CN108721943B - 电纺丝吸附柱和辣根过氧化物酶的制备方法 - Google Patents

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    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01007—Peroxidase (1.11.1.7), i.e. horseradish-peroxidase

Abstract

本发明涉及酶提取技术领域，特别涉及电纺丝吸附柱和辣根过氧化物酶的制备方法。其制备方法为：将含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝用无水乙醇浸泡20～30h，再将电纺丝用酸溶液浸泡20～30h，用碱溶液浸泡20～30h，水洗至中性；采用磁化线圈对电纺丝进行磁化，装柱，得到电纺丝吸附柱。本发明得到的辣根过氧化物酶的收率和纯度远远高于常规处理方法；本方法工艺简单，成本低廉，对环境友好。

Description

电纺丝吸附柱和辣根过氧化物酶的制备方法
技术领域
本发明涉及酶提取技术领域，特别涉及电纺丝吸附柱和辣根过氧化物酶的制备方法。
背景技术
过氧化物酶(POD)是一种以含正铁离子血红素为辅基的酶分子，分子量为42KD，理化性质能催化过氧化氢参与的一类反应，理化性质稳定，比一般蛋白质耐热，用丙酮、乙醇、甲苯等有机溶剂处理也不失活。在生物界广泛存在，资源丰富，尤其以辣根(属十字花科植物)中含量最高。
随着科学技术的发展，POD在食品、医药、环保、化工领域只能够作为工具酶正在大量使用，例如在临床生化检测中用于葡萄糖、胆固醇、脂肪、尿酸、胆红素等含量的测定。在酶标免疫检验中，作为最常用的标记酶，在化工用于橡胶成型、朔料及多泡沫性粘合剂的合成及纤维的漂白等，在食品工业中用于杀菌等。
目前POD的提取方法仍以经典的盐析法为主，其工艺路线是：原料粉碎后，经水抽提得到粗酶液，粗酶液先用0.4饱和度的硫酸铵溶液除去沉淀，再用0.8饱和度的硫酸铵沉淀，沉淀用水溶解，再用-15℃的丙酮分级分离，并透析后得到RZ值为1的酶液，最后用硫酸锌纯化、透析除盐、冷冻干燥，得到RZ值为1的POD粗品。酶粗品进一步纯化通常用凝胶色谱柱，本身凝胶色谱柱填料昂贵，并且容易污染失活，而且处理量和效率低下，不适合工业大生产。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了电纺丝吸附柱和辣根过氧化物酶的制备方法。该电纺丝吸附柱可有效吸附辣根过氧化物酶，收率和纯度均较高，且吸附柱成本低廉，适合工业化生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种电纺丝吸附柱，其制备方法为：
将含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝用无水乙醇浸泡20～30h，采用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味；再将电纺丝用酸溶液浸泡20～30h，水洗至中性，用碱溶液浸泡20～30h，水洗至中性；采用磁化线圈对电纺丝进行磁化，装柱，得到电纺丝吸附柱。
作为优选，含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的制备方法为：将四氧化三铁粉体分散在含有高分子材料的有机溶剂中，通过锥体喷嘴和静电高压，抽丝制得含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝。
作为优选，四氧化三铁粉体的制备方法为：将二价铁盐和三价铁盐按摩尔比(2.5～4):1混合制得铁盐混合溶液，然后加入氨水，反应0.5～1h后离心分离、洗涤、干燥，得到四氧化三铁粉体。
作为优选，高分子材料为聚氧乙烯、聚丙烯腈、聚乳酸、聚酰亚胺、尼龙、聚乙烯醇或聚苯乙烯。
作为优选，有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或苯。
作为优选，含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的制备方法中反应的时间为0.5h。
作为优选，氨水为体积百分含量为20％～40％的氨水。
优选地，氨水为体积百分含量为30％的氨水。
作为优选，氨水与铁盐混合溶液的质量比为(1～2)：(1～2)。
优选地，氨水与铁盐混合溶液的质量比为1：1。
