CN104195135B - 一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法 - Google Patents
一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104195135B CN104195135B CN201410381499.5A CN201410381499A CN104195135B CN 104195135 B CN104195135 B CN 104195135B CN 201410381499 A CN201410381499 A CN 201410381499A CN 104195135 B CN104195135 B CN 104195135B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fragment
- primer
- target nucleotide
- reverse
- chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种引物、靶核苷酸扩增方法及检测靶核苷酸序列扩增的方法，属于生物技术领域。所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括B片段，所述反向引物的5'末端包括A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，A片段与A1片段互补，B片段与B1片段互补，C片段与C1片段互补。所述靶核苷酸扩增方法，提供靶核苷酸，加入正向引物和反向引物，所述正向链和所述反向链分别扩增。所述检测靶核苷酸序列扩增的方法用于检测靶核苷酸是否扩增。所述引物能够高效进行环形扩增并不断延长靶核苷酸片段，所述靶核苷酸扩增方法与现有技术相比检测效率至少提高了20倍，即提高了灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法。
背景技术
核苷酸是组成核酸的基本单位，对核苷酸遗传序列分析方法是一种鉴定遗传疾病、病原微生物等非常强有力的方法，该核苷酸序列分析方法可直接分析生命体的遗传特征，并且，该核苷酸序列分析方法检测的对象是基因自身。
常用的体外扩增核苷酸序列的方法包括PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术，该PCR技术由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步组成一个周期，该周期循环进行，使得目的核苷酸得以扩增。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
现有的PCR技术的扩增效率仍不能满足人们的要求，因此，该PCR技术的扩增效率有待提高。
发明内容
为了解决现有技术中PCR技术的扩增效率低的问题，本发明实施例提供了一种引物、扩增靶核苷酸的方法及检测靶核苷酸扩增的方法。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种引物，所述引物适用于扩增的所述靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括所述C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补，所述正向引物的序列如序列表中SEQ IDNO.2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法，所述方法包括：
提供靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段；
加入所述正向引物、所述反向引物和等温扩增反应液，使得所述正向链和所述反向引物互补并进行扩增，所述反向链和所述正向引物互补并进行扩增；
所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补，所述正向引物的序列如序列表中SEQ IDNO.2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，所述靶核苷酸的序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；
所述正向链和所述反向链分别扩增后，得到第一正向链和第一反向链，当所述反向引物的5'末端包括所述A片段时，所述第一正向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一反向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的3'末端和5'末端分别通过所述A片段和所述A1片段互补形成环链，所述第一正向链的5'末端和3'末端互补成环，所述第一反向链的5'末端和3'末端互补成环；当所述反向引物的5'末端包括A1片段时，所述第一正向链的两端均具有所述A片段，所述第一反向链的两端均具有所述A1片段，所述A片段和所述A1片段互补配对，使所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的5'末端和3'末端均互补形成环链；
所述第一正向链和所述第一反向链在互补后，在聚合酶的催化下，所述第一正向链和所述第一反向链作为模板进行延长扩增，得到第二反向链和第二正向链；
