WO2017217812A1 - 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증의 개선 및 예방용 밀 - Google Patents

글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증의 개선 및 예방용 밀 Download PDF

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강천식
이종렬
박철수
정영근
김경훈
손재한
박종철
박광근
박기훈
김영미
임선형
김보경
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Definitions

  • the present invention relates to novel wheat varieties and their use for the improvement or prevention of gluten intolerance and wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WEDIA).
  • WEDIA wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis
  • Celiac diseasece is a bowel disease of the digestive tract caused by gluten intolerance in the digestive system of gluten contained in grains such as wheat, barley, rye and oats. Most people digest and absorb gluten without any problems, but those who have problems with gluten digestion easily absorb nutrients by causing immune responses in the gastrointestinal tract, damaging inflammation and villi in mucosal cells of the digestive tract. It becomes impossible to do so, causing various symptoms such as growth retardation, decreased appetite, chronic diarrhea, abdominal swelling, herpes dermatitis, and iron deficiency, resulting in poor absorption of nutrients.
  • gluten is absorbed into the intestine in a lumpy state.At this time, mucosal villi atrophy and damage occurs due to deterioration of intestinal function, resulting in malabsorption and allergic reactions and hormonal disturbances. Because it causes.
  • Gluten which is the cause of celiac disease, is known as a protein composed of monomer molecules gliadin and glutenin in the form of a composite polymer, which is a high molecular weight component (HMW-GS) and a low molecular weight linked by disulfide bonds. It consists of a component (LMW-GS). It is generally known that gluten exhibits the properties necessary for the manufacture of wheat products. The gliadin constituting the gluten causes viscous properties in the dough, and the glutenin causes elasticity and toughness in the dough.
  • HMW-GS high molecular weight component
  • LMW-GS low molecular weight linked by disulfide bonds
  • Gliadin is a major component of wheat gluten and accounts for 40-50% of total storage protein. Most gliadins are present as monomers and gliadins are ⁇ 5-, ⁇ 1,2-, ⁇ - / ⁇ - and ⁇ -letters depending on the mobility of low pH A-PAGE or SDS-PAGE. It is divided into four groups of liadine and has a molecular weight of about 30-75 kDa.
  • ⁇ -, ⁇ -gliadin are present on the forearm of chromosome 1 and are encoded by Gli-A1, Gli-B1 and Gli-D1, and ⁇ - / ⁇ -gliadine is on the forearm of chromosome 6 It is encoded by Gli-A2, Gli-B2 and Gli-D2.
  • Gli-A2 Gli-B2 and Gli-D2
  • ⁇ - / ⁇ - and ⁇ -gliadine are composed of major proteins, accounting for 28-33% and 23-31%, respectively.
  • ⁇ -gliadin is much less, ⁇ -1,2gliadine accounts for 4-7% and ⁇ -5gliadine is 3-6%.
  • WDEIA wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis
  • ⁇ 5-gliadine, ⁇ 1,2-gliadine, alpha / beta gliadine or gamma which are the leading causes of wheat allergy or celiac disease, as wheat allergy sufferers increase and the gluten-free market explodes in Korea Attempts have been made to find a hypoallergenic wheat strain lacking the gliadin group, and the team is identifying a strain that is missing some gluten protein.
  • One object of the present invention is to provide novel wheat varieties lacking the causal genes of gluten intolerance and / or wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WEDIA).
  • Another object of the present invention is to provide a method for improving varieties of wheat, comprising the step of crossing the wheat varieties using a copy or a parent.
  • Another object of the present invention is to provide a wheat flour derived from the wheat variety.
  • Still another object of the present invention is to provide a method of manufacturing a processed food comprising the step of processing the flour.
  • Another object of the present invention to provide a processed food prepared by the above method.
  • the present inventors named the new wheat varieties "opri,” and deposited with the Korean Agricultural Culture Collection (KACC) on October 22, 2015, KACC 88001BP, National Agricultural Science Institute, Iseo-myeon, Wanseo-gun, Jeollabuk-do.
  • the present invention in one embodiment the Glu-B3 trait and / or omega-5 gliadin of low molecular weight Glutenin Subunit (LMW-GS) ) Provides a novel wheat variety that has been deleted and deposited with accession number KACC88001BP.
  • LMW-GS low molecular weight Glutenin Subunit
  • LMW-GS Low Molecular Weight Glutenin Subunit
  • the genes encoding the LMW-GS are Glu-A3, Glu-B3 and Glu-D3 genes located at the Glu-3 locus located on chromosome 1 of wheat, which can be subdivided according to the genotype of these genes. Combination of the genotype of the gene can exhibit a variety of properties of the flour.
  • the term "glutenin” of the present invention is composed of 18 amino acids, has the form of a globular protein that is ball-shaped due to the bridge bonds caused by the interaction between the branches and is present in various grains including wheat Means a protein belonging to the glutelin family, which is a relatively simple protein.
  • the glutenin is composed of a high molecular weight Glutenin Subunit (HMW-GS) having a size of 96 to 136 kDa and a form in which the LMW-GS is bound by disulfide bonds. It can exist in various forms by the combination of GS (Glu-A1, Glu-B1 and Glu-D1) and three kinds of LMW-GS (Glu-A3, Glu-B3 and Glu-D3).
  • HMW-GS high molecular weight Glutenin Subunit
  • gliadin of the present invention is a major component of wheat gluten and accounts for 40-50% of the total storage protein. Most gliadins are present as monomers and gliadins are ⁇ 5-, ⁇ 1,2-, ⁇ - / ⁇ - and ⁇ -letters depending on the mobility of low pH A-PAGE or SDS-PAGE. It is divided into four groups of liadine and has a molecular weight of about 30-75 kDa.
  • ⁇ -, ⁇ -gliadin are present on the forearm of chromosome 1 and are encoded by Gli-A1, Gli-B1 and Gli-D1, and ⁇ - / ⁇ -gliadine is on the forearm of chromosome 6 It is encoded by Gli-A2, Gli-B2 and Gli-D2.
  • Gli-A2 Gli-B2 and Gli-D2
  • ⁇ - / ⁇ - and ⁇ -gliadine are composed of major proteins, accounting for 28-33% and 23-31%, respectively.
  • ⁇ -gliadin is much less, ⁇ -1,2 gliadine accounts for 4-7% and ⁇ -5 gliadine 3-6%.
  • the omega 5-gliadin is known to be the central antigen of wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WDEIA), a serious food allergy.
  • WDEIA wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis
  • WEDIA wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis
  • IgE serum immunoglobulin E
  • omega 5-gliadine The predominant epitope that binds to serum immunoglobulin E (IgE) in WDEIA patients is known as omega 5-gliadine.
  • a novel wheat cultivar of the present invention lacks omega 5-gliadin, which is a major central antigen of WEDIA, and thus can improve and / or prevent WEDIA.
  • prevention means any action that inhibits or delays gluten intolerance and WEDIA by ingesting the Opry wheat variety.
  • the Opry wheat cultivar of the present invention is free of Glu-B3 traits showing gluten intolerance and omega 5-gliadin, which is an antigen that causes WEDIA, which is insulated from gluten intolerance because it is free of allergens. Prevention of the disease is also possible.
  • the term "improvement” includes the use of reducing or alleviating the degree of gluten intolerance and WEDIA. Specifically, it may include lowering or alleviating the degree of celiac disease and WEDIA disease.
  • the inventors have discovered a novel wheat variety that lacks the Glu-B3 trait and / or the omega-5 gliadin gene of LMW-GS, which is a major cause of gluten intolerance by crossing kumgang wheat and all-glumil. It was developed and named “Oprie” and was deposited with the Korean Agricultural Culture Collection (KACC) under accession number KACC88001BP dated October 22, 2015. Thus, in the present invention, expressions such as “oprimil”, “opri”, “new wheat varieties” and the like may be interpreted as representing substantially the same wheat varieties.
  • the novel wheat varieties provided in the present invention exhibit a level similar to that of the parent wheat, Geumgang wheat or ol 'wheat, or the median value of the wheat wheat and the ol' wheat.
  • the leaf color, soy sauce, and disease resistance of leaves are the same or similar to all-glumil
  • the leaf type and the number of leaves are the same or similar to kumgang wheat
  • the baking-related quality characteristics such as milling rate, ash content, flour color, protein content , Gluten content, sedimentation value, kneading characteristics, bread volume, and inner hardness were shown to be median between kumgang wheat and all-glumil.
  • the yield characteristics were lower than that of Geum-Gil or All-Grum-Mil, and higher than Geum-Gang-Gil or All-GrumMil in the case of natural grains.
  • a new wheat cultivar, Oprimil which has strong cold resistance and has excellent moldability and moldability by crossing geumgang wheat and all-glumil, is developed (FIG. 1), and the oil field of the offrimil is developed.
  • the omega-5 gliadin gene which is responsible for the Glu-B3 trait of LMW-GS and the wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WEDIA), is a major cause of gluten intolerance Deletion was confirmed that it is not expressed (Table 1, Figures 2a to 2c and Figures 3 to 7),
  • the milling ratio, ash and flour color of the OPRILL powder showed the median value between the KUM mill powder and the all-Grum mill powder. Similarity was observed (Table 6), and the protein content, gluten content, precipitation value, and kneading characteristics of the oprimill powder showed the median value between the kumgang wheat powder and all-glumil powder. Similarity was confirmed (Table 7), and the bread volume and inner hardness of the bread made of the powder of Opry Mill showed the median value between the bread and the whole wheat bread. (Table 8).
  • the present invention provides a wheat that can improve or prevent gluten intolerance and / or wheat dependent exercise-induced hypersensitivity (WDEIA), comprising using the wheat cultivar as a copy or parent to cross with other wheat cultivars.
  • WDEIA wheat dependent exercise-induced hypersensitivity
  • omega 5-gliadin which is the cause of Glu-B3 trait of LMW-GS and / or wheat-dependent exercise-induced hypersensitivity (WDEIA) which is the main cause of gluten intolerance
  • WDEIA wheat-dependent exercise-induced hypersensitivity
  • Glu-B3 trait and omega 5-gliadin gene as well as other traits are deleted. Varieties can be developed, which will be more effective in preventing the development of gluten intolerance and wheat-dependent exercise-induced hypersensitivity than Opry.
