KR20180099662A

KR20180099662A - 곡물 낟알에서 글루텐 단백질의 해독 방법 및 그 의료 분야에서의 용도

Info

Publication number: KR20180099662A
Application number: KR1020187016926A
Authority: KR
Inventors: 카멜라 라마키아
Original assignee: 뉴 글루텐 월드 에스.알.엘.
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-09-05
Also published as: CN108697127B; WO2017103214A1; MD3389400T2; RS59492B1; ECSP18047901A; AU2016372550A1; LT3389400T; CL2018001589A1; ME03543B; MA45879A; US20190000118A1; BR112018011911A2; JP2019503170A; GEP20207133B; DK3389400T3; EA201891158A1; PT3389400T; SG11201805063UA; SI3389400T1; EP3389400B1

Abstract

본 발명은 곡물의 낟알에서 글루텐 단백질을 해독하는 개선된 방법에 관한 것으로 글루텐 단백질의 독성 에피토프의 항원성을 0 내지 20 ppm 범위로 감소시켜 해독된 밀가루를 수득하는 것을 가능하게 하며, 박테리아 또는 바이러스 감염 제제 또는 셀리약 병(celiac disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease) 및 과민성 장 증후군(irritable intestine syndrome)과 같은 강한 염증성 또는 자가면역 성분을 갖는 병리학에 의해 유발된 장내세균 불균형에 대한 예방 및/또는 치료 효과를 나타내는 식품 제품(예를 들어, 베이커리 제품, 파스타 또는 유제품)의 제조에 유리하게 사용될 수 있다.

Description

곡물 낟알에서 글루텐 단백질의 해독 방법 및 그 의료 분야에서의 용도

본 발명은 곡물의 낟알에서 글루텐 단백질을 해독하는 개선된 방법에 관한 것으로 글루텐 단백질의 독성 에피토프의 항원성을 0 내지 20 ppm 범위로 감소시켜 해독된 가루를 수득하는 것을 가능하게 하며, 박테리아 또는 바이러스 감염 제제 또는 셀리약 병(celiac disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease) 및 과민성 장 증후군(irritable intestine syndrome)과 같은 강한 염증성 또는 자가면역 성분에 의한 병리에 의해 유발된 장내세균 불균형(gut dybiosis)에 대한 예방 및/또는 치료 효과를 나타내는 식품 제품(예를 들어, 베이커리 제품, 파스타 또는 유제품)의 제조에 유리하게 사용될 수 있다.

글루텐(gluten)은 주로 단백질로 구성된 식품 복합체이다. 프롤라민(prolamins)은 곡물 영과(caryopsis)에 존재하는 전체 단백질 분율의 약 80%를 구성하고 히드로알코올(hydroalcoholic) 용액에서의 용해도를 기준으로 글리아딘과 글루테닌으로 분류된다. 히드로알코올 용액에서 용해되는, 글리딘은, 단량체 조건이 오메가-글리아딘의 경우처럼, 시스테인 잔기의 부재로 인한 것 또는 분자 내 이황화 결합만의 존재(나머지 글리아딘) 로 인한 것인 (전기영동의 이동도에 따라)알파, 베타, 감마 및 오메가로 일반적으로 분류되는 단량체 분자이다.

대신에, 글루테닌은 분자간 내 이황화 가교(bridge)에 의해 안정화된, 고(HMW-GS) 및 저(LMW-GS) 분자량을 가지는 서브-유닛(sub-unit)으로 구성된 히드로알코올 수용액에서 불용성인 고분자 복합체이다.

글리아딘 및 글루테닌은 가루에 기술적 특성을 제공한다; 글리아딘은 반죽의 점도에 기여하는 반면, 글루텐은 탄력과 점착력(tenacity)을 책임진다.

특히, 글루테닌 중합체의 양과 크기(dimension)는 반죽의 기술적 특성과 양의 상관 관계가 있다.

따라서, 글루테닌 중합체의 이러한 특성은 다소 연장된 중합체를 형성하는데 개별 성분 서브-유닛의 능력에 의존한다.

글루텐은, 특히, 곡물 영과에는 존재하지 않지만, 후에 형성된다; 단백질 복합체로서 글루텐은 수화 작용 및 니딩(kneading)의 기계적 작용에 의해 형성되며 반죽에 점성과 탄력을 제공하기 때문에, 가루의 가공과 제빵을 위한 필수 요소이다.

잘 알려진 바와 같이, 물이 밀가루에 첨가되면, (단일 단백질 사슬에 의해 형성된) 글라이딘은 수화하기 시작하며 글루텐 메쉬(mesh)에 연장성을 제공하는 원섬유(fibril)(작은, 얇은 섬유)를 형성한다. 동시에, (여러 서브-유닛을 포함하는) 글루테닌도 조립되어, 메쉬를 발생시키고 안정적이고 고도의 응집성 구조를 형성하여, 반죽에 일관성(consistency)과 연장 및 탄성에 대한 일정한 저항성을 제공한다.

부풀어오름(leavening)의 강도와 정도는 따라서 가루의 글라이딘과 글루테닌 함량 사이의 비율에 달려있다. 두 종류의 단백질 사이의 비율은 고려되는 곡물의 다양성에 달려 있으며 글루텐에 변형 및 늘어짐(stretching)에 저항할 수 있는 능력을 제공한다.

기계적 니딩 작용을 하는 동안, 글리아딘 원섬유와 글루테닌 중합체가 서로 얽히기 시작하면서, 전분 과립, 지질, 무기 염, 물 및 기포를 포함하는 3차원 메쉬를 형성하며, 후자는 효모의 알코올 발효에 매우 중요하고, 상기 효모는 첨가되어 알코올 및 이산탄소의 생산을 통해, 상기글루텐의 메쉬의 확장을 결정하고, 상기 글루텐의 확장 및 늘어짐은 상기 반죽의 부피를 증가시킨다. 후속 요리는 상기 단백질의 변성/응고를 결정하고, 상기 글루텐은, 늘어지는 능력을 잃어버리고, 그래서 반죽의 구조 및 모양을 비가역적으로 안정화시킨다.

단백질 복합체로서, 글루텐은 라이신, 메티오닌 및 트립토판과 같은, 필수 아미노산이 불충분하기 때문에, 특별한 영양 특성을 갖지 않는다.

식이에 이 화합물이 없더라도 특별한 영양 위험이 초래되지 않는다.

반면에, 글루텐은 특히 장 점막과 관련하여, 독성 작용을 수행할 수 있다; 세포를 손상시키는(cytodamaging) 사이토카인의 염증성 캐스케이드를 유발하는 것과 같은, 밀 글루텐 및 호밀, 보리 및 귀리의 상응하는 단백질에 대한, 영구적 불내성은 셀리약 병으로 정의된다.

초기에, 글루텐의 독성 작용은 글라이딘의 알파 분획에 의하여 야기되는 것으로 생각되었다; 이어서, 보리(호르데인), 호밀(세칼린) 및 귀리(아베민)와 같은 유사한 곡물의 프롤아민인, 오메가 글리아딘 및 글루테닌 또한 장 점막에 손상을 야기할 수 있다는 것이 입증되었다.

33-mer로 알려진 알파-글리아딘의 33개 아미노산의 펩티에 대한 최근 연구가 관심을 끌고 있다; 상기 펩티드는 조직 트랜스글루타미나제에 대해 높은 친화성을 가지고 있어서, 장의 점막에 전체(whole)로 도달하고, 소화 효소의 단백질 분해 작용을 견딜 수 있어, 민감성 개체에서 강력한 면역원성 작용을 발휘한다; 이 작용은 세포를 손상시키는 염증성 사이토카인을 방출하는 CD4 T 림프구의 강력한 활성화에 의해, 상기 펩티의 상기 독성 에피토프의 탈아미드화(deamidation)의 결과로서, 결정될 것이다(Shuppan D. et al., 2009).

알파-글리아딘의 다른 독성 에피토프가 셀리약 환자의 장 점막의 이식편(explants)로부터 유래한 장세포(enterocytes)의 세포사멸을 외견상 유도할 수 있음이 또한 증명되었다.

따라서, 글루텐은 사이토카인의 염증성 캐스케이드를 유발함으로써, 및 직접적인 독성 효과를 야기함으로써 장 점막에 해로운 영향을 미친다.

일반 인구의 약 30%가 셀리약 병 감수성 유전자인, HLA-DQ2/8을 가진다; 그러나, 이들 중 2-5%만이 실제로 셀리약 병을 일으킬 것이며, 이는 추가적인 환경 요인이 질병의 발생에 기여한다는 것을 시사한다(Rossi M. et al., 2010). 셀리약 병의 발생에 영향을 미치는 추가 요인은 알려지지 않았지만, 장내 미생물총(microbiota)의 변화를 포함할 수 있다. 사실, 일부 연구는 셀리약 병이 진행 중인 환자가 건강한 개체와 비교하여 대변(fecal) 및 십이지장 미생물의 질-양적 조성(quali-quantitative composition)이 변화되었고, 그 후 글루텐-프리(gluten-free) 식이 요법에 의해 치료한 후 부분적으로 회복된다는 것을 보여주었다. 특히, 가장 중요한 변화는 활성 셀리약 병을 가진 소아 및 성인에서 피르미쿠테스(Firmicutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 양의 변화와 관련이 있다(Sanchez E. et al., 2013; Wacklin P. et al., 2013). 다른 연구들은 활성 셀리약 병 환자에서 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은, 항-염증 효과를 가진 보호 박테리아의 농도 감소 및 박테로이데스(Bacteroides) 및 대장균(Escherichia coli)과 같은, 그람-음성균의 증가를 보고하였다(Collado M. et al., 2009; Collado M. et al., 2008; Di Cagno R. et al., 2011).

또한, 셀리약 병의 영향을 받은 소아들은 포도상구균(Staphylococcus spp.) (Collado M. et al., 2009; Collado M. et al., 2008; Di Cagno R. et al., 2011), 클로스트리디움(Clostridium spp.) (Di Cagno R. et al., 2011; De Palma G. et al., 2010)의 증가 및 락토바실러스균(Lactobacillus spp.) (Di Cagno R. et al., 2011, Sanz Y. et al 2007; Nadal M. et al., 2007)의 감소가 일반적으로 나타난다. 또한, 셀리약 병 환자는 단쇄 지방산(short chain fatty acids, SCFA)의 생산 측면에서 미생물총의 변화된 구성과 대사 기능을 보였다(Di Cagno R. et al., 2011; Schippa S. et al., 2010). 연구는 셀리약 병에 영향을 받은 환자에서 장내 미생물 조성은 질병의 임상적 증상과 관련이 있음을 입증하였다. 위장관 증상이 있는 환자의 장내 플로라(flora)은 프로테오박테리아가 지배적인 반면, 포진형 피부염(Dermatitis Herpetiformis) 환자 또는 소화 불량증(dyspepsia)을 가지고 사는 개체(대조군)의 미생물총은 피르미쿠테스의 우세(prevalency)를 보였다(Wacklin P. et al., 2013).

지금까지, 셀리약 환자의 유일한 치료법은 식이에서 글루텐을 완전히 배제하는 것이었다. 소위 "글루텐-프리(gluten-free)" 식이 요법은 많은 증상을 완화하지만, 놀랍게도 그러한 치료법은 건강한 개체에 존재하는 미생물총의 프로파일을 완전히 회복시키지 못함을 암시하였다(Wacklin P. et al., 2014).

