TW201400124A - 用於預防和治療感染之源自益生菌的非存活性物質 - Google Patents

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Abstract

一種組成物，其包含來自例如LGG之益生菌的批式培養法的指數生長期末期之培養物上清液，用於治療或預防例如坂崎氏克羅諾斯桿菌(C.sakazakii)之病原體感染。

Description

用於預防和治療感染之源自益生菌的非存活性物質 相互參照之相關申請案
本申請案主張下列專利申請案之利益，其係以引用方式併入本案：歐洲專利申請案第12161083.6號，申請日期2012年3月23日。
本發明關於一種自益生菌細菌菌株、特別是自鼠李醣乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus Goldin Gorbach)(LGG)收取非存活性、具生物活性物質之方法。特定言之，本發明關於一種製備有效抵抗細菌感染的源自益生菌的物質之方法，該益生菌物質可藉由所揭示之收取方法獲得，以及關於一種包括該源自益生菌的物質之膳食或營養產品。
坂崎氏克羅諾斯桿菌(Cronobacter sakazakii)(坂崎氏克羅諾斯桿菌先前被稱為坂崎氏腸桿 菌(Enterobacter sakazakii))係一種伺機性病原體，其與嬰兒、特別在新生兒加護病房的感染突發有關。在嬰兒，其會造成菌血症、腦膜炎及壞死性腸結腸炎(NEC)。由於感染此生物體的嬰兒死亡率據報為40-80%。由於細菌侵入腦部，感染常導致發育遲緩及認知功能受損。達至20%存活的新生兒產生嚴重的神經性併發症。
因此，亟需提供防護或可治療例如坂崎氏克羅諾斯桿菌之病原體感染的組成物。本發明提供一種對於例如坂崎氏克羅諾斯桿菌之病原體侵入腦部以及對於新生大鼠模式中的致命性具有作用的組成物。目前已發現LGG培養物的上清液降低坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入腦部及肝臟，甚至完全抑制坂崎氏克羅諾斯桿菌相關的大鼠仔鼠死亡率。
有鑑於此，已針對各種化合物測試其對於坂崎氏克羅諾斯桿菌的細菌附著或體外生長的抑制性質。舉例而言，在細胞培養中，已顯示益菌生(prebiotic)寡醣抑制坂崎氏克羅諾斯桿菌附著至上皮細胞(Quintero等人，Curr.Microbiol.62(5)：1448-54)。已有描述由嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)產生的酪蛋白衍生性抗微生物胜肽於擴散分析法中發揮抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌及大腸桿菌抗細菌活性之作用(Hayes et al,2006 Appl.Environ.Microbiol.vol.72 no.3；2260-2264)。Collado等人(2008 FEMS Microbiol Lett 285 58-64)測試益生菌 菌株抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌附著至經分離之人黏液(在此研究中未包括LGG)。尿羰基酸(uronic acid)醣類已用於培養基中以抑制坂崎氏克羅諾斯桿菌生長(WO2009/148312)。總之，與LGG上清液物質比較，這些化合物有眾多者具有極為不同特性及組成。再者，這些物質均曾於體外測試，且著重選定在造成感染產生的方面，例如抑制於培養基中的細菌生長或抑制細菌附著至上皮細胞。雖然像是細菌附著及生長方面可造成感染產生，但這些體外分析法未精確預測對於體內之感染的系統性後續參數及臨床終點。除了保加利亞乳酸桿菌(L.bulgaricus)(下文說明)，上列物質尚未經體內測試，且因此迄今仍未證明在體內可達到所顯示之保護作用。
就益生菌或彼等之上清液而言，這些均已顯示在體外預防病原體(坂崎氏克羅諾斯桿菌)附著至上皮細胞或人黏液或在體外抑制病原體生長。舉例而言，Sherman等人(Infect.Immun.2005 5183-5188)已顯示在體外益生菌降低在T84上皮細胞的經EHEC(出血性大腸桿菌)及ETEC(腸毒性大腸桿菌)誘發之改變，但培養物上清液及經間歇滅菌之細菌(予以熱處理或γ照射)未具有相同對應的效果。Hudeault等人(Appl.Environ.Microbiol 1997 513-518)已證明乳酸桿菌GG(LGG)及彼之已使用培養物上清液於體外降低(雖然至較低的程度)鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)侵入。僅有活LGG微生物於對應的鼠傷寒沙門桿菌感染之小鼠模 式進行體內測試。De Keersmaecker等人(FEMS Microbiol Lett 2006 259 89-96)特徵分析LGG上清液於體外抗鼠傷寒沙門桿菌的抗微生物活性。EP1384483揭露小鼠經旋毛蟲(Trichinella spiralis)感染之小鼠以乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)處理，較以培養基MRS處理的小鼠具有較低的蟲計數。再者，其他益生菌菌株例如像是嗜酸乳酸桿菌具有不同效果，且提高或未影響蟲負荷量(worm load)。重要的是，來自研究其他病原體的結果無法自然而然地轉譯(translate)至坂崎氏克羅諾斯桿菌，這是因為病理機轉截然不同所致。更特定言之，坂崎氏克羅諾斯桿菌可侵襲至腦部內並造成腦部損害，這與大多數常見胃腸道感染的情況不同。
為進一步著重在益生菌及彼等之上清液之角色，近期在本技術領域將界定益生菌為活微生物，當其投予適當量時，賦予宿主健康效益。然而，活益生菌的本質對將彼併入營養產品時帶來挑戰。尤其，取決於所使用之益生菌菌株類型、接受該產品的個體之健康狀態、或兩者皆有，這些挑戰程度不同。又，以製程技術的觀點，將活微生物併入產品中時，有相當大障礙必須克服。若係欲將益生菌併入期限長的產品，舉例而言，例如嬰兒配方之粉末產品，這特別扮演一角色。又，該挑戰隨營養產品矩陣(nutritional product matrix)複雜度增加而提高。
