PT109524B - Processo de destoxificação de farinha de trigo e glúten através da formação de estruturas supramoleculares com a quitosana e respectiva farinha de trigo e glúten destoxificados para consumo por doentes celíacos - Google Patents
Processo de destoxificação de farinha de trigo e glúten através da formação de estruturas supramoleculares com a quitosana e respectiva farinha de trigo e glúten destoxificados para consumo por doentes celíacos Download PDFInfo
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Abstract
A PRESENTE INVENÇÃO É REFERENTE A UM PROCESSO DE DESTOXIFICAÇÃO DA FARINHA DE TRIGO (TRITICUM SPP.) E GLÚTEN ATRAVÉS DA FORMAÇÃO DE ESTRUTURAS SUPRAMOLECULARES COM A QUITOSANA. A INVENÇÃO REFERE-SE TAMBÉM À RESPETIVA FARINHA E GLÚTEN DESTOXIFICADOS EM QUE SÃO OBTIDOS VALORES DE REDUÇÃO DE EPÍTOPOS TÓXICOS PARA OS DOENTES CELÍACOS DE 65 E 88% QUANDO COMPARADOS COM A FARINHA E GLÚTEN NÃO MODIFICADOS OU ORIGINAIS, RESPETIVAMENTE. ADICIONALMENTE DIZ AINDA RESPEITO À UTILIZAÇÃO DO PROCESSO DE DESTOXIFICAÇÃO NOUTROS CEREAIS E RESPETIVOS PRODUTOS, NOMEADAMENTE EM OUTRAS GRAMÍNEAS (POACEAE), SUBFAMÍLIA POOIDEAE, PRINCIPALMENTE DAS ESPÉCIES DA TRIBO TRITICEAE COMO A CEVADA (HORDEUM SPP.), O CENTEIO (SECALE SPP.), O TRITICALE (X TRITICOSECALE) E DA TRIBO AVENEAE COMO A AVEIA (AVENA SPP.), BEM COMO OS SEUS PRODUTOS GERMINADOS.
Description
DESCRIÇÃO
PROCESSO DE DESTOXIFICAÇÃO DE FARINHA DE TRIGO E GLÚTEN ATRAVÉS DA FORMAÇÃO DE ESTRUTURAS SUPRAMOLECULARES COM A QUITOSANA E RESPECTIVA FARINHA DE TRIGO E GLÚTEN DESTOXIFICADOS PARA CONSUMO POR DOENTES CELÍACOS
Domínio técnico
A presente invenção diz respeito a um processo de destoxificação da farinha de trigo (Trítícum spp.) e glúten através da formação de estruturas supramoleculares com a quitosana e à respetiva farinha e glúten destoxifiçados em que são obtidos valores de redução de epitopos tóxicos para os doentes celíacos de 65 e 88% quando comparados com a farinha e glúten não modificados ou originais, respetivamente. Adicionalmente diz ainda respeito à utilização do processo de destoxificação noutros cereais e respetivos produtos, nomeadamente em outras gramíneas (Poaceae), subfamília Pooideae, principalmente das espécies da tribo Triticeae como a cevada (Hordeum spp.), o centeio (Secale spp.), o triticale (x Triticosecale) e da tribo Aveneae como a aveia (Avena spp.), bem como os seus produtos germinados.
Antecedentes
A doença celíaca é uma doença autoimune que se traduz por uma enteropatia que ocorre após contacto com o glúten em indivíduos geneticamente suscetíveis (1, 2). A doença causa atrofia das vilosidades da mucosa do intestino delgado, causando prejuízo na absorção dos nutrientes, sendo os sintomas mais comuns a diarreia, atraso no crescimento, anemia e fadiga (1) . Adicionalmente, outros sintomas como complicações neurológicas, desregulação hormonal e cirrose biliar primária foram descritos (3-5) . Esta doença é mais comum em populações ocidentais do que se pensava anteriormente, tendo uma prevalência, nestas populações, de aproximadamente 1% (2) e sendo sub-diagnosticada em
Portugal (1). 0 único tratamento efetivo é uma dieta estritamente sem glúten, não existindo medicamentos que previnam os danos, nem a resposta autoimune do corpo (6) . Considerando a relevância deste problema, a investigação relativa à alergenicidade das proteínas do trigo e de proteínas de outros cereais é particularmente importante (7) .
trigo (Triticum spp.) é um dos principais cereais cultivados pelo Homem e o seu grão constitui a maior fonte de proteínas na dieta humana. A produção mundial anual deste cereal ronda os 715 milhões de toneladas, fornecendo aproximadamente 20% das calorias. O trigo possui a maior área global de produção (~220 milhões ha) e o maior volume de transações internacionais de uma cultura agronómica simples (~150 milhões de toneladas), significando cerca de 50 mil milhões de dólares (8). Contém um complexo proteico, o glúten, que é o principal responsável pelo comportamento reológico único das suas farinhas (9) e que o tornam um cereal de eleição na sua diversidade de utilizações: produtos de panificação e de pastelaria tradicionais, como por exemplo, pão, bolachas, biscoitos, bases de pizza, massas alimentícias e pastas, bolos de natureza diversa, entre outros. Os principais componentes proteicos do glúten são as gliadinas e as gluteninas que conferem extensibilidade e elasticidade à massa, respetivamente (10) .