식이 자체가 정상적인 미생물 모델에 따른 완전한 회복을 방해하는 것으로 보인다. 글루텐-프리 식이를 한 건강한 환자들에게서도, 유용한 박테리아가 기회주의 병원체(opportunist pathogens)로 빠르게 대체됨에 따라 그람-양성균 및 그람-음성균 간의 정교한 균형이 깨지며, 된다. 장기간의 결과는 면역 방어의 약화와 만성 염증 상태로 이어질 수 있다. 이것은 셀리약 환자가 엄격한 글루텐-프리 식이를 준수하는 동안, 염증 및 감염의 위험에 여전히 도출되고, 잠재적으로 건강상 위험의 증가뿐만 아니라 다소 불쾌한 증상을 겪을 수 있는 상황을 야기한다. 셀리약 병의 관리에 있어서 프로바이오틱스의 잠재적 사용은 셀리약 병 및 장벽 기능과 면역계의 선천성, 적응성 반응 조절을 유지함에 있어 잠재적으로 유익하게 유익한 박테리아(beneficially beneficial bacteria)(즉, "프로바이오틱스")에 기인하는 역할과 관련된 장내세균 불균형에 의해 뒷받침된다. 도 1은 셀리약 병의 병인을 설명하는 모델을 보여준다. 숙주와 환경 요인의 특정한 유전적 구성은 잠재적인 장내 유해균(pathobiont)의 콜로니화(colonization)를 촉진하고 공생충(symbionts)을 감소시킴으로써, 불균형을 결정할 수 있다. 불균형은 장의 항상성과 면역 무결성(integrity)을 방해하는데 기여함으로써, 셀리약 병의 발생(insurgence)을 촉진하고 병인을 악화시킬 수 있다(Cenit M.C. et al., 2015).

이 가설을 바탕으로, 현재까지 이중 맹검법(double-blind procedure)으로 위약으로 통제된, 무작위로 선정된 셀리약 환자에 대한 많은 중재(interventions)로서 세 가지 연구가 수행되었다. 이러한 중재 중 하나에서, 글루텐-프리 식이와는 독립적으로 프로바이오틱스의 효과를 평가하기 위하여 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis) NLS을 미치료 셀리약 환자에게 투여하였다. 이 연구는 비피도박테리움 인판티스 NLS의 투여 후 셀리약 병을 가진 미치료 환자에서, 위장 증상, 특히 소화 불량과 변비의 개선을 나타냈다. 또한, 설사 또는 복부 통증의 상태, 또는 일부 사이토카인 및 케모카인의 혈청 수준에서 측정된 변화된 장내 투과성 또는 염증촉진성 상태(pro-inflammatory state)를 변화시키지 못했다(Smecuol E. et al., 2013). 중재에 관한 또 다른 연구는 이들 프로바이오틱 이식 박테이라가 글루텐-프리 식이의 효과를 향상시킬 수 있는지 평가하기 위해서, 글루텐-프리 식이를 한 소아 셀리약 병 환자에게서 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) CECT 7347의 영향을 분석하였다. 이 연구는 위약으로 치료받은 군과 비교하여 비피도박테리움 롱검 CECT 7347을 투여한 후 CD3+ 말초 T 림프구의 감소와 TNF-α의 혈청 수준 감소의 경향 및 대변(feces)에서 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 및 sIgA의 수에서 유의적으로 감소하는 것을 또한 보여주었다(Olivares M. et al., 2014). 최근 3개월 간의 장기간의 연구는 위약과 비교하여, 글루텐-프리 식이를 한 셀리약 병을 가진 소아에서, 비피도박테리움 브리브(Bifidobacterium breve) B632 균주 및 비피도박테리움 브리브 BR03 균주 조합의 효과를 평가하였다. 이 연구는 비피도박테리움 브리브 균주가 글루텐-프리 식이를 한 셀리약 병을 가진 소아에서 염증촉진성 TNF-α의 생성을 감소시킨다는 것을 보고하였다(Klemenak M. et al., 2015).

셀리약 병을 예방하고 돌보는데 있어서 치료법으로써 프로바이오틱스의 사용의 한계는 그것들이 장에 살아서 도달해야 하고 장 세포에 부착해야 하는 미생물이라는 사실에 있다. 또한, 프로바이오틱스는 콜로니화가 일시적일 수 있는 외인성(exogenous) 미생물이고 앞서 언급한 연구에서 얻은 프로바이오틱스의 가장 보통의 결과는 또한 상업적 제조물(preparation)에 존재하는 비교적 적은 수의 박테리아 및 개별 종들이 40,000종 이상의 다른 종에 속하는 무수한 박테리아를 포함하는 장내 플로라(flora)와 경쟁하지 못할 수도 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다.

이 필요성 -즉, 존재하는 글루텐이 면역원성이 아닐 뿐만 아니라, 실제로 미생물총의 균형이 회복될 때까지 유용한 미생물과 관련하여 보호제로서 작용하는 셀리약 환자의 장내 미생물총을 강화시킬 수 있는, 약한 유용 미생물총에 의해 생성된 항상성의 상실로 인한, 셀리약 병의 예방 및 식이 치료에서 사용될 수 있는, 밀에서 빵과 유래된 반죽(past)과 같은, 지중해 식이(Mediterranean diet)의 전형적인 식품 산물을 생산할 수 있는 필요성으로부터 본 발명이 생성되었다.

국제특허출원 WO2014/053891은 곡물 낟알을 셀리약 환자에게 비-면역원성으로 만들고 독성 에피토프의 항원성을 60 내지 40 ppm의 범위로 감소시키기 위해 곡물의 낟알로부터 글루텐 단백질의 해독을 위한 방법을 개시하고 있다(Lamacchia C. et al., 2016).

본 발명의 저자는 해독된 가루뿐만 아니라, 단백질의 항원성이 0 내지 20ppm의 범위로 더욱 감소되어 있고 훨씬 넓은 범위의 환자에서 염증 및/또는 감염의 결과로서 약한 유용 미생물총에 의해 야기되는 장내세균 불균형의 예방 및 치료에서의 치료적 효과를 갖는, 가루를 얻는 것에 관한 곡물 낟알로부터 글루텐 단백질을 해독하기 위한 개선된 방법을 고안하였다. 특히, 본 발명의 저자는 글루텐 단백질이 본 발명에 따른 분쇄(milling) 전에 수화된 곡물을 가공하는 방법의 단계의 특정 교대(alternation)에 의해 도달할 수 있는 유리 전이 상태(state of vitreous transition)를 확인하였다: 신속한 마이크로파 가열 및 상기 곡물에 함유된 유리 및 결합된 물의 증발.

보다 구체적으로, 신속한 마이크로파 가열 및 곡물에 함유된 물의 느린 증발의 단계의 교대를 통해, -셀리약 환자에게 면역원성 및 독성이 없는 것 이외에-글루텐의 독성 에피토프의 항원성을 0 내지 20 ppm 범위로 감소시키고, 놀랍고 예기치 않은 방법으로, 동일한 셀리약 환자의 유용한 장내 미생물을 강화시킬 수 있고, 균형을 회복시키며, 수많은 다른 만성 조건에서도 존재하는 장 염증의 항진 및/또는 지속을 방지하는 글루텐을 가진 가루 생산의 문제를 해결할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법을 통해 약한 프로바이오틱 마이크로플로라(microflora)에 의해 생성된 항상성 상실에 의해 야기된, 셀리약 병(celiac disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease) 및 과민성 장 증후군(irritable intestine syndrome)과 같은 만성 장 염증성 병리의 예방 및 식이 치료에서 사용될 수 있는, 상이한 식품 제품(즉, 제빵 또는 베이커리 제품 또는 파스타)을 생산할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 곡물의 낟알(grains of cereals)에서 글루텐의 해독을 위한 방법에 관한 것이다:

a) 곡물 낟알을 15 내지 18%로 구성된 낟알의 습도까지 물로 수화시키는 단계:

b) 수화된 낟알을 60 내지 70℃로 구성된 낟알의 온도에 도달하는데 필요한 시간 동안 및 전력으로 전자기파, 바람직하게는 마이크로파 또는 적외선을 처리하는 단계;

c) 50 내지 60℃로 구성된 온도에 도달할 때까지 상기 조사를 중단시키고 및 동시에 a) 단계와 비교하여 14 내지 16%로 구성된 낟알의 습도 손실에 의한 수분 증발시키는 단계;

d) 상기 수화된 낟알을 전자기파, 바람직하게는 마이크로파 및 적외선으로 80 내지 90℃로 구성된 낟알의 온도에 도달하는데 필요한 시간 동안 및 전력으로 처리하는 단계;

e) 70 내지 80℃로 구성된 온도에 도달할 때까지 조사를 중단시키고 및 동시에 a) 단계와 비교하여 40 내지 44%로 구성된 낟알의 습도 손실을 갖는 수분 증발을 시키는 단계;

f) 상기 수화된 낟알을 전자기파, 바람직하게는 마이크로파 및 적외선으로 110 내지 120℃로 구성된 낟알의 온도에 도달하는데 필요한 시간 동안 및 전력으로 처리하는 단계;

g) 80 내지 90℃로 구성된 온도에 도달할 때까지 마이크로파 오븐 내를 조사하는 것을 중단시키고 및 동시에 a) 단계와 비교하여 50 내지 60%로 구성된 낟알의 습도 손실을 갖는수분 증발시키는 단계;

h) 실온에서 상기 해독된 낟알을 서서히 냉각시키는 단계.

상기 방법은 바람직하게는 마이크로파, 구체적으로는 수화된 낟알의 상이한 처리 단계에서 상기 마이크로파를 방출하기 위한 장치로서 마이크로파 오븐을사용하여 수행된다.

대안으로, 전자기파(electromagnetic waves)를 방출하기 위해 레이저 장치가 사용될 수 있다.

바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 단계 h)의 낟알을 분쇄하여 가루 또는 세몰리나를 수득하는 단계 i)를 더 포함한다. 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 l) 해독된 글루텐을 수득하기 위하여 단계 i)의 가루 또는 세몰리나로부터 용매(즉, 염화나트륨의 물/생리 식염수)로 추출하여 해독된 글루텐을 수득하는 단계 l)을 더 단계를 포함한다.

용어 "주변 온도(ambient temperature)"는 바람직하게는 20℃ 내지 25℃의 온도 범위를 의미한다.

바람직하게는, 낟알은 곡물, 바람직하게는 밀, 보리, 호밀 또는 귀리이다.

본 발명에 따른 방법의 단계 b), d), f)에서, 중요한 것은 낟알 내에 포함된 물을 통해, 짧은 시간 내에 고온에 도달하도록 하는, 전자기파의 전력(power)이 아니라, 낟알 내에 도달되는 온도이다.

도 2의 그림은 마이크로파 그 자체가 글루텐 단백질의 구조 변화를 결정하는 것이 아니라, 오히려 주어진 온도 및 습도 조건의 달성이 특히 낟알의 습도 함량이 5-7%에 도달하고 온도는 약 100℃에 도달하는 조사 정지-물의 증발의 마지막 단계(방법의 단계 g)에서 글루텐 단백질의 구조 변화를 결정한다는 것을입증한다. 도 2에서 오직 이 단계에서만, 글루텐 단백질이 더 이상 낟알 내에 형광 항체로부터 완전히 인식되지 않는다는 것이 또한 명백(readily apparent)하다.

상기에서 기술한 모든 단계가 필요하다: 단계 a)의 15 내지 18%의 습도로 낟알을 수화시키는 것은 종자가 열화(thermalization) 과정에서 전자기파, 바람직하게는 마이크로파를 열 에너지로 변환하는데 필요한 물의 양을 축적할 수 있다.

물 분자는 전기장의 작용 하에 회전, 진동 및 정렬할 수 있다. 그들의 움직임에서, 그들은 이웃하는 분자들과 충돌하고 이러한 종류의 분자 마찰(rubbing)은 조사된 질량의 가열을 야기한다.

