック病被験者では、容器Ｖ１において高濃度の酢酸及びプロピオン酸が観察され、容器Ｖ２において高濃度のプロピオン酸塩が観察された。

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Claims (16)

1. ａ）穀粒を水で水和させて、前記穀粒の含水率を１５％〜１８％とすること；
   ｂ）前記穀粒の温度が６０℃〜７０℃に達するのに必要な電力で、所与の時間、電磁波によって、前記水和した穀粒を処理すること；
   ｃ）５０℃〜６０℃の温度に達するまで前記照射を一時中断し、同時に起こる水分蒸発によって前記穀粒の含水率を工程ａ）と比較して１４％〜１６％減少させること；
   ｄ）前記穀粒の温度が８０℃〜９０℃に達するのに必要な電力で、所与の時間、電磁波によって、前記水和した穀粒を処理すること；
   ｅ）７０℃〜８０℃の温度に達するまで前記照射を一時中断し、同時に起こる水分蒸発によって前記穀粒の含水率を工程ａ）と比較して４０％〜４４％減少させること；
   ｆ）前記穀粒の温度が１１０℃〜１２０℃に達するのに必要な電力で、所与の時間、電磁波によって、前記水和した穀粒を処理すること；
   ｇ）８０℃〜９０℃の温度に達するまで前記照射を一時中断し、同時に起こる水分蒸発によって前記穀粒の含水率を工程ａ）と比較して５０％〜６０％減少させること；
   ｈ）室温で前記解毒された穀粒を低速冷却すること、
   を含む、穀類の穀粒に由来するグルテンを解毒する方法。
2. 前記電磁波がマイクロ波又は赤外線である、請求項１に記載の方法。
3. マイクロ波を用いる場合に、前記水和した穀粒を処理する工程を電子レンジで行う、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. さらにｉ）前記工程ｈ）で得られた前記穀粒を製粉して、解毒された穀粉又はセモリナを得る工程を含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. 工程ｉ）で得られた解毒された穀粉又はセモリナからグルテンを溶媒で抽出する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 穀類が小麦、大麦、オルゾー、ライ麦又はエンバクから選択される、前記請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
7. 請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法によって得られる解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、又はグルテン。
8. パン、パスタ、ベーカリー製品、朝食用シリアル、ビール、アイスクリーム、乳製品、ソース、ジュース、ベビーフード及びサラミから選択される、請求項７に記載の解毒された穀類、穀粉、セモリナ、又はグルテンを含む食品。
9. 腸内細菌叢異常の予防又は治療に使用するための、請求項７に記載の解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、若しくはグルテン又は請求項８に記載の食品。
10. セリアック病、潰瘍性大腸炎，クローン病、及び過敏性腸症候群からなる群から選択される炎症性疾患又は自己免疫性慢性腸疾患の予防又は治療に使用するための、請求項７に記載の解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、若しくはグルテン又は請求項８に記載の食品。
11. 肥満、１型糖尿病、及び２型糖尿病から選択される全身代謝性疾患の予防又は治療に使用するための、請求項７に記載の解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、若しくはグルテン又は請求項８に記載の食品。
12. グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対する抗菌剤として使用するための、請求項７に記載の解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、若しくはグルテン又は請求項８に記載の食品の使用。
13. 前記グラム陰性細菌が、サルモネラ属、好ましくはサルモネラ・ティフィリウム種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に属し、前記グラム陽性細菌が、ブドウ球菌属、好ましくは黄色ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に属する、請求項１２に記載の解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、グルテン又は食品の使用。
14. 有用なプロバイオティクス種に対する保護剤として使用するための、請求項７に記載の解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、若しくはグルテン又は請求項８に記載の食品の使用。
15. 前記プロバイオティクス種が、ラクトバチルス属、好ましくはラクトバチルス・アシドフィルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）に属する、請求項１４に記載の解毒された穀粒、穀粉、セモリナ、グルテン又は食品の使用。
16. 食品の調製のための増粘剤としての、請求項７に記載の解毒されたグルテンの使用。