Um passo chave na patogénese da doença celíaca ocorre quando determinados peptídeos do glúten, nomeadamente derivados das gliadinas (ricas em resíduos de glutamina), são desamidados pela transglutaminase tecidular (TG2), aumentando a sua afinidade para o antigénio leucocitário humano (HLA)-DQ2 ou -DQ8, potenciando desta forma a reação autoimune (11, 12) . Os epítopos provenientes das alfagliadinas são considerados os de maior relevância clínica visando tanto a resposta adaptativa como inata que conduzem à doença celíaca (13-18). Algumas sequências de aminoácidos têm sido referidas como tendo um forte potencial imunogénico. Todos os peptídeos que se apresentaram ativos na doença celíaca continham as sequências Gln-Gln-Gln-Pro e Pro-Ser-Gln-Gln. Contrariamente, os peptídeos inativos não continham nenhuma destas sequências. Portanto, estas sequências são consideradas de elevada importância para o desenvolvimento da doença (19, 20). A atividade imunológica destas sequências de aminoácidos na doença celíaca foi confirmada por outros investigadores (21, 22). Além disso, foi identificado um peptídeo de 33 resíduos resistente às proteases intestinais e contendo três dos epítopos mais imunogénicos como um dos principais estimuladores da resposta inflamatória ao glúten (15, 23).
Até à data, não existe nenhum tratamento farmacológico para os doentes intolerantes ao glúten sendo a única via eficaz a dieta contínua estritamente sem glúten, o que resulta, por vezes, em problemas de índole social (6). Dada a resposta incompleta de muitos doentes à dieta sem glúten, bem como a dificuldade de adesão à dieta a longo prazo, o desenvolvimento de novas terapias eficazes para o controlo da sintomatologia e reversão da inflamação e dos danos causados nos órgãos torna-se extremamente importante. Neste sentido, algumas estratégias promissoras têm sido conduzidas, tanto terapêuticas como tendo em vista a modificação do glúten, para reverter este cenário. Por exemplo, o glúten e os seus peptideos podem ser hidrolisados por prolilendopeptidases e/ou outras glutenases permitindo a produção de produtos seguros para os doentes celíacos (24) . As enzimas podem, também, ser ingeridas como medida profiláctica, em que o glúten na dieta é hidrolisado pelas peptidases co-ingeridas, evitando, assim, as reações imunológicas específicas da doença celíaca no intestino delgado (25) . 0 uso destas enzimas para destoxificar o glúten ou mesmo a sua coadministração na dieta têm conduzido a diversos pedidos de patente (26-30).
Todavia, o uso de peptidases para a modificação do glúten apresenta algumas limitações, nomeadamente a perda de qualidade tecnológica do glúten e das massas pois são produtos hidrolisados sem a estrutura proteica necessária para manter as propriedades de elasticidade e extensibilidade. Já em relação à co-ingestão das peptidases, as principais limitações prendem-se com o facto de estas serem rapidamente hidrolisadas pela pepsina gástrica (31, 32), dificultando a administração oral e também por serem inativadas pela tripsina e quimiotripsina na presença de sais biliares intestinais (33).
Destacam-se, ainda, outras aproximações farmacológicas, nomeadamente o uso de ligantes poliméricos (copolímeros aleatórios de hidroxietil metacrilato (HEMA) e 4-estireno sulfonato de sódio (SS)) que através da ligação nãocovalente às gliadinas impedem a sua digestão e suprimem desta forma a toxicidade induzida pelas gliadinas no epitélio intestinal (34), moduladores de permeabilidade paracelular (35), inibidores da transglutaminase-2 tecidular (36-41), vacinação peptidica (42-44), estimuladores da regeneração intestinal (45) e bloqueadores do recetor NKG2D das células exterminadoras naturais (natural kíller) e proteína ligante MICA (46, 47) . Além disso, o polipeptídeo Glicagina-tipo 2 (GLP-2) demonstrou uma significativa atividade reparadora do epitélio da mucosa do intestino delgado e grosso, aumentando a capacidade do intestino para digerir e absorver os nutrientes. 0 seu uso para o tratamento de doenças e distúrbios gastrointestinais foi descrito (48, 49). Também, o uso de anticorpos com atividade específica contra o glúten ou peptídeos derivados do glúten que pode inibir a desamidação do glúten ou dos seus peptídeos derivados pela tranglutaminase tecidular se apresenta como uma estratégia potencial de diminuição da toxicidade do glúten (50).
De qualquer forma, o tratamento da doença celíaca ou o seu controlo através de uma aproximação farmacológica terá a contrapartida do tratamento ter como alvo os efectores endógenos da doença e neste sentido, a modificação do glúten (efector exógeno) visando a sua destoxificação torna-se uma estratégia muito atrativa quando comparada com o tratamento farmacológico. A avaliação prévia da toxicidade global dos produtos é uma vantagem crucial pois é bem conhecida a heterogeneidade da doença celíaca (18), sabendo-se agora que não apenas as gliadinas, mas todas as proteínas do glúten podem ser tóxicas para pelo menos um doente celíaco (51).