作为优选，四氧化三铁粉体、有机溶剂与高分子材料的质量比为(1～2)：(3～5)：(1～3)。
优选地，四氧化三铁粉体、有机溶剂与高分子材料的质量比为1：4：2。
作为优选，含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的内径为15～25nm。
优选地，含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的内径为20nm。
作为优选，磁化线圈为将绝缘体导线绕成直径为18～22cm、高度45～55cm的中空螺旋柱体。
优选地，磁化线圈为将绝缘体导线绕成直径为20cm、高度50cm的中空螺旋柱体。
作为优选，采用磁化线圈对电纺丝进行磁化中，磁化的电压为200～240V，磁化的时间为20～30h。
优选地，采用磁化线圈对电纺丝进行磁化中，磁化的电压为220V，磁化的时间为24h。
本发明还提供了一种辣根过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：
将辣根绞碎、压榨、过滤，得到第一滤液；将第一滤液调节pH值至4.5～6.5，静置、过滤，得到第二滤液；将第二滤液加热至50～60℃后保温，静置、过滤，得到第三滤液；采用磁化线圈将第三滤液进行磁化，得到磁化的粗酶液；
将磁化的粗酶液与水混合得到粗酶水溶液，加入本发明的电纺丝吸附柱中进行吸附，然后采用乙醇溶液进行洗脱，收集流出液；用水透析后，冻干，得到辣根过氧化物酶。
本发明在提取分离过程中利用POD对酸和热稳定的物理特性使之与杂蛋白等其他物质分离得到粗品POD。利用POD结构中耦合铁离子磁化化后，能够和磁性粒子相吸的特性，使之通过含磁性粒子电纺丝填料柱子吸附与洗脱，达到纯化的目的。
优选地，将第一滤液调节pH值至4.5～5.5。
更优选地，将第一滤液调节pH值至5.0～5.5。
优选地，将第二滤液加热至60℃后保温。
作为优选，电纺丝吸附柱的制备方法为：
将含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝用无水乙醇浸泡20～30h，采用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味；再将电纺丝用酸溶液浸泡20～30h，水洗至中性，用碱溶液浸泡20～30h，水洗至中性；将电纺丝磁化，装柱，得到电纺丝吸附柱。
优选地，将含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝用无水乙醇浸泡24h，采用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味；再将电纺丝用盐酸溶液浸泡24h，水洗至中性，用氢氧化钠溶液浸泡24h，水洗至中性；将电纺丝磁化，装柱，得到电纺丝吸附柱。
作为优选，含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的制备方法为：将四氧化三铁粉体分散在含有高分子材料的有机溶剂中，通过锥体喷嘴和静电高压，抽丝制得含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝。
作为优选，四氧化三铁粉体的制备方法为：将二价铁盐和三价铁盐按摩尔比(2.5～4):1混合制得铁盐混合溶液，然后加入氨水，反应0.5～1h后离心分离、洗涤、干燥，得到四氧化三铁粉体。
作为优选，高分子材料为聚氧乙烯、聚丙烯腈、聚乳酸、聚酰亚胺、尼龙、聚乙烯醇或聚苯乙烯。
作为优选，有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或苯。
作为优选，盐酸溶液的浓度为0.5～1.5M。
优选的，盐酸溶液的浓度为1M。
作为优选，氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1.5M。
优选的，氢氧化钠溶液的浓度为1M。
作为优选，含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的制备方法中反应的时间为0.5h。
作为优选，氨水为体积百分含量为20％～40％的氨水；氨水与铁盐混合溶液的质量比为(1～2)：(1～2)。
优选地，氨水为体积百分含量为30％的氨水；氨水与铁盐混合溶液的质量比为1：1。
作为优选，四氧化三铁粉体、有机溶剂与高分子材料的质量比为(1～2)：(3～5)：(1～3)。
优选地，四氧化三铁粉体、有机溶剂与高分子材料的质量比为1：4：2。
