CN104219968A - 用于预防和治疗感染的益生菌来源的无活力的材料 - Google Patents

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Abstract

包含来自益生菌例如LGG的分批培养过程的指数生长期后期的培养上清液的组合物，其用于治疗或预防病原体例如阪崎肠杆菌的感染。

Description

用于预防和治疗感染的益生菌来源的无活力的材料
技术领域
本公开内容涉及自益生细菌菌株、尤其是自鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus Goldin Gorbach, LGG)收获无活力的、生物活性材料的方法。具体地讲，本公开内容涉及对细菌感染具有活性的益生菌(probiotic)来源的材料的制备方法，可由所公开的收获方法获得的益生菌材料，以及涉及包含益生菌来源的材料的饮食或营养产品。
背景技术
阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii，以前称为Enterobacter sakazakii)是一种与在婴儿、尤其是新生儿重症监护室中的感染暴发相关的条件致病菌。在婴儿中，它可引起菌血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎(NEC)。由该生物感染所致的婴儿死亡率经报告为40-80%。作为细菌侵入脑部的结果，感染经常导致发育迟缓和认知功能受损。多达20%存活新生儿出现严重的神经学并发症。
因此需要提供一种组合物，其针对阪崎肠杆菌等病原体感染具有防护作用或可治疗所述感染。本公开内容提供组合物，其在新生大鼠模型中对阪崎肠杆菌等病原体向脑部的侵入和死亡率有作用。已经发现，LGG培养上清液减少阪崎肠杆菌向脑和肝的侵入并且甚至完全抑制幼小大鼠的阪崎肠杆菌相关死亡率。
关于这一点，已经体外测试了多种化合物对阪崎肠杆菌的细菌粘附或生长的抑制性能。例如，已经证明，在细胞培养中，益生元寡糖(prebiotic oligosaccharide)抑制阪崎肠杆菌向上皮细胞的粘附(Quintero等人, Curr. Microbiol. 62(5):1448-54)。在扩散测定中，已经描述了由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)产生的酪蛋白来源的抗微生物肽发挥针对阪崎肠杆菌和大肠杆菌(E. coli)的抗细菌活性(Hayes等人, 2006 Appl. Environ. Microbiol. 第72卷，第3期；2260-2264)。Collado等人(2008 FEMS Microbiol Lett 285 58-64)测试了益生菌菌株阻碍阪崎肠杆菌向分离的人粘液的粘附(在该研究中不包含LGG)。糖醛酸糖已用于在培养基中抑制阪崎肠杆菌生长(WO2009/148312)。总之，许多这些化合物与LGG上清液材料相比具有非常不同的特性和组成。此外，已经在体外测试了所有这些物质并集中在促成感染的发展(例如在培养基中抑制细菌生长或抑制细菌粘附到上皮细胞)的所选方面。尽管细菌粘附和生长等方面可促成感染的发展，但是这些体外测定并不能完全预测在体内对感染的系统下游参数和临床终点的影响。除了保加利亚乳杆菌(L. bulgaricus)(以下详细说明)之外，并未在体内测试上述物质，因此，迄今为止并未证明可在体内实现所提出的防护作用。
关于益生菌或其上清液，这些已被证明在体外能阻止病原体(包括阪崎肠杆菌)向上皮细胞或人粘液的粘附或者在体外抑制病原体生长。例如，Sherman等人(Infect. Immun. 2005 5183-5188)已经证明益生菌在体外在T84上皮细胞中减少了EHEC和ETEC诱导的变化，但是培养上清液和经处理的(tyndallized)细菌(经受热处理或γ辐射)则没有相应作用。Hudeault等人(Appl. Environ. Microbiol 1997 513-518)已经证明，乳杆菌GG (LGG)及其耗尽的培养上清液这两者在体外都减少了鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)侵入，尽管是在较小的程度上。在体内，在相应的鼠伤寒沙门氏菌感染的小鼠模型中，仅测试了活的LGG微生物。De Keersmaecker等人(FEMS Microbiol Lett 2006 259 89-96)表征了LGG上清液在体外针对鼠伤寒沙门氏菌的抗微生物活性。EP1384483公开了已感染旋毛虫(Trichinella spiralis)并用乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)治疗的小鼠与用培养基MRS治疗的小鼠相比具有较低的虫计数。此外，其它益生菌菌株例如嗜酸乳杆菌具有不同作用和增加或不影响虫载量。重要的是，来自其它病原体研究的发现不能自动转化为阪崎肠杆菌，因为发病机制明显不同。更具体地讲，阪崎肠杆菌可以侵入脑部并引起脑损伤，这对于最常见的胃肠道感染并非是这种情况。
为了进一步集中在益生菌和其上清液的作用上，益生菌在本领域中目前被定义为活的微生物，当将其以合适量给予时，赋予宿主健康益处。然而，当将其掺入营养产品时，益生菌的活的性质带来了挑战。这些挑战在数量级方面可能不同，尤其取决于所用的益生菌菌株类型、接受产品的个体健康状态，或这两者。另外从工艺技术的观点看，当将活的微生物掺入产品中时必须克服相当大的障碍。如果将益生菌掺入到长期产品例如粉状产品例如婴儿配方中时，这一点尤其起作用。另外，挑战随着营养产品基质的复杂性增加而增加。
另一方面，尤其是在婴儿和儿童的饮食产品的情况下，存在一个重要的需求，即提供益生菌的有益作用。此外，对于可通过零售或医院渠道获得并暴露于环境温度的营养产品，确保有活力的细菌的稳定性和活力特别具有挑战性。在这一方面通过施用培养上清液而使用细菌产物，将提供相当大的优势。