Um método de redução da alergenicidade de produtos alimentares utilizando dióxido de carbono supercrítico ou azoto líquido foi descrito (52) . Também a tecnologia do Ácido Ribonucleico de Interferência (RNA1) foi usada para reduzir a expressão das gliadinas em linhas de trigo que foram posteriormente avaliadas como tendo um baixo nível de toxicidade para os doentes celíacos (53). Investigações recentes mostraram que a alteração da expressão das gamagliadinas em diferentes backgrounds genéticos não tem um efeito direto na qualidade tecnológica das massas de trigo (54). Relativamente à tecnologia RNAí, a heterogeneidade da doença, a estabilidade genética das linhas ao longo das gerações e o facto de o produto final constituir um organismo geneticamente modificado (OGM) e todas as questões de naturezas várias que daí advêm ou podem advir, são apontadas como as maiores limitações desta aproximação (55) .
Outras aproximações têm sido conduzidas no sentido de modificar os resíduos de glutamina como por exemplo o tratamento da farinha de trigo com a transglutaminase microbiana para a produção de farinhas hipoalergénicas (56) ou a modificação da farinha de trigo visando interferir com a desamidação dos resíduos de glutamina através de uma prévia desamidação química ou enzimática seguida de derivatização enzimática do grupo carboxílico formado que conduziu a um pedido de patente (57). Além disso, a capacidade de conjugação de peptídeos pela transglutaminase foi descrita (58, 59) e a sua utilização para o desenvolvimento de produtos e melhoramento de determinadas características como a textura através do entrecruzamento proteico, colmatar a deficiência em lisina de determinados alimentos, entre outras, conduziu a diversos pedidos de patente (60-69). A utilização da transglutaminase microbiana em combinação com um dador amina para destoxificar o glúten para doentes celíacos foi recentemente descrita (70, 71) . Através da modificação seletiva dos resíduos de glutamina presentes nos epítopos tóxicos pela transglutaminase microbiana (transamidação) utilizando a lisina ou ésteres metílicos ou etílicos de lisina impede-se o processo de desamidação conduzido pela transglutaminase tecidular presente no corpo humano, que é um passo fundamental para o desenvolvimento da resposta imunológica em doentes celíacos (72).
Vários estudos foram posteriormente conduzidos utilizando a ação da transglutaminase microbiana e o éster metílico de lisina como substrato em farinha de trigo Intacta (73), o éster etílico de lisina como substrato em farinhas de trigo previamente desprovidas das albuminas e globulinas (proteínas do endosperma) (74, 75), ou a L-lisina como substrato em glúten previamente hidrolisado pela pepsina seguida por tripsina (76) . Em todos estes estudos constatou-se uma forte diminuição da toxicidade para os doentes celíacos dos produtos modificados. A grande desvantagem da aplicação a nível industrial prende-se com o elevado custo do substrato utilizado. Além disso, todos os trabalhos citados anteriormente e que envolvem a utilização da lisina ou dos ésteres metílicos ou etílicos de lisina como dadores do grupo amina para a transglutaminase, carecem de uma avaliação da qualidade reológica/tecnológica final dos produtos modificados. Mais recentemente foi publicado um estudo utilizando a ação da transglutaminase microbiana e a n-butilamina como substrato em farinha de trigo e respetivo glúten, em que a extensão da reação de transamidação é francamente aumentada através do uso de condições redutoras. Além disso, o aumento de hidrofobicidade das proteínas tratadas resultou em melhores propriedades de panificação da farinha tratada quando comparada com a farinha original (77).
A presente invenção descreve um novo processo de destoxificação da farinha de trigo Intacta e respetivo glúten através da formação de estruturas supramoleculares entre as proteínas e o polissacarídeo natural quitosana, traduzindo-se em produtos destinados ao consumo por doentes celíacos e apresentando uma série de vantagens e diferenças relativamente aos processos anteriormente descritos, nomeadamente:
• A quitosana é um polissacarídeo não tóxico, é hipoalergénico, biocompatível e biodegradável;
• A quitosana é um produto mais barato que os produtos anteriormente utilizados para a destoxificação da farinha e do glúten como por exemplo a L-lisina, os ésteres metílicos e etílicos de lisina;
• Os produtos derivados são compatíveis com a doença celíaca;
• A facilidade de produção, isto é, produção rápida, sem recurso a temperaturas elevadas e sem ocorrência de produtos laterais tóxicos;
• A obtenção de produtos sensorialmente, viscoelasticamente e mecanicamente semelhantes aos produtos clássicos.
Adicionalmente, a presente invenção diz ainda respeito à utilização do processo noutros cereais e os respetivos produtos, designadamente a cevada (Hordeum spp.), o centeio (Secale spp.), o triticale (x Tríticosecale Wittmack) e a aveia (Avena spp.), bem como os seus produtos germinados, pois algumas proteínas destes cereais apresentam reatividade imunológica similar ao glúten do trigo para os doentes celíacos (2).
Sumário
A presente invenção diz respeito a um processo de destoxificação de farinha de trigo (Trítícum spp.) e glúten através da formação de estruturas supramoleculares com a quitosana e à respetiva farinha e glúten em que são obtidos valores de redução de epitopos tóxicos para os doentes celíacos de cerca de 65 e 88% quando comparados com a farinha e glúten não modificados ou originais. Adicionalmente diz ainda respeito à utilização do processo noutros cereais e os respetivos produtos, nomeadamente a cevada (Hordeum spp.), o centeio (Secale spp.), o triticale (x Trítícosecale) e a aveia (Avena spp.) e produtos germinados.
Numa forma de realização preferencial, a quitosana pode ter origem em crustáceos ou em fungos.