  • other wheat varieties that may be used are not particularly limited thereto, but may be, for example, landscape wheat, wheat wheat, white wheat wheat, high wheat flour, or the like.
  • the Opry provided by the present invention can be used to develop new varieties that can more effectively prevent gluten intolerance and wheat dependent exercise-induced hypersensitivity.
  • the present invention provides a wheat flour derived from the wheat variety, a method for producing a processed food comprising the step of processing the wheat flour and a processed food prepared by the method.
  • the Opry a novel wheat cultivar provided by the present invention, deletes the Glu-B3 trait and the omega 5-gliadin gene of LMW-GS, resulting in gluten intolerance and / or wheat-dependent exercise-induced hypersensitivity. Since it can be prevented, the flour derived from the Opry can be used as a raw material of processed foods that can prevent gluten intolerance and wheat-dependent exercise-induced hypersensitivity, and the processed food prepared using the flour is gluten intolerant and wheat-dependent exercise It can be used as a functional food to prevent induced hypersensitivity.
  • the method for producing a processed food which can prevent gluten intolerance and / or wheat dependent exercise-induced hypersensitivity comprises the steps of: (a) pulverizing the novel wheat varieties to obtain flour; (b) obtaining a dough comprising the flour; And (c) processing the dough.
  • the flour of step (a) may be obtained by using the new wheat variety alone or by using a mixture of the new wheat variety and other wheat varieties.
  • Flour obtained from the novel wheat varieties provided by the present invention may not exhibit physical properties enough to produce all processed foods, even when used alone, and from other wheat varieties to exhibit suitable properties for the production of processed foods. It can be used by mixing with the obtained flour.
  • the content of the new wheat varieties derived flour contained in the mixture of the new wheat varieties derived flour and other wheat varieties derived flour may prevent the development of gluten intolerance, celiac disease and gluten intolerance and wheat dependent exercise-induced hypersensitivity.
  • One particular example is not limited thereto, but may be 50 to 99% (v / v) as one example, 60 to 80% (v / v) as another example, and 65 to 70% as another example.
  • other wheat varieties included in the mixture is not particularly limited thereto, but may be, for example, geumgang mill, all-grain mill, landscaping mill, small mill, white heavy mill, high-density mill and the like.
  • the dough of step (b) can be obtained by a method known in the art, depending on the characteristics of the various processed foods, including flour, water content, additives contained therein And it can be obtained by changing the factors, such as its content, whether or not aged and age.
  • the processing of step (c) may be performed by a method known in the art.
  • the dough in order to manufacture processed foods such as cookies and sweets, the dough may be processed by heat treatment in a short time, and in order to manufacture processed foods such as noodles, the dough is increased to form a cotton pad.
  • it may be processed by a method of drying, in order to produce a processed food, such as bread can be processed by a method of heat-treating the dough at a medium temperature and then again to a high temperature.
  • the processed food prepared by the above manufacturing method is a gluten intolerance and reflects the characteristics of the Glu-B3 trait of LMW-GS and / or the deletion of the omega 5 gliadin gene represented by the novel wheat variety provided by the present invention. As long as it can prevent wheat-dependent exercise-induced hypersensitivity, it is not particularly limited thereto, but may be bread, noodles, confectionary, and the like.
  • Oprimil provided by the present invention is an omega 5 that causes Glu-B3 traits of LMW-GS and / or wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis (WEDIA), which is a major cause of gluten intolerance
  • Figure 1 is a genealogical diagram showing the process of developing varieties of Opry Mill.
  • Figure 2a is an electrophoresis picture showing the results of PCR amplification of Glu-B3 trait genes related to Geumgang wheat, all-glumil and Oprymil.
  • Figure 2b is an electrophoresis picture showing HMW-GS and LMW-GS related proteins of Geumgangmil, Allgmil and Oprimil.
  • Figure 2c is an electrophoresis picture showing LMW-GS related proteins of various levels of oprimil extract.
  • Figure 3 is an electrophoresis picture showing the results of the detection of omega-5 gliadin protein by analyzing the gliadin fraction of Geumgang wheat, all-glumil and oprimil by SDS-PAGE, lane 1 is Geumgang wheat, 2 Burn lanes represent allgmil and lane 3 represent oprimil, respectively.
  • Figure 4 is an electrophoresis picture showing the results of detecting the omega-5 gliadin protein by analyzing the glutenin fractions of Geumgang wheat, all-glumil and oprimil by A-PAGE, lane 1 is Opry, No. 2 Lanes represent Geummil and Lane 3 represent Allgmil.
  • Figure 5 shows the results of the analysis of the gliadin fractions of Geumgang, Allgmil and Oprimil by RP-HPLC, showing the Geummil, Olglumil and Opry Mill in order from the top.
  • FIG. 6 shows immuno-blotting results of omega-5 gliadin specific antibodies of Geumgangmil, Allgmil and Oprimil.
  • FIG. 7 shows two-dimensional electrophoresis of seed total storage protein fractions of Geumgang wheat, Allgmil, Oprimil (DH20) and Butte86, and immuno-blotting using serum of WDEIA patients. And MS / MS protein results on immunoblotting pictures of WDEIA patients.
  • Progeny wheat (F1) is obtained by artificially crossing Geumgang wheat and all-glumil, and haploid culture is carried out at the CIMMYT Institute in Mexico for the F1, and this is performed for 4 years in Iksan, whereby cold resistance is strong and super-type
  • the final development of a new wheat cultivar showing good properties of fruit and tree was named "Ofri" (FIG. 1).
  • Figure 1 is a genealogical diagram showing the process of developing varieties of Opry Mill.
  • Glu-1 and Glu- which are components of Glu-1 and LMW-GS (Low Molecular Weight Glutenin Subunit), which are components of HMW-GS (High Molecular Weight Glutenin Subunit) of gluten. In terms of the expression level of 3 was confirmed.
  • Genomic DNA extraction kit for plant from SolGent was used to extract genomic DNA from the young leaves of Geumgang, Allgmil and Oprimil. Subsequently, using the extracted genomic DNA as a template, PCR using a primer capable of detecting the following Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1, Glu-A3, Glu-B3, or Glu-D3 is performed. The genetic composition of Glu-1 and Glu-3 included in the oprimil was confirmed (Table 1).
  • Glu-A1ab F 5'-AAGACAAGGGGAGCAAGGT-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Glu-A1ab R 5'-GTGCTCCGCGCTAACATG-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Glu-A1c F 5'-ACGTTCCCCTACAGGTACTA-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Glu-A1c R 5'-TATCACTGGCTAGCCGACAA-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Glu-B1bcf F 5'-TTCTCTGCATCAGTCAGGA-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Glu-B1bcf R 5'-AGAGAAGCTGTGTAATGCC-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Glu-D1d F 5'-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Glu-D1d R 5'-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Glu-D1adf F 5'-TTTGGGGAATACCTGCACTACTAAAAAGGT-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • Glu-D1adf F 5'-AAAAGGTATTACCCAAGTGTAACTTGTCCG-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Glu-D1adf R 5'-AATTGTCCTGGCTGCAGCTGCGA-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • Glu-A3a F 5'-AAACAGAATTATTAAAGCCGG-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • Glu-A3a R 5'-GGTTGTTGTTGTTGCAGCA-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • Glu-A3b F 5'-TTCAGATGCAGCCAAACAA-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • Glu-A3b R 5'-GCTGTGCTTGGATGATACTCTA-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • Glu-A3ac F 5'-AACAGAATTATTAAAGCCGG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • Glu-A3ac R 5'-CTGTGCTTGGATGATACTCTA-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • Glu-A3d F 5'-TTCAGATGCAGCCAAACAA-3 '(SEQ ID NO: 18)
  • Glu-A3d R 5'-TGGGGTTGGGAGACACATA-3 '(SEQ ID NO: 19)
  • Glu-A3e F 5'-AAACAGAATTATTAAAGCCGG-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • Glu-A3e R 5'-GGCACAGACGAGGAAGGTT-3 '(SEQ ID NO: 21)
  • Glu-B3d F 5'-CACCATGAAGACCTTCCTCA-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • Glu-B3d R 5'-GTTGTTGCAGTAGAACTGGA-3 '(SEQ ID NO: 23)
  • Glu-B3fg F 5'-TATAGCTAGTGCAACCTACCAT-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • Glu-B3fg R 5'-CAACTACTCTGCCACAACG-3 '(SEQ ID NO: 25)
  • Glu-B3g F 5'-CAAGAAATACTAGTTAACACTAGTC-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • Glu-B3g R 5'-GTTGGGGTTGGGAAACA-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • Glu-B3h F 5'-CCACCACAACAAACATTAA-3 '(SEQ ID NO: 28)
  • Glu-B3h R 5'-GTGGTGGTTCTATACAACGA-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • Glu-B3i F 5'-TATAGCTAGTGCAACCTACCAT-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • Glu-B3i R 5'-TGGTTGTTGCGGTATAATTT-3 '(SEQ ID NO: 31)
  • Glu-D3ab F 5'-TTGGGCCTAATCGCTCGC-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • Glu-D3ab R 5'-TAGTCTCCATCTGCGCAATT-3 '(SEQ ID NO: 33)
  • Glu-D3c F 5'-CAGCTAAACCCATGCAAGC-3 '(SEQ ID NO: 34)
  • Glu-D3c R 5'-CAATGGAAGTCATCACCTCAA-3 '(SEQ ID NO: 35)
  • Figure 2a is an electrophoresis picture showing the results of PCR amplification of Glu-B3 trait genes related to Geumgang wheat, all-glumil and Oprymil. As shown in Fig. 2a, it was confirmed that Glu-B3 trait genes were not detected in Oprimil.
  • Figure 2b is an electrophoresis picture showing HMW-GS and LMW-GS related proteins of Geumgangmil, Allgmil and Oprimil. As shown in Fig. 2b, it was confirmed that Glu-B3 trait was not detected in oprimil even at the protein level.