作为优选，四氧化三铁粉体、二氯甲烷与聚苯乙烯的质量比为(1～2)：(3～5)：(1～3)。
优选地，四氧化三铁粉体、二氯甲烷与聚苯乙烯的质量比为1：4：2。
作为优选，含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的内径为15～25nm。
优选地，含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的内径为20nm。
作为优选，磁化线圈为将绝缘体导线绕成直径为18～22cm、高度45～55cm的中空螺旋柱体。
优选地，磁化线圈为将绝缘体导线绕成直径为20cm、高度50cm的中空螺旋柱体。
作为优选，采用磁化线圈将第三滤液进行磁化中，磁化的电压为200～240V，磁化的时间为20～30h。
优选地，采用磁化线圈将第三滤液进行磁化中，磁化的电压为220V，磁化的时间为24h。
作为优选，以ml/g计，粗酶水溶液中，磁化的粗酶液与水的比例为(1.2～4.0)：1；粗酶水溶液的流速为0.3～2.5ml/min。
优选地，以ml/g计，粗酶水溶液中，磁化的粗酶液与水的比例为(1.2～3.5)：1；粗酶水溶液的流速为0.5～2.5ml/min。
更优选地，以ml/g计，粗酶水溶液中，磁化的粗酶液与水的比例为(2～3)：1；粗酶水溶液的流速为0.8～1.0ml/min。
作为优选，洗脱所用乙醇溶液中水与乙醇的体积比为1：(0.5～3)。
优选地，洗脱所用乙醇溶液中水与乙醇的体积比为1：(0.5～2)。
更优选地，洗脱所用乙醇溶液中水与乙醇的体积比为1：(0.8～2)。
作为优选，乙醇溶液的流速为3.5～6.5ml/min。
优选地，乙醇溶液的流速为3.5～6.0ml/min。
更优选地，乙醇溶液的流速为4～5ml/min。
本发明提供了电纺丝吸附柱和辣根过氧化物酶的制备方法。该电纺丝吸附柱的制备方法为：将二价铁盐和三价铁盐按摩尔比(2.5～4):1混合制得铁盐混合溶液，然后加入氨水，反应0.5～1h后离心分离、洗涤、干燥，得到四氧化三铁粉体，将四氧化三铁粉体分散在含有高分子材料的有机溶剂中，通过锥体喷嘴和静电高压，抽丝制得含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝；将含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝用无水乙醇浸泡20～30h，采用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味；再将电纺丝用酸溶液浸泡20～30h，水洗至中性，用碱溶液浸泡20～30h，水洗至中性；采用磁化线圈对电纺丝进行磁化，装柱，得到电纺丝吸附柱。本发明的技术效果为：
本发明是利用磁性电纺丝对磁化后的过氧化物酶进行分离，利用磁性作用达到其他杂质与其分离的目的，每千克鲜辣根产出2.8～3.6mg辣根过氧化物酶，RZ大于3.0以上，收率和纯度远远高于常规处理方法；
本方法工艺简单，成本低廉，对环境友好。
具体实施方式
本发明公开了电纺丝吸附柱和辣根过氧化物酶的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的辣根过氧化物酶的制备方法如下：
1、过氧化物酶粗品制备
将鲜辣根洗净，绞碎压榨分离后，滤液调pH于4.5-6.5，静置、分离，得到滤液，滤液再加热到50～60℃后，并保温，静置、分离，取滤液，这两步沉淀分别析出酸性不稳定的蛋白质和对热不稳定的蛋白质，得到过氧化物酶粗酶液。备用。
2、含四氧化三铁磁性粒子的电纺丝制备
采用化学共沉淀法制备磁性纳米粒子四氧化三铁，具体方法是：将二价铁盐和三价铁盐溶液按摩尔比(2.5～4):1混合，将20％～40％的氨水快速加入上述铁盐混合溶液中，氨水与铁盐混合溶液的质量比为(1～2)：(1～2)，搅拌、反应0.5～1h后经离心分离、洗涤和干燥后得四氧化三铁粉体。将粉体均匀分散在二氯甲烷溶解的聚苯乙烯溶液中，通过锥体喷嘴和静电高压后，抽丝制得内径为20nm的电纺丝，粉体、二氯甲烷与聚苯乙烯的质量比为(1～2)：(3～5)：(1～3)。
3、辣根过氧化物酶吸附
a电纺丝预处理
将含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝用无水乙醇浸泡20～30h，采用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味；再将电纺丝用酸溶液浸泡20～30h，水洗至中性，用碱溶液浸泡20～30h，水洗至中性；将电纺丝磁化，装柱，得到电纺丝吸附柱。
