CN104342431B - 一种固定化酶用磁性纳米载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种固定化酶用磁性纳米载体的制备方法。该载体以纳米Fe₃O₄为核，以海藻酸碱土金属盐为壳；具有粒径小、颗粒均匀、单分散性好、比表面积大、化学稳定性好、负载能力强、生物相容性好、磁响应强等特点。其制备步骤：1)在反相微乳液体系中制备纳米Fe₃O₄；2)接着往反应体系中加入海藻酸钠溶液，混匀后，加入碱土金属盐溶液；3)反应结束后，通过分离纯化即可得到所述磁性纳米载体。本发明所涉及的磁性纳米载体的制备方法反应条件温和、制备工艺简单，且在制备过程中载体粒径大小与孔隙结构可控。

Description

一种固定化酶用磁性纳米载体的制备方法

技术领域

本发明涉及酶工程与固定化酶载体技术领域，尤其是一种固定化酶载体的制备方法。

背景技术

酶是具有催化功能的生物大分子，是生物体内一切代谢反应的催化剂，是维持生物体生命活动的基本物质，具有催化反应条件温和，催化效率高，底物专一性强，副产物少，应用范围广，催化活性调节方便等优点，是一种理想的催化剂。随着生物工程、酶工程、分子生物学等技术的发展，酶制剂在分子诊断、疾病防治、药物制备、农业生产、食品加工、环境保护以及绿色化学品合成等领域均得到了迅速发展和广泛应用。开发利用酶资源，促进酶工业化生产与应用，实现酶的高效利用，对推动我国医药卫生事业的发展，保障食物等生活物质的供应，提高绿色化学产业技术水平，改善生态环境，实现经济又好又快发展，提升国际竞争力具有重要意义。

但是，酶的制备过程复杂，反应条件要求苛刻，生产成本高。同时，其本质是由氨基酸组成蛋白质，空间结构不稳定，对环境十分敏感，温度、pH值、压力、胰蛋白酶、有机溶剂、金属离子、氧化剂、还原剂、电磁场等因素的存在均有可能使其丧失催化活性，保存比较困难。此外，在催化反应过程中，酶液分散在反应体系中，回收纯化困难，不能重复使用，既造成酶的浪费又增加产物的提纯和精制成本，且随反应时间的延长，催化活性逐渐下降，导致反应速度降低。价格昂贵，空间结构不稳定，容易丧失活性，酶液回收困难等被认为是限制酶大规模推广使用的瓶颈。因此，在不改变酶的空间结构与催化性能的基础上，开发一种既能增强稳定性，提高催化活性，又便于回收利用，增加循环使用次数，降低使用成本的固定化技术，是近年来酶工程的重要研究方向之一。

利用各种有机/无机多孔材料，通过物理或化学方法，将酶负载在多孔材料的内部孔隙或表面基团上制备固定化酶，可以提高酶的回收效率，增加循环次数，降低生产成本，是促进酶工业化生产与应用的有效途径之一。固定化载体是影响酶能否成功固定化以及固定化后酶活回收率高低、催化活性强弱、循环次数多少的关键因素之一，开发性能优良的载体材料，是固定化酶的重要发展方向之一。

磁性纳米材料粒径小、比表面积大、结合力与负载能力强、粒子分散均匀、强度硬度高、低毒、生物相容性和稳定性好、表面易功能化修饰、具有超顺磁性与磁响性应强等优点，以磁性纳米材料为载体，构建固定化酶，待催化反应结束后，通过外加磁场，在磁场力的驱动下，固定化酶可以向某一方向定向移动，而从反应体系中分离出来，因而便于固定化酶的回收利用。目前，已有一些专利和文献报道了磁性纳米颗粒用作固定化酶载体。已申请的专利有：蔡林君等申请的“一种可再生的磁性固定化酶载体及其制备方法”(申请号：201310544114.8)；李彦锋等申请的“磁性纳米粘土载体固定化酶及其再生的方法”(申请号：20121015217.9)；于洪巍等申请的“磁性共价固定化酶载体的制备方法”(授权号：ZY201110201473.4)；闫瑞香等申请的“一种采用功能化磁性载体固定几丁质酶的制备方法(申请号：201310363837.8)”；费辉等申请的“高底物耐受性的磁性纳米载体固定化醛缩酶的制备方法”(专利号：ZY 201110417666.3)。已报导的论文有：杜崇旭，等.磁性聚乙二醇微球固定化辅酶维生素B6的研究.大连民族学院学报，2003，5(1)：41-46；任广智，等.磁性壳聚糖微球用于脲激酶的固定化研究.离子交换与吸附，2000，16(4)：304-310；辛宝娟，等.氧化铁磁性纳米粒子固定化酶.化学进展，2010，22(4)：593-601；李咏兰，等.纳米磁性微粒固定化纤维素酶及水解秸秆的研究.江西师范大学学报，2011，35(6)：574-578。