마이크로파로 그 다음 단계 b)의 조사는 60 내지 70℃의 온도에 도달해야 하는 조사 제1 단계에서 시료를 가열할 수 있다. 습도가 높을수록, 도달해야하는 원하는 온도에 도달하기 위해 일정 시간 간격으로 적용되는 전력이 낮아진다. 원하는 온도에 도달하는 시간 간격은 조사되어질 질량의 함수이다.

예: 습도가 15-18%인 낟알 100g은 750W의 전력을 공급하여 1분 후에 60-70℃의 온도에 도달할 것이다.

따라서, 습도는 적용되는 전력에 반비례 관계가 있지만, 조사 시간은 조사되는 시료의 질량에 직접적으로 비례한다.

조사 중단-증발 단계는 낟알의 최 내층에서 주변부(periphery)로 및 주변에서 표면으로 및 낟알의 표면에서 외부 환경으로 물을 전달하는 과정을 허용하기 위하여 바람직하게는 마이크로파 오븐 내에서 수행되어야 한다. 이 과정은 천천히 일어나야 하고 낟알을 가열에 사용되는 장치, 즉 마이크로파 오븐의 외부 온도에 노출시키지 않아야 한다. 이것은 낟알 표면에 물의 증발만을 야기하고, 상기 분자에 결합된 물의 일부를 제거하지 못하게 할 수 있다.

조사 및 조사 중단-증발 단계는, 글루텐 단백질의 유리 전이 상태, 즉, 습도 및 온도의 결정된 조건에서, 글루텐 단백질이 플라스틱이 되는 상태에 도달할 때까지, 교대로 n번 반복된다(도 3 참조).

각각의 단백질은 고유한 구조(conformation), 즉, 다른 수준의 조직화(organization)가 확인될 수 있는 특징적인 3차원 모양을 가진다. 나타난 바와 같이, 1차 구조는 공유결합에 의해 상호 연결된, 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열에 의해 주어진다. 다음 수준은 1차 구조의 아미노산 사이에 수소결합이 이루어질 때 형성되는, 그의 비틀림(torsion)을 야기하는, 2차 구조이다. 단백질의 3차 구조는 2차 구조의 다른 지점에 위치하는 아미노산 사이의 상호작용에 의해 생성되며 주로 폴리펩티드 알파 나선(helice)과 2차 구조의 접힌 시트(sheet) 사이의 연결 부분(juctional segment)에서 사슬의 접힘에 기인한다. 4차 구조는 서브-유닛으로 불리는, 2개 또는 폴리펩티드 사슬이 서로 결합하여 서로 상호 작용하는 방식의 결과이다. 본 발명의 방법은 분자가 진동하지 않고 2차 및 3차 구조의 결합이 끊어짐에 따라 이동하여 글루텐 단백질이 유리 전이 상태에 도달하는 것을 가능하게 하며, 분자는 플라스틱/고무가 된다(Noel T.R. et al., 1995; Micard V. and Guilbert S., 2000).

특히, 수소 결합 및 단백질이 그들의 2차 및 3차 구조를 유지할 수 있게 하는 이황화 결합이 파괴될 뿐만 아니라 반대 전하를 가진 그룹과 결합하는 이온 결합 분자들이 공간에서 움직일 수 있게 하고, 그들의 2차 및 3차 구조를 변형시킨다.이 과정에 의해 플라스틱으로 만들어진 글루텐 단백질은 도 4에 나타난 바와 같이 성숙한 낟알의 단백질 체(protein body) 중 천연 형태로 존재하기 때문에 (Tosi P. et al., 2011), 비-전통적인 방식으로 응집하는 경향이 있다. 도 4는 본 발명의 방법으로 처리한 후, 단백질이 그들 자신의 항체로부터 인식할 수 없을 뿐만 아니라, 대조군 종자에 대해 처리된 종자의 단백질 체에서 단백질 자체의 응집이 명백하다는 것을 나타낸다. 특히, 상기 단백질은 이미 형성되고 고온에 노출된 글루텐의 구조에 일어나는 공유 결합(도 5)에 의해 응집되지 않지만(파스타를 건조하는 것, 오븐에서 반죽을 요리하는 것(cooking the dough in the oven, drying the pasta); Lamacchia C. et al., 2007; Gerrard J.A., 2000), 성숙한 낟알의 단백질 체에서 천연 형태로 존재할 때 상기 분자의 2차 및 3차 구조의 변화에 의해 생성된 반대 전하를 갖는 그룹을 연결하는 이온 결합에 의해 응집할 것이다. 도 5는, 대조군 종자 및 본 발명의 방법으로 종자 및로부터 추출된 단백질의 분자량에서 어떠한 차이도 나타내지 않는 환원 조건에서 수행된 겔 전기영동을 나타낸 것으로서, 이는 상기 단백질이 1차 구조의 변화를 겪지 않을 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 따라 열처리 후 종자의 단백질 체에서 가시적인 응집이 공유, 디티로신(dityrosine) 및/또는 이소펩타이드 결합을 통해 이루어질 수 없다는 것을 강조할 것이다(Gerrard J.A., 2000; Lamacchia C. et al., 2007; Tilley K.A. et al., 2001). 이 경우, 더 높은 분자량으로의 단백질 밴드의 이동이 관찰되었어야 한다.

따라서, 처리된 종자의 단백질 체에서 관찰된 응집은, 공유결합일 수 없으며, 즉, 공유결합의 형성을 통해 달성되지 않는다.

본 발명에 따른 방법의 주위 온도에서 서서히 냉각하는 단계 h)는 비-통상적 응집 상태에서 분자가 결정화될 수 있도록 한다.

이 개선된 방법의 요점은 다음과 같다:

1) 이중 기능을 하는, 물의 사용. 첫 번째는 열화 과정에서 전자기파, 바람직하게는 마이크로파를 열 에너지로 변환하는 것이다. 두 번째는 글루텐 단백질을 플라스틱으로 만드는, 유리 전이의 상태 즉, 상기 글루텐을 플라스틱으로 만드는 상태, 또한 천천히 증발시키고 결합된 물의 일부분으로 상기 글루텐과 함께 끌어당기게 하는 상태에 도달할 수 있게 하는 것이다.

마이크로파의 사용은 그것이 이온화 방사선(ionizing radiation)이 아니기때문에, 결합을 파괴할 수 없기 때문에, 특히 바람직하다. 따라서, 그들의 유일한 기능은 짧은 시간에 물 분자가 진동하고 열을 발생시키도록 하는 것이다.

3) 이중 기능을 또한 갖는, 열의 발생. 그것은 자유 및 결합된 물이 증발하고, 성숙한 낟알의 단백질 체에 둘러싸인, 글루텐 단백질이, 진동하지 않고 움직이는 상태에 도달할 수 있게 한다.

이 운동은 단백질의 2차 및 3차 구조를 변화시키는 수소 가교 및 이온 결합이 끊어짐으로써, 플라스틱으로 만들게 한다(도 3). 이 변화는 분명히 단백질에 의한 전화의 노출을 이끌고, 이 과정을 거친 글루텐이 물에 녹을 수 있게된다는 사실에 의해 확인된다. 단백질의 2차 및 3차 구조의 손실로 인한 전하의 노출은 동일한 단백질 체에 존재하고 상이한 전하를 갖는 같은 단백질 사이의 응집을 유도한다. 도 6은 본 발명의 방법을 적용하기 전에 글루텐 단백질이 밀 낟알의 단백질 체에 둘러싸인 것 즉 그들의 3차원 구조로 추정되는 경우를 개략적으로 나타낸다. 본 발명의 방법의 적용 후에, 단백질은 유리 전이의 상태에 도달하고, 그들의 3차원 구조를 잃어버리는 플라스틴이 된다. 이 변화는 이 과정을 거친, 글루텐이 물에 녹을 수 있게 된다는 사실에 의해 확인되어, 단백질에 의한 전하의 노출로 이어진다. 단백질의 2차 및 3차 구조의 손실로 인한 전하의 노출은 동일한 단백질 체에 존재하는 상이한 전하를 갖는 단백질 사이의 응집을 유도한다. 도 6에 묘사된 그림에 나타난 바와 같이, 글리아딘 (-) + LMW (+), 알부민 (+) + 글리아딘 (-), 글로불린 (+) + 글리아딘 (-)을 가정화할 수 있다.

위의 가설을 추가로 확인하기 위해, 도 21의 패널 a)의 A-Ff 해독 과정의 6 단계의 면역형광 분석에 추가하여, 패널 b)는 'Image J' 소프트웨어를 사용함으로써 상기 단계들의 이미지 임계값(thresholding) 분석을 나타낸다 (http://imagej.nih.gov/ij). 패널 c)는 각각의 단계에 대한 글리아딘 단백질 분획 및 70% EtOH에서 추출된 대조 중량 가루(the control weight flour, CWF)의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 패널 d)는 글리아딘 단백질 분획으로 표현된 SDS-PAGE에 대한 현미경 이미지 단계 및 광학 밀도(OD)의 분석으로부터 획득한 MGV(평균 회색 값)값에 대한 감소 %의 요약 표를 나타낸다. 패널 b)에 예시된 6 단계 A-F의 이미지 분석으로서 밝기의 규칙적인 감소, 즉 각 단계에서, 글리아딘 단백질 분획 및 LMW-GS를 인식하는, 0610 항체의 표시로 인한 형광을 육안으로 관찰할 수 있다. 감소는 각 단계 사이의 비교가 수행된, 패널 c)에 설명된 표에 보고된 평균 회색 값의 분석에 의해 확인된다. 각 단계의 규칙적이고 의미있는 감소는 항체에 의해 더 이상 인식되지 않는, 단백질의 구조적 변화를 대표한다. 감소는 각 단계에서 정교한 단백질 클래스가 즉 고체에서 점성(gummy)/플라스틱 상태로 "전이(transition_"하는, 이것의 구조적 변화를 나타내(stat)는, 온도 및 습도 값에 대응하기 때문에 규칙적이다. 즉, 각 단백질 클래스는 중합체 사슬이 자유롭게 이동하고 구조를 변형시킬 수 있다는 것을 넘어서서, 이것의 화학 구조에 기초하여 상대적 유리 전이 온도(Tg)를 제공할 것이다. 특히, 저온(50-65℃ 사이)에서, 따라서 과정의 시작 단계에서, 알부민, 글로불린 및 LMW 단백질은 HMW와 함께 변화를 겪게 되는 첫 번째가 될 것이다(Lamacchia C. et al., 2007에 의해 관찰된 바와 같이); 약 70℃의 온도에서 글리아딘은 첫 번째로 그들의 구조 변화(structural conformation)를 시킬 것이고 과정의 마지막 단계(80-90℃)에서 끝날 것이다. 이 사건을 입증하기 위하여, 임의의 단계 과정에서 낟알로부터 에탄올 추출된 글리아딘의 SDS-PAGE 분석이 수행되었다. SDS-PAGE 분석은 단계 A 내지 F에서 및 대조군에 대하여, 천연 구조에서 사슬 간 이황화 결합을 생성하기 위해 이용 가능한 시스테인 잔기를 제공하지 않는, 어떻게 글라이딘이 시스테인 잔기의 노출을 야기하는 구조적 변화(conformational change)로 인한 과정의 중간 및 최종 단계 동안 이 유형의 결합에 관여하는지 보여주는, 특징적인 밴드 감소를 나타낸다.

밴드 감소(OD)가 현미경 기술에 의한 과정의 6단계 동안 관찰된 밝기 감소(MGV)와 비교할 정도는 아니며, 따라서 0610 항체에 대한 글루텐 단백질의 교차-반응성 감소가 공유 결합에 의한 것이 아니라 유리 상태 후 3차 구조의 변화 후에 일어나는 반대 전하 그룹을 연결하는 이온 결합에 의해 생성되는(도 5 및 21 참조), 과정 단계 동안 단백질 사이의 강한 응집에 의해 야기되는(도 4 참조), 단백질 및/또는 에피토프 범위(coverage)에 의한다는 것을 확인하는 것을 관찰할 수 있다.