将所述第二反向链和第二正向链解链，解链后的所述第二反向链和第二正向链作为下一个延长扩增反应的模板进行扩增，分别得到所述第二反向链和所述第二正向链的互补链，并循环进行，使得所述靶核苷酸在恒温的条件下不断延长，完成所述靶核苷酸的扩增。
具体地，当所述靶核苷酸为RNA链时，所述等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶和反转录聚合酶。
具体地，当所述靶核苷酸为DNA链时，所述等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。
具体地，所述恒温的温度为60-65℃。
具体地，所述等温扩增反应液中包括解链温度调节剂，所述解链温度调节剂为甜菜碱、二甲基亚砜、脯氨酸或甲酰胺。
具体地，在所述正向引物和所述反向引物中，所述A片段的长度小于所述B片段和所述C片段的长度。
又一方面，本发明实施例提供了一种非诊断目的的检测上述靶核苷酸序列扩增的方法，在所述等温扩增反应液中添加检测试剂，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的靶核苷酸，若电泳结果得到清晰明亮的特征性条带，则靶核苷酸已扩增；若未出现特征性条带，则靶核苷酸未扩增。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供的引物能够高效进行环形扩增并不断延长靶核苷酸，该引物与靶核苷酸结合扩增出两端相同或互补的核苷酸区，该相同或互补的核苷酸区与另一条互补链互补成环，周而复始地不断延长扩增。同时，本发明提供的靶核苷酸扩增方法，其扩增过程在变性反应过程中无需的温度变化，且全程的反应条件均在恒温条件下进行，进而避免了温度变化，提高了扩增的效率，在序列互补链成环后，高效率的加长重复片段，利用该新型引物与核苷酸结合扩增出两端相同或互补的核苷酸区，该相同或互补的核苷酸区与另一条互补链互补成环，周而复始地不断延长扩增，能够用于检测各种基因或基因突变的方法，与现有技术相比检测效率至少提高了20倍，即提高了灵敏度。同时，本发明提供的检测方法能够快速有效的检测出靶核苷酸是否扩增。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例二提供的正向引物和反向引物的序列示意图；
图2是本发明实施例二提供的正向链和反向引物互补以及反向链和正向引物互补配对的示意图；
图3是本发明实施例二提供的第三反向链和第三正向链的示意图；
图4是本发明实施例二提供的第三正向链和反向引物以及第三反向链和正向引物互补并进行扩增的示意图；
图5是本发明实施例二提供的第四正向链和第四反向链的示意图；
图6是本发明实施例二提供的第四正向链和反向引物以及第四反向链和正向引物互补并进行扩增的示意图；
图7是本发明实施例二提供的第一正向链和第一反向链的示意图；
图8是本发明实施例二提供的第一正向链和第一反向链分别通过正向引物和反向引物扩增，以及互补成环的示意图；
图9是本发明实施例二提供的第二反向链和第二正向链的示意图；
图10是本发明实施例二提供的解链后的第二反向链和第二正向链作为模板进行扩增的示意图；
图11是本发明实施例二提供的得到第二反向链和第二正向链的互补链的示意图；
图12是本发明实施例二提供的反应液A的电泳图；
图13是本发明实施例二提供的反应液B较高浓度样本的电泳图，且泳道1为HAV DNA(1×10-15mol)，泳道2为HCV DNA(1×10-15mol)，泳道3为HBVDNA(-)，泳道4为DL 2000的Marker，泳道5为HBV DNA(1×10-18mol),泳道6为HBV DNA(1×10-19mol)，泳道7为HBV DNA(1×10-20mol)；
图14是本发明实施例二提供的反应液B低浓度样本的电泳图，且泳道1为HBV DNA(-)，泳道2为HBV DNA(1×10-23mol)，泳道3为HBV DNA(1×10-22mol)，泳道4为HBV DNA(1×10-21mol)，泳道5为DL 2000的Marker；
图15是本发明实施例三提供的正向引物和反向引物的序列示意图；
图16是本发明实施例三提供的正向链和反向引物互补以及反向链和正向引物互补配对的示意图；
图17是本发明实施例三提供的第三反向链和第三正向链的示意图；
图18是本发明实施例三提供的第三正向链和反向引物以及第三反向链和正向引物互补并进行扩增的示意图；
图19是本发明实施例三提供的第四正向链和第四反向链的示意图；
图20是本发明实施例三提供的第四正向链和反向引物以及第四反向链和正向引物互补并进行扩增的示意图；
图21是本发明实施例三提供的第一正向链和第一反向链的示意图；
图22是本发明实施例三提供的第一正向链和第一反向链分别通过正向引物和反向引物扩增，以及互补成环的示意图；
图23是本发明实施例三提供的第二反向链和第二正向链的示意图；
图24是本发明实施例三提供的解链后的第二反向链和第二正向链作为模板进行扩增的示意图；
图25是本发明实施例三提供的得到第二反向链和第二正向链的互补链的示意图；
图26是本发明实施例三提供的反应液C的样本电泳图，且泳道1为DL 2000的Marker，泳道2为HBV DNA(1×10-21mol)，泳道3为HBV DNA(1×10-22mol)，泳道4为HBV DNA(1×10-23mol)，泳道5为HBV DNA(-)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本发明实施例提供了一种引物，该引物适用于扩增靶核苷酸，该靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，正向链包括B片段和C片段，反向链包括B1片段和C1片段，该引物包括正向引物和反向引物，正向引物的5'末端包括A片段，正向引物的3'末端包括B片段，反向引物的5'末端包括A1片段或A片段，反向引物的3'末端包括C1片段，A片段与A1片段互补，B片段与B1片段互补，C片段与C1片段互补。