  • Figure 2c is an electrophoresis picture showing LMW-GS related proteins of various levels of oprimil extract. As shown in Figure 2c, as the level of the offrimil extract increased the level of various proteins in proportion to this, it was confirmed that the level of Glu-B3 traits did not increase even if the level of the offrimil extract.
  • FIGS. 1A to 1C summarize the results of the present invention, because the off-mill is provided with Glu-B3 traits of LMW-GS, which is a major cause of gluten intolerance, and thus, the off-rimil is gluten-resistant It can be seen that the person representing the can be used in the manufacture of bakery products that can eat without side effects.
  • the precipitate was mixed with 1 ml of 70% ethanol aqueous solution and reacted at the same temperature for 12 hours, followed by centrifugation at 20 ° C. 15000 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was stored at 20 ° C.
  • Samples are injected 10 ⁇ l for analysis and solvent B is made up from 25% to 50% for 70 minutes at 1 ml / min.
  • the column temperature is maintained at 65 ° C. and the sample temperature at 15 ° C.
  • the analyzed sample was observed at 210 nm.
  • Figure 5 shows the results of analyzing the gliadin fractions of Geumgang, Allgmil and Oprimil by RP-HPLC. 5, unlike Geumgang and Allgmil, it can be confirmed that the omega-5 gliadin is deleted in Oprimil.
  • MS / MS analysis (Dupont, FM, Vensel, WH, Tanaka, CK, Hurkman II, WJ, Altenbach, SB 2011. Deciphering the complexities of the wheat flour proteome using quantitative two-dimensional electrophoresis, three proteases and tandem mass spectrometry. Proteome Science.9 (10) available: http: //www.proteomesci.com/content/9/1/10.) Each spot uses three proteases (trypsin, chymotrypsin, and thermolysine) to maximize the coverage of the amino acid sequence. In FIG. 6, NCBI protein accession numbers of the result of identifying each spot are shown.
  • Omega-5 gliadin (BAE20328) and i-type LMW-GS (AAS10189) were found in kumgang wheat, and omega-5 gliadin (BAE20328, AII26682) and i-type LMW-GS (AGM38903) in allgmil. , ACY08811) and s-type LMW-GS (ACY08813).
  • 2-DE total protein was transferred to nitrocellulose membrane. The serum of this patient was used for immuno-blotting.
  • MS / MS analysis (Dupont, FM, Vensel, WH, Tanaka, CK, Hurkman II, WJ, Altenbach, SB 2011. Deciphering the complexities of the wheat flour proteome using quantitative two-dimensional electrophoresis, three proteases and tandem mass spectrometry. Proteome Science.9 (10) available: http: //www.proteomesci.com/content/9/1/10.) Each spot uses three proteases (trypsin, chymotrypsin, and thermolysine) to maximize the coverage of the amino acid sequence. In FIG. 7, NCBI protein accession numbers indicating the results of identification of each spot are shown. After 2-DE, total protein was transferred to nitrocellulose membrane. Antibodies were made using RLLSPRGKELG, a specific sequence of omega-5 gliadin, and immuno-blotting was performed using the antibodies.
  • omega-5 gliadin BAE20328, AII26682
  • i-type LMW-GS AGM38903, ACY08811
  • s-type LMW-GS ACY08813, ACA63868, AEI00677
  • m-type LMW-GS AGK83389, ACP27643
  • the present inventors deposited the OPRILLI with the deposit number KACC88001BP dated October 22, 2015 to KACC (Korean Agricultural Culture Collection), National Institute of Agricultural Science, Iseo-myeon, Wanseo-gun, Jeollabuk-do.
  • Example 1 Investigation criteria for agricultural science and technology research (Rural Development Administration, 2012) and new varieties of various characteristics, such as the intrinsic characteristics, agricultural quality, quantity composition, disease resistance, quality characteristics, baking suitability, etc. developed in Example 1 The characteristics of each crop were assessed according to the National Research Center for Agriculture and Seeds (2000), and the results were compared with those of the parents' wheat, Geumgang wheat and all-grain wheat.
  • oprimil The intrinsic characteristics of oprimil, such as hair growth rate, cold resistance, growth level, leaf color, form, strait and uniformity, were evaluated (Table 2).
  • the intrinsic properties of oprimil was generally similar to kumgang wheat and all-glumil, but the leaf color is similar to all-glumil, and the form is confirmed to be similar to the kumgang wheat.
  • the extract and maturation period of the off-rimil was similar to the kumgang wheat and all-glumil, but the soy sauce is the same as the all-glumil, and the head is similar to the kumgang wheat.
  • the number of ears per unit area, the number of grains per head, the grain weight, the weight in liters, and the number of units per unit area were evaluated.
  • the number of grains per ear of Opry Mill is similar to that of Geummil or Allgmil, but the number of heads per unit area is significantly lower than that of Geummil or Allgmil.
  • the levels were significantly lower than wheat or olglumil.
  • it showed a high level compared to Geumgang wheat or all-glumil, and the liters of the medium level between Geumgang wheat and all-glumil, and it was confirmed that some of the superiority in terms of quality compared to Geumgang or all-Gamil.
  • the disease resistance of Oprimil was found to be the same as the disease resistance of all-glumil.
  • Example 3-5 Quality characteristics related to baking
  • the baking properties, dough properties and baking suitability of the bakery were evaluated.
  • the harvested oprimill was applied to a Buhler Mill to obtain a powder, which was then aged for 1 month, and then the milling ratio, ash content and color were evaluated (Table 6).
  • the ash content was measured using AACC method (2000) 08-01, and chromaticity was measured by using Minolta JS-555 (Minolta Camera Co., Ltd, Japan) to measure the whiteness, redness and yellowness, respectively. Shown as CIE-LAB L * (whiteness).
  • the milling ratio, ash and flour color of the oprimill powder generally showed the median value between the kumgang mill powder and the all-glumil powder, but it was confirmed that it was similar to the value of the kumgang mill rather than the all-glumil. However, L value was lower than that of Geumgang Mill and All-Grumille.
  • the total protein content, the gluten content and the settling value of the oprymill powder obtained in Examples 3-5-1 were measured, and a dough was obtained using the oprymill powder, and then the amount of water, Dough characteristics such as kneading time and stability were measured (Table 7).
  • total protein and gluten content were measured using AACC method (2000) 46-30; Settle 3 g (14% water content) of the flour into a 100 ml cylinder, add 50 ml of 0.0004% bromophenol blue solution, shake it well for 2 seconds at 2 minute intervals for 15 seconds, and then contain 12.5% lactic acid.
  • the protein content, the gluten content, the settling value, and the kneading characteristics of the oprimil powder showed the median value between the kumgang wheat powder and the all-glumil powder, and were similar to the values of the kumgang wheat rather than the all-glumil. Confirmed. However, in the case of the hydrolyzate, the same as the value of the Geumgang mill showed the characteristics as a strong powder, while in the case of the kneading time it was confirmed that the characteristics similar to the gravity component.
  • Example The bread was prepared using the oprimil powder obtained in Example 3-5-1, and the bread volume and the inner hardness of the bread, which are representative baking aptitudes of the prepared bread, were measured (Table 8). At this time, the bread volume was measured by Loaf volumeter (National Mfg. Co., USA) immediately after baking in the oven, and the hardness of the bread was cooled by cooling the bread at room temperature for 2 hours, and cut the center of bread into 2.0 cm thick. Next, using a texture analyzer, a plastic plunger of 2.5 cm diameter was measured at 25% strain of bread thickness and a speed of 1.0 mm / sec.
  • Loaf volumeter National Mfg. Co., USA
  • the bread volume and inner hardness of the bread made of the powder of Opry Mill showed the median value of the Kumgang wheat bread and all-grain wheat bread, and was evaluated as being bulky and soft than the all-glumil bread.
  • Figure 8 shows the extractors (A), grains (B) and slices of bread (C) for each of the Opry Mill (DH20), Geumgang Mill, and Al Grumil.
  • Oprimil cookie was prepared in the following manner.

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Abstract

본 발명은 금강밀과 올그루밀을 교배하여 제조되고, 글루텐불내성을 나타내는 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)을 나타내는 주요 인자인 오메가 5-글리아딘(omega 5-gliadin) 유전자가 결실된 신규한 밀 품종인 오프리, 상기 밀품종을 이용하여 품종개량하는 방법, 상기 밀품종으로부터 유래된 밀가루, 상기 밀가루를 이용하여 가공식품을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 가공식품에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 오프리밀은 글루텐불내성으로 인한 셀리악병의 발병 및 을 밀 의존성 운동 유발성 과민증 예방할 수 있는 가공식품의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증의 개선 및 예방용 밀
본 발명은 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)의 개선 또는 예방용 신규 밀 품종 및 이의 이용에 대한 것이다.
셀리악병(celiac diseasece)은 글루텐불내성으로 인하여 밀, 보리, 호밀, 귀리 등의 곡물에 함유되어 있는 글루텐(gluten) 성분의 소화장애로 발생하는 소화기관의 장(腸)질환이다. 대부분의 사람들은 아무런 문제없이 글루텐을 소화하고 흡수시키지만, 글루텐 소화에 문제가 있는 사람들은 위장관에서 면역반응을 유발하여 소화기관의 점막세포에 염증과 융모(villi)를 손상시킴에 따라 영양분을 쉽게 흡수할 수 없는 상태가 되어 성장지연, 식욕저하, 만성설사, 복부팽창, 포진성 피부염, 철분결핍으로 인한 빈혈 등 다양한 증상을 일으키고 이로 인한 영양분의 흡수불량은 결국 심각한 질병을 유발시키는 원인으로 작용한다. 즉, 글루텐을 분해하는 효소가 선천적으로 없거나 부족한 사람이 섭취하게 되면 글루텐이 덩어리진 상태로 장에 흡수되는데 이때 장기능의 저하로 점막 융모가 위축되고 손상이 일어나 흡수장애가 생겨 알러지 반응이나 호르몬 교란 등을 일으키기 때문이다.