但上述报导的专利和论文中磁性载体的制备方法均是首先制备出磁性纳米颗粒，经分离纯化、重新分散后，再对磁性纳米颗粒进行加工修饰等一系列处理才能得到磁性纳米载体。其制备条件要求苛刻、步骤复杂、酶活损失严重、催化效率低、循环次数少、生产效率低，同时制备所得的磁性纳米载体存在容易团聚、粒径大、比表面积小、单分散性差、固定化率低等缺点。

发明内容

因此，本发明提供一种全新的固定化酶用磁性纳米载体的制备方法。本发明结合了磁性纳米材料和海藻酸盐的优点，采用微乳液法，直接在反相微乳液中制备出以磁性纳米材料为核和以海藻酸盐为壳的磁性纳米载体。

本发明制备得到的载体具有粒径小、颗粒均匀、单分散性好、比表面积大、负载能力强、固定化率高、循环次数多、生物相容性好、磁响应强、回收方便等优点。本发明的制备方法的整个过程都是在反相微乳液中进行，中间不需要对纳米磁性颗粒进行分离、纯化、重新分散等操作，其反应条件温和、工艺简单、成本低廉，因而是一种比较理想的固定化酶载体的制备方法。使用本发明方法所制备的载体，通过包埋、化学结合、非共价结合等负载方式，可以制备出固定化率高、稳定性好、催化活性强、酶活回收率高、循环次数多、分离回收容易的固定化酶。

本发明为固定化酶载体的制备提供了一种新的思路与方法，有可能成为推动酶工业化生产与应用的突破点，在酶工程与生物催化领域具有巨大的应用价值，对提高我国酶工程技术，促进绿色化学合成、生物催化与手性药物制备等产业的发展也具有重要意义。

因此，本发明提供一种固定化酶用磁性纳米载体的制备方法，包括如下步骤：步骤A，配制亚铁盐/铁盐反相微乳液和沉淀剂反相微乳液，所述亚铁盐/铁盐反相微乳液和所述沉淀剂反相微乳液中均含有表面活性剂、助表面活性剂和油相，所述亚铁盐/铁盐反相微乳液为含有亚铁盐和铁盐的反相微乳液；步骤B，将上述亚铁盐/铁盐反相微乳液和沉淀剂反相微乳液中的一种加入另一种中，发生化学反应；步骤C，反应完成后，往所得混合体系中加入海藻酸钠溶液并混匀；步骤D，加入碱土金属盐溶液发生化学反应；步骤E，反应结束后，进行固液分离和纯化(可选择地进行干燥)，所得固体即以纳米Fe₃O₄为核和海藻酸碱土金属盐为壳的固定化酶用磁性纳米载体。本发明步骤B中更优选的是，将所述沉淀剂反相微乳液加入到所述亚铁盐/铁盐反相微乳液中。

本发明中，不仅仅是步骤A和步骤B，包括步骤C～步骤E的固液分离之前的整个体系都是反相微乳液体系，整个制备过程都是在反相微乳液中进行，其反应条件温和，简化了磁性纳米载体的制备步骤与工艺，克服了常规载体及制备方法中存在的缺点，大大提高了所得固定化酶载体的负载性能。此外，本发明中的载体粒径大小与孔隙结构可控。

本发明中所得固定化酶用磁性纳米载体的Fe₃O₄核的颗粒直径为5～1000nm，优选为10～800nm，更优选为20～500nm；海藻酸碱土金属盐壳的厚度为20～1000nm，优选为80～800nm，更优选为100～500nm；且所述固定化酶用磁性纳米载体的颗粒直径为25～1000nm，优选50～800nm，更优选80～500nm。

所述亚铁盐为强酸亚铁盐及其水合物，优选氯化亚铁及其水合物、硝酸亚铁及其水合物、硫酸亚铁及其水合物中的一种或多种；所述铁盐为强酸铁盐及其水合物，优选氯化铁及其水合物、硝酸铁及其水合物、硫酸铁及其水合物中的一种或多种；所述的沉淀剂为可溶性碱性物质，优选氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或几种；所述表面活性剂优选为十六烷基三甲基溴化铵、溴化十二烷基三甲基铵、十二烷基苯磺酸钠、苯乙烯基苯酚甲醛树脂、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段型聚醚、烷基苯酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯、磺酸酯类、酰胺类、有机硅类中的一种或多种，更优选十六烷基三甲基溴化铵；所述助表面活性剂为醇类溶剂，优选异丙醇、丙醇、乙醇中的一种或几种，更优选异丙醇；所述油相为烃类溶剂，优选环己烷、正庚烷、四氯化碳，更优选环己烷；所述碱土金属为钙、钡或锶，优选所述碱土金属盐为可溶性钙盐、可溶性钡盐、可溶性锶盐中的一种或几种，更优选可溶性钙盐。优选本发明中所述亚铁盐和铁盐的摩尔比例为0.2～1∶1。