另一方面，特別是在針對嬰兒及孩童的膳食產品情況中，對於提供益生菌有益效應存有重大需求。 又，確保可透過零售或醫院管道獲得且暴露於環境溫度的營養產品中之存活性細菌的安定性及活力是特別具挑戰性。就此方面，透過應用培養物上清液使用細菌產物，將提供相當大的優勢。
如上所述，許多闡明有益效果的研究僅包括體外培養或分析法，無法直接預測體內結果。此外，由於潛在機轉相當地不同，所以益生菌的培養物上清液並不一定具有如同益生菌存活性細菌細胞的相同有益效果。舉例而言，Sherman等人的研究(Infect.Immun.2005 5183-5188)顯示，益生菌在體外降低在T84上皮細胞中經EHEC及ETEC誘發之改變，但培養物上清液及經間歇滅菌之細菌未有相同對應的效應。甚而，更為相近似的細菌菌株的特性會不同，導致益生菌及病源性菌株的不同性質。相關於某一選定益生菌菌株的結果無法直接被轉譯為另一益生菌菌株的效應。這由Gueimonde等人(Food Res.Internat.39 2006 467-471)所示，其闡明乳酸桿菌之間及病原體之間抑制病原體(包括坂崎氏腸桿菌)附著的能力極為不同，且有需要逐一評估，以選擇具有抑制特定病原體能力的菌株。此外，Gross等人(Beneficial Microbes 2010 1(1),61-66)描述益生菌特性的菌株專一性，並顯示相同菌屬的不同益生菌菌株的益生菌性質會不同。因此，無法從使用特定益生菌菌株及存活性細菌而非上清液的研究，獲得可預期其他益生菌菌株及所衍生之上清液的相同效果之結論。
就特定LGG(上清液)及病原體附著至上皮細胞或細菌生長的效果而言，目前有相牴觸的證據。Silva等人(Antimicrobial Agents Chemotherapy Vol 31,no 8,1987,1231-1233)已闡明LGG上清液抵抗各種菌種的抑制活性，其中未提及有納入坂崎氏克羅諾斯桿菌。相反地，在Johnson-Henry等人(Infect.Immun.2008 Vol 76,no 4,1340-1348)的研究中，LGG上清液於體外未影響大腸桿菌O157：H7生長。Ruas-Madiedo等人(J.Food Protec.Vol 69,no 8,2006,2011-2015)曾報導，來自包括LGG的不同益生菌細菌細胞表面的胞外多醣(EPS)部分，在體外甚至提高例如坂崎氏克羅諾斯桿菌之病原體附著至人腸黏液。最後，Roselli等人(Br.J.Nutr.2006 95 1177-1184)闡明LGG上清液降低大腸桿菌附著至Caco-2細胞以及經ETEC誘發之嗜中性球移動，但未影響大腸桿菌存活性。因此，經特別製備之LGG上清液於體內對坂崎氏克羅諾斯桿菌相關結果的效果，無法從近期文獻預期。
已知唯一使用益生菌乳酸桿菌於體內抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌相關效果的研究文獻，為Hunter等人(Infect.Immun.2009 1031-1043)所描述者。這些文獻的作者已闡明保加利亞乳酸桿菌在新生大鼠NEC模式中預防由坂崎氏克羅諾斯桿菌誘發之一氧化氮造成的腸上皮細胞傷害。此研究顯示，在體外及在體內，於坂崎氏克羅諾斯桿菌感染前，以保加利亞乳酸桿菌益生菌生物體預處 理，保存腸細胞完整性。然而，保加利亞乳酸桿菌併同坂崎氏克羅諾斯桿菌的處理則不具保護性。雖然此研究指出在NEC模式中某些具前景的存活性保加利亞乳酸桿菌細菌細胞抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌感染有關的腸上皮細胞傷害之作用，該結果相較於本發明係涉及不同益生菌菌株(保加利亞乳酸桿菌而非LGG)、不同物質(存活性益生菌微生物而非上清液)、以及不同研究參數(腸上皮細胞傷害，而非侵入腸外器官，像是腦)。
總之，益生菌細菌對於病原體抑制的先前研究之結果差異極大。在某些研究中，活微生物具有有益效果，但已顯示，來自培養基的上清液並不絕對重現此效果。大多數有關坂崎氏克羅諾斯桿菌附著及生長抑制的證據係基於體外數據，無法推知體內效果。來自迄今唯一一項已發表的體內試驗研究的有限結果，顯示在NEC大鼠模式中存活性益生菌對於坂崎氏克羅諾斯桿菌感染後的腸細胞完整性之保護效果，但先前未闡明抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入腦部的保護作用。因此，仍亟需找出降低或抑制病原體(例如坂崎氏克羅諾斯桿菌)侵入其他器官(例如腦部)、和/或降低或抑制由像是坂崎氏克羅諾斯桿菌之病原體所造成的死亡率之組成物，而不需加入存活性益生菌微生物。
本發明提供一種用於治療或預防病原體感染 之組成物，其包含來自益生菌批式培養法的指數生長期末期之培養物上清液。在特定實施態樣中，該益生菌係LGG，且該病原體係坂崎氏克羅諾斯桿菌(C.sakazakii)。
在另外態樣中，本發明提供一種用於治療或預防坂崎氏克羅諾斯桿菌感染之膳食產品，其包含可從來自LGG批式培養法的指數生長期末期之培養物上清液獲得之非存活性益生菌組成物，以及前述組成物作為營養產品中的添加物之用途。
在又另一態樣中，本發明提供一種治療或預防個體病原體感染之方法，該方法包含投予該個體有效量之組成物，該組成物包含可從來自批式培養法的指數生長期末期之培養物上清液獲得之非存活性益生菌原料。
發明詳述
在第一實施態樣中，本發明關於一種用於治療或預防病原體感染之組成物，該組成物包含來自益生菌批式培養法的指數生長期末期之培養物上清液。
在一些實施態樣中，本發明係基於領會到：可收取來自例如LGG之益生菌的批式培養之培養物上清液(亦可被稱為「已使用培養基(spent medium)」)，其具有防護像是坂崎氏克羅諾斯桿菌之病原體的感染，特別是對坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入器官(例如腦部)的抵抗；又，該已使用培養基對病原體相關的致命性具有效 果。