이처럼 셀리악병의 발병원인이 되는 글루텐은 단량체 분자인 글리아딘과 복합 중합체 형태인 글루테닌으로 구성된 단백질로 알려져 있는데, 상기 글루테닌은 이황화 결합으로 연결된 고분자량 구성요소(HMW-GS)와 저분자량 구성요소(LMW-GS)으로 구성된다. 대체로 글루텐은 밀제품의 제조에 필요한 특성을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 상기 글루텐을 구성하는 글리아딘은 밀가루 반죽에서 나타나는 점성의 원인이 되고, 글루테닌은 밀가루 반죽에서 나타나는 탄성과 인성의 원인이 된다.
글리아딘은 밀 글루텐의 주요 구성 성분이며, 전체 저장단백질의 40-50% 차지한다. 대부분의 글리아딘이 단량체로 존재하고 글리아딘은 낮은 pH의 A-PAGE(Acid-PAGE)나 SDS-PAGE의 이동성에 따라 ω5-, ω1,2-, α-/β-, γ-글리아딘 4그룹으로 나뉘며 분자량은 30-75 kDa정도이다. γ-, ω-글리아딘은 1번 염색체의 단완에 존재하며 Gli-A1, Gli-B1 및 Gli-D1에 의해 암호화되고, α-/β-글리아딘은 6번 염색체의 단완에 존재하며 Gli-A2, Gli-B2 및 Gli-D2로 암호화 된다. 전체 글리아딘 단백질 중 α-/β- 및 γ-글리아딘이 메이져 단백질로 구성되고, 각각 28-33% 및 23-31%를 차지한다. ω-글리아딘은 훨씬 적으며, ω-1,2글리아딘은 4-7%, ω-5글리아딘은 3-6%를 차지한다.
이들 ω5-글리아딘은 심각한 음식 알러지인 밀 의존성 운동 유발성 과민증 (wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WDEIA) 의 중심 항원이라고 알려져 있고, 심한 경우 사망에 이르게 한다.
국내에서도 밀 알러지 환자가 증가하고 글루텐 프리 시장이 폭발적으로 증가함에 따라 밀 알러지 또는 셀리악 병의 주요 원인이 되는 ω5-글리아딘, ω1,2-글리아딘, 알파/베타 글리아딘 또는 감마 글리아딘 군 (群)이 결손된 알러지 저감 밀 (Hypo-allergenic wheat) 계통을 찾는 시도가 진행되고 있으며, 본 연구팀에서 일부 글루텐 단백질이 결손된 계통을 찾아 동정 중에 있다.
현재까지 고분자 및 저분자 글루테닌에 대한 유전자좌 및 이들과 밀 품질에 관련 연구는 많은 진전이 있었지만, 이들 보다 복잡하고 어려운 글리아딘은 일부 알러지 및 기본적인 물성 연구 외에는 미미한 실정이다.
이에 본 발명자들은 글루텐 알러지 및 밀 알러지 저감용 밀품종에 대한 연구를 계속하여 WDEIA의 중심 항원인 오메가 5 글리아딘(omega-5 gliadin의) 및 글루텐불내성을 나타내는 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질 모두 결실된 밀 품종을 개발하고 본 발명에 이르렀다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
Matsuo H, Morita E, Tatham AS, Morimoto K, Horikawa T, Osuna H, Ikezawa Z, Kaneko S, Kohno K, Dekio S. 2004. Identification of the IgE-binding epitope in ω-5 gliadin, a major allergen in wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis. J Biol Chem 279: 12135 12140.
본 발명의 하나의 목적은 글루텐불내성 및/또는 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)의 원인 유전자가 결실된 신규한 밀 품종을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 밀 품종을 부본 또는 모본으로 사용하여 교배하는 단계를 포함하는 밀의 품종개량방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 밀 품종으로부터 유래된 밀가루를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 밀가루를 가공하는 단계를 포함하는 가공식품의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 가공식품을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 글루텐 및 글리아딘을 손상시켜서, 셀리악병 및 의 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA) 발병 원인을 제거할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 금강밀과 올그루밀을 교배시켜서 글루텐불내성을 나타내는 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)의 원인인 오메가-5 글리아딘(omega-5 gliadin) 유전자가 모두 결실된 신규한 밀 품종을 개발하였다. 상기 신규한 밀 품종은 유전적으로는 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및/또는 오메가-5 글리아딘(omega-5 gliadin) 유전자가 결실되었다는 점에서 금강밀 또는 올그루밀과 구별되지만, 그 외 고유특성, 농업형질, 수량특성, 병해저항성 및 제빵관련 품질특성은 금강밀 또는 올그루밀과 유사한 수준을 나타내거나 또는 금강밀과 올그루밀의 중간값을 나타냄을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 상기 신규한 밀 품종을 "오프리"라 명명하고, 전라북도 완주군 이서면 혁신로 소재 국립농업과학원 KACC(Korean Agricultural Culture Collection)에 2015년 10월 22일자 기탁번호 KACC88001BP로 기탁하였다. 본 발명에서 제공하는 오프리밀과 같이 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및/또는 오메가-5 글리아딘(omega-5 gliadin) 유전자가 모두 결실된 밀 품종은 지금까지 전혀 개발되거나 보고된바 없으며, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 저분자 글루테닌 구성인자(Low Molecular Weight Glutenin Subunit, LMW-GS)의 Glu-B3 형질 및/또는 오메가-5 글리아딘(omega-5 gliadin) 유전자가 결실되고, 기탁번호 KACC88001BP로 기탁된 신규한 밀 품종을 제공한다.
본 발명의 용어 "저분자 글루테닌 구성인자(Low Molecular Weight Glutenin Subunit, LMW-GS)"란, 글루테닌을 구성하는 구성인자 중에서 36 내지 44 kDa의 상대적으로 적은 분자량을 갖는 구성요소를 의미한다. 상기 LMW-GS을 코딩하는 유전자는 밀의 1번 염색체에 존재하는 Glu-3 좌위에 위치한 Glu-A3, Glu-B3 및 Glu-D3 유전자이며, 이들 유전자의 유전형에 따라 세분될 수 있는데, 이들 3가지 유전자의 유전형의 조합에 의하여 밀가루의 다양한 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "글루테닌(glutenin)"이란, 18개의 아미노산으로 구성되고, 곁가지 사이의 상호작용으로 생긴 다리결합 때문에 공모양을 하고 있는 구형단백질의 형태를 갖으며, 밀을 비롯한 다양한 곡물에 존재하는 비교적 단순한 단백질인 글루텔린(glutelin) 류에 속하는 단백질을 의미한다. 상기 글루테닌은 96 내지 136 kDa의 크기를 갖는 고분자 글루테닌 구성인자(High Molecular Weight Glutenin Subunit, HMW-GS)와 상기 LMW-GS가 이황화결합에 의해 결합된 형태로 구성되는데, 3종의 HMW-GS(Glu-A1, Glu-B1 및 Glu-D1)와 3종의 LMW-GS(Glu-A3, Glu-B3 및 Glu-D3)의 조합에 의하여 다양한 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 용어 "글리아딘"이란, 밀 글루텐의 주요 구성 성분이며, 전체 저장단백질의 40-50% 차지한다. 대부분의 글리아딘이 단량체로 존재하고 글리아딘은 낮은 pH의 A-PAGE(Acid-PAGE)나 SDS-PAGE의 이동성에 따라 ω5-, ω1,2-, α-/β-, γ-글리아딘 4그룹으로 나뉘며 분자량은 30-75 kDa정도이다. γ-, ω-글리아딘은 1번 염색체의 단완에 존재하며 Gli-A1, Gli-B1 및 Gli-D1에 의해 암호화되고, α-/β-글리아딘은 6번 염색체의 단완에 존재하며 Gli-A2, Gli-B2 및 Gli-D2로 암호화 된다. 전체 글리아딘 단백질 중 α-/β- 및 γ-글리아딘이 메이져 단백질로 구성되고, 각각 28-33% 및 23-31%를 차지한다. ω-글리아딘은 훨씬 적으며, ω-1,2 글리아딘은 4-7%, ω-5 글리아딘은 3-6%를 차지한다.
상기 오메가 5-글리아딘은 심각한 음식 알러지인 밀 의존성 운동 유발성 과민증 (wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WDEIA) 의 중심 항원이라고 알려져 있다.
본 발명의 용어 “밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)”는 밀이 들어간 음식을 섭취 후 물리적인 운동을 했을 때 발생하며, 주로 성인들에서 발병한다고 알려져 있다. WDEIA 환자들의 혈청 immunoglobulin E (IgE)와 결합하는 주된 항원결정기(predominant epitope)는 오메가 5-글리아딘으로 알려져 있다.
본 발명의 신규 밀 품종인 오프리는 WEDIA의 주요 중심 항원인 오메가 5-글리아딘이 없으므로, WEDIA의 개선 및/또는 예방이 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 오프리 밀 품종을 섭취하여 글루텐불내성 및 WEDIA를 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 오프리 밀 품종은 글루텐불내성을 나타내는 Glu-B3 형질 및 WEDIA를 유발시키는 항원인 오메가 5-글리아딘이 없는데, 이는 알러지의 원인물질이 아예 없는 것이므로 글루텐불내성으로 발명하는 셀리악병 및 WEDIA 질환의 예방도 가능하다.