4) 느린 냉각에 의해, 새로운 단백질 구조가 이 새로운 상태에서 결정화된 채로 남아있게 한다.

본 발명은 또는 본 발명의 방법에 따라 수득할 수 있는 해독된 낟알, 가루 또는 세몰리나 또는 글루텐에 관한 것이다. 가루 또는 세몰리나는 밀, 호밀, 보리 또는 귀리일 수 있으며 추가 단계 i)의 분쇄 후에 수득할 수 있다. 글루텐은 밀, 호밀, 보리 또는 귀리일 수 있으며, 가루 및/또는 추가 단계 l)의 세몰리나로부터 용매 추출한 후에 수득할 수 있다.

가루 또는 세몰리나를 나타낼 때 본 발명의 문맥에서 용어 "해독된(detoxified)"은 0 내지 20 ppm 범위로 감소된 독성 글루텐 에피토프의 수준을 의미한다. 글루텐이 아직 남아있지만, 이러한 가루 또는 세몰리나는 법의 모든 목적을 위해"글루텐 프리(gluten free)"으로 간주될 수 있다.

본 발명은 빵, 파스타, 베이커리 제품, 아침 곡물 및 맥주 사이에서 선택된, 밀가루, 밀 세몰리나, 보리 또는 귀리를 포함하는 식품 제품에 관한 것이다.

대안적으로, 본 발명은 본 발명의 방법의 단계 l)에 따라 수득된 해독된 글루텐이 첨가될 수 있는 유제품(즉, 요구르트, 아이스크림, 발효유, 치즈, 모짜렐라, 버터, 크림, 리코타)에 관한 것이다.

특히, 본 발명의 방법의 단계 l)에 따라 수득된 해독된 글루텐은 유제품 뿐만 아니라 콜드 컷(cold cut), 아이스크림, 아기 음식(baby foods), 소스 및 주스와 같은 제품의 다른 범주들에서의 식품 제품의 제조를 위한 증점제로써 유익하게는 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 글루텐-프리 또는 저 유당식을 섭취하는 사람들을 위한 것이기 때문에 이러한 식품 제품들 또한 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

간략하게, 첫 번째 이점은 본 발명의 방법에 따라 생산된 세몰리나 및 밀가루로부터 지중해 식에서 일반적으로 사용되는 것과 동등한 맛 및 외관의 감각적 특성을 가지지만, 셀리약 환자의 장내 미생물 플로라에 대한 치료법, 균형 회복, 및 보호 및 유용 미생물 플로라를 강화시키는, 0 내지 20ppm으로 감소된 독성 글루텐 에피토프의 항원성을 갖는 셀리약 환자를 위한 식품을 생산할 수 있다는 점이다.

따라서, 본 발명은 또한 장내세균 불균형의 예방 또는 치료를 위해 의료 분야에서 사용하기 위한 해독된 낟알, 가루, 세몰리나 또는 글루텐 또는 이들 중 하나를 기초로 하거나 또는 이들 중 하나로 보충된 식품에 관한 것이다.

두 번째 이점은 이렇게 생산된 낟알, 세몰리나, 가루, 또는 글루텐으로부터, 장내 미생물 총의 변화가 비포괄적 예로서 비만, 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병과 같은 전신 대사성 질환뿐만 아니라, 셀리약 병, 궤양성 대장염, 크론병 및 장 증후군으로 구성된 군으로부터 선택된, 염증성 및/또는 자가면역성의 만성 장 질환에 대한 감수성을 나타낼 위험을 증가시키는 모든 병리학의 식이 치료를 위한 식품을 생산하는 것을 가능하게 할 것이다.

본 발명의 추가 구체예에 따르면, 이러한 해독된 가루 및 세몰리나, 또는 해독된 글루텐 또는 그들의 사용을 통해 획득되는 식품 제품은, 락토바실러스 속, 예를 들어 락토바실러스 아시도필루스(특히 유당 불내성 환자를 위한 유제품에 첨가되는 경우)와 같은 프로바이오틱 미생물에 대한 보호제 및/또는 그람-음성균 및/또는 그람-양성균과 관련된 항미생물제로써 사용되는 이점을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 그람-음성균은 살모넬라 속, 보다 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움종에 속하고 상기 그람-양성균은 포도상구균 속, 보다 바람직하게는 황색포도상구균에 속한다.

본 발명은 하기의 실시예 및 첨부도면에 나타낸 결과에 기초하여 비-제한적인 설명으로 기술될 것이다:
- 도 1은 셀리약 병의 발병 기전을 설명한다(MC).
- 도 2는 글리아딘 및 저분자량 글루테닌(LMW-GS)의 단백질 분획을 인식하는 항체 06010으로 표지한 후 처리 방법의 단계와 관련된 밀 박편(section) (1 μM)을 나타낸다. 패널 A: 본 발명에 따른 방법의 단계 b; 패널 B: 단계 c; 패널 C: 단계 d; 패널 D: 단계 e; 패널 E: 단계 f; 패널 F: 단계 g.
- 도 3은 본 발명의 방법에 따른 열처리 전후의 단백질의 구조를 나타낸다.
- 도 4는 밀 박편(1㎛) 대조군 및 본 발명의 방법의 처리 후를 나타낸다. (1) 비-균질 단백질 매트릭스(Pb1)을 갖는 대조군 밀 박편, (2) 균질 및 융합(confluent) 단백질 매트릭스(Pb2)로 처리한 후의 밀 박편. 6개의 다른 종자(각 종자에서 4개의 박편)에 적용된 비-보수 프리드먼 검정(non-parametric Friedman test)은 대조군과 처리 후 시료의 종자에서 두 종류의 단백질 체(Pb1 및 Pb2) 사이의 매우 중요한 차이를 발견했다.
- 도 5는 단백질 분획의 추출 및 환원 조건에서의 SDS-PAGE를 통한 분리를 나타낸다. 레인 1, 본 발명의 열 처리를 거치지 않은, 대조군 종자로부터 유래된 가루에서 추출된 글리아딘; 레인 2, 본 발명의 방법으로 처리된 종자로부터 유래된 가루에서 추출된 글리아딘; 레인 3, 본 발명의 열처리를 거치지 않은 대조군 종자로부터 유래된 가루에서 추출된 글리아딘 및 HMW-GS; 레인 4, 본 발명의 방법으로 처리된 종자로부터 유래된 가루에서 추출된 및 HMW-GS 글리아딘; 레인 5, 본 발명의 열처리를 거치지 않은 대조군 종자로부터 유래된 가루에서 추출된 글루테닌; 레인 6, 본 발명의 방법으로 처리된 종자로부터 유래된 가루에서 추출된 글루테닌; 레인 7, 본 발명의 열처리를 거치지 않은 대조군 종자로부터 유래된 가루에서 추출된 총 단백질; 레인 8, 본 발명의 방법으로 처리된 종자로부터 유래된 가루에서 추출된 총 글루테닌 단백질.
- 도 6은 동일한 단백질체 내에 존재하고 다른 전하를 가진 단백질 간의 응집에 대한 가설을 나타낸다.
- 도 7은 본 발명의 방법과 비교된 국제특허출원 WO2014/053891의 방법에 따른 대조군 가루 및 처리 후의 시료에 대하여 실시된 단일클론항체 R5 Ridascreen Gliadin에 의한 ELISA 분석의 요약 히스토그램을 나타낸다.
- 도 8은 대조군 밀(대조군) 및 본 발명에 기술된 방법의 처리 후(처리된) 박편을 가로로 절단하고, 0610 항체 및 γ-글리아딘으로 면역표지된 SEM-면역금표지(Immunogold)를 통해 조사한 박편(section)을 나타낸다. 1. 0610 항체로 표지된 대조군; 2. 항체 항 γ-글리아딘으로 표지한 후의 대조군; 3. 0610 항체로 표시 처리된 군; 4. 항체 항 γ-글리아딘으로 표지 처리된 군. 그림의 화살표는 EDS 분석(Energy Dispersive Spectroscopy)을 통해 감지된 은 입자(AgNp)를 나타낸다.
- 도 9는 0610 항체, HMW-G γ-글라이딘으로 표지된, 본 발명의 방법에 따른 처리 후(처리된) 및 밀(1μM) 대조군(대조군)의 박편을 나타낸다. 1. 0610 항체로 표지된 대조군; 2. γ-글리아딘 항체로 표지한 후의 대조군; 3. 항체 HMW-GS로 표지된 대조군; 4. 0610 항체로 표지된 처리군, 5. 항체 γ-글리아딘으로 표지한 후 처리된 군; 6. 항체 HMW-GS로 표지한 후 처리된 군.
- 도 10은 대조군 및 처리 후 종자의 박편에서, 단일클론항체 R5-HRP 접합체로 수행된 비색 분석을 나타낸다. 1. 대조군 종자의 서브-호분(Sub-aleurone); 2. 본 발명의 방법에 따른 처리 후 종자의 서브 호분; 3. 대조군 종자의 주름(Crease); 4. 본 발명의 방법에 따른 처리 후 종자의 주름. 그림의 막대는 100㎛에 해당한다.
- 도 11은 대조군 빵 및 변형된 빵(0.8g/l) 모두를 첨가한 후 식염수 중 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)의 사멸에 대한 동적(kinetic) 분석을 나타낸다. 선들은 와이블 분포(Weibull distribution)를 통해 가장 잘 맞는 것을 나타낸다.
- 도 12는 대조군 빵 또는 처리된 빵(0.2, 0.4 또는 0.8g/l)을 첨가한 식염수 중 포도상구균의 생체 수(vital count)를 나타낸다. 평균값±표준편차. "*" 및 "**"기호는 유의한 차이를 나타낸다(일원분산 분석 및 Tukey's 테스트).
- 도 13은 대조군 빵 또는 변형된 빵의 0.8g/l이 첨가된 식염수 내 살모넬라 속의 생체 수를 나타낸다. 평균 값±표준편차.
- 도 14는 발효 6 시간 후의 SCFA 및 FISH 결과에 대한 주요 성분 분석 결과를 나타낸다. 패널 A) 변수의 투영; 패널 B) 케이스의 투영. 시료: A, 음성 대조군 건강한 공여자; B, 건강한 공여자+대조군 빵; C, 건강한 공여자+변형된 빵; D, 셀리약 공여자의 음성 대조군; E, 셀리약 공여자+ 대조군 빵; F, 셀리약 공여자+변형된 빵. 변수: 1, Bif164; 2, Erec482; 3, Bac; 5, lab158; AC: 아세트산(acetic acid); BUT: 부티르산(butyric acid); PROP: 프로피온산(propionic).
- 도 15는 발효 24시간 후의 SCFA 및 FISH 결과에 대한 주요 성분 분석 결과를 나타낸다. 패널 A) 변수의 투영; 패널 B) 케이스의 투영. 시료: A, 음성 대조군 건강한 공여자; B, 건강한 공여자+대조군 빵; C, 건강한 공여자+변형된 빵; D, 셀리약 공여자의 음성 대조군; E, 셀리약 공여자+ 대조군 빵; F, 셀리약 공여자+변형된 빵. 변수: 1, Bif164; 2, Erec482; 3, Bac; 5, lab158; AC: 아세트산(acetic acid); BUT: 부티르산(butyric acid); PROP: 프로피온산(propionic).
- 도 16은 발효 48시간 후의 SCFA 및 FISH 결과에 대한 주요 성분 분석 결과를 나타낸다. 패널 A) 변수의 투영; 패널 B) 케이스의 투영. 시료: A, 음성 대조군 건강한 공여자; B, 건강한 공여자+대조군 빵; C, 건강한 공여자+변형된 빵; D, 셀리약 공여자의 음성 대조군; E, 셀리약 공여자+ 대조군 빵; F, 셀리약 공여자+변형된 빵. 변수: 1, Bif164; 2, Erec482; 3, Bac; 5, lab158; AC: 아세트산(acetic acid); BUT: 부티르산(butyric acid); PROP: 프로피온산(propionic).
- 도 17은 건강한 지원자에서 (A) 대조군 빵 및 (B) 변형된 빵을 첨가하기 전(SS1) 및 후(SS2) 대장의 부분을 모사한 모델 시스템의 3개의 다른 용기(V1, V2 및 V3)의 배양 액(broth)으로부터 회수된 박테리아 군을 나타낸다. 결과는 두 모델 시스템의 평균±SEM 으로 보고된다(n=2).
- 도 18은 (A) 건강한 환자 및 (B) 셀리약 환자에서 변형된 빵을 첨가하기 전(SS1) 및 후(SS2) 대장의 부분을 모사한 모델 시스템의 3개의 다른 용기(V1, V2 및 V3)의 배양 액(broth)으로부터 회수된 박테리아 군을 나타낸다. 결과는 두 모델 시스템의 평균±SEM 으로 보고된다(n=2).
- 도 19는 건강한 지원자에서 (A) 대조군 빵 및 (B) 변형된 빵을 첨가하기 전(SS1) 및 후(SS2) 대장의 부분을 모사한 모델 시스템의 3개의 다른 용기(V1, V2 및 V3)의 배양 액(broth)으로부터 회수된 단쇄 지방산(short-chain fatty acids, SCFA)을 나타낸다. 결과는 두 모델 시스템의 평균 테이터±SEM 으로 보고된다(n=2).
- 도 20은 (A) 건강한 환자 및 (B) 셀리약 환자에서 변형된 빵을 첨가하기 전(SS1) 및 후(SS2)의 대장 부분을 모사한 모델 시스템의 3개의 다른 용기(V1, V2 및 V3)의 배양 액(broth)으로부터 회수된 단쇄 지방산(short-chain fatty acids, SCFA)을 나타낸다. 결과는 두 모델 시스템의 평균±SEM 으로 보고된다(n=2).
- 도 21의 패널 a)는 글리아딘 및 LMW-GX의 단백질 분획을 인식하는, 0610 항체로 접합한 후의 처리 단계에 대한 연질 밀 박편(1㎛)을 나타낸다; (A) 단계 b; (B) 단계 c; (C) 단계 d; (D) 단계 e; (E) 단계 f; (F) 단계 g; 패널 b)는 Image J 소프트웨어의 사용을 통해 상기 단계의 이미지 임계값 분석을 나타낸다; 패널 c)는 70% EtOH에서 추출된 글리아딘의 단백질 분획 및 관련된 무게 대조군 밀가루(CWF)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. (A) 단계 b의 글리아딘; (B) 단계 c의 글리아딘; (C) 단계 d의 글리아딘; (D) 단계 e의 글리아딘; (E) 단계 f의 글리아딘; (F) 단계 g의 글리아딘; 패널 d)는 현미경 이미지 단계에서 획득한 형균 회색 값(Mean Grey Value, MGV)에 관한 % 감소의 요약 표 및 글리아딘 단백질 분획에 발현된 SDS-PAGE와 관한 광학 밀도(OD)를 예시한다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 본 발명에 따른 방법으로 처리한 후 글루텐 단백질의 항원성의 감소