未欲受理論侷限，咸信此活性可歸因於經發現益生菌批式培養的指數(或「對數」)期之末期階段釋至培養基的組分(包括蛋白質物質，且可能包括(胞外)多醣物質)混合物。該組成物於下文將稱之為「本發明之培養物上清液」。
鼠李醣乳酸桿菌GG(乳酸桿菌G.G.，菌株ATCC 53103)係自健康人個體的小腸所分離之細菌。其被眾人理解係為益生菌，且因此已被建議用於併入許多營養產品，例如乳類產品、營養補充物、嬰兒配方等等。其揭露於Gorbach等人的美國專利第5,032,399號，其係以引用方式全部併入本案。LGG對多數抗生素不具抗性，在酸及膽汁存在下具安定性，且極偏好附著至人小腸道的黏膜細胞。在多數個體中持續1至3天，且在30%個體中達至7天。除了彼之菌落聚集能力之外，LGG亦有利地影響黏膜免疫反應。LGG寄存於寄存機構美國菌種保存中心，寄存編號ATCC 53103。
本發明及彼之實施態樣提供一種培養物上清液，其有效抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌感染；更特定言之，在特定實施態樣中，提出一種適宜的簡易發酵及收取方法，以自LGG獲得一種非存活性益生菌物質，其支持有效抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入及致命性。
辨識在細菌的批式培養中的階段，係熟習本技術領域者所知悉。這些階段為「遲滯」、「對數」(或 「指數」)、「穩定」及「死亡」(或「對數下降」)期。在活細菌存在的所有階段期中，細菌代謝來自培養基的營養素，並分泌(具有作用、釋出)物質至培養基中。在特定生長階段時點的所分泌物質之組成通常並非可預測的。
在一較佳實施態樣中，根據本發明和/或彼之實施態樣之組成物，係可藉由包含下列步驟之方法獲得：(a)使用批式法將例如LGG之益生菌培養於適合的培養基中；(b)於培養步驟的指數生長末期收取培養物上清液，指數生長末期係以介於批式培養法的遲滯期及穩定期之間的時間的後半段而為準而界定；(c)隨意自該上清液移除低分子量成分，以保留超過5-6千道耳頓(kDa)分子量之成分；(d)自該培養物上清液移除液體內容物，以獲得該組成物。
在本發明及彼之實施態樣中，所分泌物質自指數期末期收取。指數期末期發生在指數期中期之後的時間(指數期中期係指數期期間的半數時間，因此指數期末期係以遲滯期及穩定期之間時間的後半為準)。特定言之，本文中使用之用語「指數期末期」，係以LGG批式培養法介於遲滯期及穩定期之間的時間的後四分之一部分為準。在本發明及彼之實施態樣的較佳實施態樣中，收取培養物上清液係在指數期期間的75%至85%之時間點，且最佳係在指數期過了約5/6之時。
用語「培養(cultivation或culturing)」係 指微生物(在本例中為LGG)於適合的培養基之上或之中繁殖。如本技術領域中習知者，此類培養基可為各種類型，且特別為培養液。較佳培養液係例如常用於培養乳酸桿菌的MRS培養液。MRS培養液通常包含聚山梨糖醇酯、乙酸鹽、鎂及錳，該等已知作為乳酸桿菌的特別生長因子，以及包含高營養素基質。典型組成包含(含量為g/升)：來自酪蛋白的腖為10.0；肉萃取物為8.0；酵母萃取物為4.0；D(+)-葡萄糖為20.0；磷酸氫二鉀為2.0；Tween® 80為1.0；檸檬酸三銨為2.0；乙酸鈉為5.0；硫酸鎂為0.2；硫酸錳為0.04。
本發明及/或彼之實施態樣的培養物上清液之較佳用途係用於嬰兒配方。收取所分泌之細菌產物帶來的問題是：培養基無法輕易地去除非所欲之組分。這特別攸關於針對較羸弱個體的營養產品，例如嬰兒配方或臨床營養。若來自培養物上清液的特定組分先經分離、純化並接著施加至營養產品中時，不會引起此問題。然而，理想的是利用較完整的培養物上清液。這用以提供較能反映益生菌(即LGG)自然作用之組成物。然而，不可僅使用培養物上清液本身作為特定用於嬰兒配方等等的非存活性益生菌物質基底。
在此，為使本發明為完全使用，理想的是確保自LGG培養所收取的組成物未含有該類配方非所欲或一般而言不可接受之組分(可能存在於培養基中者亦然)。就常存於MRS培養液的聚山梨糖醇酯而言，用於 培養細菌的培養基可包括乳化性非離子性界面活性劑，例如以聚乙氧化山梨醇酐及油酸(典型可取得者為Tween®聚山梨糖醇酯類，例如Tween® 80)。雖然這些界面活性劑常見於食品，例如冰淇淋，且通常被認為是安全的，但它們在用於針對較羸弱個體的營養產品，例如嬰兒配方或臨床營養，在所有管轄區域中並非均被視為所欲者，或甚至被視為無法接受者。
因此，本發明在本發明和/或彼之實施態樣的較佳實施態樣中，亦關於使用可避免有前述之聚山梨糖醇酯的培養基。為此目的，本發明的較佳培養基係不含聚山梨糖醇酯，例如Tween 80。在本發明和/或彼之實施態樣的較佳實施態樣中，該培養基可包含選自十八烯酸、亞麻仁油、橄欖油、菜子油、葵花子油或彼等之混合物之油質成分。應理解的是，若聚山梨糖醇酯界面活性劑的存在係實質上或完全避免時，該油質成分的完整效益可達成。
針對本發明用途，最佳的是，MRS培養基不含聚山梨糖醇酯。又，除了一或多個前述的油，較佳的是，培養基包含腖(典型上0-10g/L，特別是0.1-10g/L)；肉萃取物(典型上0-8g/L，特別是0.1-8g/L)，酵母萃取物(典型上4-50g/L)；D(+)葡萄糖(典型上20-70g/L)；磷酸氫二鉀(典型上2-4g/L)；三水合醋酸鈉(典型上4-5g/L)；檸檬酸三銨(典型上2-4g/L)；七水合硫酸鎂(典型上0.2-0.4g/L)和/或四水 合硫酸錳(典型上0.05-0.08g/L)。
培養通常進行溫度為20℃至45℃，較佳為35℃至40℃，且最佳為37℃。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣之組成物具有中性pH，例如pH介於pH 5及pH 7之間，較佳為pH 6。理想的是，本發明和/或彼之實施態樣之組成物不含有重量成分低於5-6kDa。應注意的是，如上所指出，某些先前技術測試已顯示，只有當pH係約4時，上清液才會發揮效果，且當pH係中性時，未有觀察到效果。同樣地，此抗微生物活性在先前技術中已與乳酸存在有相關。