将绝缘体导线绕成直径为18～22cm、高度45～55cm的中空螺旋柱体，得到磁化线圈。将电纺丝在水液里用磁化线圈磁化一次，通200～240V直流电20～30h。然后在水浸润的条件下湿法装柱，得到电纺丝吸附柱。
b吸附
将磁化线圈插入粗酶液中通200～240V直流电20～30h后，等待上柱。
粗酶液加入预处理好的电纺丝吸附柱中，粗酶液：水＝(1.2～4)：1(V/W)，流速控制在0.3～2.5ml/min。
4、辣根过氧化物酶洗脱
采用乙醇溶液将吸附的POD洗脱下来。乙醇溶液中溶剂水与乙醇的体积比为1：(0.5～3)，流速控制在3.5～6.5ml/min，收集流出液。水透析冻干后得产品。
在本发明中，酶的纯度以RZ表示：RZ＝OD403/OD275，纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占75％。
本发明提供的电纺丝吸附柱和辣根过氧化物酶的制备方法中所用原料或材料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、过氧化物酶粗品制备
将10kg鲜辣根洗净，绞碎压榨分离后，滤液调pH于5.0，静置、分离，得到滤液，滤液再加热到60℃后，并保温，静置、分离，取滤液，这两步沉淀分别析出酸性不稳定的蛋白质和对热不稳定的蛋白质，得到过氧化物酶粗酶液。备用。
2、含四氧化三铁磁性粒子的电纺丝制备
采用化学共沉淀法制备磁性纳米粒子四氧化三铁，具体方法是：将二价铁盐和三价铁盐溶液按一定摩尔比3:1混合，将30％的氨水快速加入上述铁盐混合溶液中，氨水与铁盐混合溶液的质量比为1:1，搅拌、反应0.5h后经离心分离、洗涤和干燥后得四氧化三铁粉体。将粉体均匀分散在二氯甲烷溶解的聚苯乙烯溶液中，通过锥体喷嘴和静电高压后，抽丝制得内径为20nm的电纺丝，粉体、二氯甲烷与聚苯乙烯的质量比为1:4:2。
3、辣根过氧化物酶吸附
a电纺丝预处理
电纺丝先用无水乙醇浸泡24h，并用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味。然后加1M HCl溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，得到磁化线圈。将电纺丝在水液里用磁化线圈磁化一次。然后在水浸润的条件下湿法装柱，得到电纺丝吸附柱。
b吸附
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，插入粗酶液中通220V直流电24h后，等待上柱。
粗酶液加入预处理好的电纺丝吸附柱中，粗酶液：水＝1.2：1(V/W)，流速控制在0.5ml/min。
4、辣根过氧化物酶洗脱
采用乙醇溶液将吸附的POD洗脱下来。乙醇溶液中溶剂水与乙醇的体积比为1：0.5，流速控制在3.5ml/min，收集流出液。水透析冻干后得产品30mg，经紫外分光仪测得RZ＝3.1。
实施例2
1、过氧化物酶粗品制备
将10kg鲜辣根洗净，绞碎压榨分离后，滤液调pH于5.5，静置、分离，得到滤液，滤液再加热到60℃后，并保温，静置、分离，取滤液，这两步沉淀分别析出酸性不稳定的蛋白质和对热不稳定的蛋白质，最后得到的滤液经自制磁化线圈磁化后等待上柱。
2、含四氧化三铁磁性粒子的电纺丝制备
采用化学共沉淀法制备磁性纳米粒子四氧化三铁是将二价铁盐和三价铁盐溶液按一定摩尔比4:1混合，将30％的氨水快速加入上述铁盐混合溶液中，氨水与铁盐混合溶液的质量比为1:1，搅拌、反应0.5h后经离心分离、洗涤和干燥后得四氧化三铁粉体。将粉体均匀分散在二氯甲烷溶解的聚苯乙烯溶液中，通过锥体喷嘴和静电高压后，抽丝制得内径为20nm的电纺丝，粉体、二氯甲烷与聚苯乙烯的质量比为1:4:2。
3、辣根过氧化物酶吸附
a电纺丝预处理
电纺丝先用无水乙醇浸泡24h，并用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味。然后加1M HCl溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，得到磁化线圈。将电纺丝在水液里用磁化线圈磁化一次。然后在水浸润的条件下湿法装柱，得到电纺丝吸附柱。
b吸附
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，插入粗酶液中通220V直流电24h后，等待上柱。
粗POD加入预处理好的电纺丝吸附柱中，粗POD液：水＝2:1(V/W)，流速控制在1ml/min。
4、辣根过氧化物酶洗脱