Numa forma de realização preferencial, o processo de destoxificação envolve a utilização de quitosanas com diferentes graus de polimerização (DP = 2 a DP > 1.000.000) e graus de acetilação (0 a 60%).
Numa forma de realização preferencial, o processo de destoxificação envolve a utilização de açucares aminados. Ainda numa outra forma de realização preferencial a razão proteína:quitosana varia entre 0,5:1 a 10:1 (p/p), preferencialmente 1,9:1.
Numa forma de realização preferencial, o processo de destoxificação envolve a utilização de açucares com diferentes graus de polimerização (DP = 2 a DP > 1.000.000) .
Numa outra forma de realização preferencial, o processo de destoxificação envolve a reação a um valor de pH entre 1 a 9, preferencialmente a pH 6.
Numa forma de realização preferencial utiliza-se a glutationa como agente redutor numa concentração entre 0,1 mM a 500 mM, preferencialmente 20 mM.
Numa outra forma de realização preferencial, a farinha e as proteínas podem ter origem na aveia, centeio, cevada e triticale ou nos respetivos produtos germinados, como por exemplo o malte.
A presente invenção descreve, ainda, o processo para obtenção de farinhas de trigo, aveia, cevada ou triticale e respetivas proteínas destoxifiçadas para o consumo por doentes celíacos descrito anteriormente, que compreende os seguintes passos:
- dispersão da quitosana em ácido acético (0.05 mol/L) numa razão proteína:quitosana que varia entre 0,5:1 a 10:1 (p/p), preferencialmente 1,9:1 seguido do ajuste do pH entre 4 a 9 utilizando um sistema tampão, preferencialmente a 6 ;
- dispersão das farinhas na solução tamponizada contendo a quitosana numa razão proteína:quitosana que varia entre 0,5:1 a 10:1 (p/p), preferencialmente 1,9:1;
- adição de um agente redutor numa concentração final de 0,1 a 500 mM, preferencialmente 20 mM. O agente redutor utilizado pode ser a glutationa ou ditioeritritol (DTE) ou ditioteitrol (DTT) ou tris 2-carboxietil fosfina (TCEP), preferencialmente a glutationa;
- incubação da mistura a uma temperatura entre 4 a 80°C, preferencialmente 40°C;
- incubação com uma duração entre 30 minutos a 72 horas, preferencialmente 24 horas;
separação da farinha da solução por centrifugação ou filtração, com lavagens com água;
recuperação da farinha e secagem por liofilização, secagem em estufa, secagem em estufa de vácuo, atomização.
A presente invenção descreve, também, o processo para obtenção de glúten de trigo destoxifiçado para o consumo por doentes celíacos descrito anteriormente, que compreende os seguintes passos:
- dispersão da quitosana em ácido acético (0.05 mol/L) numa razão proteína:quitosana que varia entre 0,5:1 a 10:1 (p/p), preferencialmente 1,9:1 seguido do ajuste do pH entre 4 a 9 utilizando um sistema tampão, preferencialmente a 6 ;
- dispersão do glúten obtido a partir da lavagem aquosa da massa produzida da farinha de trigo com a adição de 1% de NaCl, na solução tamponizada contendo a quitosana numa razão proteína:quitosana que varia entre 0,5:1 a 10:1 (p/p), preferencialmente 1,9:1;
- adição de um agente redutor numa concentração final de 0,1 a 500 mM, preferencialmente 20 mM. O agente redutor utilizado pode ser a glutationa ou ditioeritritol (DTE) ou ditioteitrol (DTT) ou tris 2-carboxietil fosfina (TCEP), preferencialmente a glutationa;
- incubação da mistura a uma temperatura entre 4 a 80°C, preferencialmente 40°C;
- incubação com uma duração entre 30 minutos a 72 horas, preferencialmente 24 horas;
separação do glúten da solução por centrifugação ou filtração, com lavagens com água;
recuperação do glúten e posterior secagem por liofilização, secagem em estufa, secagem em estufa de vácuo, atomização.
Breve descrição das figuras
Para uma mais fácil compreensão do presente pedido juntamse em anexo figuras, as quais, representam realizações preferenciais que, contudo, não pretendem limitar a técnica aqui divulgada.
Figura 1. Natureza da associação entre as gliadinas e a quitosana numa proporção de 1:1 (p/p), a diferentes pHs e em condições redutoras e não redutoras.
Figura 2. Espectro de raio-x do glúten contendo estruturas supramoleculares com a quitosana (w®®) e a quitosana tratada em condições similares (^) .
Figura 3. Caracterização do efeito da presença de estruturas supramoleculares na farinha e no glúten em relação à à libertação de epitopos tóxicos medidos pelo anticorpo R5 (A) , à digestibilidade (B) e à atividade de desamidação pela transglutaminase tecidular (C). * p<0,05, ** p<0,01, *** p< 0,001 e **** p<0,0001; n=3.
Figura 4. Curvas de extensão de microextensógrafo de Kieffer da massa produzida através da farinha contendo estruturas supramoleculares com a quitosana (>>>>5®) e a farinha controlo, i.e. tratada em condições similares ), n=2 .
Figura 5. Processo de obtenção de obtenção de estruturas supramoleculares glúten-chitosana em farinhas de diversas origens e glúten isolado a partir da farinha de trigo.