於培養以供收取培養物上清液期間，即，在前述之指數期末期，較佳的時間點可依OD 600nm及葡萄糖濃度來決定。OD 600係指600nm的光學密度，其為已知的密度測量，直接相關於培養基中的細菌濃度。
除了前述，應注意的是，包括LGG的乳酸桿菌批式培養，為本發明所屬技術領域中具有通常知識者知悉的一般通常知識。因此，這些方法在此不需另外說明。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣的組成物係藉由大規模發酵所製造(例如在大於100L發酵槽，較佳為約200L或更大者)。
本發明和/或彼之實施態樣的組成物可藉由任何用於自細菌培養物分離培養物上清液的已知技術來收取。此種技術為本技術領域中已知者，且包括例如離心、過濾、沈降等等。
本發明及彼之實施態樣的上清液可立即使用或儲存以供未來使用。在後者例子中，該上清液通常被冷藏、冷凍或凍乾。該上清液可依需要濃縮或稀釋。
至於化學物質，咸信本發明和/或彼之實施態樣的培養物上清液的組成物為複數種不同分子量之胺基酸、寡胜肽及聚胜肽及蛋白質的混合物。另咸信該組成物包含多醣結構和/或核苷酸。
欲強調的是，不同於先前技術，本發明和/或彼之實施態樣較佳為有關全部、即未經劃分的培養物上清液。在上述指數期末期收取、且保留本質上所有上清液組分的明智選擇，咸信有助於以此獲得令人訝異的結果，特別是就抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌感染的預防活性、且更特定而言，就此種對嬰兒及新生兒之活性以及對於懷孕爾後泌乳女性產期投予之活性，尤為如此。
更特定言之，本發明及彼之實施態樣的全部培養物上清液係界定為實質上排除低分子量組分，通常低於6kDa，或甚至低於5kDa。這關於到組成物較佳為不包括乳酸和/或乳酸鹽的事實。因此，本發明和/或彼之實施態樣的較佳上清液具有分子量大於5kDa，或在一些實施態樣中，大於6kDa。這通常涉及過濾或管柱層析術。事實上，此過濾滯留物呈現分子量範圍大於6kDa(易言之，低於6kDa的成分被過濾掉)。
本發明和/或彼之實施態樣的上清液之組成物通常不僅為蛋白質性，且包含多醣，特別為胞外多醣 (如LGG所製造，由糖殘基構成之高分子量聚合物)。未欲受理論侷限，本案發明人相信，相較於自例如指數期中期或穩定期的其他階段收取之組成物，自如上討論之指數期末期所收取之蛋白質物質的含量及碳水化合物物質的含量之比值，促成上清液抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌感染的保護本質。
依本發明所收取的本發明及彼之實施態樣之培養物上清液可以各種方式使用，藉以獲得所發現之有效抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌之效益。此種用途通常涉及某些投予本發明和/或彼之實施態樣之組成物至對其有需求之個體的形式。在此方面，培養物上清液可被用作為例如像是併入膠囊中以供口服投予，或併入液體營養組成物(例如飲品)，或可於進一步使用前加工。後者為較佳者。
此種加工通常涉及將該化合物自通常為上清液的液體連續相分離。這較佳為藉由乾燥方法完成，例如噴霧乾燥或冷凍乾燥(凍乾)。較佳為噴霧乾燥。在噴霧乾燥方法的較佳實施態樣中，會於噴霧乾燥前加入載體原料，例如麥芽糊精DE29。
本發明和/或彼之實施態樣的組成物經發現具有抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌感染的保護活性，即，預防和/或治療活性。感染坂崎氏克羅諾斯桿菌可導致細菌附著至上皮細胞、失去絨毛結構、上皮細胞的細胞凋亡、病原體侵入其他腸外器官、干擾宿主免疫系統、菌血症、腦膜炎、發育遲緩、智能障礙、水腦、壞死性腸結腸炎 (NEC)和/或死亡。本發明和/或彼之實施態樣的培養物上清液可對這些效果的任一者具有衝擊，較佳的是，其對選自下述這些效果的至少一者具有衝擊：細菌附著至上皮細胞、失去絨毛結構、上皮細胞的細胞凋亡、病原體侵入其他腸外器官、干擾宿主免疫系統、菌血症、腦膜炎、發育遲緩、智能障礙、水腦、壞死性腸結腸炎(NEC)和/或死亡及/或彼等之組合，更佳為對這些效果的至少二者具有衝擊，再更佳為對這些效果的至少三者具有衝擊，且最佳為對這些效果的至少四者或更多者具有衝擊。在本發明和/或彼之實施態樣的培養物上清液的較佳實施態樣中，對選自下述這些效果的至少一者具有衝擊：細菌附著至上皮細胞、上皮細胞的細胞凋亡、病原體侵入其他腸外器官、菌血症、腦膜炎、壞死性腸結腸炎(NEC)和/或死亡及/或彼等之組合。
為使本發明之組成物發揮其有益之抗坂崎氏克羅諾斯桿菌效果，其係由個體、較佳為人個體所消化吸收。特定言之，在較佳實施態樣中，該個體係懷孕女性、泌乳女性、新生兒、嬰兒或孩童。如上所指出，使用可被視為「非存活性益生菌」物質的優點，在嬰兒膳食產品中，最為有益。用語「嬰兒」意指小於約1歲之出生後的人。
可了解的是，個體消化會需要口服投予本發明之組成物。投予根據本發明之組成物的形式並非關鍵。在一些實施態樣中，該組成物經由錠劑、丸劑、包囊、膠 囊錠(caplet)、凝膠膠囊(gel cap)、膠囊、油滴劑或小藥包投予至個體。在另一實施態樣中，該組成物經包囊至糖類、脂肪或多醣。
在又另一實施態樣中，該組成物係加至食品或飲品並食用。該食品或飲品可為孩童的營養產品，例如延續配方(follow-on formula)、成長乳、飲料、乳、酸酪乳、果汁、以水果為基底飲料、可嚼錠、餅乾、脆餅或乳粉。在其他實施態樣中，該產品可為嬰兒營養產品，例如嬰兒配方或人乳強化營養品。
本發明的組成物不論以分開的劑型加入或經營養產品，通常以治療或預防病原體感染的有效量投予。該有效量較佳為等同1×104至約1×1012活益生菌細菌當量/公斤體重/天，且更佳為108-109細胞當量/公斤體重/天。細胞當量的回推計算係熟習本技術者知識範圍內。