采用乙醇溶液将吸附的POD洗脱下来。乙醇溶液中溶剂水与乙醇的体积比为1：0.8，流速控制在4ml/min，收集流出液。水透析冻干后得产品35mg，经紫外分光仪测得RZ＝3.2。
实施例3
1、过氧化物酶粗品制备
将10kg鲜辣根洗净，绞碎压榨分离后，滤液调pH于5.5，静置、分离，得到滤液，滤液再加热到60℃后，并保温，静置、分离，取滤液，这两步沉淀分别析出酸性不稳定的蛋白质和对热不稳定的蛋白质，最后得到的滤液经自制磁化线圈磁化后等待上柱。
2、含四氧化三铁磁性粒子的电纺丝制备
采用化学共沉淀法制备磁性纳米粒子四氧化三铁是将二价铁盐和三价铁盐溶液按一定摩尔比2.5:1混合，将30％的氨水快速加入上述铁盐混合溶液中，氨水与铁盐混合溶液的质量比为1:1，搅拌、反应0.5h后经离心分离、洗涤和干燥后得四氧化三铁粉体。将粉体均匀分散在二氯甲烷溶解的聚苯乙烯溶液中，通过锥体喷嘴和静电高压后，抽丝制得内径为20nm的电纺丝，粉体、二氯甲烷与聚苯乙烯的质量比为1:4:2。
3、辣根过氧化物酶吸附
a电纺丝预处理
电纺丝先用无水乙醇浸泡24h，并用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味。然后加1M HCl溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，得到磁化线圈。将电纺丝在水液里用磁化线圈磁化一次。然后在水浸润的条件下湿法装柱，得到电纺丝吸附柱。
b吸附
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，插入粗酶液中通220V直流电24h后，等待上柱。
粗POD加入预处理好的电纺丝吸附柱中，粗POD液：水＝3:1(V/W)，流速控制在1ml/min。
4、辣根过氧化物酶洗脱
采用乙醇溶液将吸附的POD洗脱下来。乙醇溶液中溶剂水与乙醇的体积比为1：1.0，流速控制在5ml/min，收集流出液。水透析冻干后得产品36mg，经紫外分光仪测得RZ＝3.3。
实施例4
1、过氧化物酶粗品制备
将10kg鲜辣根洗净，绞碎压榨分离后，滤液调pH于4.5，静置、分离，得到滤液，滤液再加热到60℃后，并保温，静置、分离，取滤液，这两步沉淀分别析出酸性不稳定的蛋白质和对热不稳定的蛋白质，最后得到的滤液经自制磁化线圈磁化后等待上柱。
2、含四氧化三铁磁性粒子的电纺丝制备
采用化学共沉淀法制备磁性纳米粒子四氧化三铁是将二价铁盐和三价铁盐溶液按一定摩尔比3:1混合，将30％的氨水快速加入上述铁盐混合溶液中，氨水与铁盐混合溶液的质量比为1:1，搅拌、反应0.5h后经离心分离、洗涤和干燥后得四氧化三铁粉体。将粉体均匀分散在二氯甲烷溶解的聚苯乙烯溶液中，通过锥体喷嘴和静电高压后，抽丝制得内径为20nm的电纺丝，粉体、二氯甲烷与聚苯乙烯的质量比为1:4:2。
3、辣根过氧化物酶吸附
a电纺丝预处理
电纺丝先用无水乙醇浸泡24h，并用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味。然后加1M HCl溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，得到磁化线圈。将电纺丝在水液里用磁化线圈磁化一次。然后在水浸润的条件下湿法装柱，得到电纺丝吸附柱。
b吸附
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，插入粗酶液中通220V直流电24h后，等待上柱。
粗POD加入预处理好的电纺丝吸附柱中，粗POD液：水＝3.5:1(V/W)，流速控制在2.5ml/min。
4、辣根过氧化物酶洗脱
采用乙醇溶液将吸附的POD洗脱下来。乙醇溶液中溶剂水与乙醇的体积比为1：1，流速控制在6ml/min，收集流出液。水透析冻干后得产品28mg，经紫外分光仪测得RZ＝2.9。
实施例5
1、过氧化物酶粗品制备
将10kg鲜辣根洗净，绞碎压榨分离后，滤液调pH于5.0，静置、分离，得到滤液，滤液再加热到60℃后，并保温，静置、分离，取滤液，这两步沉淀分别析出酸性不稳定的蛋白质和对热不稳定的蛋白质，最后得到的滤液经自制磁化线圈磁化后等待上柱。
2、含四氧化三铁磁性粒子的电纺丝制备
采用化学共沉淀法制备磁性纳米粒子四氧化三铁是将二价铁盐和三价铁盐溶液按一定摩尔比3:1混合，将30％的氨水快速加入上述铁盐混合溶液中，氨水与铁盐混合溶液的质量比为1:1，搅拌、反应0.5h后经离心分离、洗涤和干燥后得四氧化三铁粉体。将粉体均匀分散在二氯甲烷溶解的聚苯乙烯溶液中，通过锥体喷嘴和静电高压后，抽丝制得内径为20nm的电纺丝，粉体、二氯甲烷与聚苯乙烯的质量比为1:4:2。