如上所述，证明有益作用的许多研究仅包括体外培养或测定，它们不能直接预测体内结果。另外，益生菌培养上清液不一定发挥与益生的有活力的细菌细胞相同的有益作用，因为潜在机制可显著相同。例如，Sherman等人(Infect. Immun. 2005 5183-5188)的研究证明益生菌在体外在T84上皮细胞中减少了EHEC和ETEC诱导的变化，但是培养上清液和经处理的(tyndallized)细菌则没有相应作用。此外，甚至密切相关的细菌菌株在其性质上也可不同，导致益生菌菌株以及病原菌菌株的不同性质。涉及所选益生菌菌株的发现不能直接转化为另一益生菌菌株的益处。这由Gueimonde等人(Food Res. Internat. 39 2006 467-471)证明，证明了在不同乳杆菌之间和在不同病原体之间，抑制病原体(包括阪崎肠杆菌)粘附的能力极大地不同，需要具体情况具体评价，以便选择具有抑制特定病原体的能力的菌株。另外，Gross等人(Beneficial Microbes 2010 1(1), 61-66)阐明了益生菌特性的菌株特异性并证明了相同属的不同益生菌菌株在益生菌性质上可不同。因此，从采用某些益生菌菌株和有活力的细菌而不是上清液的研究中不能得出以下结论：对于其它益生菌菌株和所得到的上清液，可预期相同的作用。
具体关于LGG (上清液)的作用和病原体向上皮细胞的粘附或细菌生长，迄今为止有自相矛盾的证据。Silva等人(Antimicrobial Agents Chemotherapy 第31卷, 第8期, 1987, 1231-1233)已经证明了LGG上清液对一系列细菌种类的抑制活性，其中并未提及包括阪崎肠杆菌。相比之下，在Johnson-Henry等人(Infect. Immun. 2008 第76卷, 第4期, 1340-1348)的研究中，LGG上清液在体外不影响大肠杆菌O157:H7的生长。Ruas-Madiedo等人(J. Food Protec. 第69卷, 第8期, 2006, 2011-2015)已经报告来自包括LGG在内的不同益生细菌的细胞表面胞外多糖(EPS)部分在体外甚至增加了病原体例如阪崎肠杆菌向人肠道粘液的粘附。最终，Roselli等人(Br. J. Nutr. 2006 95 1177-1184)证明LGG上清液减少了大肠杆菌向Caco-2细胞的粘附和ETEC所致的嗜中性粒细胞-迁移，但不影响大肠杆菌活力。因此，从目前的文献中不能预期特别制备的LGG上清液在体内对阪崎肠杆菌相关结果的影响。
我们注意到，使用益生的乳杆菌在体内针对阪崎肠杆菌相关的作用的研究的唯一参考文献由Hunter等人(Infect. Immun. 2009 1031-1043)描述。这些作者已经证明保加利亚乳杆菌在新生大鼠的NEC模型中预防由阪崎肠杆菌-诱导的一氧化氮所导致的肠道上皮细胞损伤。研究表明用保加利亚乳杆菌益生生物预治疗，然后再用阪崎肠杆菌感染，在体外和体内都保持了肠细胞的完整性。然而，保加利亚乳杆菌治疗连同阪崎肠杆菌不是保护性的。尽管该研究表明在NEC模型中对于肠上皮细胞损伤，有活力的保加利亚乳杆菌细菌细胞针对阪崎肠杆菌感染的某些有希望的作用，但与本公开内容相比，结果涉及不同的益生菌菌株(保加利亚乳杆菌，而非LGG)、不同的材料(有活力的益生微生物，而非上清液)和不同的研究参数(肠上皮细胞损伤，而非侵入到肠外器官例如脑部)。
总之，益生细菌对病原体的抑制的先前研究结果有极大的不同。在某些研究中，活的微生物发挥有益作用，但已经证实来自培养基的上清液不能总是重现该作用。关于阪崎肠杆菌粘附和生长抑制的大部分证据基于体外数据，不能将其外推到体内作用。迄今为止仅发表了一例体内研究的有限结果，证明在NEC大鼠模型中在阪崎肠杆菌感染之后，有活力的益生菌对肠细胞完整性的保护性作用，但早先并没有证明针对阪崎肠杆菌侵入脑部的防护作用。因此，仍然非常需要鉴定这样的组合物：其减少或抑制病原体例如阪崎肠杆菌向其它器官例如脑部的侵入和/或减少或抑制病原体例如阪崎肠杆菌所致的死亡率，而没有必要加入有活力的益生微生物。
发明内容
本公开内容提供组合物，所述组合物包含来自益生菌分批培养过程的指数生长期后期的培养上清液，用于治疗或预防病原体感染。在某些实施方案中，所述益生菌是LGG，所述病原体是阪崎肠杆菌。
在进一步的方面，本公开内容提供包含无活力的益生菌组合物的饮食产品，所述组合物可得自来自LGG分批培养过程的指数生长期后期的培养上清液；以及前述组合物作为营养产品的添加剂用于治疗或预防阪崎肠杆菌感染的用途。
再一方面，本公开内容提供在受试者中治疗或预防病原体感染的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的组合物，所述组合物包含可得自来自益生菌分批培养过程的指数生长期后期的培养上清液的无活力的益生材料。
实施本发明的最佳方式
在第一实施方案中，本公开内容涉及组合物，所述组合物包含来自益生菌分批培养过程的指数生长期后期的培养上清液，用于治疗或预防病原体感染。
在某些实施方案中，本公开内容基于以下知识：从益生菌例如LGG分批培养中可收获培养上清液(其也可称为“耗尽培养基(spent medium)”)，其针对病原体例如阪崎肠杆菌感染、尤其是对于阪崎肠杆菌向器官例如脑部的侵入具有防护作用；此外，耗尽培养基对于病原体相关死亡率有影响。
不希望受到理论的束缚，认为该活性可归因于在益生菌分批培养的指数(或“对数”)期后期释放到培养基中的各组分的混合物(包括蛋白质材料，并可能包括(胞外)多糖材料)。所述组合物在下文称为“本公开内容的培养上清液”。