본 명세서에서 상기 "개선"이란, 글루텐불내성 및 WEDIA의 정도를 낮추어주거나 완화시키는 용도를 포함하는 것이다. 구체적으로, 이미 발생한 셀리악병 및 WEDIA 질환의 정도를 낮추어주거나 완화시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 금강밀과 올그루밀을 교배시켜서 글루텐불내성을 나타내는 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및/또는 오메가-5 글리아딘(omega-5 gliadin) 유전자가 결실된 신규한 밀 품종을 개발하고, 이를 "오프리"라 명명하였으며, KACC(Korean Agricultural Culture Collection)에 2015년 10월 22일자 기탁번호 KACC88001BP로 기탁하였다. 따라서, 본 발명에 있어서, "오프리밀", "오프리", "신규한 밀 품종" 등의 표현은 실질적으로 동일한 밀 품종을 나타내는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 신규한 밀 품종은 그의 특성면에서 부모 밀인 금강밀 또는 올그루밀과 유사한 수준을 나타내거나 또는 금강밀과 올그루밀의 중간값을 나타낸다. 예를 들어, 잎의 엽색과 간장, 병해저항성 등은 올그루밀과 동일 또는 유사하고, 잎의 초형과 수장은 금강밀과 동일 또는 유사한 반면, 제빵관련 품질특성인 제분율, 회분함량, 밀가루 색도, 단백질 함량, 글루텐 함량, 침전가, 반죽특성, 식빵부피, 속질경도 등은 금강밀과 올그루밀의 중간값을 나타내었다. 다만, 수량특성은 금강밀 또는 올그루밀보다도 낮은 수준을 나타내고, 천립중의 경우에는 금강밀 또는 올그루밀보다도 높은 수준을 나타내었다.
본 발명의 일실시예에 의하면, 금강밀과 올그루밀을 교배하여 내한성이 강하고, 초형과 수형이 양호한 특성을 나타내는 신규한 밀 품종인 오프리밀을 개발하고(도 1), 상기 오프리밀의 유전적 특성을 분석한 결과 글루텐불내성을 나타내는 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)의 원인인 오메가-5 글리아딘 유전자가 결실되어 발현되지 않음을 확인하였다(표 1, 도 2a 내지 2c 및 도 3 내지 도 7),
또한, 오프리밀의 고유특성인 입모율, 내한성, 생육수준, 엽색, 초형, 지협 및 균일도를 평가한 결과 대체로 금강밀 및 올그루밀과 유사하였으나, 엽색은 올그루밀과 유사하고, 초형은 금강밀과 유사함을 확인하였다(표 2).
다음으로, 오프리밀의 농업형질인 출수기, 성숙기, 간장 및 수장을 평가한 결과 출수기와 성숙기는 대체로 금강밀 및 올그루밀과 유사하였으나, 간장은 올그루밀과 동일하고, 수장은 금강밀과 유사함을 확인하였다(표 3).
다음으로, 오프리밀의 수량특성인 단위면적당 이삭수, 1이삭당 립수, 천립중, 리터중 및 단위면적당 수량을 평가한 결과 단위면적당 수량이 금강밀 또는 올그루밀에 비하여 현저히 낮은 수준을 나타내었으나, 천립중의 경우에는 금강밀 또는 올그루밀에 비하여 높은 수준을 나타내었고, 리터중은 금강밀과 올그루밀의 중간수준을 나타내어, 품질면에서는 금강밀 또는 올그루밀에 비하여 일부 우수함을 확인하였다(표 4).
아울러, 오프리밀의 병해저항성을 평가하기 위하여, 붉은곰파이병, 바이러스 감염, 흰가루병 및 잎집눈무늬병에 대한 저항성을 측정한 결과 올그루밀의 병해저항성과 동일한 수준을 나타냄을 확인하였다(표 5).
끝으로, 오프리밀의 제빵관련 품질특성을 평가한 결과 오프리밀 분말의 제분율, 회분 및 밀가루 색도는 대체로 금강밀 분말과 올그루밀 분말의 중간값을 나타내었으나, 올그루밀 보다는 금강밀의 값과 유사함을 확인하였고(표 6), 오프리밀 분말의 단백질 함량, 글루텐 함량, 침전가 및 반죽특성은 대체로 금강밀 분말과 올그루밀 분말의 중간값을 나타내었고, 올그루밀 보다는 금강밀의 값과 유사함을 확인하였으며(표 7), 오프리밀의 분말로 제조된 식빵의 식빵부피와 속질경도는 금강밀 식빵 및 올그루밀 식빵의 중간값을 나타내어, 올그루밀 식빵보다 부피가 크고 부드러운 것으로 평가되었다(표 8).
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 밀 품종을 부본 또는 모본으로 사용하여 다른 밀 품종과 교배시키는 단계를 포함하는 글루텐불내성 및/또는 밀 의존성 운동 유발성 과민증(WDEIA)을 개선 또는 예방할 수 있는 밀 품종의 개량방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 오프리는 글루텐불내성을 나타내는 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및/또는 밀 의존성 운동 유발성 과민증(WDEIA)의 원인인 오메가 5-글리아딘(omega 5-gliadin) 유전자가 결실된 밀 품종으로, 상기 오프리를 부본 또는 모본으로 사용하여 다른 밀 품종과 교배시키면, Glu-B3 형질 및 오메가 5-글리아딘(omega 5-gliadin) 유전자 뿐만 아니라 다른 형질이 결실된 품종이 개발될 수 있으며, 이처럼 개발된 품종은 오프리 보다도 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증의 발생을 더욱 효과적으로 예방할 수 있을 것이다. 이때, 사용될 수 있는 다른 밀 품종은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 조경밀, 조품밀, 백중밀, 고소밀 등이 될 수 있다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 오프리는 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 더욱 효과적으로 예방할 수 있는 새로운 품종의 개발에 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 상기 밀 품종으로부터 유래된 밀가루, 상기 밀가루를 가공하는 단계를 포함하는 가공식품의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 가공식품을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 신규한 밀 품종인 오프리는 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및 오메가 5-글리아딘(omega 5-gliadin) 유전자가 결실되어 글루텐불내성 및/또는 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 예방할 수 있으므로, 상기 오프리로부터 유래된 밀가루는 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 예방할 수 있는 가공식품의 원료로서 사용될 수 있고, 상기 밀가루를 이용하여 제조된 가공식품은 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 예방할 수 있는 기능성 식품으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 글루텐불내성 및/또는 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 예방할 수 있는 가공식품의 제조방법은 (a) 상기 신규한 밀 품종을 분쇄하여 밀가루를 수득하는 단계; (b) 상기 밀가루를 포함하는 반죽물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 반죽물을 가공하는 단계를 포함한다.
상기 가공식품의 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 밀가루는 상기 신규한 밀 품종을 단독으로 사용하여 수득하거나 또는 상기 신규한 밀 품종과 다른 밀 품종의 혼합물을 사용하여 수득할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 신규한 밀 품종으로부터 수득한 밀가루는 단독으로 사용하여도 모든 가공식품을 제조할 수 있을 정도의 물성을 나타낼 수 없으므로, 가공식품의 제조에 적합한 물성을 나타낼 수 있도록 다른 밀 품종으로부터 수득한 밀가루와 혼합하여 사용할 수 있다.
이처럼, 상기 신규한 밀 품종유래 밀가루와 다른 밀 품종유래 밀가루의 혼합물에 포함된 신규한 밀 품종유래 밀가루의 함량은 글루텐불내성, 셀리악병 및 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증의 발병을 예방할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 50 내지 99%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 60 내지 80%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서 65 내지 70%(v/v)가 될 수 있다. 또한, 상기 혼합물에 포함되는 다른 밀 품종 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 금강밀, 올그루밀, 조경밀, 조품밀, 백중밀, 고소밀 등이 될 수 있다.
상기 가공식품의 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 반죽물은 당업계에 공지된 방법에 의하여 수득할 수 있는데, 밀가루를 포함하는 다양한 가공식품의 특성에 따라, 이에 포함되는 수분함량, 첨가물 및 그의 함량, 숙성여부 및 숙성시간 등의 요인을 변화시켜서 수득할 수 있다.
상기 가공식품의 제조방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 가공은 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 쿠키, 과자 등의 가공식품을 제조하기 위하여는 상기 반죽물을 단시간내에 열처리하는 방법에 의해 가공될 수 있고, 면류 등의 가공식품을 제조하기 위하여는 상기 반죽물을 늘려서 면대를 형성하고, 이를 건조시키는 방법에 의해 가공될 수 있으며, 빵류 등의 가공식품을 제조하기 위하여는 상기 반죽물을 중온으로 열처리한 후 다시 고온으로 열처리하는 방법에 의해 가공될 수 있다.
상기 제조방법에 의하여 제조된 가공식품은, 본 발명에서 제공하는 신규한 밀 품종에 의해 나타나는 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및/또는 오메가 5 글리아딘 유전자가 결실된 특성을 반영하여 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증을 예방할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 빵류, 면류, 과자류 등이 될 수 있다.
일반적으로, 글루텐을 분해하는 효소가 선천적으로 없거나 부족한 사람은 빵을 섭취할 경우, 분해되지 않은 글루텐이 덩어리진 상태로 장에 흡수되는 글루텐불내성(gluten intolerance)으로 인하여, 장기능의 저하로 점막 융모가 위축되고 손상이 일어나 흡수장애가 생겨 알러지 반응이나 호르몬 교란 등을 일으키기는 셀리악병이 발병될 수 있다. 그러나, 본 발명에서 제공하는 신규한 밀 품종은 글루텐불내성의 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질이 결실되었으므로, 상기 밀 품종의 분말을 주재로 하여 제조된 가공식품은 글루텐을 분해하는 효소가 선천적으로 없거나 부족한 사람이 섭취하여도, 글루텐불내성을 유발시키지 않아, 셀리악병의 발병을 예방할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 오프리밀은 글루텐불내성을 나타내는 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질 및/또는 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)의 원인이 되는 오메가 5-글리아딘(omega 5-gliadin) 유전자가 결실된 품종으로, 글루텐불내성으로 인한 셀리악병의 발병 및/또는 밀 의존성 운동 유발성 과민증(wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis; WEDIA)을 예방할 수 있는 가공식품의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 오프리밀의 품종개발과정을 나타내는 계보도이다.
도 2a는 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 Glu-B3 형질 관련 유전자의 PCR 증폭결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 2b는 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 HMW-GS 및 LMW-GS 관련 단백질을 나타내는 전기영동사진이다.
도 2c는 다양한 수준의 오프리밀 추출물의 LMW-GS 관련 단백질을 나타내는 전기영동사진이다.
도 3은 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 글리아딘 분획을 SDS-PAGE로 분석하여 오메가-5 글리아딘 단백질을 검출한 결과를 나타내는 전기영동 사진으로서, 1번 레인은 금강밀, 2번 레인은 올그루밀 및 3번 레인은 오프리밀을 각각 나타낸다.