若本發明和/或彼之實施態樣的組成物係經由嬰兒配方投予，該嬰兒配方可為營養完整且含有適合的脂質、碳水化合物、蛋白質、維生素及礦物質之類型及含量。脂質或脂肪含量典型上可約3至約7g/100kcal不等。脂質來源可為任何本技術領域中已知或使用者，例如植物油，像是棕櫚油、黃豆油、軟棕櫚油(palmolein)、椰子油、中鏈三酸甘油酯、高油酸葵花油、高油酸紅花油等等。蛋白質含量典型上可約1至約5g/100kcal不等。蛋白質來源可為任何本技術領域中已知或使用者，例如無脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白質、(部分或大量) 水解蛋白質、胺基酸等等。碳水化合物含量典型上可約8至約12g/100kcal不等。碳水化合物來源可為任何本技術領域中已知或使用者，例如乳糖、葡萄糖、玉米糖漿固體、麥芽糊精、蔗糖、澱粉、稻米糖漿固體等等。
方便地，可使用市售可得的出生前、早產、嬰兒及孩童營養產品。例如，可於Expecta®、Enfamil®、Enfamil®早產兒配方；Lactofree®、Nutramigen®、Gentlease®、Pregestimil®、ProSobee®、Enfakid®、Enfaschool®、Enfagrow®、Kindercal®(來自Mead Johnson Nutrition Company,Glenview,Illinois,U.S.)補充適量之本發明之組成物且用以實施本發明之方法。
在一實施態樣中，本發明和/或彼之實施態樣的組成物可併以一或多種存活性益生菌。只要能達到預期結果，在此實施態樣中，任何本技術領域已知的存活性益生菌均可接受。
若存活性益生菌係併以本發明之組成物投予，存活性益生菌的量可相當於介於約1×104及1×1012菌落形成單位(cfu)/公斤體重/天。在另一實施態樣中，該存活性益生菌可包含介於約1×106及1×1012cfu/公斤體重/天。在又另一實施態樣中，該存活性益生菌可包含約1×109cfu/公斤體重/天。又於另外實施態樣中，該存活性益生菌可包含約1×1010cfu/公斤體重/天。
在另一實施態樣中，本發明和/或彼之實施 態樣的組成物可併以一或多種益菌生。「益菌生」意指以有益健康所需的方式刺激消化道中細菌生長和/或活性的非可消化性食物成分。只要能達到所欲結果，在此實施態樣中，任何本技術領域已知的益菌生均可接受。可用於本發明之益菌生可包括乳酮糖、葡萄-寡糖、菊糖、聚葡萄糖、半乳-寡糖、果-寡糖、異麥芽-寡糖、大豆寡醣、乳蔗糖、木-寡糖及龍膽-寡糖。
在本發明及彼之實施態樣之又另一實施態樣中，該嬰兒配方可含有其他活性劑，例如長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)。適合的LCPUFA包括但不限於α-亞麻油酸、γ-亞麻油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(ARA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)。在一實施態樣中，本發明之組成物係併以DHA投予。在另一實施態樣中，本發明之組成物係併以ARA投予。在又另一實施態樣中，本發明和/或彼之實施態樣的組成物係併以DHA及ARA投予。亦可於含有DHA、ARA或其組合之市售嬰兒配方中補充本發明之組成物且用於本發明。例如，Enfamil® LIPIL®，其含有有效量之DHA及ARA，可商業性購得且可補充本發明之組成物且用於本發明。若含有ARA，於本發明之實施態樣中該ARA之有效量典型為約5mg/公斤體重/天至約150mg/公斤體重/天。在本發明和/或彼之實施態樣的組成物的一實施態樣中，該含量為約10mg/公斤體重/天到約120mg/公斤體重/天不等。在另一實施態樣中，該含量為約15 mg/公斤體重/天到約90mg/公斤體重/天不等。在又另一實施態樣中，該含量為約20mg/公斤體重/天到約60mg/公斤體重/天不等。若採用嬰兒配方，那麼在嬰兒配方中DHA之含量可為約5mg/100kcal至約80mg/100kcal不等。於本發明之一實施態樣中，DHA量為約10mg/100kcal到約50mg/100kcal不等；且於另一實施態樣中，為約15mg/100kcal到約20mg/100kcal不等。於本發明之特定實施態樣中，該DHA含量為約17mg/100kcal。若採用嬰兒配方，那麼在嬰兒配方中ARA之含量可為約10mg/100kcal至約100mg/100kcal不等。於本發明之一實施態樣中，該ARA含量為約15mg/100kcal至約70mg/100kcal不等。於另一實施態樣中，該ARA含量為約20mg/100kcal至約40mg/100kcal不等。於本發明之特定實施態樣中，該ARA含量為約34mg/100kcal。
若採用嬰兒配方時，可用本技術領域中已知之標準技術把含有DHA及ARA之油脂補充到該嬰兒配方中。例如，可用DHA及ARA取代等當量之油脂(例如於嬰兒配方中常見之高油酸葵花油)來把DHA及ARA添加到該配方中。作為另一實施態樣，含有DHA及ARA的油脂可藉由取代等當量之通常存在於未有DHA及ARA之配方中的其餘整體脂肪摻合物來加至該配方。若有使用，則DHA及ARA來源可為本技術領域中任何已知來源，例如水產油脂、魚油、單細胞油脂、蛋黃脂質、腦部脂質等等。在一些實施態樣中，該DHA及ARA係分別源自單細 胞Martek油脂、DHASCO®或彼等之變化物。該DHA及ARA可為天然形式，惟該LCPUFA來源之剩餘物不會造成對嬰兒任何實質有害影響。或者，該DHA及ARA可以精製形式使用。在本發明的一實施態樣中，DHA及ARA來源係如美國專利第5,374,567、5,550,156及5,397,591號中所教示之單細胞油脂，該等專利所揭露者係以引用方式全部併入本案。然而，本揭露不只限於此種油脂。