밀 곡물을 본 발명에 따른 해독 방법에 적용한 후에, 밀가루에서 글루텐 단백질의 독성 에피토프의 항원성 감소는 셀리약 환자를 위해 의도된 가루 및 식품에서 글루텐의 인식을 위하여 barred ear laboratories에 의해 채택된 공식 방법(항체 R5를 이용한 ELISA 분석법)을 사용하여 시험하였다.

특히, 이전에 Mendez 칵테일에 의하여 변성된 글루텐 단백질을 알코올 용액에 의하여 가루로부터 추출하고 글루텐 단백질에서 반복적으로 발견되는, 독성 펩타이드 서열 QQPFP을 인식하는 단일클론항체 R5를 사용한 R5 샌드위치 ELISA 방법(도 7 참조)에 따라 시험하였다. 도 7(패널A)은 본 발명의 방법(패널B)과 비교된 국제특허출원 WO2014/053891에 개시된 방법으로 처리된 시료의, R5 Ridascreen Gliadin을 사용한 ELISA 분석의 요약 히스토그램을 나타낸다. 부수적으로, 국제특허출원 WO2047/053891에 개시된 방법으로 처리된 낟알로부터 유래된 가루 시료는 60 내지 40ppm 범위의 독성 에피토프 QQPFP의 항원성 감소를 나타냈다(패널 A, 도 7; Lamacchia C. et al. 2016). 대신에, 본 발명의 방법으로 처리된 낟알에서 유래한 가루는 독성 에피토프의 항원성이 13.83±7.22 ppm으로 현저히 감소하여, 범의 모든 목적을 고려하여 이들 가루를 비록 글루텐이 여전히 그들 안에 존재할지라도"글루텐 프리" 가루로 고려될 수 있게 한다.

본 발명에 따른 곡물 낟알로부터 글루텐 단백질의 해독의 개선은 0 내지 20 ppm의 범위에서 글루텐의 독성 에피토프의 항원성의 감소로 이루어져, 셀리약 환자에게 훨씬 안전해진다. 이러한 감소는 국제특허출원 WO2014/503891 방법에서 120초 동안 마이크로파 단계 후 주위 온도에서 서서히 냉각시키는 것은 단백질의 플라스틱 형태로의 완전한 변형을 보장하지 못하기 때문에, 국제특허출원 WO2014/503891의 방법을 통해 달성할 수 없으며, 그 대신에 본 발명에서 기술된 방법의 단계들로 인해 완전히 도달되었다.

본 발명의 방법에 의해 유도된 변화는 글루텐 단백질의 항원성을 감소시켜 글루텐 단백질이 그들 자신의 항체에 의해 더 이상 인식 가능하지 않도록 한다. 이를 입증하기 위해, 대조군 종자(CWS) 및 처리된 종자(TWS)의 세 가지 시료를 가로로 자르고, 글리아딘 분획물의 세 가지 특정 단일클론항체를 사용하여 면역금표지(immunogold)(도 8), 면역형광(도 9) 및 비색 현미경(도 10)을 시험하였다.

- IFRN 0610, 많은 글리아딘에 공통된 에피토프(QQSF)를 인식하는 단일클론항체;

- LMW-GS, γ 글리아딘의 분획물에 존재하는 반복적인 도메인(PEQPFPQGC)을 인식하는, 생쥐 단일클론항체;

- R5, 글루텐 단백질에서 반복적으로 존재하는, 매우 독성이 강한 서열 QQPFP을 인식하는 단일클론항체 R5.

도 8은 대조군 밀(대조군) 및 본 발명에 따른 방법의 처리 후(처리된), 가로로 절단하고, 0610 항체 및 γ-글리아딘으로 면역표지된, SEM-면역금표지를 통해 시험한 박편을 나타낸다. 5개의 다른 대조군 및 처리된 종자에서 유래된 5개 박편에서 얻어진 값을 스튜던트의 T-테스트(Student's T-test)에 의하여 비교하였다. 두 종류의 항체에서 관찰된 차이는 매우 유의미한 것으로 나타났다(p<0.001). 항체 0610의 경우, 대조군 종자와 비교하여 처리된 종자에서 89%의 감소가 얻어졌으며, 항체 γ-글리딘과 비교하여 87.5%의 감소가 얻어졌다.

도 9는 0610 항체, HMW-G 및 γ-글리아딘으로 표지된, 밀(1 ㎛) 대조군(대조군) 및 본 발명의 방법에 따른 처리 후(처리된) 박편을 나타낸다. 대조군 및 처리 후 종자의 시료로부터 유래한 3개의 다른 시료(각각의 종자에 대해 3개의 박편)를 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 그레이 스케일(grey scale)로 변환된, 각각의 이미지에 대해, 각각의 MGV(평균 그레이 값)이 얻어졌다. 0610 항체의 경우, 대조군 종자와 비교하여 처리된 종자에서 91.7%의 감소가 관찰되었고 항체 γ-글리아딘과 비교하여 90.6%의 감소가 관찰되었다. 그 후, 두 변수에 대한 분해 가설을 통한(시료의 유형 및 처리의 유형) 양-방향 아노바 시험(two-way Anova test)을 수행하였다. 두 변수에 대한 분해 가설을 수행하였다. 분석된 변수 중, 종자에 의해 처리된 처리의 유형이 가장 중요한 인자였다. 획득한 데이터는 매우 유의미한 것으로 나타났다(p<0.001).

도 10은 대조군 및 처리 후 종자의 박편에서, 단일클론항체 R5-HRP 접합된 것을 사용하여 수행된, 비색 분석을 나타낸다. Imagej 소프트웨어를 사용하여 대조군 및 처리 후 종자의 시료에서 유래한 3개의 다른 시료(각각의 종자에 대해 3개의 박편)를 분석하였다. 그레이 스케일로 변환된, 각각의 이미지에 대해, 2진 포맷(binary format)으로, 각각의 MGV가 얻어졌다. 서브-호분(aleuronic) 지역의 수준에서, 대조군 종자와 비교하여 처리 후 종자에서 89.2%의 감소가 관찰되었고, 접힘 수준에서 82%의 감소가 관찰되었다. 이후, 양방향 아노바 시험을 두 변수에 대한 분해 가설을 사용하여(시료의 유형 및 처리의 유형) 수행하였다. 분석된 변수 중, 종자에 의해 처리된 처리의 유형이 가장 중요한 인자였다. 획득한 데이터는 매우 유의미한 것으로 나타났다(p<0.001).

실시예 2: 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)에 대한 상기 방법에 따라 처리된 가루로 제조한 소화된 빵의 보호 효과 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 쥐티푸스균(Salmonella Typhimurium)에 대한 항미생물 효과에 대한 in vitro 연구

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 두 가지 일련의 실험이 수행되었다.

특히, 생리학적 용액(NaCl 0.9%)(50㎖)의 분취액에 대조군 빵 또는 그 가루가 글루텐이 상기에서 기술된 방법으로 변형된 종자의 분쇄로부터 유래된 Maccaferri S. et al.(2012)에 의해 기술된 과정에 따른 적절한 조건에서 인 비트로에 소화된 빵으로서, 다른 분취액을 보충하고 탈수 및 log ufc/㎖로 접종하였다; 그 후 시료를 분석하여 MRS 한천(락토바실러스 아시도필루스 및 비피도박테리움 애니멀리스(Bifidobacterium animalis)) 또는 TSA(병원균) 상에 도말함으로써 생체 수(vital count)를 정기적으로 평가하고 37℃에서 2-4일 동안 인큐베이션 하였다. 상기 유산균을 혐기성 조건에서 분석하였다.

사멸 동역학(Death kinetics)	락토바실러스 아시도필루스(Lactobaccilus Acidophilus) 비피도박테리움 애니멀리스(Bifidobacterium Animalis)	생리 식염수 및 대조군 빵 또는 본 발명의 방법에 따라 처리된 종자의 가루로 제조된 빵의 0.4 또는 0.8g/l을 첨가한 시료	7 일(매 6-10 시간 마다 미생물 계수)
농도의 영향	락토바실러스 아시도필루스(Lactobaccilus Acidophilus) 비피도박테리움 애니멀리스(Bifidobacterium Animalis)	생리 식염수 및 대조군 빵 또는 본 발명의 방법에 따라 처리된 종자의 가루로 제조된 빵의 0.8 또는 0.5g/l을 첨가한 시료	24 시간
병원균	살모넬라 티피뮤리움(Slalmonella Typhimurium) 황색포도상구균(Staphylococcus Aureus)	생리 식염수 및 대조군 빵 또는 본 발명의 방법에 따라 처리된 종자의 가루로 제조된 빵의 0.2, 0.4 또는 0.8g/l을 첨가한 시료	7 일(1 및 7일 후미생물 계수)

표 2는 락토바실러스 아시도필루스의 사멸 동역학에 대한 와이블 분포(Weibull distribution)를 위한 맞춤(fitness) 변수를 나타낸다(평균±표준 편차 값). 각 변수에 대해 문자는 유의한 차이를 나타낸다(ANOVA 및 Tukey의 시험, P <0.05). 사멸 동역학은 모양 변수>1로 하향 곡선을 나타냈다.