도 4는 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 글루테닌 분획을 A-PAGE로 분석하여 오메가-5 글리아딘 단백질을 검출한 결과를 나타내는 전기영동 사진으로서, 1번 레인은 오프리, 2번 레인은 금강밀 및 3번 레인은 올그루밀을 각각 나타낸다.
도 5는 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 글리아딘 분획을 RP-HPLC로 분석한 결과를 나타내며, 위에서부터 순서적으로 금강밀, 올그루밀 및 오프리 밀을 나타낸다.
도 6은 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 오메가-5 글리아딘 특이 항체의 이뮤노블랏팅(immuno-blotting) 결과이다.
도 7은 금강밀, 올그루밀, 오프리밀 (DH20) 및 Butte86의 종자 총 저장단백질 분획을 이차원전기영동을 하고, WDEIA 환자의 혈청 을 이용하여 이뮤노블랏팅(immuno-blotting)을 수행한 결과 및 WDEIA 환자의 이뮤노블랏팅 사진 위에 MS/MS 단백질 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 오프리밀(DH20), 금강밀, 올그루밀 각각의 출수기(A), 낟알(B) 및 식빵 조각(C) 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규 품종의 개발
금강밀과 올그루밀을 인공교배하여 자손밀(F1)을 수득하고, 상기 F1을 대상으로 멕시코 CIMMYT 연구소에서 반수체 배양을 실시하고, 이를 익산에서 4년동안 생산력 검정을 수행하여, 내한성이 강하고, 초형과 수형이 양호한 특성을 나타내는 신규한 밀 품종을 최종 개발하고, 이를 "오프리"라 명명하였다(도 1).
도 1은 오프리밀의 품종개발과정을 나타내는 계보도이다.
실시예 2: 오프리밀의 유전형 규명
실시예 2-1 Glu -B3 형질을 나타내는 유전자의 결실 확인
상기 실시예 1에서 개발된 오프리밀의 유전적 특성을 글루텐의 HMW-GS(High Molecular Weight Glutenin Subunit)의 구성요소인 Glu-1 및 LMW-GS(Low Molecular Weight Glutenin Subunit)의 구성요소인 Glu-3의 발현수준의 관점에서 규명하였다.
대략적으로, SolGent사(Korea)의 Genomic DNA extraction Kit for plant를 사용하여, 상기 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 어린잎으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 이어, 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기의 Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1, Glu-A3, Glu-B3 또는 Glu-D3를 검출할 수 있는 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, 상기 오프리밀에 포함된 Glu-1과 Glu-3의 유전적 조성을 확인하였다(표 1).
Glu-A1ab F: 5'-AAGACAAGGGGAGCAAGGT-3'(서열번호 1)
Glu-A1ab R: 5'-GTGCTCCGCGCTAACATG-3'(서열번호 2)
Glu-A1c F: 5'-ACGTTCCCCTACAGGTACTA-3'(서열번호 3)
Glu-A1c R: 5'-TATCACTGGCTAGCCGACAA-3'(서열번호 4)
Glu-B1bcf F: 5'-TTCTCTGCATCAGTCAGGA-3'(서열번호 5)
Glu-B1bcf R: 5'-AGAGAAGCTGTGTAATGCC-3'(서열번호 6)
Glu-D1d F: 5'-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3'(서열번호 7)
Glu-D1d R: 5'-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3'(서열번호 8)
Glu-D1adf F: 5'-TTTGGGGAATACCTGCACTACTAAAAAGGT-3'(서열번호 9)
Glu-D1adf F: 5'-AAAAGGTATTACCCAAGTGTAACTTGTCCG-3'(서열번호 10)
Glu-D1adf R: 5'-AATTGTCCTGGCTGCAGCTGCGA-3'(서열번호 11)
Glu-A3a F: 5'-AAACAGAATTATTAAAGCCGG-3'(서열번호 12)
Glu-A3a R: 5'-GGTTGTTGTTGTTGCAGCA-3'(서열번호 13)
Glu-A3b F: 5'-TTCAGATGCAGCCAAACAA-3'(서열번호 14)
Glu-A3b R: 5'-GCTGTGCTTGGATGATACTCTA-3'(서열번호 15)
Glu-A3ac F: 5'-AACAGAATTATTAAAGCCGG-3'(서열번호 16)
Glu-A3ac R: 5'-CTGTGCTTGGATGATACTCTA-3'(서열번호 17)
Glu-A3d F: 5'-TTCAGATGCAGCCAAACAA-3'(서열번호 18)
Glu-A3d R: 5'-TGGGGTTGGGAGACACATA-3'(서열번호 19)
Glu-A3e F: 5'-AAACAGAATTATTAAAGCCGG-3'(서열번호 20)
Glu-A3e R: 5'-GGCACAGACGAGGAAGGTT-3'(서열번호 21)
Glu-B3d F: 5'-CACCATGAAGACCTTCCTCA-3'(서열번호 22)
Glu-B3d R: 5'-GTTGTTGCAGTAGAACTGGA-3'(서열번호 23)
Glu-B3fg F: 5'-TATAGCTAGTGCAACCTACCAT-3'(서열번호 24)
Glu-B3fg R: 5'-CAACTACTCTGCCACAACG-3'(서열번호 25)
Glu-B3g F: 5'-CAAGAAATACTAGTTAACACTAGTC-3'(서열번호 26)
Glu-B3g R: 5'-GTTGGGGTTGGGAAACA-3'(서열번호 27)
Glu-B3h F: 5'-CCACCACAACAAACATTAA-3'(서열번호 28)
Glu-B3h R: 5'-GTGGTGGTTCTATACAACGA-3'(서열번호 29)
Glu-B3i F: 5'-TATAGCTAGTGCAACCTACCAT-3'(서열번호 30)
Glu-B3i R: 5'-TGGTTGTTGCGGTATAATTT-3'(서열번호 31)
Glu-D3ab F: 5'-TTGGGCCTAATCGCTCGC-3'(서열번호 32)
Glu-D3ab R: 5'-TAGTCTCCATCTGCGCAATT-3'(서열번호 33)
Glu-D3c F: 5'-CAGCTAAACCCATGCAAGC-3'(서열번호 34)
Glu-D3c R: 5'-CAATGGAAGTCATCACCTCAA-3'(서열번호 35)
Glu-1과 Glu-3의 유전적 조성
품종 및 계통 HMW-GS LMW-GS
Glu-A1 Glu-B1 Glu-D1 Glu-A3 Glu-B3 Glu-D3
금강밀올그루밀오프리밀 bbb bbb dff cdc hd aaa
상기 표 1에서 보듯이, 오프리밀이 나타내는 대부분의 형질은 금강밀과 올그루밀의 형질 중의 하나와 동일하지만, 예외적으로 Glu-B3 형질을 나타내는 유전자는 금강밀과 올그루밀의 것과 상이하였다(도 2a).
도 2a는 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 Glu-B3 형질 관련 유전자의 PCR 증폭결과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 2a에서 보듯이, 오프리밀에서는 Glu-B3 형질 관련 유전자가 검출되지 않음을 확인하였다.
이에, 상기 Glu-B3 형질을 단백질 수준에서 검출하고자 상기 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 어린잎의 추출물을 대상으로 SDS-PAGE를 수행하였다(도 2b)
도 2b는 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 HMW-GS 및 LMW-GS 관련 단백질을 나타내는 전기영동사진이다. 도 2b에서 보듯이, 단백질 수준에서도 오프리밀에서는 Glu-B3 형질이 검출되지 않음을 확인하였다.
또한, 도 2b의 결과가 SDS-PAGE에 적용하는 오프리밀의 추출물 양이 부족하여 나타나는 것인지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 오프리밀의 추출물을 다양한 수준으로 SDS-PAGE에 적용하였다(도 2c).
도 2c는 다양한 수준의 오프리밀 추출물의 LMW-GS 관련 단백질을 나타내는 전기영동사진이다. 도 2c에서 보듯이, 오프리밀 추출물의 수준이 증가할수록 이에 비례하여 다양한 단백질의 수준이 증가되었으나, 이처럼 오프리밀 추출물의 수준을 증가시켜도 Glu-B3 형질의 수준은 증가되지 않음을 확인하였다.
따라서, 상기 도 1a 내지 1c의 결과를 종합하면, 본 발명에서 제공하는 오프리밀은 글루텐불내성을 나타내는 주요 원인인 LMW-GS의 Glu-B3 형질이 결실된 품종이므로, 상기 오프리밀은 글루텐불내성을 나타내는 사람이 부작용없이 취식할 수 있는 제빵 제품의 제조에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-2 오프리밀의 오메가 5- 글리아딘 유전자 결실 확인
글리아딘 추출은 선행문헌(Dziuba M, Nałecz D, Szerszunowicz I, Waga J. 2014.Proteomic Analysis of Wheat α/A-and β-Gliadins. Czech J Food Sci 32: 437-442.)을 참고하였다. 미세하게 분쇄한 금강밀, 올그루밀, 오프리밀 100mg에 0.15M NaCl 수용액 1ml을 혼합하여 25℃ 에서 2시간 동안 반응시키고 20℃ 15000 x g에서 5분 동안 원심 분리 후 상등액을 제거하였다. 침전물에 70% 에탄올 수용액 1ml을 혼합하여 동일 온도로 12시간 동안 반응시킨 후에 20℃ 15000 x g에서 5분 동안 원심 분리하여 상등액을 20℃에 보관하였다.
SDS -PAGE 분석 및 결과
-20℃에 보관중인 글리아딘과 샘플 버퍼(50mM Tris-HCl pH6.8, 8% β-mercaptoethanol, 2% SDS, 20%glycerol)를 1:2의 비율로 섞어 제조하고 50ul를 12.5% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ) 젤에 로딩하여 70V로 13시간, 110V로 4시간 동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 commassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad) 용액으로 젤을 4시간 염색 하였고, 탈색용액(10% glacial acetic acid, 10% 메탄올, 80% 증류수)로 5시간 탈색시켜 형성된 단백질 밴드 패턴을 분석 하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 것과 같이, 오메가-5 글리아딘이 금강밀 그리고 올그루밀과 달리 오프리밀에서 결손된 것을 알 수 있다.