於一實施態樣中，係以含有EPA之LCPUFA來源併以至少一種本發明之組成物來使用。於另一實施態樣中，係以實質上不含EPA之LCPUFA來源併以至少一種本發明之組成物來使用。舉例來說，本發明之一實施態樣中，將含有少於約16mg EPA/100kcal之嬰兒配方中補充本發明之組成物。在另一實施態樣中，將含有少於約10mg EPA/100kcal之嬰兒配方中補充本發明之組成物。在又另一實施態樣中，將含有少於約5mg EPA/100kcal之嬰兒配方中補充本發明之組成物。
本發明和/或彼之實施態樣之另一實施態樣包括補充本發明之組成物之嬰兒配方，其連微量EPA都沒有。咸信提供本發明之組成物及DHA及/或ARA之組合，就含有這些劑的調合物之抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌感染的保護性質而言，提供增效或協同的效果。
在本發明及彼之實施態樣之進一步較佳實施態樣中，本發明之膳食產品包含一或多種正常下存在於人乳之生物活性物質，例如蛋白質或多醣。較佳的是，本發 明之膳食產品包含乳鐵蛋白。
在本發明和/或彼之實施態樣之另一態樣中，係使用以降低、抑制、改善及/或治療坂崎氏克羅諾斯桿菌感染。
在本發明和/或彼之實施態樣之較佳實施態樣中，本發明和/或彼之實施態樣之組成物係使用以降低、抑制和/或改善至少一種、較佳為至少二種、更佳為至少三或更多種選自下列之病況：細菌附著至上皮細胞、失去絨毛結構、上皮細胞的細胞凋亡、病原體侵入其他腸外器官、干擾宿主免疫系統、菌血症、腦膜炎、發育遲緩、智能障礙、水腦、壞死性腸結腸炎(NEC)和/或死亡及/或彼等之組合。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣之組成物係使用以降低、抑制和/或改善侵入例如下列之器官：腦、肝、脾、盲腸、腸道上皮、腸繫膜、腦脊液、血液；較佳為侵入腦、肝、脾；更佳為侵入腦。在較佳實施態樣中，本發明和/或彼之實施態樣之組成物係使用以降低、抑制和/或改善因坂崎氏克羅諾斯桿菌感染所致之智能障礙。本發明和/或實施態樣本發明和/或實施態樣。在本發明和/或彼之實施態樣之較佳實施態樣中，本發明和/或彼之實施態樣之組成物係使用以降低、抑制和/或改善坂崎氏克羅諾斯桿菌感染的死亡率。
本發明之另一態樣係關於根據本發明和/或彼之實施態樣之組成物在預防坂崎氏克羅諾斯桿菌感染中 之用途。本發明及彼之實施態樣之組成物極適於預防疾病性使用。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣之組成物係用於預防坂崎氏克羅諾斯桿菌感染相關之侵入例如肝、脾和/或腦之器官。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣之組成物係用於預防坂崎氏克羅諾斯桿菌感染之菌血症。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣之組成物係用於預防坂崎氏克羅諾斯桿菌感染所造成之腦膜炎。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣之組成物係用於預防坂崎氏克羅諾斯桿菌感染所造成之壞死性腸結腸炎(NEC)。
本發明之又另一態樣係關於使用本發明和/或彼之實施態樣之組成物來治療坂崎氏克羅諾斯桿菌感染。較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣係關於治療坂崎氏克羅諾斯桿菌感染相關之侵入例如肝、脾和/或腦之器官。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣係關於治療坂崎氏克羅諾斯桿菌感染之菌血症。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣係關於治療坂崎氏克羅諾斯桿菌感染所造成之腦膜炎。
較佳的是，本發明和/或彼之實施態樣係關於治療坂崎氏克羅諾斯桿菌感染所造成之壞死性腸結腸炎 (NEC)。
就上述使用活的或存活性益生菌之缺點而論，本發明特別有利在取代作為預防、降低、改善或治療坂崎氏克羅諾斯桿菌感染和/或彼之症狀之產品中的此種益生菌。為此目的，該組成物較佳為經由膳食或營養產品投予，更佳為出生前、嬰兒或孩童配方或營養組成物、醫療用食品或或針對特定醫療目的之食品(即，標示為特定醫療目的之食物)，最佳為嬰兒配方或針對懷孕或泌乳女性出生前後的營養，其如前文大體上討論者。此外，本發明亦能以經改善之方法提供益生菌。為此，根據本發明源自非存活性益生菌物質可在工業環境下以標準化及再現性方式製造，避免活益生菌固有的問題。又，由於非存活性本質且特別當以乾燥粉末提供時，它們可適當地併入及給劑至用於預防或處理治療坂崎氏克羅諾斯桿菌感染之營養組成物。
下文將參照下述之非限制實施例說明本發明。
材料與方法
動物。懷孕時間同步之CD-1小鼠自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)取得，為妊娠期(GD)第17天。動物飼養於動物房，為12h：12h亮/暗週期。母鼠個別分籠飼養，讓母鼠在GD第19或20天自 然生產。新生小鼠經性別鑑定及隨機分派至代養母鼠(foster mother)。嚙齒動料飼料(rodent chow)及飲水為任飼提供。
製備LGG、LGG上清液、坂崎氏克羅諾斯桿菌及培養物益生菌LGG(由Mead Johnson Nutrition提供)透過三次繼代至de Man,Rogosa及Sharpe氏(MRS)培養液來活化，並於37℃培養24小時。經由離心(8,000 x g，4℃，共15分鐘)分離細胞、以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌兩次、並重新懸浮於載劑，濃度為106CFU/ml LGG。LGG上清液係自批式發酵製程製備。
使用下列培養基(經修改之MRS培養液)(表1)。
LGG於恆定pH為6(藉由加入33%的NaOH)、在37℃下配以速度50rpm攪拌器生長，頂部空間充以N2。在指數生長期末期，於14000 x g及4℃下離心15分鐘將細菌細胞自培養基分離，丟棄細胞沈澱片(pellet)，並將已使用培養基儲存於-20℃。此原料經去鹽及凍乾，且在用於動物實驗前重組還原，於動物坂崎氏克羅諾斯桿菌感染模式中測試(後文稱之為LGG上清液)。