시료	log N₀*	△	p	d.t.	R
대조군 0.4 g/l	8.43±0.14A	17.99±0.90A	1.62±0.15A	67.46±2.06A	0.995
해독(Detox) 0.4 g/l	8.38±0.13A	17.43±2.06A	1.40±0.14A	80.53±2.03B	0.994
대조군0.8 g/l	8.19±0.12A	23.40±2.00B	1.94±0.20A	70.28±2.63A	0.993
해독 0.8 g/l	8.56±0.14A	17.57±2.70A	1.27±0.17A	93.96±4.00C	0.990

대조군 빵과 변형된 빵 모두에 생리 식염수를 첨가하였음에도 곡선의 형태에는 영향을 미치지 않았다. 반면, 빵의 종류는 박테리아 개체의 사멸 역동학에 유의한 영향을 미쳤으며, 상기에서 기술한 방법으로 종자를 처리한 가루로 제조한 빵을 사용할 때 0.4g/l에서 67.46에서 80.53으로, 0.8g/l에서 70.28에서 93.96으로 연장되었다.

매개 변수의 모양이 아닌, 사멸 역동학에서, 이전에 기술된 방법으로 종자를 처리한 가루로 제조한 빵의 효과는, 대조군 빵 및 도 11에서 나타낸 바와 같이 처리된 빵(0.8g/l)의 모두의 첨가 후 생리 식염수에서 락토바실러스 아시도필루스의 사멸 역동학에 의해 제안된 바와 같이, 사망 곡선의 마지막 부분에서 사망률의 가능한 감소(probable reduction)의 결과이다. 이 선들은 와이블 방정식(Weibull's equation)을 통해 가장 잘 맞는 것을 나타낸다.

두 번째 시험은 변형된 빵의 농도가 락토바실러스 아시도필루스 및 비피도박테리움 애니멀리스 모두에 유해 효과를 야기하거나 또는 미치는지지를 결정하기 위해 수행되었다; 생리 식염수에는 장내 느린 이동으로 인한 상기 빵의 국부적인 증가를 모사하기 위해 첫 번째 실험을 위해 사용된 양(0.8g/l)과 더 높은 농도(5.0g/l)가 추가되었다. 생체 수(vital count)는 소화된 빵의 농도에 영향을 받지 않았으며 사멸 동역학은 도 11에 나타난 바와 유사한 경향을 나타냈다.

마지막으로, 생리 식염수에 그람-양성균 또는 그람-음성균(황색포도상구균 및 쥐티푸스균)을 접종하였다: 황색포도상구균의 결과는 도 12에 나타나 있으며 대조군 빵 또는 처리된 빵(0.2, 0.4 또는 0.8g/l)을 첨가한 생리 식염수의 생체 수를 보여준다. 평균값±표준편차. 기호 "*" 및 "**"는 유의한 차이를 나타낸다(일원분산 분석 및 Tukey의 시험).

기술된 방법에 따라 종자를 처리한 밀가루로 제조한 빵 0.8g/l를 첨가한 시료에 대해 유의한 차이가 관찰되었는데, 이는 대조군 빵이 첨가된 시료에 비해 1-로그만큼 더 낮은 생체 수율(vital count rate)을 나타냈다. 살모넬라 속의 존재 하에서 7일 후 동일한 시료에서 3-로그의 감소가 관찰된 반면, 대조군 빵은 1-로그의 감소를 결정하였다(도 13).

실시예 3: 대장의 원위부를 시뮬레이션하는 모델 시스템에서 셀리약 환자의 장내 플로라 균형의 회복에서 치료 효과에 대한 연구

배치(batch) 발효 배양에서, 본 발명의 방법에 따라 종자가 처리된 가루로 제조된 빵 및 대조군 빵 모두를 평가하였다(단일 화합물 또는 섬유의 효과를 연구하도록 하는 대장의 윈위 부분을 모방한 조절된 pH를 갖는 모델 시스템).

대변 시료는 공지된 대사성 및 위장병 질환(예를 들어, 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 과민성 대장 증후군, 소화성 궤양 및 암)을 제외한 3명의 건강한 지원자(30 내지 38세의 남성 2명, 여성 1명; BMI: 18.5-25)로부터 획득하였다. 모든 건강한 공여자에게는 대변 시료를 제공할 것을 요청하기 전에 건강 상태, 약물 사용, 임상 기형(anamnesis) 및 생활 방식에 관한 정보를 수집하기 위해 표준 설문지를 제공하였다. 셀리약 공여자(30 내지 38세의 여성 2명, 남성 1명; BMI:18.5-25)의 경우 각각에게 서면 동의서를 얻었고 연구는 영국 레딩 대학교의 연구윤리위원회(Research Ethics Committee of the University of Reading) (UREC 15/20; 인간 대장의 in vitro 모델 시스템을 위한 대변 샘플 수집 센터에 기부된) 승인을 받았다. 현장에서 건강한 및 셀리약 공여자에게 모든 대변 시료를 수집하여, 혐기성 캐비닛(10% H₂-10% CO₂-80% N₂)에 보관하고 수집 후 15분 이내에 사용하였다. 시료를 혐기성 PBS 용액(0.1M 인산 완충액, pH 7.4)에서 1:10(w/v)로 희석하고 2분 동안 균질화시켰다.

미리 멸균한 회분배양(batch culture)(280㎖)에tj 배양액의 발효를 위한 용기를 45㎖의 대장의 모델 복합 성장 배지로 채웠다(Tejero-Sarinena S., et al., 2012).

이후, 용기를 37℃의 순환 수조에 연결하고 O₂가 결핍된 N₂ 기체를 주입하여 접종(inoculation) 전 혐기성으로 만들었다. NaOH 또는 HCl 용액을 사용하여 pH를 6.7 내지 6.9로 완충시켰다(Electrolab260; Electrolab Ltd, Tewkesbury, United Kingdom). 배양 배지에 상기에서 기술한 바와 같이 준비한 대변 균질액 5㎖와, 소화된 빵 1㎖를 추가하였다.

각 공여자에 대해, 3개의 다른 용기를 준비하였다:

- 건강한 개체에 대해 A, 셀리약 개체에 대해 D라고 칭하는 음성 대조군(소화된 빵을 첨가하지 않음);

- 건강한 개체를 B로 칭하고 셀리약 개체를 E로 칭하는 대조군 빵을 첨가한 용기;

- 건강한 개체를 C로 칭하고 셀리약 개체를 F로 칭하는 상기에서 기술된 방법으로 종자를 처리한 가루로 제조한 빵을 첨가한 용기.

회분 배양을 48시간 동안 형광동소혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH)를 통한 미생물 총의 평가 및 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 사용한 단쇄 지방산의 결정에 필요한 시료를 접종 시, 6, 24 및 48시간 후에 분석하였다. 도 14, 15 및 16은 6, 24 및 48 시간의 발효 후 SCFA 및 FISH의 결과에 관한 주요 성분 분석의 결과를 나타낸다.

FISH 및 SCFA 실험으로부터 얻은 결과는 공여자의 유형으로 인한 가변성을 배재하기 위해, 음성 대조군의 t0(접종)에 대한 증가/감소로 표준화되었다; 따라서, 결과는 실험 시작과 관련하여 시스템의 수정을 보여주며 미생물 개체군 또는 미생물 대사산물의 증가(양수 값) 또는 감소(음수 값)으로 읽어야 한다. 증가/감소는 음성대조군(log cells/㎖)의 접종에 참조되었다.

또한, 각 변수는 ANOVA 시험을 통해 유의한 차이를 확인하기 위해 분석되었다; 균질군(Homogeneous groups)에 대한 접근법의 사용은 시간이 지남에 따라 가능한 추세를 확립하기 위하여 추가 기구로서 적용되었다. 하기 표 3은 6, 24 및 48시간의 발효 후 비피도박테리아의 FISH 데이터에서 균질군에 대한 ANOVA 시험 결과를 나타낸다.

		균질군
6 시간		I	II	III
시료	FISH
E	0.147100	****
F	0.264242	****
D	0.489640	****
B	0.604836	****
A	0.632162	****
C	0.700706	****
24 시간
E	0.371967	****
F	0.490137	****
D	0.507300	****
A	0.716912	****
B	0.734684	****
C	0.909206	****
48 시간
E	0.273558			****
A	0.654479	****
F	0.681301	****	****
D	0.707120	****	****
B	0.715355	****	****
C	0.925907		****

시료: A, 음성 대조군 건강한 공여자; B, 건강한 공여자 + 대조군 빵; C,

건강한 공여자 + 변형된 빵; D, 음성 대조군 셀리약 공여자; E, 셀리약 공여자 + 대조군 빵; F, 셀리약 공여자 + 변형된 빵

6시간 후, 또는 24시간 후 시료 간의 차이는 유의하지 않았다. 대신, 48시간 후 두 가지 통계 그룹이 관찰되었다: 첫 번째 그룹은 시료 E(대조군 빵이 있는 셀리약 공여자)로만 구성되었으며 두 번째 그룹은 다른 모든 시료로 구성되었다.

시료 E는 마이크로플로라(microflora) 상에서 빵에 의해 수행된 부정적인 영향으로 인해, 비티도박테리아의 개체군에서 유의한 증가를 보이지 않은(0.27-log cells/㎖ 증가) 반면, 다른 시료에서는 0.7에서 0.9 log cells/㎖까지 증가하였다. 사실, 상기에서 기술된 방법으로 종자를 처리한 가루로 제조한 빵이 유익한 효과를 나타내어, 비피도박테리아 개체군에서 정상적인 경향을 회복할 수 있는, 흥미로운 데이터는 건강한 개체의 시료와 함께 시료 F를 포함에 있다.

표 4 및 5는 6, 24 및 48시간의 발효 후 박테리아 군 Erec482(Franks A.H. et al., 1998), Bac303(Manz W. et al., 1996)과 관련된 FISH 데이터에서 균질군에 대한 일원 분산 분석의 결과를 보여준다(long cells/㎖). 박테리아 군은 probeBase(http://www.microbial-ecology.net/probebase)에서 보고된 바와 같이 형광염료 Cy3이 표지된 16S RNA(Langendijk P.S. et al., 1995)의 특정 지역을 위한 합성 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여 확인하였다.