A-PAGE 분석 및 결과
미세하게 분쇄한 금강밀, 올그루밀, 오프리밀 100mg에 70% Ethanol 1ml을 혼합 25℃에서 1시간 교반하여 동일한 온도로 14000rpm에서 10분간 원심분리 후, 상등액 500㎕에 Glycerin과 1% Methyl violet 5 : 1의 비율로 섞은 용액을 250㎕ 혼합하였다.
12% gel solution(12% acrylamide, 0.6% Bis-acrylamide, 0.1% Ascorbic acid, 0.004% Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate, 0.25% Aluminum lacate, Lactic acid로 pH 3.1로 맞춤)에 글리아딘 10㎕씩 넣고 400V 5시간 로딩하였다. Coomassie brilliant blue R-250으로 3시간 염색하고 10% Acetic acid와 10% Methanol로 4시간 탈색하여 단백질 밴드 패턴을 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 것과 같이, 금강밀 그리고 올그루밀과 달리 오프리밀에서 오메가-5 글리아딘이 결손된 것을 다시 확인하였다.
RP- HPLC 분석 및 결과
미세하게 분쇄한 금강밀, 올그루밀, 오프리밀 100mg에 70% Ethanol 1ml 혼합하여 25℃에서 하루 동안 반응시키고 20℃ 15000 x g에서 5분 동안 원심 분리 후 상등액을 0.1% TFA in 20% ACN 300㎖로 녹여 PVDF Syring Filter(0.45㎛, Whatman)를 이용해 걸러냈다. HPLC는 Agilent ZORBAX 300SB-C18 column(300Å pore size, 5㎛ particle size, 4.6 x 250mm)을 이용해 Waters Alliance e2695 HPLC에 의해 분석하였다. 분석용 용매 A는 0.1% TFA in Water, 용매 B는 0.1% TFA in CAN, 용매 C와 D는 MeOH를 사용한다. 분석을 위해 샘플은 10㎕씩 주입하고, 용매B는 25%에서 50%으로 1ml/min 에서 70분 동안 구성된다. 컬럼 온도는 65 ℃, 샘플 온도는 15 ℃로 유지한다. 분석이 끝난 샘플은 210nm에서 관찰하였다.
도 5는 금강밀, 올그루밀 및 오프리밀의 글리아딘 분획을 RP-HPLC로 분석한 결과를 나타낸다. 도 5를 통해, 금강밀 그리고 올그루밀과는 달리 오프리밀에서는 오메가-5 글리아딘이 결손되었음을 확인할 수 있다.
오메가-5 글리아딘 특이 항체를 이용한 이뮤노블랏팅 ( immuno -blotting) 결과
토탈 단백질 추출, 이차원 전기영동, 이뮤노 블라팅 실험은 (Susan B. Altenbach et al. 2015. Journal of Agricultural and Food Chemistry DOI:10.1021)을 참고하였다. 미세하게 분쇄한 금강밀, 올그루밀, 오프리밀 100mg에 2% SDS sample buffer (2% SDS, 10% glycerol, 0.04 M Tris pH 8.5, 50 mM DTT)로 토탈 단백질을 추출한다. ampholyte pI 3-10와 capillary tube를 사용하여 manual IEF 실시하고 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel에 두 번째 전기영동을 실시하였다. 2-DE의 스팟들은 MS/MS로 단백질 동정을 실시하였다. MS/MS 분석은 (Dupont, F.M., Vensel, W.H., Tanaka, C.K., Hurkman II, W.J., Altenbach, S.B. 2011. Deciphering the complexities of the wheat flour proteome using quantitative two-dimensional electrophoresis, three proteases and tandem mass spectrometry. Proteome Science. 9(10) available:http://www.proteomesci.com/content/9/1/10.)의 방법대로 실시하였다. 각 스팟은 세가지 protease (트립신, 키모트립신, 써모리신)을 사용하여 최대한 아미노산 서열의 coverage를 높였다. 도 6에 각 스팟을 동정한 결과물의 NCBI protein accession 번호를 표시하였다. 금강밀에서는 오메가-5 글리아딘(BAE20328) 및 i-type LMW-GS(AAS10189)이 나타났고, 올그루밀에서는 오메가-5 글리아딘(BAE20328, AII26682), i-type LMW-GS(AGM38903, ACY08811) 및 s-type LMW-GS(ACY08813)이 나타났다. 2-DE 후에 토탈 단백질은 nitrocellulose membrane에 트랜서퍼하였다. 이 환자의 혈청을 이용 이뮤노블랏팅 (immuno-blotting)을 실시하였다.
도 6에 나타난 것과 같이, 오프리밀은 오메가-5 글리아딘 단백질이 생성되지 않음을 알 수 있다.
WDEIA 환자의 혈청을 이용한 이뮤노블랏팅 ( immuno -blotting) 분석 결과
토탈 단백질 추출, 이차원 전기영동, 이뮤노 블라팅 실험은 (Susan B. Altenbach et al. 2015. Journal of Agricultural and Food Chemistry DOI:10.1021)을 참고하였다. 미세하게 분쇄한 금강밀, 올그루밀, 오프리밀 100mg에 2% SDS sample buffer (2% SDS, 10% glycerol, 0.04 M Tris pH 8.5, 50 mM DTT)로 토탈 단백질을 추출한다. ampholyte pI 3-10와 capillary tube를 사용하여 manual IEF 실시하고 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel에 두 번째 전기영동을 실시하였다. 2-DE의 스팟들은 MS/MS로 단백질 동정을 실시하였다. MS/MS 분석은 (Dupont, F.M., Vensel, W.H., Tanaka, C.K., Hurkman II, W.J., Altenbach, S.B. 2011. Deciphering the complexities of the wheat flour proteome using quantitative two-dimensional electrophoresis, three proteases and tandem mass spectrometry. Proteome Science. 9(10) available:http://www.proteomesci.com/content/9/1/10.)의 방법대로 실시하였다. 각 스팟은 세가지 protease (트립신, 키모트립신, 써모리신)을 사용하여 최대한 아미노산 서열의 coverage를 높였다. 도 7에 각 스팟의 동정 결과인 NCBI protein accession 번호를 표시 하였다. 2-DE 후에 토탈 단백질은 nitrocellulose membrane에 트랜서퍼하였다. 오메가-5 글리아딘의 특이 서열인 RLLSPRGKELG을 이용하여 항체를 만들었고, 상기 항체을 이용하여 이뮤노블랏팅 (immuno-blotting)을 실시하였다.
금강밀, 올그루밀, 오프리밀(DH20) 및 Butte86의 종자 총 저장단백질 분획을 이차원전기영동을 하고, WDEIA 환자의 혈청(serum)을 이용하여 이뮤노블랏팅(immuno-blotting)을 수행하였다. 그리고 WDEIA 환자의 이뮤노블랏팅 사진 위에 MS/MS 단백질 결과를 나타내었다(도 7). 금강밀에서는 오메가-5 글리아딘(BAE20328), i-type LMW-GS(AAS10189), s-type LMW-GS(BAD12055, AEI00677) 및 m-type LMW-GS(AEI00671)이 나타났고, 올그루밀에서는 오메가-5 글리아딘(BAE20328, AII26682), i-type LMW-GS(AGM38903, ACY08811), s-type LMW-GS(ACY08813, ACA63868, AEI00677) 및 m-type LMW-GS(AGK83389, ACP27643)이 나타났다. 반면에 도 7에 나타난 것과 같이, WDEIA 환자는 오메가-5 글리아딘 부분에 항원-항체 반응이 없는 것을 확연히 알 수 있었다. 이에 따라 오프리밀(DH20)은 WDEIA 알러지 면역반응을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 오프리밀을 전라북도 완주군 이서면 혁신로 소재 국립농업과학원 KACC(Korean Agricultural Culture Collection)에 2015년 10월 22일자 기탁번호 KACC88001BP로 기탁하였다.
실시예 3: 오프리밀의 특성분석
상기 실시예 1에서 개발된 오프리밀의 고유특성, 농업형질, 수량구성, 병해저항성, 품질특성, 제빵적성 등의 다양한 특징을 농업과학기술 연구 조사 분석 기준(농촌진흥청, 2012)과 신품종 심사를 위한 작물별 특성조사요령(농림부 국립종자관리소, 2000)에 따라 평가하고, 그 결과를 부모세대의 밀인 금강밀 및 올그루밀의 특성과 비교하였다.
실시예 3-1: 고유특성
오프리밀의 고유특성인 입모율, 내한성, 생육수준, 엽색, 초형, 지협 및 균일도를 평가하였다(표 2).
오프리밀의 고유특성
품종 및 계통 입모율 내한성 생육 엽색 초형 지엽 균일도
금강밀올그루밀오프리밀 양호양호양호 333 양호양호양호 담녹연녹연녹 반직립반개장반직립 다소 늘어짐다소 늘어짐다소 늘어짐 양호양호양호
상기 표 2에서 보듯이, 오프리밀의 고유특성은 대체로 금강밀 및 올그루밀과 유사하였으나, 엽색은 올그루밀과 유사하고, 초형은 금강밀과 유사함을 확인하였다.
실시예 3-2: 농업형질
오프리밀의 농업형질인 출수기, 성숙기, 간장 및 수장을 평가하였다(표 3).
오프리밀의 농업형질
품종 및 계통 출수기(월.일) 성숙기(월.일) 간장(㎝) 수장(㎝)
금강밀올그루밀오프리밀 5.45.65.9 6.116.136.12 696666 9.48.69.2
상기 표 3에서 보듯이, 오프리밀의 출수기와 성숙기는 대체로 금강밀 및 올그루밀과 유사하였으나, 간장은 올그루밀과 동일하고, 수장은 금강밀과 유사함을 확인하였다.
실시예 3-3: 수량특성
오프리밀의 수량특성인 단위면적당 이삭수, 1이삭당 립수, 천립중, 리터중 및 단위면적당 수량을 평가하였다(표 4).