針對製備存活性LGG，劑量濃度藉由測量培養物的光學密度(OD)並與透過連續稀釋培養物繪得之標準曲線比較來判定。接著，藉由塗布培養LGG於胰酶大豆瓊脂(TSA)(Oxoid)上24小時並計算CFU/ml， 來確認劑量。105CFU/天的LGG劑量或相當的LGG上清液劑量用於處理，並與載劑同時投予。-80℃冷凍於陶瓷珠的坂崎氏克羅諾斯桿菌(菌株3290)保存株在胰酶大豆培養液(TSB)(Oxoid,3 LTD,Basingstoke,England)中生長以測試濃度。製備坂崎氏克羅諾斯桿菌培養物，劑量如針對LGG說明來確認，但細胞係透過於TSB中2次繼代活化。
小鼠的處理
此研究的處理方法如先前所述(Richardson,A.N.,S.Lambert and M.A.Smith.2009.“Neonatal mice as models for Cronobacter sakazakii infection in infants.”J Food Prot 174；72(11)：2363-2367)。簡言之，於開始四個連續出生後天數(PND第1至4天)，將仔鼠以在重組還原之嬰兒配方(RPIF)粉末中的LGG及LGG上清液處理，並使用接附至1ml注射器的24 x 1”(25.4mm)W/1-1¼不鏽鋼動物餵食針(Popper & Sons,Inc.,New Hyde Park,N.Y.)，於PND第2天經由口灌食坂崎氏克羅諾斯桿菌。依照製造商之使用說明，將RPIF與無菌去離子水混合來重組還原。於分派仔窩前，將香草調味劑(The Kroger Co.,Cincinnati,O.H.)塗在各母鼠的鼻子上(鼠鼻)，以掩蓋動物氣味及產生嗅覺混淆。進行此步驟以增加代養母鼠對仔鼠的接受度。製備經不同濃度坂崎氏克羅諾斯桿菌菌株3290接種之重組還原嬰兒配方粉末的 連續稀釋。各仔鼠接受帶有經確認坂崎氏克羅諾斯桿菌劑量為107、108及1011CFU/劑或載劑對照組、體積0.1ml的RPIF。於處理後期間，每日兩次觀察新生仔鼠的發病率或死亡率。所有在處理後第7天(PTD 7)存活的仔鼠均予安樂死。死亡率數據以整個研究過程期間的總死亡率(表3A)及經調整死亡率(表3B)來呈現，經調整死亡率僅計算在最後一次灌食處理後的24小時發生的死亡。經調整死亡率的計算為移除任何可能與灌食技術或重複性灌食接觸的緊迫有關之死亡。
自組織檢體培養坂崎氏克羅諾斯桿菌
從各新生仔鼠收取將肝、盲腸及腦，並在冰上儲於Whirl Pack(Nasco,Fort Atkinson,WI)過濾袋以供培養。將腸內細菌科增菌(EE)培養液(Oxoid)加入至檢體，比率為10mlEE對1g檢體。將檢體劃於平板上紫紅色膽汁葡萄糖(VRBG)瓊脂(二重複)，以選擇性生長腸內桿菌屬，並接著培養於37℃共24小時。將生長株次培養於TSA平板上，並於25℃培養48小時。使用RapID ONE鑑定系統(Remel,Inc.,Lenexa,K.S.,USA)以進行坂崎氏克羅諾斯桿菌分離株之陽性生化確認。
統計分析
坂崎氏克羅諾斯桿菌感染性及死亡率數據統計分析係使用SAS第9.1版(SAS Institute,Cary,N.C.) 及Microsoft Excel(Microsoft Corporation,Redmond,W.A.)來進行。數值比較經處理動物年齡的顯著性差異(P0.05)，使用Scheffe氏檢定及Excel t檢定來判定。單因子變異數分析(ANOVA)檢定使用Dunnett氏t檢定及Excel t檢定進行，以針對各小鼠年齡判定處理組及對照組顯著性差異(P0.05)。
結果
為獲得足夠數量的動物以供統計分析，下列數據係結合三次獨立實驗的結果。表2A顯示任何組織中可分離出坂崎氏克羅諾斯桿菌的動物之百分比。當新生仔鼠接受以LGG或LGG上清液的共同處理時，坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入的組織數量明顯降低約二分之一(表2A)。在三次實驗中，給予各動物的坂崎氏克羅諾斯桿菌之濃度範圍在108-1012CFU/ml。然而，被侵入的組織之數量及被侵入的組織之種類無劑量相依性，且與本案發明人先前研究一致。不論LGG上清液組或RPIF對照組均未分離出坂崎氏克羅諾斯桿菌。雖然犧牲小鼠平均重量範圍在5.39-6.22g，但未發現明顯差異。
當檢測來自僅以坂崎氏克羅諾斯桿菌處理的動物之個別組織時，腦較易分離出坂崎氏克羅諾斯桿菌的動物百分比較高於肝或脾較易分離之百分比。與LGG或LGG上清液共同處理，降低約50%的腦侵入(表2B)。由於在人體內腦為坂崎氏克羅諾斯桿菌的目標組織，所以這對開發療法和/或避免對腦的不良反應是重要發現。雖然肝的總侵入率僅為15%，但值得注意的是，在接受LGG作為共同處理的動物中，於任一實驗中均未從肝組織分離 出坂崎氏克羅諾斯桿菌，而以LGG上清液共同處理，自肝分離出坂崎氏克羅諾斯桿菌降低二分之一(表2B)。以LGG及LGG上清液兩者處理均顯著降低從腦及肝組織分離出坂崎氏克羅諾斯桿菌，而僅以LGG處理則明顯降低坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入脾組織(表2B)。
具有相同標示之處理組無統計性差異。(p0.05)。
所有在排定犧牲時間前死亡的仔鼠，仍予維持記錄。表3顯示結合三次實試的死亡率結果。針對任何有接受坂崎氏克羅諾斯桿菌的組別，總死亡率係約30% (表3A)。
表3. CD-1新生仔鼠在以坂崎氏克羅諾斯桿菌併以或未併以LGG或LGG上清液處理後的死亡率。*
具有相同標示之處理組無統計性差異。(p0.05)。
此與未接受坂崎氏克羅諾斯桿菌的二組載劑對照組具有約7%死亡率相比。當數據依本文坂崎氏克羅諾斯桿菌相關死亡的定義(僅計算在灌食處理後24小時或超過24小時發生的死亡)調整，在坂崎氏克羅諾斯桿菌及坂崎氏克羅諾斯桿菌加上LGG組的死亡率降低約三分之一(表3B)。接受坂崎氏克羅諾斯桿菌及LGG上清液組的死亡率降至0%(表3B)。在總計112隻動物中，LGG上清液組及RPIF對照組僅有一隻動物死亡。