	균질군
6 시간		I	II	III
시료	FISH
B	0.001945	****
A	0.087913	****
C	0.130655	****
E	0.159812	****
D	0.370365	****
F	0.382277	****
24 시간
F	-0.065175		****
A	0.077214	****	****
E	0.169113	****	****
C	0.286015	****	****
D	0.443906	****
B	0.481756	****
48 시간
D	-0.017101	****
C	0.051435	****	****
F	0.064366	****	****
A	0.150569	****	****	****
E	0.223303		****	****
B	0.267762			****

시료: A, 음성 대조군 건강한 공여자; B, 건강한 공여자 + 대조군 빵; C, 건강한 공여자 + 변형된 빵; D, 음성 대조군 셀리약 공여자; E, 셀리약 공여자 + 대조군 빵; F, 셀리약 공여자 + 변형된 빵

	균질군
6 시간		I	II	III	IV
시료	FISH
A	-0.094164	****
D	-0.043412	****
E	0.080924	****
B	0.106672	****
C	0.133569	****
F	0.176720	****
24 시간
D	-0.189282	****
E	-0.172388	****
F	0.028873	****	****
A	0.414786		****	****
B	0.433302		****	****
C	0.636738			****
48 시간
B	-0.330564	****
F	-0.313381	****	****
E	-0.307379	****	****
D	-0.193349		****	****
C	-0.110862			****	****
A	-0.034976				****

통계 분석은 시간 및 미생물의 유형에 따라. 2-4 중첩 균질군과 함께, 시료의 지속적인 분포를 강조하였다. 시료의 통계적 분포는 시간에 따라 변화하였다; 그러나, 생체 수(-0-33-0,26 log cells/㎖)의 증가/감소는 절대 값으로 적당한 크기였다. 박테리아 군 Chis150(Franks A.H. et al., 1998)에 대한 빵의 첨가 효과를 하기 표 6에 나타냈다.

	균질군
6 시간		I	II	III
시료	FISH
B	-0.266858	****
A	-0.180315	****
C	-0.103523	****	****
D	0.153936		****	****
F	0.171644		****	****
E	0.316956			****
24 시간
C	-0.162934	****
F	-0.120933	****
A	-0.083551	****
B	-0.030945	****
E	0.072539	****
D	0.096110	****
48 시간
A	-0.305986	****
C	-0.234457	****
B	0.060428	****
D	0.166901	****
F	0.190838	****
E	0.216414	****

6시간 후, 2개의 잘 정의된 군(시료 A 및 B를 갖는 제1 군; 시료 E를 포함하는 제2 군) 및 중간체 클래스(시료 C,D,F)로 시료의 연속적인 분포를 관찰하였다. 마지막으로, 시료 E(대조군 빵이 있는 셀리약 공여자)(celiac donor with control bread)는 시료 D 및 F("변형된(modified)" 빵을 갖는 음성 대조군 및 셀리약 공여자(celiac donor))와 통계적으로 다르지 않았으나 건강한 공여자의 시료와 통계적으로도 달랐다. 그러나, 시료 F 및 D에서 시료 C에 대한 통계적 변화가 관찰되었다. 이러한 변이(shift)는 24 및 48시간 후에 관찰되지 않았다. 젖산균(lactic bacteria)는 6, 24 및 48시간의 발효 후 Lab 158의 FISH 데이터에 대한 균질군에 대한 일원분산분석 결과를 보여주는, 하기 표 7에 나타난 바와 같이, 시간 경과에 따라 특징적인 경향을 나타냈다(log cells/㎖).

	균질군
6 시간		I	II	III
시료	FISH
F	-0.639714		****
E	-0.565338		****
D	-0.327822	****	****
C	-0.122414	****
A	0.001010	****
B	0.038547	****
24 시간
E	-0.591904		****
F	0.014006	****
D	0.015039	****
A	0.165791	****
C	0.267343	****
B	0.288811	****
48 시간
E	-0.526397			****
D	-0.289074	****		****
F	-0.022714	****	****	****
A	0.135032	****	****
B	0.188054	****	****
C	0.304061		****

발효 6시간 후, 시료 E 및 F의 젖산 개체군에서 감소가 관찰되었다 (0.57-0.64 log cells/㎖). 24시간 후, 시료 E에서 음의 경향이 관찰되었지만, 글루텐 단백질이 변형된 밀가루로 제조된 빵의 변형된 흥미롭고 유익한 영향을 암시하는, 젖산균이 증가하고 건강한 개체와 유사한 경향을 보이는 시료 F에서는 관찰되지 않았다.

48시간 후, 그것의 분포는 연속적이었다; 특히, 시료 F는 건강한 개체 및 시료 E 사이의 중간 그룹에 위치하였다.

통계적 결과는 박테리아 군 Eu(Eub338 I, Eub338 II, Eub338 III (함께 사용됨)(Daims H. et al., 1999)는 다른 시료들 간에 유의한 차이 없이, 연속적인 분포를 보여주었다. 하기 표 8은 6, 24 및 48시간의 발효 후 Eu의 FISH 데이터에 대한 균질군에 대한 일원분산분석 시험의 결과를 나타낸다(log cells/㎖).

	균질군
6 시간		I	II
시료	FISH
B	-0.132923	****
A	-0.061032	****
C	0.056311	****
F	0.238798	****
D	0.336604	****
E	0.435467	****
24 시간
A	0.274960		****
B	0.488056	****	****
C	0.496600	****	****
F	0.599021	****	****
D	0.720836	****
E	0.825880	****
48 시간
C	-0.197966		****
B	-0.005315	****	****
A	0.102244	****	****
D	0.265949	****	****
F	0.345989	****
E	0.434101	****

동일한 접근법이 SCFA(단쇄 지방산)의 결과를 분석하는데 사용되었다. SCFA는 일반적으로 잘-정의된 통계 그룹과 유의한 차이로 결과의 이산 분포(discrete distribution)를 보여주었다. 결과를 하기 표 9, 10 및 11에 나타냈다. 표 9는 24 및 48시간 후 부티르산(butyric acid)의 균질군에 대한 일원분산분석을 보여준다; 음성대조군과 비교하여 평균 증가가 나타났다(mM).

		균질군
24 시간		I	II	III	IV	V	VI
시료	SCFA
C	43.3736		****
A	45.3854			****
D	52.3644	****
F	52.3767	****
E	62.2977				****
B	174.0981					****
48 시간
A	43.8577	****
F	52.9641		****
E	57.6583			****
D	61.8410				****
C	62.4645					****
B	258.4700						****

표 10은 24 및 48시간 후 프로피온산(propionic acid)의 균질군에 대한 일원분산분석을 보여준다; 음성대조군과 비교하여 평균 증가가 나타났다(mM).

프로피온산에 관하여는, 건강한 공여자의 시료(24시간 및 48시간 후)에서의 증가는 작았으나, 그 농도는 셀리약 공여자의 시료에서 23-37mM 만큼 증가하였다.

		균질군
24 시간		I	II	III	IV	V	VI
시료	SCFA
B	-4.30662	****
A	-0.75728		****
C	0.96521			****
D	23.15887				****
E	31.18544					****
F	32.70900						****
48 시간
A	0.39286	****
B	1.71661		****
C	4.68863			****
D	22.58833				****
F	37.13872					****
E	37.45659						****

표 11은 24 및 48시간 후 부티르산(butyric acid)의 균질군에 대한 일원분산분석을 보여준다; 음성대조군과 비교하여 평균 증가가 나타났다(mM).

		균질군
24 시간		I	II	III	IV	V	VI
시료	SCFA
C	-3.63255	****
B	-0.38556		****
A	2.43478			****
F	4.07283				****
E	7.59356					****
D	17.42258						****
48 시간
A	2.24822	****
B	4.01809		****
F	4.27836			****
C	6.58688				****
E	10.66568					****
D	15.03661						****

24시간 후, 부티르산은 가장 큰 증가를 기록한, 음성대조군 D에서 17mM까지 증가하였고, 셀리약 공여자(각각 E, 7.6mM 및 F, 4.1mM)의 다른 두 시료가 뒤따랐다; 48시간 후의 결과는 시료 F가 부티르산에서 4.8mM의 순 증가를 나타내는, 건강한 공여자 시료와 유사한 프로필을 보이는, 흥미로운 경향을 보였다.

도 15, 16 및 17은 주요 구성요소의 분석을 통해 건강한 및 셀리약 공여자로부터 나온 회분배양과 관련된 전반적인 차이의 연구를 보여준다; SCFA 및 FISF의 결과는 모두 인풋(inputs)으로 사용되었다; 분석의 모든 시간마다, 다른 분석이 수행되었다.

6시간 후, 2개의 통계 그룹이 다원적 공간에서 확인되었다; 첫 번째 것은 건강한 개체(A, B 및 C)의 시료로 구성되고 두 번째 것은 시료 E 및 F로 구성된다.

셀리약 공여자(시료 D)의 음성 대조군은 공간의 다른 영역에 위치했다(도 14).

24시간 후, 공간의 분포가 크게 변화하였다(도 15); 시료 B가 공간의 다른 영역으로 이동하였기 때문에, 건강한 공여자로부터 온 군은 두 개의 하위 그룹으로 나뉘었으나, 셀리약 개체 시료에 의해 차지된 계층 영역으로부터 이동되고 건강한 개체 A 및 C의 시료 영역으로 이동한 시료 F는 흥미로운 결과와 관련되었 다. 48시간 후에 A도 유사한 효과가 관찰되었다(도 16).

실시예 4. 대장의 근위부, 횡단면 및 원위부를 시뮬레이션하는 모델 시스템에서 건강한 환자 및 셀리약에서 장내 플로라의 조성 및 대사 개선에서 치료 효과에 관한 연구

본 발명의 글루텐 에피토프 해독 방법에 따라 낟알이 처리된 대조군 및 변형된 빵의 효과는, 인간 대장의 근위부, 횡단부 및 말단부를 시뮬레이션하는, 3-단계 연속 발효 배양에서(각 용기 1, 2 및 3), 평가되었다.

대변(foecal) 시료의 채집 전 6개월에 어떠한 프로바이오틱 또는 프리바이오틱(prebiotic) 보충제, 및 항생제를 섭취하지 않은, 대사성 또는 위장관 질환(당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 과민성 대장 증후군, 소화성 궤양 및 암과 같은)이 없는 2명의 건강한 및 2명의 셀리약 지원자(30 내지 50세 사이의 남성 및 여성; BMI:18.5-25)로부터 대변 시료를 수득하였다.

건강한 공여자에게는 대변 시료를 제공할 것을 요청하기 전에 건강 상태, 약물 사용, 임상 기형 및 생활 방식에 관한 정보를 수집하기 위해 표준 설문지를 제공하였다. 연구는 영국 레딩 대학교의 연구윤리위원회(Research Ethics Committee of the University of Reading)의 승인을 받았다.

방 안의 혐기성 조건을 재현하기 위해 가스 재생 키트(AnaeroGenTM, Oxoid)를 포함하는 혐기성 자(AnaeroJarTM 2,5 L, Oxoid Ltd)에 대변 시료를 저장하였다. 각 시료의 20 g 분취량을 혐기성 PBS 용액(0.1M 인산 용액, pH7.4, w/w) 100㎖에 희석하고 2분 동안 균질화시켰다(Stomacher 400, Seward, West Sussex, UK).

시료를 준비 15분 이내에 혐기성 발효조에 첨가하였다. 물리적-화학적 대장 조건은 부피가 증가하고 직렬 연결되는 3개의 유리 발효조로 이루어진 3-단계 연속 시스템에서 반복되었다. 이 연구에서 처음으로 Macfarlane et al. (1998)에 의해 검증된 시스템의 소규모 버전이 사용되었으며, 성장 배지를 건강한 및 셀리약 지원자의 대변 균질액 20%(w/v)로 접종된 용기 1(V1, 80㎖)는 상기대장의 근위부를, 용기 2(V2, 100㎖)는 대장의 횡단부를, 용기 3(V3, 120㎖)은 원위부를 나타낸다. 성장배지는 하기 성분을 함유하였다: 전분, 5g/l; 뮤신(mucin), 4 g/l; 카세인(casein), 3 g/l; 펩톤 물(peptone water), 5 g/l; 트립토판 물(tryptone water), 5 g/l; 담즙산 염(biliary salts), 0.4 g/L; 효모 추출액, 4.5 g/l; FeSO₄, 0,005 g/l; NaCl, 4.5 g/l; KCl, 4.5 g/l; KH₂PO₄, 0.5 g/l; MgSO₄ x 7H₂O, 1.25 g/l; CaCl₂ x 6H₂O, 0.15 g/l; NaHCO₃, 1.5 g/l; Tween 80, 1 mL; 헤민(hemin), 0.05 g/l; 및 시스테인(cysteine) HCl, 0.8 g/l.