鼠李糖乳杆菌GG(乳杆菌G.G., 菌株ATCC 53103)是分离自健康人类受试者肠道的细菌。普遍认为它是益生菌，并因此建议将其掺入到许多营养产品中，例如乳制品、营养补充剂、婴儿配方等。其公开于美国专利号5,032,399(Gorbach等人)，其通过引用全部结合到本文中。LGG对大多数抗生素无抗性，在酸和胆汁存在下稳定，强力附着在人类肠道粘膜细胞上。在大多数个体中它维持1-3天，在30%受试者中维持至多7天。除了它的定居能力外，LGG也有益地影响粘膜免疫应答。LGG保藏在保藏权威机构美国典型培养物保藏中心，保藏号ATCC 53103。
本公开内容及其实施方案提供培养上清液，其针对阪崎肠杆菌感染具有活性；更具体地讲，在某些实施方案中，给出了适当地简单发酵和收获方法，以便从LGG获得无活力的益生材料，其维持了针对阪崎肠杆菌侵入和死亡的活性。
细菌分批培养中公认的各时期是技术人员已知的。这些时期是“延迟期”、“对数期”(“对数期”或“指数期”)、“稳定期”和“死亡期”(或“对数下降期”)。在存在活细菌的所有时期中，细菌代谢培养基中的营养物，并分泌(施加、释放)材料到培养基中。在生长期间的指定时间点所分泌的材料的组成通常是不可预测的。
在一个优选的实施方案中，本公开内容和/或其实施方案的组合物可通过包括以下步骤的方法而获得：(a)使用分批过程，将益生菌例如LGG在合适培养基中培养；(b) 在培养步骤的指数生长期后期收获培养上清液，该期参照分批培养过程的延迟期和稳定期之间的时间的后一半而定义；(c) 任选从所述上清液中除去低分子量成分，以保留超过5-6千道尔顿(kDa)的分子量成分；(d) 从所述培养上清液中除去液体内容物，以获得所述组合物。
在本公开内容及其实施方案中，在指数期后期收获所分泌的材料。指数期后期发生在指数期中期之后的时间(指数期中期是指数期持续时间的一半时间，因此提及指数期后期是指延迟期和稳定期之间的时间的后一半)。具体地讲，术语“指数期后期”在本文中用于指LGG分批培养过程的延迟期和稳定期之间的时间的后四分之一部分。在本公开内容及其实施方案的优选实施方案中，培养上清液的收获是在指数期持续时间的75%至85%的时间点，和最优选在指数期经过约5/6的时间。
术语“培养(cultivation或culturing)”是指微生物(在本例中指LGG)在合适培养基上或中的繁殖。这样的培养基可以是各种类型，尤其是本领域惯常的液体肉汤。优选的肉汤是例如通常用于乳杆菌培养的MRS肉汤。MRS肉汤通常包含聚山梨酯、乙酸盐、镁和锰(其已知作为乳杆菌的特别生长因子起作用)以及富营养物的基础。典型的组成包含(以g/升的量):来自酪蛋白的蛋白胨10.0；肉膏8.0；酵母膏4.0；D(+)-葡萄糖20.0；磷酸氢二钾2.0；Tween®80 1.0；柠檬酸三铵2.0；乙酸钠5.0；硫酸镁0.2；硫酸锰0.04。
本公开内容和/或其实施方案的培养上清液的优选用途是在婴儿配方中。所分泌的细菌产物的收获引起以下困难：无法容易地耗尽培养基中的不想要的组分。这尤其涉及用于相对易受伤害的受试者的营养产品，例如婴儿配方或临床营养。如果来自培养上清液的特定组分首先被分离、纯化，然后再用于营养产品，就不会引起这一问题。然而，希望利用更完全的培养上清液。这将用于提供更好地反映益生菌(即LGG)天然作用的组合物。然而，不能只使用培养上清液本身作为特别用于婴儿配方等的无活力的益生材料的基础。
为了在此更充分利用本公开内容，希望确保从LGG培养中收获的组合物不含有在这类配方中不想要的或通常不被接受的组分(当可能存在于培养基中时)。对于MRS肉汤中常规存在的聚山梨酯，培养细菌的培养基可包含乳化的非离子型表面活性剂，例如基于聚氧乙烯化脱水山梨醇和油酸(通常可作为Tween®聚山梨酯，例如Tween®80得到)。尽管这些表面活性剂在食品例如冰淇淋中经常存在，并且公认为是安全的，但是对于用于相对易受伤害的受试者的营养产品例如婴儿配方或临床营养，它们并非在所有司法管辖区都被认为是合乎要求的，或甚至可接受的。
因此，在本公开内容和/或其实施方案的一个优选实施方案中，本公开内容也涉及使用其中可避免上述聚山梨酯的培养基。为此，本公开内容的优选培养基缺乏聚山梨酯例如Tween 80。在本公开内容和/或其实施方案的一个优选实施方案中，培养基可包含选自以下的油性成分：油酸、亚麻籽油、橄榄油、菜籽油、葵花油及其混合物。可以理解，如果聚山梨酯表面活性剂的存在是基本或完全可避免的话，就获得了油性成分的全部益处。
对于本公开内容的用途，最优选地，MRS培养基缺乏聚山梨酯。除一种或多种上述油类之外，也优选培养基还包含蛋白胨(典型地0-10 g/L，尤其是0.1-10 g/L)、肉膏(典型地0-8 g/L，尤其是0.1-8 g/L)、酵母膏(典型地4-50 g/L)、D(+)葡萄糖(典型地20-70 g/L)、磷酸氢二钾(典型地2-4 g/L)、乙酸钠三水合物(典型地4-5 g/L)、柠檬酸三铵(典型地2-4 g/L)、硫酸镁七水合物(magnesium sulfphate heptahydrate)(典型地0.2-0.4 g/L)和/或硫酸亚锰四水合物(典型地0.05-0.08 g/L)。
培养通常在20ºC至45ºC、优选35ºC至40ºC、最优选在37ºC的温度进行。
优选地，本公开内容和/或其实施方案的组合物具有中性pH，例如pH介于pH5和pH7之间，优选为pH6。也希望本公开内容和/或其实施方案的组合物不含有分子量低于5-6 kDa的成分。应当注意，如上所述的某些现有技术测试表明，上清液仅当pH在约4时才发挥作用，而当pH为中性时未见其发挥作用。相应地，现有技术的这种抗微生物活性与乳酸的存在相关。
根据例如OD600nm和葡萄糖浓度，可确定在培养期间收获培养上清液的优选时间点，即在上述指数期后期。OD600是指在600nm处的光密度，这是与培养基中的细菌浓度直接相关的已知的密度度量。
除了上述之外，应当注意，乳杆菌(包括LGG)的分批培养是本领域技术人员可获得的常识。因此，这些方法在本文中无需进一步阐述。
优选地，本公开内容和/或其实施方案的组合物通过大规模发酵(例如在超过100 L发酵罐中，优选约200 L或更大的发酵罐中)而生产。
本公开内容和/或其实施方案的组合物可以通过从细菌培养物中分离培养上清液的任何已知技术而收获。这样的技术是本领域众所周知的并包括例如离心、过滤、沉淀等。