討論
益生菌已顯示提供保護，抵抗病原體。Corr等人(2007.Bacteriocin production as a mechanism for the antiinfective activity of Lactobacillus salivarius UCC118.Proc Natl Acad Sci USA 104(18)：7617)發現殺細菌素(bacteriocin)的產生，殺細菌素為一種由唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)所製造的抗細菌胜肽，其為抵抗單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)的可能機轉。雖然先前研究顯示益生菌在體外可預防坂崎氏克羅諾斯桿菌附著至小腸細胞，但先前研究工作尚未著重LGG於新生小鼠體內預防或降低坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入的可能性。然而，保加利亞乳酸桿菌已顯示在新生大鼠NEC模式中具保護性，其中仔鼠係暴露於坂崎氏腸桿菌 (Hunter,C.J.,M.Williams等人.2009.保加利亞乳酸桿菌於體外及壞死性腸結腸炎新生兒大鼠模式均預防坂崎氏腸桿菌誘發之一氧化氮所造成的小腸上皮細胞傷害，Infect Immun 77(3)：1031)。在近期研究中，藉由在暴露於坂崎氏克羅諾斯桿菌之前及之後投予源自LGG及LGG上清液保護效果，提供益生菌可預防坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入的另外證據。LGG及LGG上清液持續降低自新生小鼠組織中分離出坂崎氏克羅諾斯桿菌。
補充存活性或LLG上清液降低組織有坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入的動物之百分比。介於坂崎氏克羅諾斯桿菌及彼之侵入率之間未發現劑量相依性關係；然而，以LGG及LGG上清液處理的動物，侵入率降低。坂崎氏克羅諾斯桿菌最常見於經處理動物的腦組織中。
接受坂崎氏克羅諾斯桿菌及LGG和LGG上清液兩者的組別，侵入腦組織的減少，是很重要的，此乃腦膜炎為坂崎氏克羅諾斯桿菌感染中發病及死亡的主要原因之故。整體上，在接受坂崎氏克羅諾斯桿菌及LGG和LGG上清液兩者的組別中，組織被坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入的動物之總百分比下降。近期研究指出，LGG和/或彼之上清液，限制了在新生小鼠中的坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入程度。
有趣的是，接受坂崎氏克羅諾斯桿菌及接受坂崎氏克羅諾斯桿菌併以LGG的組別，具有類似的經調整死亡率(分別為17%及13%)，且明顯高於坂崎氏克 羅諾斯桿菌併以LGG上清液之組(表3)。發明人觀察到LGG較LGG上清液黏稠許多，其此或許在未來研究中是需要多加注意的促成因子。載劑對照組的低死亡率，顯示在經坂崎氏克羅諾斯桿菌處理組中的多數死亡事實上為暴露於坂崎氏克羅諾斯桿菌的結果。
結論
益生菌LGG及彼之於發酵製程期間所收集的分泌因子(LGG上清液)降低在經口服暴露於帶有不同劑量坂崎氏克羅諾斯桿菌之RPIF的新生小鼠中坂崎氏克羅諾斯桿菌的整體侵入。在檢測的組織中，腦為最常被坂崎氏克羅諾斯桿菌所侵入，但也最受到LGG或LGG上清液處理所保護者。針對腦，LGG或LGG上清液兩者有等同的保護性抵抗坂崎氏克羅諾斯桿菌侵入。LGG上清液在保護新生小鼠免於坂崎氏克羅諾斯桿菌相關死亡中是最有效的。

Claims (10)

  1. 一種用於治療或預防病原體感染之組成物，其包含來自益生菌批式培養法的指數生長期末期之培養物上清液。
  2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該益生菌係LGG(Lactobacillus rhamnosus Goldin Gorbach(鼠李醣乳酸桿菌Goldin Gorbach))。
  3. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該病原體係坂崎氏克羅諾斯桿菌(C.sakazakii)。
  4. 如申請專利範圍第1項之用於治療或預防病原體感染之組成物，可藉由包含下列步驟之方法獲得：(a)使用批式法將益生菌培養於適合的培養基中；(b)於培養步驟的指數生長末期收取培養物上清液，指數生長末期係以介於批式培養法的遲滯期及穩定期之間的時間的後半段而為準而界定；(c)隨意自該上清液移除低分子量成分，以保留超過5kDa分子量之成分；(d)自該培養物上清液移除液體內容物，以獲得該組成物。
  5. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該益生菌係LGG，且該病原體係坂崎氏克羅諾斯桿菌。
  6. 如申請專利範圍第5項之組成物，其中該指數期末期係以LGG批式培養法介於遲滯期及穩定期之間的時間的後四分之一部分為準而界定。
  7. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該批式培養係於不含聚山梨糖醇酯的培養基中進行。
  8. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該培養基含有選自十八烯酸、亞麻仁油、橄欖油、菜子油、葵花子油或彼等之混合物之成分。
  9. 如申請專利範圍第4項之組成物，其中該批式培養係在pH為5-7下進行。
  10. 如申請專利範圍第1項之組成物，其包含出生前、嬰兒或孩童配方或營養組成物或補充物、醫療用食品或針對特定醫療目的之食品。
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