오프리밀의 수량특성
품종 및 계통 단위면적당 이삭수(/㎡) 1이삭당 립수 천립중(g) 리터중(g) 단위면적당 수량(kg/10a)
금강밀올그루밀오프리밀 1,041880622 353736 42.441.547.5 806815810 422485386
표 4에서 보듯이, 오프리밀의 1이삭당 립수는 금강밀 또는 올그루밀과 유사하지만, 단위면적당 이삭수는 금강밀 또는 올그루밀에 비하여 현저히 낮은 수준을 나타내어, 결과적으로는 단위면적당 수량이 금강밀 또는 올그루밀에 비하여 현저히 낮은 수준을 나타내었다. 그러나, 천립중의 경우에는 금강밀 또는 올그루밀에 비하여 높은 수준을 나타내었고, 리터중은 금강밀과 올그루밀의 중간수준을 나타내어, 품질면에서는 금강밀 또는 올그루밀에 비하여 일부 우수함을 확인하였다.
실시예 3-4: 병해저항성
오프리밀의 병해저항성을 평가하기 위하여, 붉은곰파이병, 바이러스 감염, 흰가루병 및 잎집눈무늬병에 대한 저항성을 측정하였다(표 5).
오프리밀의 병해저항성
품종 및 계통 붉은곰파이병(강,중,약) 바이러스(강,중,약) 흰가루병(강,중,약) 잎집눈무늬병(발생,없음)
금강밀올그루밀오프리밀 중약약약 중중강중강 중강중강중강 없음없음없음
상기 표 5에서 보듯이, 오프리밀의 병해저항성은 올그루밀의 병해저항성과 동일함을 알 수 있었다.
실시예 3-5: 제빵관련 품질특성
오프리밀의 제빵관련 특성인 제분특성, 반죽특성 및 제빵적성을 평가하였다.
실시예 3-5-1: 제분특성
수확한 오프리밀을 Buhler Mill에 적용하여 분말을 수득한 다음, 이를 1개월간 숙성시킨 후, 제분율, 회분함량 및 색도를 평가하였다(표 6). 이때, 회분함량은 AACC 방법(2000) 08-01을 이용하여 측정하였고, 색도는 Minolta JS-555 (Minolta Camera Co., Ltd, 일본)을 이용하여 백도, 적색도와 황색도를 측정하였으며, 이를 각각 CIE-LAB L*(백도)로 나타내었다.
오프리밀의 제분특성
품종 및 계통 제분율(%) 회분(%) 밀가루 색도
L a b
금강밀올그루밀오프리밀 72.5767.1971.50 0.460.400.44 91.6292.6591.55 2.101.532.00 9.217.898.72
상기 표 6에서 보듯이, 오프리밀 분말의 제분율, 회분 및 밀가루 색도는 대체로 금강밀 분말과 올그루밀 분말의 중간값을 나타내었으나, 올그루밀 보다는 금강밀의 값과 유사함을 확인하였다. 다만, L값은 금강밀 및 올그루밀에 비하여 낮은 수준을 나타내었다.
실시예 3-5-2: 반죽특성
상기 실시예 실시예 3-5-1에서 수득한 오프리밀 분말을 대상으로 총 단백질 함량, 글루텐 함량 및 침전가를 측정하고, 상기 오프리밀 분말을 이용하여 반죽물을 수득한 다음, 가수량, 반죽시간 및 안정도와 같은 반죽특성을 측정하였다(표 7). 이때, 총 단백질과 글루텐 함량은 AACC 방법(2000) 46-30을 이용하여 측정하고; 침전가는 밀가루 3 g(14% 수분함량 기준)을 100 ml 실린더에 넣고 50 ml의 0.0004% bromophenol blue 용액을 넣은 후 2분 간격으로 2회, 15초 동안 잘 흔들어 준 후, 12.5% lactic acid을 포함한 2% SDS (sodium dodecyl sulfate)용액 50 ml을 첨가한 후 2분, 4분과 6분 후에 15초간 잘 흔들고 20분간 방치한 후 침전물의 눈금을 측정하였으며; 반죽특성은 10 g mixograph (National Mfg. Co., 미국)를 이용한 AACC 방법 54-40A(2000)을 이용하여 측정하였다.
오프리밀의 반죽특성
품종 및 계통 단백질(%) 글루텐(%) 침전가(㎖) 반죽특성
가수량(%) 반죽시간(분.초) 안정도(㎜)
금강밀올그루밀오프리밀 15.6612.3514.78 15.1510.9513.60 70.0048.5066.00 67.0063.0067.00 4.002.303.15 18.0013.0016.00
상기 표 7에서 보듯이, 오프리밀 분말의 단백질 함량, 글루텐 함량, 침전가 및 반죽특성은 대체로 금강밀 분말과 올그루밀 분말의 중간값을 나타내었고, 올그루밀 보다는 금강밀의 값과 유사함을 확인하였다. 다만, 가수량의 경우에는 금강밀의 값과 동일하여 강력분으로서의 특성을 나타낸 반면, 반죽시간의 경우에는 중력분과 유사한 특성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 3-5-3: 제빵적성
상기 실시예 실시예 3-5-1에서 수득한 오프리밀 분말을 이용하여, 식빵을 제조하고, 제조된 식빵의 대표적인 제빵적성인 식빵부피와 속질경도를 측정하였다(표 8). 이때, 식빵부피는 오븐에서 구워낸 직후 Loaf volumeter (National Mfg. Co., USA)를 이용하여 측정하고, 속질경도는 식빵을 상온에서 2시간 동안 냉각시키고, 빵의 중심부를 2.0 cm 두께로 잘라 적출한 다음, Texture Analyser를 이용하여, 2.5 cm 직경의 플라스틱 plunger로 빵 두께의 25% strain, 1.0 mm/sec 속도로 측정하였다.
오프리밀의 제빵적성
품종 및 계통 식빵부피(㎖) 속질경도(N)
금강밀올그루밀오프리밀 900692793 2.605.042.53
상기 표 8에서 보듯이, 오프리밀의 분말로 제조된 식빵의 식빵부피와 속질경도는 금강밀 식빵 및 올그루밀 식빵의 중간값을 나타내어, 올그루밀 식빵보다 부피가 크고 부드러운 것으로 평가되었다.
도 8은 오프리밀(DH20), 금강밀, 올그루밀 각각의 출수기(A), 낟알(B) 및 식빵 조각(C)을 보여준다.
제조예 : 오프리밀로부터 얻은 밀가루를 이용한 쿠키 제조
다음과 같은 방법으로 오프리밀 쿠키를 제조하였다.
버터 150 g을 믹싱기에 넣어 부드럽게 풀어준 다음 설탕 100 g을 넣고 거품기로 균일하게 크림화하였다. 그 다음, 달걀 120 g을 넣어 혼합한 다음, 혼합밀가루(100 g 오프리밀가루와 통상의 박력분 300g), 30 g 아몬드분말, 코코아 24 g을 넣고 가볍게 혼합하여 전체 반죽을 완성시켰다.
전체 반죽물에 50 g 우유를 넣으면서 반죽의 되기를 조절하고 생크림 20 g을 넣어 두께 1 cm 크기로 일정하게 밀어 펴서 냉동실에 넣어 보관하고, 냉동고에서 냉동 반죽의 겉면에 흰자와 설탕을 도포하고 가로 x 세로=1 cm x 10 cm로 재단하여 팬닝한 다음 미리 예열된 오븐에서 윗불 190℃, 아랫불 165℃에서 15분간 구워 오프리밀쿠키를 제조하였다. 구운 쿠키들은 4시간 정도 실온에서 냉각하였다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
[수탁번호]
기탁기관명: 한국농업미생물자원센터
수탁번호 : KACC88001BP
수탁일자 : 20150921
Figure PCTKR2017006335-appb-I000001

Claims (13)

  1. 저분자 글루테닌 구성인자(Low Molecular Weight Glutenin Subunit, LMW-GS)의 Glu-B3 형질의 결실을 포함하는, 기탁번호 KACC88001BP로 기탁된 밀 신품종.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 밀 품종은 오메가 5-글리아딘(omega 5-gliadin) 유전자의 결실을 더 포함하는, 기탁번호 KACC88001BP로 기탁된 밀 신품종.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 품종은 금강밀과 올그루밀을 교배하여 수득하는 것인, 신규한 밀 품종.
  4. 제1항 또는 제2항의 밀 품종을 부본 또는 모본으로 사용하여 다른 밀 품종과 교배시키는 단계를 포함하는, 밀 품종의 개량방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 다른 밀 품종은 조경밀, 조품밀, 백중밀 또는 고소밀인 것인 밀 품종의 개량방법.
  6. 제1항 또는 제2항의 밀 품종으로부터 유래된 밀을 분쇄하여 수득한 밀가루.
  7. 제 6항의 밀가루를 포함하는 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증(WDEIA)을 개선 또는 예방할 수 있는 식품 조성물.
  8. 제 7항의 식품 조성물을 포함하는 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증(WDEIA)을 개선 또는 예방할 수 있는 가공 식품.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 가공식품은 면류, 과자류 또는 빵류인 것인 가공 식품.
  10. (a) 제1항 또는 제2항의 밀 품종을 분쇄하여 밀가루를 얻는 단계; 및
    (b) 상기 밀가루를 포함하는 반죽물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 반죽물을 가공하는 단계를 포함하는, 글루텐불내성 및 밀 의존성 운동 유발성 과민증(WDEIA)을 개선 또는 예방할 수 있는 가공식품의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 얻은 밀가루에 다른 밀 품종유래 밀가루를 혼합하는 단계를 더 포함하는, 가공식품의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 혼합물에 포함된 제 1항 또는 제 2항의 밀 품종 유래의 밀가루의 함량은 50 내지 99%(v/v)인 것인, 가공식품의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 다른 밀 품종은 금강밀, 올그루밀, 조경밀, 조품밀, 백중밀, 고소밀 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 밀 품종인 것인, 가공식품의 제조방법.
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