本公开内容及其实施方案的上清液可以立即使用，或贮存以备未来使用。在后一种情况下，通常将上清液冷藏、冷冻或冻干。可视需要将上清液浓缩或稀释。
对于化学物质，认为本公开内容和/或其实施方案的培养上清液的组合物认为是不同分子量的多种氨基酸、寡肽和多肽、和蛋白质的混合物。认为所述组合物还包含多糖结构和/或核苷酸。
应强调的是，不同于现有技术，本公开内容和/或其实施方案优选地涉及全部即未分级的培养上清液。认为在上述指数期后期收获的明智选择，和对上清液的几乎所有组分的保留，促进了所获得的意想不到的结果，尤其是考虑到针对阪崎肠杆菌感染的预防活性，更尤其是考虑到在围产期给予怀孕以及哺乳妇女后(upon perinatal administration to pregnant respectively lactating women)在婴儿和新生儿中的这类活性。
本公开内容及其实施方案的全部培养上清液更具体地定义为基本排除低分子量组分，通常低于6 kDa、或甚至低于5 kDa。这涉及到以下事实：组合物优选不包括乳酸和/或乳酸盐。因此，本公开内容和/或其实施方案的优选上清液的分子量大于5kDa，或，在某些实施方案中，大于6kDa。这通常涉及到过滤或柱色谱。事实上，该过滤保留物代表分子量范围大于6 kDa(换句话说，低于6 kDa的成分被滤出)。
本公开内容和/或其实施方案的上清液的组合物通常不仅是蛋白质性质的，而且包含多糖，尤其是胞外多糖(由LGG产生的、由糖残基构成的高分子量聚合物)。不希望受到任何理论的束缚，本发明人相信，与自其它时期例如指数期中期或稳定期收获的组合物相比，自如上所述的指数期后期收获的蛋白质材料的量和碳水化合物材料的量的比例，有助于上清液针对阪崎肠杆菌感染的防护性质。
依照本公开内容收获的本公开内容及其实施方案的培养上清液可以以不同方式投入使用，使其得益于针对阪崎肠杆菌的活性。这样的使用通常包括将本公开内容和/或其实施方案的组合物以某种形式给予有需要的受试者。在这一方面，培养上清液可以如下使用：例如掺入到胶囊中供口服给予，或掺入到液体营养组合物例如饮料中，或者可在进一步使用前将其加工。后者是优选的。
这样的加工通常包括从上清液的通常液体连续相中分离化合物。这优选通过干燥方法进行，例如喷雾干燥或冷冻干燥(冻干)。优选喷雾干燥。在喷雾干燥法的一个优选实施方案中，在喷雾干燥前加入载体材料，例如麦芽糊精DE29。
已经发现本公开内容和/或其实施方案的组合物具有针对阪崎肠杆菌感染的防护活性，即预防活性和/或治疗活性。阪崎肠杆菌感染可以导致细菌向上皮细胞的粘附、绒毛结构的丧失、上皮细胞的细胞凋亡、病原体向其它肠外器官的侵入、对宿主免疫系统的干扰、菌血症、脑膜炎、发育迟缓、精神发育迟缓、脑积水、坏死性小肠结肠炎(NEC)和/或死亡。本公开内容或其实施方案的培养上清液可以影响这些效应中的任何一种，优选影响这些效应中的选自以下的至少一种：细菌向上皮细胞的粘附、绒毛结构的丧失、上皮细胞的细胞凋亡、病原体向其它肠外器官的侵入、对宿主免疫系统的干扰、菌血症、脑膜炎、发育迟缓、精神发育迟缓、脑积水、坏死性小肠结肠炎(NEC)和/或死亡和/或其组合，更优选影响这些效应中的至少两种，甚至更优选影响这些效应中的至少三种，和最优选影响这些效应中的至少四种或更多种。在一个优选的实施方案中，本公开内容或其实施方案的培养上清液影响选自以下的效应中的至少一种：细菌向上皮细胞的粘附、上皮细胞的细胞凋亡、病原体向其它肠外器官的侵入、菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎(NEC)和/或死亡和/或其组合。
为了本公开内容的组合物发挥其有益的抗阪崎肠杆菌的效应，它将要经受试者(优选人类受试者)消化。具体地讲，在一个优选的实施方案中，所述受试者是怀孕妇女、哺乳期妇女、新生儿、婴儿或儿童。如上所述，使用可被认为是“无活力的益生菌”的材料的优势将大部分得益于婴儿食品。术语“婴儿”是指出生后的、小于约1岁的人。
可以理解，受试者的消化将需要口服给予本公开内容的组合物。本公开内容的组合物的给予形式并非关键。在某些实施方案中，可将组合物经由片剂、丸剂、胶囊化剂(encapsulation)、囊片、软明胶胶囊(gel caps)、胶囊剂、油滴或小药囊给予受试者。在另一个实施方案中，将组合物包封入糖、脂或多糖中。
在再一个实施方案中，将组合物加入食品或饮品并消耗。食品或饮品可以是儿童营养品，例如后续配方、成长奶、饮料、奶、酸奶、果汁、基于水果的饮料、咀嚼片、曲奇、饼干或奶粉。在其它实施方案中，所述产品可以是婴儿营养品，例如婴儿配方或人奶强化剂。
本公开内容的组合物，无论是以单独剂型还是经由营养产品添加，通常都以治疗或预防病原体感染的有效量给予。有效量优选相当于1x104至约1x1012个的活益生细菌的细胞当量/kg体重/天，和更优选108-109细胞当量/kg体重/天。对细胞当量的反演计算在技术人员的知识范围内。
如果本公开内容和/或其实施方案的组合物经由婴儿配方给予，婴儿配方可以是营养完全的并含有合适类型和量的脂质、碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质。脂质或脂肪的量典型地可在约3至约7 g/100 kcal之间变化。脂质来源可以是本领域任何已知或使用的，例如植物油，例如棕榈油、大豆油、棕榈油精、椰子油、中链甘油三酯油、高油酸葵花籽油、高油酸红花油等。蛋白质的量典型地可在约1至约5 g/100 kcal之间变化。蛋白质来源可以是本领域任何已知或使用的，例如脱脂奶、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白(部分地或广泛地)水解蛋白、氨基酸等。碳水化合物的量典型地可在约8至约12 g/100 kcal之间变化。碳水化合物来源可以是本领域任何已知或使用的，例如乳糖、葡萄糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精、蔗糖、淀粉、大米糖浆固体等。