3、辣根过氧化物酶吸附
a电纺丝预处理
电纺丝先用无水乙醇浸泡24h，并用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味。然后加1M HCl溶液浸泡24h，水洗至中性，加1MNaOH溶液浸泡24h，用水洗至中性。
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，得到磁化线圈。将电纺丝在水液里用磁化线圈磁化一次。然后在水浸润的条件下湿法装柱，得到电纺丝吸附柱。
b吸附
将绝缘体导线绕成直径为20cm，高度50cm的中空螺旋柱体，插入粗酶液中通220V直流电24h后，等待上柱。
粗POD加入预处理好的电纺丝吸附柱中，粗POD液：水＝2.5:1(V/W)，流速控制在0.8ml/min。
4、辣根过氧化物酶洗脱
采用乙醇溶液将吸附的POD洗脱下来。乙醇溶液中溶剂水与乙醇的体积比为1：2，流速控制在4.5ml/min，收集流出液。水透析冻干后得产品35mg，经紫外分光仪测得RZ＝3.5。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将辣根绞碎、压榨、过滤，得到第一滤液；将第一滤液调节pH值至4.5～6.5，静置、过滤，得到第二滤液；将第二滤液加热至50～60℃后保温，静置、过滤，得到第三滤液；采用磁化线圈将第三滤液进行磁化，得到磁化的粗酶液；
将磁化的粗酶液与水混合得到粗酶水溶液，加入电纺丝吸附柱中进行吸附，然后采用乙醇溶液进行洗脱，收集流出液；用水透析后，冻干，得到辣根过氧化物酶；
电纺丝吸附柱的制备方法为：
将含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝用无水乙醇浸泡20～30h，采用无水乙醇洗脱至无色，然后水洗至无醇味；再将电纺丝用酸溶液浸泡20～30h，水洗至中性，用碱溶液浸泡20～30h，水洗至中性；采用磁化线圈对电纺丝进行磁化，装柱，得到电纺丝吸附柱。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的制备方法为：将四氧化三铁粉体分散在含有高分子材料的有机溶剂中，通过锥体喷嘴和静电高压，抽丝制得含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝；
所述四氧化三铁粉体的制备方法为：将二价铁盐和三价铁盐按摩尔比(2.5～4):1混合制得铁盐混合溶液，然后加入氨水，反应0.5～1h后离心分离、洗涤、干燥，得到四氧化三铁粉体；
所述高分子材料为聚氧乙烯、聚丙烯腈、聚乳酸、聚酰亚胺、尼龙、聚乙烯醇或聚苯乙烯；
所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或苯。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氨水为体积百分含量为20％～40％的氨水；所述氨水与铁盐混合溶液的质量比为(1～2)：(1～2)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁粉体、有机溶剂与高分子材料的质量比为(1～2)：(3～5)：(1～3)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有四氧化三铁磁性纳米粒子的电纺丝的内径为15～25nm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁化线圈为将绝缘体导线绕成直径为18～22cm、高度45～55cm的中空螺旋柱体。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述采用磁化线圈将第三滤液进行磁化中，磁化的电压为200～240V，磁化的时间为20～30h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以ml/g计，所述粗酶水溶液中，磁化的粗酶液与水的比例为(1.2～4.0)：1；所述粗酶水溶液的流速为0.3～2.5ml/min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱所用乙醇溶液中水与乙醇的体积比为1：(0.5～3)；所述乙醇溶液的流速为3.5～6.5ml/min。
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