접종 후, 박테리아 개체군은 회분 배양으로 24시간 동안 안정화되었다. 24시간 후(T0), 모델 시스템을 안정 상태(steady state)(SS1)를 달성할 수 있도록 8개의 완전한 용량 라운드 동안 실행하였다(SCFA 프로파일(+/-5%)의 안정화를 통하여 확인).

작동 부피(300㎖) 및 체류 시간(48시간, 유속 6.25 ㎖/hr)을 명심하면서, Maccaferri S. et al. (2012)에 의해 개시된 절차에 따라 적합한 상태에서 in vitro 소화된 대조군 또는 변형된 빵(3.75㎖)을, 용기 V1에 매일 추가하였다. 안정 상태2(SS2)에 도달할 때까지 빵을 시스템에 8 완전한 용량 라운드(complete volume rounds)으로 더 추가하였다.

4.5mL 분취량을 제거하고 SS1(T0 일) 및 SS2(T30 일)에 분석하였다.

대장의 세 부분을 시뮬레이션하는 모델 시스템의 박테리아 조성의 변화는 FISH 분석을 통해 평가되었으며(도 17 및 18) 미생물군 대사의 변화는 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 단쇄 지방산(SCFA)을 측정함으로써 평가되었다(도 19 및 20).

도 17에 묘사된 건강한 지원자에 대한 대조군 빵의 효과의 결과는 락토바실러스/엔터로코커스 종(Lactobacillus/Enterococcus spp.)(프로브 Lab158에 의해 검출된)(용기 V1 및 V2), 박테로이데스-프레보텔라(Bacteroides-Prevotella) 군(V2)(프로브 Bac303에 의해 검출된) 및 클로스트리듐 클러스터(Clostridium clusters) XIVa+b (V1)(프로브 Erec482에 의해 검출된)의 유의한 감소를 나타냈다.

또한 이러한 차이는 유의하지는 않을지라도 모델 시스템의 모든 단계에서 총 박테리아 감소 경향이 관찰되었다. 그런 다음, 대조군 빵은 대변 미생물의 조절 및 조성에 긍정적 영향을 미치지 않았다.

그 대신, 본 발명의 방법에 따라 처리된 빵의 투여는, 셀리약 및 건강한 지원자 모두에서 비피도박테리아(프로브 Bif164에 의해 검출된)의 유의한 증가를 유도하였다.

특히, 셀리약 개체에서 각각 모델 시스템의 제2 단계(용기 2)에서 8.42 내지 8.90 Log CFU/㎖로, 용기 3에서 8.60 내지 9.80 Log CFU/㎖로의 비피도박테리아의 유의한 증가가 관찰되었다(p<0.05).

건강한 개체에서, 용기 3에서 7.90 내지 8.40 Log CFU/㎖로의 비피도박테리아의 유의한 증가가 관찰되었다(p<0.05)(도 18).

또한, 셀리약 지원자에서 모든 용기에서 8.85 내지 9.50 Log CFU/㎖; 9.1 내지 9.60 Log CFU/㎖ 및 9 내지 9.50 Log CFU/㎖로의 클로스트리듐 클러스터의 증가가 관찰되었다(p<0.05).

모든 박테리아 군 및 모든 용기에서 증진의 일반적인 경향은 건강한 및 셀리약 개체 모두에서 유의한 차이 없이 검출되었다.

SCFA는 모델 시스템의 모든 세 개의 다른 용기 중 SS1 및 SS2에서 HPLC에 의해 측정되었다(도 19 및 20). 대조군 빵의 투여는 아세트산염(V1 및 V2) 및 프로피온산염(V1)의 유의한 감소, 및 모든 용기에서 부트르산염의 증가를 유도한다(도 19).

건강한 개체에서, 변형된 빵의 발효는 각각 V1에서 28.80 내지 22.10 mM(p<0.01), V2에서 44.40 내지 56.94 mM(p<0.01) 및 V3에서 46 내지 76.50mM(p<0.01)으로, 아세트산염의 유의한 생성을 유도한다(p<0.01). 또한, 각각 V1에서 70.46 내지 89.81 mM(p<0.05)로 프로피온산염 농도의 증가, V3에서 40.35 내지 77.09 mM(p<0.05)로 부트르산염 농도의 증가가 관찰되었다. 셀리약 개체에서, 각각 V1에서 45.10 내지 69.20 mM(p<0.01)로 V2에서 50.80 내지 70.20 mM(p<0.05)로 프로피온산염 수준의 유의한 증가가 관찰되었다. 또한, 용기 1에서 41.20 내지 89mM(p<0.01)로 아세트산염 농도의 유의한 증가가 검출되었다(도 20).

결과로부터, 변형된 빵의 in vitro 발효가 건강한 개체에서 대조군 빵으로 관찰되지 않은, 아세트산염 및 프로피온산염 농도의 증가로 대장 미생물 총의 조절을 유도한다는 것이 추측된다.

아세트산염 및 프로피온산염의 생산을 위한 위장 박테리아에서 가장 잘 알려진 대사 경로는 다당류 대사에 관한 것이다.

아세트산염 생산은 주로 비피도박테리아에 의한 과당-6-인산포스포케톨라아제(fructose-6-phosphate phosphoketolase)의 대사 경로를 통해 이루어지며, 이러한 산의 주요 생산은 박테리아 증진과 밀접하게 관련되어 있다(Miller T.L. et al., 1996).

Hosseini E. et al. (2011)에 따르면, 프로피온산염은 두 가지 대사 경로를 통해 발효 탄수화물에 의해 생산될 수 있다. 첫 번째는 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) 및 프로피오니박테리아 속(Propioni bacterium spp.)의 존재 하에 숙신산염 탈카르복실화반응(succinate decarboxylation)을 예상하는 반면, 두 번째는 피루브산염(pyruvate)이 클로스트리듐의 몇몇 클러스터의 존재 하에 젖산염 탈수소효소(lactate dehydrogenase)가 감소된다는 점에서, 아크릴산염(acrylate)의 대사 반응을 예상한다. 변형된 빵의 발효 동안에 비피도박테리아, 박테로이데스 및 E. 렉테일(E. rectale) 군의 유의한 증가가 관찰되었다.

변형된 빵은 건강한 및 셀리약 공여자 모두에서 SCFA의 증가뿐만 아니라 미생물의 구성의 양의 조절을 보여주었다.

이후, 변형된 빵의 발효는 건강한 및 셀리약 개체 모두에서 비피도제닉(bifidogenic) 효과와 셀리약 개체에서 클로스트리디움 XIVa+b의 성장 수의 관점에서 양의 조절을 만든다.

건강한 개체에서 아세트산 및 프로피온산 수준이 용기 1에서 감소되었지만, 아세트산 수준은 V2 및 V3에서 상당히 증가하였고, 부티르산 수준이 V3에서 증가하였다. 또한, 셀리약 개체의 경우 V1에서 아세트산 및 프로피온산의 고 농도 및 V2에서 프로피온산염의 고농도가 관찰되었다.

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Claims

하기 단계를 포함하는, 곡물의 낟알(grains of cereals)에서 글루텐(gluten)의 해독 방법:
a) 곡물 낟알을 15 내지 18%로 구성된 낟알의 습도까지 물로 수화시키는 단계:
b) 수화된 낟알을 60 내지 70℃로 구성된 낟알의 온도에 도달하는데 필요한 시간 동안 및 전력으로 전자기파로 처리하는 단계;
c) 50 내지 60℃로 구성된 온도에 도달할 때까지 상기 조사를 중단시키고 및 동시에 a) 단계와 비교하여 14 내지 16%로 구성된 낟알의 습도 손실(humidity loss of the grains)을 갖는 수분 증발을 시키는 단계;
d) 수화된 낟알을 전자기파로 80 내지 90℃로 구성된 낟알의 온도에 도달하는데 필요한 시간 동안 및 전력으로 처리하는 단계;
e) 70 내지 80℃로 구성된 온도에 도달할 때까지 조사를 중단시키고 및 동시에 a) 단계와 비교하여 40 내지 44%로 구성된 낟알의 습도 손실을 갖는 수분 증발을 시키는 단계;
f) 수화된 낟알을 전자기파로 110 내지 120℃로 구성된 낟알의 온도에 도달하는데 필요한 시간 동안 및 전력으로 처리하는 단계;
g) 80 내지 90℃로 구성된 온도에 도달할 때까지 조사를 중단시키고 및 동시에 a) 단계와 비교하여 50 내지 60%로 구성된 낟알의 습도 손실을 갖는 수분 증발을 시키는 단계;
h) 실온에서 해독된 낟알을 서서히 냉각시키는 단계.
청구항 1에 있어서, 상기 전자기파는 마이크로파 또는 적외선인 것인 방법.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 전자기파가 사용되는 경우 수화된 낟알을 처리하는 단계는 마이크로파 오븐에서 수행되는 것인 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, i) h) 단계에서 수득된 낟알의 분쇄(milling of the grains)하여 해독된 가루 또는 세몰리나(semolina)로 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 4에 있어서, 용매로 i) 단계에서 수득한 해독된 가루 또는 세몰리나로부터 글루텐을 추출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곡물은 밀, 보리, 오조, 호밀 또는 귀리로부터 선택된 것인 방법.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 해독된 곡물, 가루, 세몰리나 또는 글루텐.
빵, 파스타, 베이커리 제품, 맥주, 아이스크림, 유제품, 소스, 주스, 유아식품 및 살라미로부터 선택된, 청구항 7에 따른 해독된 곡물, 가루, 세몰리나 또는 글루텐을 포함하는 식료품.
장내세균 불균형(gut dysbiosis)의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 청구항 7에 따른 해독된 곡물, 가루, 세몰리나 또는 글루텐 또는 청구항 8에 따른 식료품.
셀리약병(celiac disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease) 및 과민성 장 증후군(irritable intestine syndrome)의 군으로부터 선택된, 염증성 또는 자가면역성 장 만성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 청구항 7에 따른 해독된 곡물, 가루, 세몰리나 또는 글루텐 또는 청구항 8에 따른 식료품.
비만, 제1 형 당뇨병 및 제2 형 당뇨병 중에서 선택되는 전신 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 청구항 7에 따른 해독된 곡물, 가루, 세몰리나 또는 글루텐 또는 청구항 8에 따른 식료품.
그람-음성균 및 그람-양성균에 대한 항박테리아제로 사용하기 위한, 청구항 7에 따른 해독된 곡물, 가루, 세몰리나 또는 글루텐 또는 청구항 8에 따른 식료품의 용도.
청구항 12에 있어서, 상기 그람-음성균은 살모넬라 속(Salmonella genus), 바람직하게는 쥐티푸스균(Salmonella Typhimurium)에 속하고 그람-양성균은 스타필로코커스 속(Staphylococcus genus), 바람직하게는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 속하는 것인, 해독된 곡물, 가루, 세몰리나, 글루텐 또는 식료품의 용도.
유용한 프로바이오틱(probiotics) 종에 대한 보호제로서 사용하기 위한, 청구항 7에 따른 해독된 곡물, 가루, 세몰리나 또는 글루텐 또는 청구항 8에 따른 식료품의 용도.
청구항 14에 있어서, 상기 프로바이오틱 종은 락토바실리 속(Lactobacilli genus). 바람직하게는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)에 속하는 것인, 해독된 곡물, 가루, 세몰리나, 글루텐 또는 식료품의 용도.
식료품의 제조를 위한 증점제(thickening agent)로서 청구항 7에 따른 해독된 글루텐의 용도.