Descrição de formas de realização
Fazendo referência às figuras, algumas formas de realização são agora descritas de forma mais pormenorizada, as quais não pretendem contudo limitar o âmbito do presente pedido.
A farinha de trigo e glúten destoxifiçados para o consumo por doentes celíacos, objetos da presente invenção, são diferentes dos produtos elaborados com a mesma finalidade pelo facto de conterem estruturas supramoleculares produzidas entre as proteínas do glúten e a quitosana, a qual é um polissacarídeo seguro para consumo humano. Estas estruturas supramoleculares resultam da interação nãocovalente por pontes de hidrogénio entre as proteínas do glúten, nomeadamente as gliadinas, e a quitosana, em condições redutoras (Figura 1) . Além disso, a re-oxidação das pontes disulfeto resulta num encarceramento mecânico e consequente estabilização destas estruturas. A análise da formação de complexos de alto peso molecular e a natureza da associação entre proteínas e quitosana foi conduzida através de cromatografia de exclusão molecular. Para tal, foi utilizada uma coluna (30cm x 7.8mm, partículas 8pm) TSK-Gel G4000 SWXL (TOSOH Bioscience, Japão) a 50°C e uma solução de 0,2mol/L ácido acético / 0,15 mol/L acetato de amónio (pH 4,5) como eluente. Foi utilizado um fluxo de 0,5 mL/min e um detetor de fotodiodo (Dionex PDA-100). A deteção foi realizada a 280 nm. O volume de amostra utilizado foi de cerca de 50 pL. A coluna analítica foi previamente calibrada com dextrana azul (~2000 kDa), urease (-545 kDa), albumina do soro bovino (— 66 kDa), citocromo c (—12 kDa), insulina (~6 KDa) e tirosina (—181 Da).
A difração de raio-x (Figura 2) e a espectroscopia de infravermelho (Tabela 1) mostram a alteração profunda que a associação entre as proteínas e as quitosanas, e a formação de estruturas supramoleculares, têm no glúten. A análise de difração de raio-x foi realizada usando o difractómetro PANalytical X'Pert Pro X-ray equipado com o detetor X'Celerator. As medições foram conduzidas utilizando uma radiação Cu-Κα (40kV; 30mA) em geometria Bragg-Bentano (760° de intervalo angular 2Θ) . Em relação à espectroscopia de infra-vermelho, esta foi realizada num Bruker Alpha com o módulo Platinum ATR no intervalo 4000 a 600 cm-1 a uma resolução de 4 cm-1. Os espectros resultaram da co-adição de 32 scans. A desconvolução da segunda derivada da banda correspondente à amida I foi feita com o programa informático PeakFIT (Systat).
Tabela 1. Espectroscopia de infra-vermelho e atribuição das estruturas proteicas secundárias do glúten controlo e contendo estruturas supramoleculares.
| Número de onda | Estrutura secundária | Glúten controlo | Glúten com estruturas supramoleculares | t test |
| 1623 | Folha β | 10,6910,01 | 11,1410,39 | P=0,1164 |
| 1629 | Folha β | 11,0910,14 | 11,1010,09 | P=0,9221 |
| 1636 | Folha β | 12,0910, 14 | 11,7010,10 | P=0,0172 |
| 1643 | Folha β | 13,3410,04 | 13,7610,00 | P<0,0001 |
| 1651 | Hélice α | 13,4510,10 | 14,0710,15 | P=0,0040 |
| 1659 | Hélice α | 11,6410,12 | 12,2110,10 | P=0,0032 |
| 1667 | Volta β | 9,2710,05 | 9,3710,07 | P=0,1143 |
| 1674 | Volta β | 7,1410,04 | 6,6710, 12 | P=0,0030 |
| 1681 | Volta β | 6,0310,02 | 5,7610, 08 | P=0,0048 |
| 1689 | Folha β | 3,3710,02 | 2,7310,05 | P<0,0001 |
| 1696 | Folha β | 1,8910,07 | 1,4910,06 | P=0,0017 |
| Σ Folha β | 52,48 | 51,92 (-1,07%) | ||
| Σ Hélice α | 25,08 | 26,28 (+4,78%) | ||
| Σ Volta β | 22,44 | 21,80 (-2,85%) |
resultado em termos de aplicação à produção de produtos toleráveis por doentes celíacos é uma clara diminuição da digestibilidade das proteínas do glúten, nomeadamente as gliadinas, resultando consequentemente num produto em que mais de 65% dos epítopos tóxicos para os doentes celíacos são eliminados e o processo de desamidação conduzido pela transglutaminase tecidular, um passo chave na patogénese da doença celíaca (11, 12), inibido (Figura 3).