本发明所述方法制备的磁性纳米载体具有顺磁性，在磁场的驱动下，能携带所负载的酶进行定向驱动。与传统固定化酶载体相比，本发明能实现固定化酶的定向移动，缩短回收时间，大大提高回收效率。

本发明所述方法制备的磁性纳米载体具有粒径小、颗粒均匀、单分散性好、比表面积大、负载能力强、固定化率高、循环次数多、生物相容性好、磁响应强、回收方便、制备条件温和、工艺简单、成本低廉等优点。

本发明的磁性纳米载体适用于制备固定化酶，但不仅仅只能用于固定化酶，也同样可以作为固定化细胞、缓控释药物和靶向药物的载体。

附图说明

图1为实施例1制备得到的磁性纳米载体的粒度分布图；

图2为实施例5制备得到的磁性纳米载体的粒度分布图；

图3为实施例9制备得到的磁性纳米载体的粒度分布图；

图4为实施例1制备得到的磁性纳米载体的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的描述，但本发明并不仅仅限于以下实施例。

实施例中所使用的激光粒度分析仪为ZS 90激光粒度分析仪，扫描电镜为S-800扫描电子显微镜。

实施例中所用原料来源：海藻酸钠与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购置于Sigma公司，其余所有的试剂与材料均购置于阿拉丁试剂公司。

实施例1

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入0.152gFeSO₄和0.400gFe₂(SO4)₃，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中加入3.75mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入1.25mL25％的氨水、5gCTAB、10mL异丙醇和15mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的氨水反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将氨水反相微乳液逐滴加入到Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液中，全部加完后，继续搅拌反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL0.1％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，加入2.5mL1.0％(质量分数)的CaCl₂溶液，全部加完后，继续搅拌反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。图1和图4分别为本实施例中制备得到的载体的粒度分布图和扫描电镜图。从图1及其相应的数据报告结果可见，该载体的粒径Z均值为29.74nm。从图4可见，本发明中的载体粒径小、颗粒尺寸大小一致、分布均匀。

实施例2

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入0.260gFeSO₄·6H₂O和0.562gFe₂(SO₄)₃·9H₂O，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL四氯化碳，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中加入5.0mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，加入0.32g的NaOH，溶解后，分别加入5gCTAB、10mL异丙醇和15mL四氯化碳，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的NaOH反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将NaOH反相微乳液加入到Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液中，全部加完后，继续搅拌反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL1.0％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，加入2.5mL1.0％(质量分数)的Ca(NO₃)₂溶液，全部加完后，继续反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。

实施例3

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入0.186gFe(NO₃)₂和0.502gFe(NO₃)₃，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL异丙醇和30mL正庚烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中加入5.0mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，加入0.448gKOH，溶解后，分别加入5gCTAB、10mL异丙醇和15mL正庚烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的KOH反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将KOH反相微乳液加入到Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液中，全部加完后，继续搅拌反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL2.0％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，加入2.5mL1.0％(质量分数)的CaSO₄溶液，全部加完后，继续反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。

实施例4

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入1.470gFe(NO₃)₂·6H₂O和4.13gFe(NO₃)₃.9H₂O，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL乙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中分别加入6.25mL25％的氨水、6.25gCTAB、12.5mL乙醇和18.75mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的氨水反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将氨水反相微乳液逐滴加入到Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液中，全部加完后，继续搅拌反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL0.1％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，加入2.5mL1.0％(质量分数)的CaCl₂溶液，全部加完后，继续搅拌反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。

实施例5

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入0.635gFeCl₂和1.625gFeCl₃，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL乙醇和30mL四氯化碳，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中加入5.0mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，加入1.60g的NaOH，溶解后，分别加入5gCTAB、10mL乙醇和15mL四氯化碳，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的NaOH反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将NaOH反相微乳液加入到Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液中，全部加完后，继续搅拌反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL1.0％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，逐滴加入2.5mL1.0％(质量分数)的Ca(NO₃)₂溶液，全部加完后，继续反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。从图2及其相应的数据报告结果可见，该载体的粒径Z均值为398.8nm。

实施例6

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入0.995gFeCl₂·4H₂O和2.705gFeCl₃·6H₂O，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL乙醇和30mL正庚烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中加入5.0mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，加入2.24g的KOH，溶解后，分别加入5gCTAB、10mL乙醇和15mL正庚烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的KOH反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将KOH反相微乳液加入到Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液中，全部加完后，继续搅拌反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL2.0％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，加入2.5mL1.0％(质量分数)的CaSO₄溶液，全部加完后，继续反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。