便利地，可以使用市售的产前的、早产的婴儿和儿童营养产品。例如，Expecta® Enfamil®、Enfamil®早产儿配方、Lactofree ®、Nutramigen®、Gentlease®、Pregestimil®、ProSobee®、Enfakid®、Enfaschool®、Enfagrow®、Kindercal®(可得自Mead Johnson Nutrition Company, Glenview, Illinois, U.S.)中可以添加合适水平的本公开内容的组合物并用于本公开内容的方法的实践。
在一个实施方案中，可将本公开内容和/或其实施方案的组合物与一种或多种有活力的益生菌组合。在该实施方案中，本领域已知的任何有活力的益生菌都可为可接受的，只要它达到预期结果。
如果将有活力的益生菌与本公开内容的组合物联合给予，有活力的益生菌的量可相当于约1x104和1x1012个菌落形成单位(cfu)/kg体重/天。在另一个实施方案中，有活力的益生菌可包含约1x106和1x1012个cfu/kg体重/天。在再一个实施方案中，有活力的益生菌可包含约1x109个cfu/kg体重/天。在再一个实施方案中，有活力的益生菌可包含约1x1010个cfu/kg体重/天。
在另一个实施方案中，可将本公开内容和/或其实施方案的组合物与一种或多种益生元组合。“益生元”是指以声称有益于健康的方式、在消化道中刺激细菌的生长和/或活性的不可消化的食物成分。本领域已知的任何益生元在本实施方案中都将是可接受的，只要它达到所需结果。可用于本公开内容的益生元可包括乳果糖、低聚葡萄糖(gluco-oligosaccharide)、菊糖、聚葡萄糖、低聚半乳糖，低聚果糖，低聚异麦芽糖，大豆低聚糖，低聚乳果糖、低聚木糖，和低聚龙胆糖(gentio-oligosaccharide)。
在本公开内容及其实施方案的再一实施方案中，婴儿配方可含有其它活性剂，例如长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)。合适的LCPUFA包括但不限于[α]-亚油酸、[γ]-亚油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(ARA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)。在一个实施方案中，将本公开内容的组合物与DHA联合给予。在另一个实施方案中，将本公开内容的组合物与ARA联合给予。在再一个实施方案中，将本公开内容和/或其实施方案的组合物与DHA和ARA两者联合给予。含有DHA、ARA或其组合的市售的婴儿配方可添加本公开内容的组合物并用于本公开内容。例如，含有有效水平的DHA和ARA的Enfamil® LIPIL®是市售的并可以添加本公开内容的组合物并用于本公开内容。如果包括的话，在本公开内容的一个实施方案中，ARA的有效量典型地为约5 mg/kg体重/天至约150 mg/kg体重/天。在本公开内容及其实施方案的一个实施方案中，其量在约10 mg/kg体重/天至约120 mg/kg体重/天之间变化。在另一个实施方案中，其量在约15 mg/kg体重/天至约90 mg/kg体重/天之间变化。在再一个实施方案中，其量在约20 mg/kg体重/天至约60 mg/kg体重/天之间变化。如果使用婴儿配方，DHA在婴儿配方中的量可在约5 mg/100 kcal至约80 mg/100 kcal之间变化。在本公开内容的一个实施方案中，DHA在约10 mg/100 kcal至约50 mg/100 kcal之间变化；和在另一个实施方案中，约15 mg/100 kcal至约20 mg/100 kcal。在本公开内容的一个具体实施方案中，DHA的量为约17 mg/100 kcal。如果使用婴儿配方，则ARA在婴儿配方中的量可以在约10 mg/100 kcal至约100 mg/100 kcal之间变化。在本公开内容的一个实施方案中，ARA的量在约15 mg/100 kcal至约70 mg/100 kcal之间变化。在另一个实施方案中，ARA的量在约20 mg/100 kcal至约40 mg/100 kcal之间变化。在本公开内容的一个具体实施方案中，ARA的量为约34 mg/100 kcal。
如果使用婴儿配方，则可使用本领域已知的标准技术，向婴儿配方中添加含有DHA和ARA的油类。例如，通过替代等量的油类(例如配方中通常存在的高油酸葵花油)，将DHA和ARA添加到配方中。作为另一实例，可通过替代无DHA和ARA的配方中通常存在的全部脂肪掺合物的等量的剩余部分，将含有DHA和ARA的油类添加到配方中。如果使用的话，DHA和ARA的来源可以是本领域已知的任何来源，例如海洋油(marine oil)、鱼油、单细胞油、蛋黄脂质、脑脂质等。在某些实施方案中，DHA和ARA来源于单细胞Martek油、DHASCO®或其变体。DHA和ARA可呈天然形式，只要LCPUFA来源的剩余部分不会对婴儿产生任何实质性的有害效应。或者，DHA和ARA可以以精制形式使用。在本公开内容的实施方案中，DHA和ARA的来源是单细胞油，其教导于美国专利号5,374,567；5,550,156和5,397,591，其公开内容通过引用全部结合到本文中。然而，本公开内容不限于这些油类。
在一个实施方案中，含有EPA的LCPUFA来源与本公开内容的至少一种组合物组合使用。在另一个实施方案中，基本不含EPA的LCPUFA来源与本公开内容的至少一种组合物组合使用。例如，在本公开内容的一个实施方案中，向含有小于约16 mg EPA/100 kcal的婴儿配方中添加本公开内容的组合物。在另一个实施方案中，向含有小于约10 mg EPA/100 kcal的婴儿配方中添加本公开内容的组合物。在再一实施方案中，向含有小于约5 mg EPA/100 kcal的婴儿配方中添加本公开内容的组合物。