Para a quantificação dos epítopos tóxicos na farinha e glúten, controlos e associados com quitosana, foi utilizado o produto comercial RIDASCREEN® Gliadin competitive. Este produto baseia-se no ensaio imunosorbente ligado a enzima (ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) competitivo e no anticorpo monoclonal R5, que é recomendado pelo Codex Alimentarius e reconhece entre outras a sequência potencialmente tóxica QQPFP, que ocorre repetidamente nas proteínas da farinha e do glúten. 0 formato competitivo deste teste tem a vantagem de detetar fragmentos peptídicos individuais comparativamente ao formato sandwích ELISA. 0 limite de deteção é de 1,36 ppm de gliadina e o limite de quantificação é de 5 ppm de gliadina. Todas as instruções do produto RIDASCREEN® Gliadin competitive foram seguidas rigorosamente e a preparação do material foi feita de acordo com o descrito por Gessendorfer e colaboradores (78), também uma recomendação do teste utilizado. Resumidamente, a farinha e o glúten, originais e destoxifiçados, foram dispersos em água destilada numa proporção de 5%, e o pH foi ajustado a 1,8 com recurso a uma solução de HC1 a 1 M (79) . Seguidamente foram adicionados 2,5 mg de pepsina que ficaram a reagir durante quatro horas sob agitação e a 37°C. Posteriormente o pH foi ajustado a 7,8 com uma solução de NaOH a 1 M e 2,5 mg de tripsina foram adicionadas à mistura que ficou a reagir por mais quatro horas sob agitação a 37°C. Finalmente, o pH foi ajustado a 4,5 com uma solução de HC1 a 1 M, e os digeridos pépticos-tripticos foram centrifugados a 4000 x g durante vinte minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi decantado, congelado e liofilizado. Os resíduos secos obtidos correspondem aos digeridos pépticos-tripticos (PT) da farinha e do glúten, controlos e associados com quitosana. Este protocolo de digestão da farinha e do glúten com proteases semelhantes às presentes no sistema digestivo humano permite mimetizar o processo de digestão.
A digestibilidade foi determinada pela quantificação dos peptídeos resultantes da hidrólise péptica-tríptica por cromatografia de exclusão molecular como descrito anteriormente. A análise de desamidação pela transglutaminase tecidular foi conduzida de acordo com van de Wal e colaboradores (80) e utilizando o kit comercial Ammonia assay (Megazyme, Bray, Ireland).
A quitosana utilizada para a destoxificação das farinhas dos cereais mencionados, entre os quais o trigo (Trítícum spp. ) e do glúten, pode apresentar um peso molecular que varia entre 2 unidades de glucosamina até mais de um milhão de unidades de glucosamina. Para este processo podem também ser utilizados outros açúcares aminados.
A quitosana utilizada para a destoxificação das farinhas dos cereais mencionados, entre os quais o trigo (Trítícum spp. ) e do glúten pode ainda ser naturalmente parcialmente acetilada, com um grau de acetilação até 60%.
Ainda a quitosana utilizada para a destoxificação das farinhas dos cereais mencionados, entre os quais o trigo (Trítícum spp.) e do glúten pode ser obtida a partir do exoesqueleto de crustáceos como o caranguejo ou o camarão, ou obtido a partir das paredes celulares de fungos como o Agarícus bísporus ou o Aspergíllus níger.
A quitosana é previamente dissolvida numa solução ácida para promover a sua solubilidade, por exemplo utilizando soluções diluídas de ácido acético, tipicamente com uma concentração de 1%.
A reação de destoxificação da farinha ou do glúten com a quitosana ocorre a uma temperatura que pode variar entre 4°C e 80°C, preferencialmente a 40°C, durante trinta minutos até setenta e duas horas, preferencialmente vinte e quatro horas.
Depois deste período de destoxificação a farinha ou o glúten são separados da mistura reacional por centrifugação ou filtração, com lavagens sucessivas com água de forma a remover o agente redutor e a quitosana que permaneceu por reagir.
A farinha ou o glúten destoxifiçados e após a sua recuperação são secos por liofilização ou secagem em estufa ou secagem em estufa de vácuo ou atomização.
A farinha ou o glúten contendo as estruturas supramoleculares conservam ou melhoram as caracteristicas organolépticas, viscoelásticas e mecânicas reconhecidas das farinhas de trigo e glúten tratados de forma semelhante (Figura 4) , sendo ingredientes passíveis de serem transformados em produtos de panificação e de pastelaria tradicionais, como por exemplo, pão, bolachas, biscoitos, bases de pizza, massas alimentícias e pastas, bolos de natureza diversa, entre outros.
Para a determinação da extensibilidade e resistência à extensão da farinha contendo estruturas supramoleculares e a sua comparação com a farinha controlo, foi utilizado o micro-extensógrafo de Kieffer (81) . Em síntese, as massas foram obtidas por mistura de água calculada de acordo com o procedimento AACC 54-40.02 (82), foram deixadas a repousar 20 min a 30°C em condições de atmosfera saturada com água. Após este período as massas foram prensadas num molde de teflon pré-aquecido a 30°C e deixado a repousar durante mais 40 min a 30°C numa atmosfera saturada com água. O molde de teflon e o sistema de medição para a massa foram o SMS/Kieffer Dough and Glúten Extensibility Rig com o texturómetro TA-XT2 da Stable Micro Systems.
Resumindo, através da utilização da quitosana na presença de um agente redutor (Figura 5), é possível alterar as propriedades alergénicas das proteínas do glúten, eliminando a toxicidade em mais de 65% dos epítopos reativos na doença celíaca, sem perda das caracteristicas organolépticas, viscoelásticas e mecânicas reconhecidas das farinhas de trigo e glúten, sendo ingredientes passíveis de serem transformados em produtos de panificação e de pastelaria tradicionais, como por exemplo, pão, bolachas, massas alimentícias e pastas, biscoitos, bases de pizza, bolos de natureza diversa, entre outros, constituindo a farinha e o glúten destoxifiçados um produto único e diferente de todos os produtos descritos ou existentes no mercado.