实施例7

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入1.52gFeSO₄和3.25gFeCl₃，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL丙醇和30mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中分别加入13mL25％的氨水、13gCTAB、26mL丙醇和39mL环己烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的氨水反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将氨水反相微乳液加入到Fe²⁺/Fe^{3 +}反相微乳液中，全部加完后，继续反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL0.1％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，加入2.5mL2％(质量分数)的CaCl₂溶液，全部加完后，继续反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。

实施例8

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入1.86gFe(NO₃)₂和5.41gFeCl₃·6H₂O，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL丙醇和30mL四氯化碳，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中加入6.40mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，加入3.20g的NaOH，溶解后，分别加入6.4gCTAB、12.8mL丙醇和19.2mL四氯化碳，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的NaOH反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将NaOH反相微乳液逐滴加入到Fe²⁺/Fe^{3 +}反相微乳液中，全部加完后，继续搅拌反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL1.0％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，逐滴加入2.5mL1.0％(质量分数)的Ca(NO₃)₂溶液，全部加完后，继续反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。

实施例9

取两个三角瓶，在其中一个瓶中加入10mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，分别加入1.99gFeCl₂·4H₂O和5.02gFe(NO₃)₃，完全溶解后，分别加入10gCTAB、20mL丙醇和30mL正庚烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液；在另外一个瓶中加入5.0mL去离子水，通入N₂排除三角瓶和水中的空气后，加入4.48g的KOH，溶解后，分别加入5gCTAB、10mL丙醇和15mL正庚烷，充分搅拌至完全溶解形成稳定的W/O型的KOH反相微乳液；然后以1mL/min的流速，将KOH反相微乳液加入到Fe²⁺/Fe³⁺反相微乳液中，全部加完后，继续搅拌反应30min至反应完全；然后往上述的混合体系中加入5mL2.0％(质量分数)的海藻酸钠溶液，搅拌至完全混匀后，以1mL/min的流速，逐滴加入2.5mL2％(质量分数)的CaSO₄溶液，全部加完后，继续反应30min至凝胶反应完全完成，即可得到均匀分散的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液。

将纳米Fe₃O₄/海藻酸钙悬浮液置于高速离心机中，以10000r/min的速率离心5min，收集离心沉淀物；然后分别加入水和异丙醇进行对离心沉淀物进行清洗，清洗后再次以10000r/min的速率离心5min，反复操作三次至纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体表面和内部残留的杂质被完全清洗掉。然后将离心沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即可得到纯净的纳米Fe₃O₄/海藻酸钙载体。从图3及其相应的数据报告结果可见，该载体的粒径Z均值为647.3nm。

Claims (8)

1.一种固定化酶用磁性纳米载体的制备方法，包括如下步骤：

步骤A，配制亚铁盐/铁盐反相微乳液和沉淀剂反相微乳液，所述亚铁盐/铁盐反相微乳液和所述沉淀剂反相微乳液中均含有表面活性剂、助表面活性剂和油相，所述亚铁盐/铁盐反相微乳液为含有亚铁盐和铁盐的反相微乳液；所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，所述助表面活性剂为异丙醇、丙醇和乙醇中的一种或多种，所述油相为环己烷、正庚烷和四氯化碳中的一种或多种，所述沉淀剂为氨水、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种，

步骤B，将上述亚铁盐/铁盐反相微乳液和沉淀剂反相微乳液中的一种加入另一种中，发生化学反应；

步骤C，反应完成后，往所得混合体系中加入海藻酸钠溶液并混匀；

步骤D，加入碱土金属盐溶液发生化学反应；

步骤E，反应结束后，进行固液分离和纯化，所得固体即以纳米Fe₃O₄为核和海藻酸碱土金属盐为壳的固定化酶用磁性纳米载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚铁盐为强酸亚铁盐及其水合物，所述铁盐为强酸铁盐及其水合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述亚铁盐为氯化亚铁及其水合物、硝酸亚铁及其水合物、硫酸亚铁及其水合物中的一种或多种，所述铁盐为氯化铁及其水合物、硝酸铁及其水合物、硫酸铁及其水合物中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤E中所述固液分离在高速离心机中进行。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤E中在固液分离纯化后还包括对所得固体在真空冷冻干燥机中冷冻干燥而得到所述固定化酶用磁性纳米载体。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱土金属为钙、钡或锶。

7.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，所得固定化酶用磁性纳米载体的Fe₃O₄核的颗粒直径为5～1000nm，海藻酸碱土金属盐壳的厚度为20～1000nm；且所述固定化酶用磁性纳米载体的颗粒直径为25～1000nm。

8.根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述亚铁盐和铁盐的摩尔比例为0.2～1：1。