本公开内容和/或其实施方案的另一实施方案包括添加了本公开内容的组合物的婴儿配方，其甚至不含痕量的EPA。认为本公开内容的组合物与DHA和/或ARA的组合提供，对于含有这些试剂的配方针对阪崎肠杆菌感染的防护性质而言提供了互补的或协同效应。
在本公开内容及其实施方案的又一个优选实施方案中，本公开内容的饮食产品包含通常存在于人类母乳中的一种或多种生物活性材料，例如蛋白质或多糖。优选本公开内容的饮食产品包含乳铁蛋白。
在本公开内容的另一方面，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于减少、抑制、改善和/或治疗阪崎肠杆菌感染。
在本公开内容和/或其实施方案的一个优选实施方案中，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于减少、抑制和/或改善选自以下的至少一种状况：细菌向上皮细胞的粘附、绒毛结构的丧失、上皮细胞的细胞凋亡、病原体向其它肠外器官的侵入、对宿主免疫系统的干扰、菌血症、脑膜炎、发育迟缓、精神发育迟缓、脑积水、坏死性小肠结肠炎(NEC)和/或死亡和/或其组合，优选至少两种状况，更优选至少三种或更多种状况。
优选地，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于减少、抑制和/或改善向例如以下器官的侵入：脑、肝、脾、盲肠、肠上皮、肠系膜、脑脊液、血，优选向以下器官的侵入：脑、肝、脾，更优选地向脑的侵入。在一个优选的实施方案中，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于减少、抑制和/或改善因阪崎肠杆菌感染所致的精神发育迟缓。本公开内容和/或实施方案本公开内容和/或实施方案。在本公开内容和/或其实施方案的一个优选实施方案中，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于减少、抑制和/或改善阪崎肠杆菌感染的死亡率。
本公开内容的另一方面涉及本公开内容和/或其实施方案的组合物在预防阪崎肠杆菌感染中的用途。本公开内容及其实施方案的组合物非常适合于预防性使用。
优选地，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于预防阪崎肠杆菌感染相关的器官(例如肝、脾和/或脑)侵入。
优选地，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于预防阪崎肠杆菌感染的菌血症。
优选地，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于预防阪崎肠杆菌感染所致的脑膜炎。
优选地，本公开内容和/或其实施方案的组合物用于预防阪崎肠杆菌感染所致的坏死性小肠结肠炎(NEC)。
本公开内容的再一方面涉及使用本公开内容和/或其实施方案的组合物对阪崎肠杆菌感染的治疗。优选地，本公开内容和/或其实施方案涉及对阪崎肠杆菌感染相关的器官(例如肝、脾和/或脑)侵入的治疗。
优选地，本公开内容和/或其实施方案涉及对阪崎肠杆菌感染的菌血症的治疗。
优选地，本公开内容和/或其实施方案涉及对阪崎肠杆菌感染所致的脑膜炎的治疗。
优选地，本公开内容和/或其实施方案涉及对阪崎肠杆菌感染所致的坏死性小肠结肠炎(NEC)的治疗。
关于使用活的或有活力的益生菌的上述缺点，本公开内容在替代产品中的这类益生菌方面特别有益，所述产品用于预防、减少、改善或治疗阪崎肠杆菌感染和/或其症状。为此，组合物优选经由饮食或营养产品给予，更优选经由产前的、婴儿或儿童配方或营养组合物、医用食物(medical food)或用于特定医学目的的食物(即标记用于指定医学目的的食物)、最优选经由婴儿配方、或者用于孕妇或哺乳期妇女的围产期营养，其基本上如上文所述。另外，本公开内容也能够以改善的方式提供益生菌。例如，可以以标准化和可重现的方式，在工业环境中生产本公开内容的无活力的益生菌来源的材料，避免活的益生菌所固有的这些问题。另外，由于无活力的性质且尤其是当以干燥粉末提供时，可将它们充分掺入并配制(dose)到营养组合物中，用于预防或治疗阪崎肠杆菌感染。
下文将参考以下非限制性实例阐明本公开内容。
材料与方法
动物。定时怀孕的CD-1小鼠在妊娠天数(gestation day，GD)为17天时得自Charles River Laboratories (Wilmington, MA)。将动物维持在12 h: 12 h光/暗循环的动物室。将母鼠(dam)单独饲养并让其在GD 19或20自然生产。区分新生小鼠的性别并随机分配给养母。可随意获取啮齿类饲料和饮用水。
LGG、LGG上清液、阪崎肠杆菌和培养物的制备。将益生菌LGG(由Mead Johnson Nutrition提供)通过3次连续转移至de Man、Rogosa和Sharpe(MRS)(Oxoid, LTD, Basingstoke, England)肉汤并在37°C孵育24小时而活化。细胞经由离心(8,000 x g，在4°C离心15min)而分离，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤2次并重悬于溶媒中，浓度为106 CFU/ml LGG。从分批发酵过程制备LGG上清液。
使用以下培养基(改进的MRS肉汤)(表1)。
表 1
组分 (kg)
溶液 1( 分别在 110ºC 高压灭菌 )
葡萄糖·H2O 13.2
脱矿质水 10.8
溶液 2( 在 121ºC 高压灭菌 )
吐温80 0.4
乙酸钠·3 H2O 2.0
NH4Cl 0.528
柠檬酸三钠·2 H2O 0.960
K2HPO4 0.800
MgSO4·7 H2O 0.080
MnSO4·H2O 0.016
酵母膏(Gistex LS, Powder) 9.20