Exemplos de aplicação
Exemplo 1
Para a destoxificação da farinha de trigo (Trítícum spp.) dissolveram-se inicialmente 437 mg de quitosana obtida do exoesqueleto do caranguejo com um grau de desacetilação de 66% e um peso molecular de 580 kDa numa solução de ácido acético a 0.05 mol/L. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256,8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (6,14 g/L) . A mistura é mantida a 40°C durante vinte e quatro horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é dialisada e seca por liofilização.
Exemplo 2
Para a destoxificação do glúten isolado a partir da farinha de trigo (Trítícum spp.) dissolveram-se inicialmente 437 mg de quitosana obtida do exoesqueleto do caranguejo com um grau de desacetilação de 66% e um peso molecular de 580 kDa numa solução de ácido acético a 0,05 mol/L. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. O glúten (20 g/L) é disperso na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (6,14 g/L) . A mistura é mantida a 40°C durante vinte e quatro horas. Depois deste período de destoxificação o glúten é dialisado e seco por liofilização.
Exemplo 3
Para a destoxificação da farinha de trigo (Triticum spp. ) dissolveram-se inicialmente Ig de quitosana obtida da parede celular do Agaricus bísporus com um grau de desacetilação de 78% e um peso molecular de 60-120 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 5, 0 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256,8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (3,07 g/L) . A mistura é mantida a 30°C durante quarenta e oito horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é separada da mistura reacional por filtração, lavada sucessivamente com água e seca em estufa de vácuo.
Exemplo 4
Para a destoxificação do glúten isolado a partir da farinha de trigo (Triticum spp.) dissolveram-se inicialmente 1 g de quitosana obtida da parede celular do Agaricus bísporus com um grau de desacetilação de 78% e um peso molecular de 60120 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 7,5 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. O glúten (20 g/L) é disperso na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (6,14 g/L) . A mistura é mantida a 50°C durante doze horas. Depois deste período de destoxificação o glúten é separado da mistura reacional por centrifugação, lavado sucessivamente com água e seco em estufa de vácuo.
Exemplo 5
Para a destoxificação da farinha de trigo (Triticum spp.) dissolveram-se inicialmente Ig de quitosana obtida da parede celular do Aspergíllus níger com um grau de desacetilação de 83% e um peso molecular de 60-120 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6,5 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256,8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (6,14 g/L) . A mistura é mantida a 40 °C durante vinte e quatro horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é separada da mistura reacional por centrifugação, lavada sucessivamente com água e seca por liofilização.
Exemplo 6
Para a destoxificação do glúten isolado a partir da farinha de trigo (Triticum spp.) dissolveram-se inicialmente 1 g de quitosana obtida da parede celular do Aspergíllus níger com um grau de desacetilação de 83% e um peso molecular de 60120 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6,5 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. O glúten (20 g/L) é disperso na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (6,14 g/L) . A mistura é mantida a 40°C durante vinte e quatro horas. Depois deste período de destoxificação o glúten é separado da mistura reacional por centrifugação, lavado sucessivamente com água e seco por liofilização.
Exemplo 7
Para a destoxificação da farinha de trigo (Triticum spp.) dissolveram-se inicialmente Ig de quitosana obtida do exoesqueleto do caranguejo com um grau de desacetilação de 80% e um peso molecular de 900 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6,5 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256, 8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (10 g/L) e dez unidades de biocatalizador por grama de proteína. A mistura é mantida a 40°C durante vinte e quatro horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é separada da mistura reacional por centrifugação, lavada sucessivamente com água e seca por liofilização.
Exemplo 8
Para a destoxificação do glúten isolado a partir da farinha de trigo (Trítícum spp.) dissolveram-se inicialmente 1 g de quitosana obtida do exoesqueleto do caranguejo com um grau de desacetilação de 80% e um peso molecular de 900 kDa. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6,5 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. O glúten (20 g/L) é disperso na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (10 g/L) . A mistura é mantida a 40°C durante vinte e quatro horas. Depois deste período de destoxificação o glúten é separado da mistura reacional por centrifugação, lavado sucessivamente com água e seco por liofilização.
Exemplo 9
Para a destoxificação da farinha de cevada (Hordeum spp.) dissolveram-se inicialmente Ig de quitosana obtida do exoesqueleto do caranguejo com um grau de desacetilação de 66% e um peso molecular de 580 kDa numa solução de ácido acético a 0,05 mol/L. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256,8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (3,07 g/L) . A mistura é mantida a 30°C durante quarenta e oito horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é separada da mistura reacional por filtração, lavada sucessivamente com água e seca em estufa de vácuo.
Exemplo 10
Para a destoxificação da farinha de centeio (Secale spp.) dissolveram-se inicialmente Ig de quitosana obtida das paredes celulares do Agaricus bísporus com um grau de desacetilação de 78% e um peso molecular de 60-120 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6, 0 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256,8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (6,14 g/L) . A mistura é mantida a 40°C durante quarenta e oito horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é separada da mistura reacional por filtração, lavada sucessivamente com água e seca em estufa de vácuo.
Exemplo 11
Para a destoxificação da farinha de triticale (x Tríticosecale) dissolveram-se inicialmente Ig de quitosana obtida das paredes celulares do Agaricus bísporus com um grau de desacetilação de 78% e um peso molecular de 60-120 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 5,0 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256,8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (3,07 g/L) . A mistura é mantida a 30°C durante quarenta e oito horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é separada da mistura reacional por filtração, lavada sucessivamente com água e seca em estufa de vácuo.