脱矿质水 162
总计 200 l发酵
在37°C，搅拌器速度为50 rpm下，通过加入33% NaOH使LGG在恒定pH6下生长，顶端空间吹入N2。在指数生长期后期，通过在14000 x g和4°C离心15 min，从培养基中分离细菌细胞，弃去细胞沉淀并将耗尽培养基贮存在-20°C。将该材料脱盐并冻干，并在动物实验中使用前，经重构以在动物阪崎肠杆菌感染模型中测试(下文称为LGG上清液)。
对于有活力的LGG的制备，通过测定培养物的光密度(OD)并与通过培养物系列稀释而制成的标准曲线相比，确定剂量浓度。然后通过以下方法证实剂量：将LGG接种到胰胨豆胨琼脂(tryptic soy agar，TSA)(Oxoid)上24小时，并计算CFU/ml。105 CFU/天的LGG的剂量或LGG上清液的相应剂量用于治疗并与溶媒一起给予。将在陶瓷珠上在-80°C冷冻的阪崎肠杆菌(菌株3290)的存贮培养物在胰胨豆胨培养液(tryptic soy broth，TSB)(Oxoid, 3 LTD, Basingstoke, England)上生长至测试浓度。制备阪崎肠杆菌培养物并按照对于LGG的描述证实其剂量，不同之处在于将细胞通过2次连续转移至TSB而活化。
小鼠的治疗
本研究的治疗方法先前已有描述(Richardson, A. N., S. Lambert和M.A. Smith. 2009. “Neonatal mice as models for Cronobacter sakazakii infection in infants.” J Food Prot 174；72(11): 2363-2367’’)。简而言之，在出生后天数(PND)为1-4天的4个连续天的第1天，幼鼠用在重构的粉状婴儿配方(RPIF)中的LGG和LGG上清液治疗，并在PND 2使用连接到1 ml注射器上的24 x 1’’(25.4 mm) W/1-1¼不锈钢动物饲喂针(Popper & Sons, Inc., New Hyde Park, N.Y.)，经口强饲阪崎肠杆菌。按照制造商说明书，将RPIF与无菌去离子水混合而重构。在幼崽分配之前，将香草矫味剂(The Kroger Co., Cincinnati, O.H.)施加到每只母鼠的鼻部上以掩蔽动物气味并产生嗅觉混乱。这样做，以增加养母对幼鼠的接受性。制备接种不同浓度的阪崎肠杆菌菌株3290的重构的粉末婴儿配方的系列稀释。每只幼鼠接受0.1 ml体积的RPIF以及107、108和1011 CFU/剂的经证实的阪崎肠杆菌剂量或溶媒对照。在治疗后的时期期间，每天两次观测新生儿发病率或死亡率。在治疗后天数(PTD)为7天时，对所有活的幼鼠实施安乐死。死亡率数据呈现为：整个研究的时间进程内的总死亡率(表3A)，以及仅计算在末次强饲处理后24小时发生的死亡的经调整的死亡率(表3B)。计算经调整的死亡率，以除去可能与强饲技术或重复强饲暴露的应激相关的任何死亡。
来自组织样品的阪崎肠杆菌的培养
从每只新生小鼠中收获肝、盲肠和脑并贮存于在冰上的Whirl Pack (Nasco, Fort Atkinson, WI)过滤袋中，用于培养。将肠杆菌强化(EE)肉汤(Oxoid)加到样品上，比例为10 ml EE: 1 g样品。将样品在紫红胆盐葡萄糖(violet red bile glucose, VRBG)琼脂板上划线，一式两份，用于肠杆菌(Enterobacter spp)的选择性生长，然后在37°C孵育24小时。将生长物在TSA板上亚培养并在25°C孵育48小时。RapID ONE Identification System (Remel, Inc., Lenexa, K.S., USA)用于阪崎肠杆菌分离的阳性生化证实。
统计学分析
使用SAS version 9.1(SAS Institute, Cary, N.C.)和Microsoft Excel(Microsoft Corporation, Redmond, W.A.)进行阪崎肠杆菌感染性和死亡率数据的统计学分析。使用Scheffe氏检验和Excel t检验，确定比较经治疗动物的年龄的数值的显著差异(P ≤ 0.05)。使用Dunnett氏t检验和Excel t检验，进行单向方差分析(ANOVA)检验，以确定对于每只小鼠年龄而言的治疗组和对照组之间的显著差异(P ≤ 0.05)。
结果
为了获取足够数量的动物用于统计学分析，以下数据是3次独立实验的合并结果。表2A显示自任何组织分离阪崎肠杆菌所来源的动物的百分率。当新生儿接受LGG或LGG上清液的共同治疗时，阪崎肠杆菌侵入组织的数量显著减少了约一半(表2A)。在3次实验中给予单个动物的阪崎肠杆菌的浓度范围为108-1012 CFU/ml。然而，被侵入的组织数量和被侵入的组织类型并非剂量依赖性的，并且与我们先前的工作一致。阪崎肠杆菌并非分离自LGG上清液或RPIF对照组。尽管处死(sacrifice)的平均体重范围为5.39-6.22 g，但是未发现显著差异。
表 2A. 在暴露给阪崎肠杆菌后，有或无LGG或LGG上清液时，具有至少一个被侵入组织样品的动物百分率和平均体重。
*阪崎肠杆菌剂量代表用阪崎肠杆菌浓度为108、109或1012 CFU/ml进行的3次独立实验的组合。
**具有同样字母的治疗组在统计学上没有差异。(p ≤ 0.05)。
当检查来自仅用阪崎肠杆菌处理的动物的单个组织时，与肝或脾相比，脑倾向于具有分离自较高的动物百分率的阪崎肠杆菌。用LGG或LGG上清液的共同治疗减少了向脑部的侵入达约50% (表2B)。因为脑是阪崎肠杆菌在人体中的靶组织，这可能是开发治疗和/或预防对脑的不良作用的重要发现。尽管肝的总侵入率仅为15%，但值得注意的是在接受LGG作为共同治疗的动物中，我们在任何实验中从未自肝组织中分离出阪崎肠杆菌并且用LGG上清液的共同治疗减少了自肝中分离阪崎肠杆菌达约一半(表2B)。然而，LGG和LGG上清液治疗这两者都显著地减少了自脑和肝组织分离阪崎肠杆菌，仅LGG治疗显著地减少阪崎肠杆菌向脾组织的侵入(表2B)。
表 2B. 在暴露给阪崎肠杆菌后，有或无LGG或LGG上清液时，自脑、肝或脾组织分离阪崎肠杆菌所来源的动物的百分率。
具有同样字母的治疗组在统计学上没有差异。(p ≤ 0.05)。
在处死的预定时间之前，对所有幼鼠都保持记录。表3显示3次实验的合并死亡率结果。对于接受阪崎肠杆菌的任何组，总死亡率为约30%(表3A)。
表 3. 在用阪崎肠杆菌处理之后，有或无LGG或LGG上清液*时，CD-1新生儿死亡率。
表 3A:总死亡率
表 3B: 经调整的死亡率:
具有同样字母的治疗组在统计学上没有差异。(p ≤ 0.05)。
相比之下，未接受阪崎肠杆菌的两个溶媒对照组具有约7%死亡率。当按照我们对于阪崎肠杆菌相关死亡的定义(仅计算强饲处理后24小时或更长时间发生的死亡)调整数据时，在阪崎肠杆菌和阪崎肠杆菌加上LGG组中死亡率降低约三分之一(表3B)。对于接受阪崎肠杆菌和LGG上清液的组，死亡率降低至0% (表3B)。LGG上清液和RPIF对照组的总共112只动物中仅有1只死亡。
讨论
已经证明益生菌提供针对病原体的防护作用。Corr等人(2007. Bacteriocin production as a mechanism for the antiinfective activity of Lactobacillus salivarius UCC118. Proc Natl Acad Sci USA 104(18): 7617.)发现细菌素(由唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)产生的一种抗细菌肽)的产生作为针对单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的潜在机制。尽管先前的研究已经证明益生菌在体外可以阻止阪崎肠杆菌附着在肠细胞上，但先前的工作没有集中在LGG在新生小鼠体内阻止或减少阪崎肠杆菌的侵入的潜力上。然而，已经证明保加利亚乳杆菌在新生大鼠 NEC模型中的保护性，其中幼鼠暴露给阪崎肠杆菌(Hunter, C. J., M. Williams,等人 2009. Lactobacillus bulgaricus prevents intestinal epithelial cell injury caused by Enterobacter sakazakii-induced nitric oxide both in vitroand in the newborn rat model of necrotizing enterocolitis. Infect Immun 77(3): 1031)。在目前的研究中，在暴露给阪崎肠杆菌之前和之后，通过给予LGG和LGG来源的上清液提供保护作用，这提供了额外证据，表明益生菌可以阻止阪崎肠杆菌的侵入。LGG和LGG上清液始终地减少新生小鼠组织中阪崎肠杆菌的分离。
添加活的或LLG上清液，减少了被阪崎肠杆菌侵入的组织的动物的百分率。在阪崎肠杆菌及其侵入率之间未发现剂量依赖性关系；然而，在用LGG和LGG上清液治疗的动物中，侵入率下降。发现阪崎肠杆菌最常见于经处理动物的脑组织中。
在同时接受阪崎肠杆菌和LGG以及LGG上清液的各组中脑组织侵入的减少是重要的，因为在阪崎肠杆菌感染中脑膜炎是发病率和死亡率的主要原因。总之，在同时接受阪崎肠杆菌和LGG以及LGG上清液的各组中，具有被阪崎肠杆菌侵入的组织的动物的总百分率下降。目前的研究表明，LGG和/或其上清液，在新生小鼠中限制了阪崎肠杆菌侵入的程度。
有趣的是，接受阪崎肠杆菌和阪崎肠杆菌与LGG的各组具有类似的经调整的死亡率(分别为17%和13%)并且显著高于阪崎肠杆菌与LGG上清液的组(表3)。我们观察到LGG比LGG上清液粘稠得多，这可能是在未来的研究中还需要处理的作用因素。溶媒对照组的低死亡率表明阪崎肠杆菌处理组中的大部分死亡，事实上是阪崎肠杆菌暴露的结果。
结论
在发酵过程期间收集的益生菌LGG及其分泌因子(LGG上清液)在口服暴露给具有不同剂量阪崎肠杆菌的RPIF的新生小鼠中降低了阪崎肠杆菌的总体侵入。在所检查的组织中，脑最经常受到阪崎肠杆菌的侵入，但也从LGG或LGG上清液治疗中得到最大的保护作用。对于脑，LGG和LGG上清液两者针对阪崎肠杆菌侵入具有同样的防护性。LGG上清液在保护新生小鼠免于阪崎肠杆菌相关死亡中是最有效的。

Claims (10)

1. 包含来自益生菌分批培养过程的指数生长期后期的培养上清液的组合物，其用于治疗或预防病原体感染。
2. 权利要求1的组合物，其中所述益生菌是LGG。
3. 权利要求1的组合物，其中所述病原体是阪崎肠杆菌(C. sakazakii)。
4. 权利要求1的用于治疗或预防病原体感染的组合物，其可通过包括以下步骤的方法而获得：(a)使用分批过程，将益生菌在合适培养基中培养；(b) 在培养步骤的指数生长期后期收获培养上清液，该期定义为分批培养过程的延迟期和稳定期之间的时间的后一半；(c) 任选从所述上清液中除去低分子量成分，以保留超过5 kDa的分子量成分；(d) 从所述培养上清液中除去液体内容物，以获得所述组合物。
5. 权利要求4的组合物，其中所述益生菌是LGG，且所述病原体是阪崎肠杆菌。
6. 权利要求5的组合物，其中指数期后期参照分批培养过程的延迟期和稳定期之间的时间的后四分之一部分而定义。
7. 权利要求1的组合物，其中所述分批培养在缺乏聚山梨酯的培养基中进行。
8. 权利要求7的组合物，其中所述培养基含有选自以下的成分：油酸、亚麻籽油、橄榄油、菜籽油、葵花油及其混合物。
9. 权利要求4的组合物，其中所述分批培养在pH 5-7下进行。
10. 权利要求1的组合物，其包含产前的、婴儿或儿童配方或营养组合物或添加剂、医用食物或用于特定医学目的的食物。
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