Exemplo 12
Para a destoxificação da farinha de aveia (Avena spp.) dissolveram-se inicialmente Ig de quitosana obtida do exoesqueleto do caranguejo com um grau de desacetilação de 98% e um peso molecular de 220-300 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6,5 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256, 8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (3,07 g/L). A mistura é mantida a 35°C durante vinte e quatro horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é separada da mistura reacional por filtração, lavada sucessivamente com água e seca em estufa de vácuo.
Exemplo 13
Para a destoxificação do malte produzido a partir da cevada dissolveram-se inicialmente Ig de quitosana obtida das paredes celulares do Agarícus bísporus com um grau de desacetilação de 78% e um peso molecular de 60-120 kDa numa solução de ácido acético a 1%. Após agitação e completa dissolução da quitosana, o pH da solução é ajustado e tamponizado a pH 6, 0 com uma solução tampão de fosfato de sódio a 0,5 mol/L e o volume ajustado a 50 mL. A farinha (256,8 g/L) é dispersa na solução anterior por agitação, seguida da adição de glutationa (3,07 g/L) . A mistura é mantida a 30°C durante quarenta e oito horas. Depois deste período de destoxificação a farinha é separada da mistura reacional por filtração, lavada sucessivamente com água e seca em estufa de vácuo.
A presente descrição não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações apresentadas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral, tal como definido nas reivindicações. As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais.
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Lisboa, 21 de outubro de 2016
Claims (19)
- REIVINDICAÇÕES1. Um método para destoxificar eficientemente produtos cerealíferos, produtos germinados derivados dos mesmos, e frações proteicas derivadas dos mesmos, para os doentes celíacos através da associação supramolecular entre as proteínas potencialmente tóxicas e polissacarídeos aminados.
- 2. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste na farinha trigo (Trítícum spp.) .
- 3. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste na farinha de cevada (Hordeum spp.) .
- 4. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste na farinha de centeio (Secale spp.) .
- 5. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste na farinha de triticale (x Trítícosecale) .
- 6. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste no produto germinado de trigo (Trítícum spp.).
- 7. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste no produto germinado de cevada (Hordeum spp.).
- 8. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste no produto germinado de centeio (Secale spp.).
- 9. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste no produto germinado de triticale (x Triticosecale) .
- 10. Um método de acordo com a reivindicação 1 em que o produto cerealífero consiste no glúten isolado a partir do trigo (Triticum spp.).
- 11. Farinhas de cereais, produtos germinados de cereais e glúten que de acordo com as reivindicações anteriores, apresentam uma concentração de epítopos tóxicos para os doentes celíacos inferior quando comparados com as farinhas, produtos germinados e glúten não modificados ou originais.
- 12. Processo de obtenção de farinhas de cereais, produtos germinados e glúten descritos nas reivindicações 1-11, caracterizado por compreender os seguintes passos:- dispersão dos polissacarídeos aminados em ácido acético (0.05 mol/L) numa razão proteína:polissacarídeo que pode variar entre 0,5:1 a 10:1 (p/p), preferencialmente 1,9:1 seguido do ajuste do pH entre 4 a 9 utilizando um sistema tampão, preferencialmente a 6;- dispersão das farinhas de cereais, produtos germinados ou glúten na solução tamponizada contendo os polissacarídeos aminados numa razão proteína:polissacarídeos que varia entre 0,5:1 a 10:1 (g/g), preferencialmente 1,9:1;- adição de um agente reductor numa concentração final de0,1 a 500 mM, preferencialmente 20 mM;- incubação da mistura a uma temperatura entre 4 a 80°C, preferencialmente 40°C;- incubação com uma duração entre 30 minutos a 72 horas, preferencialmente 24 horas;separação da farinha da solução por centrifugação ou filtração, com lavagens com água;recuperação da farinha e secagem por liofilização, secagem em estufa, secagem em estufa de vácuo, atomização.
- 13. Processo de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por o polissacarideo aminado destoxif icante ser a quitosana com um grau de polimerização entre 2 unidades de monossacarideos e até mais de um milhão de unidades de monossacrideos e graus de acetilação dos grupos amina entre 0% e 60%.
- 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a quitosana ter origem no exoesqueleto de crustáceos ou das paredes celulares de fungos.
- 15. Farinhas de cereais e glúten de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizados por serem produtos viscoelasticamente superiores aos produtos não-modifiçados ou originais.
- 16. Farinhas de cereais e glúten de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizados por serem produtos sensorialmente semelhantes aos produtos clássicos.
- 17. Processo de acordo com as reivindicações anteriores em que se utiliza um agente redutor anteriormente à modificação das farinhas de cereais, produtos germinados e glúten.
- 18. Processo de acordo com as reivindicações 12-14, caracterizado por o agente redutor poder ser a glutationa, ditioeritritol (DTE), ditioteitrol (DTT) e tris 2-carboxietil fosfina (TCEP).
- 19. Alimento ou produto dietético preparado com as farinhas de cereais, produtos germinados dos cereais e glúten destoxifiçados pelos polissacarideos aminados de acordo com as reivindicações anteriores.Lisboa, 21 de outubro de 2016
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 20161031 |
|
| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20211110 |