进一步地，A片段可以包括10-20个碱基，且A片段的退火温度低于B片段和C片段的退火温度。
采用本发明提供的引物能够用于定量扩增靶核苷酸，该靶核苷酸可以为RNA链或DNA链，当靶核苷酸为RNA链时，可以为丙肝病毒或肠道病毒71型核酸，当靶核苷酸为DNA链时，可以为乙肝病毒或人乳头瘤病毒核酸等。
具体地，当靶核苷酸为RNA链时，等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶和反转录聚合酶。
具体地，当靶核苷酸为DNA链时，等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。
具体地，本发明实施例提供一种引物，该引物用于乙肝核酸定量检测，该引物的序列如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，具体引物如下：
选择乙肝特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得乙肝B基因型和C基因型的基因序列，在该基因序列的基因区选择一段保守序列进行比对，该序列如序列表中SEQ ID NO.6所示：GCGACGCGGYGATTGAGRCCTTCGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTGCSYCKKYVTCTAACAACASHAGTYTCCGGAAGTGTTGATAAGATAGGGGCA，序列中Y＝C或T，K＝G或T，V＝A、C或G，S＝C或G，R＝A或G，H＝A、C或T。利用实时PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)的专业引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物序列，引物序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保乙肝引物序列能检测全部B基因型和C基因型的序列。
具体地，B片段可以选取扩增区保守性强的约15-30个碱基的序列，C片段可以选取扩增区保守性强的约15-30个碱基的互补序列，且B片段和C片段可以为靶核苷酸的正向链中的根据设计软件筛选出的最佳引物序列。
具体引物序列参见表1，具体引物的组合见表2：
表1.A组引物
表中：F：forward，正向；HBV-F表示用于检测乙肝核酸的正向引物。
R：reverse，反向；HBV-R表示用于检测乙肝核酸的反向引物。
表1中设计的引物均委托宝生物工程(大连)有限公司合成。
其中，引物的A片段为序列中ACCGATAGCCATCCG。
A1片段为序列中CGGATGGCTATCGGT。
B片段为序列中GCGACGCGGYGATTGAG。
C1片段为序列中TGCCCCTATCTTATCAACACTTCC。其中，A片段与A1片段互补，因此A片段与A1片段可以在正向引物和反向引物中相互替换。
表.2为表1提供的引物的组合方式
其中，反应液A为传统的PCR引物组合；反应液B和反应液C为引物组合，反应液B中，正向引物为AB，反向引物为AC1；反应液C中，正向引物为AB，反向引物为A1C1。
实施例二
本发明实施例提供了一种扩增靶核苷酸的方法，该扩增方法是一种快速灵敏的核酸扩增技术(Quick and Sensitive Nucleic acid Amplication Technology)，具体扩增方法为：提供靶核苷酸，该靶核苷酸包括互补的正向链1’和反向链2’，正向链1’包括B片段和C片段，反向链2’包括B1片段和C1片段，正向引物F的5'末端连接有A片段，反向引物Rq的5'末端连接有A片段，A片段与A1片段互补，B片段与B1片段互补，C片段与C1片段互补。
正向引物F的5'末端和反向引物Rq的5'末端分别连接有A片段(见图1)，正向引物F和反向引物Rq可以为反应液B中的正向引物F和反向引物Rq，反应液B中的正向引物F和反向引物Rq加入等温扩增反应液，使得正向链1’和反向引物Rq互补并进行扩增，反向链2’和正向引物F互补并进行扩增(见图2)，并得到5'末端具有A片段的第三正向链1、以及5'末端具有A片段的第三反向链2(见图3)。
第三正向链1和反向引物Rq互补并进行扩增，第三反向链2和正向引物F互补并进行扩增(见图4)，得到第四正向链3和第四反向链4(见图5)，第四正向链3与反向引物Rq互补并进行扩增，第四反向链4和正向引物F互补并进行扩增(见图6)，得到两端分别具有A片段和A1片段的第一正向链5、以及两端分别具有A1片段和A片段的第一反向链6(见图7)，其中，第一正向链5与第四正向链3的序列相同，第一反向链6与第四反向链4的序列相同。
正向链1’和反向链1’分别扩增后，得到第一正向链5和第一反向链6，第一正向链5的两端具有A片段和A1片段，第一反向链6的两端具有A片段和A1片段，第一正向链5和第一反向链6的两端互补形成环链(见图8)，同时，第一正向链5的5'末端和3'末端互补成环，第一反向链6的5'末端和3'末端互补成环，即存在三种成环方式。
本实施例中以第一正向链5和第一反向链6举例说明其成环过程，容易知道，该第一正向链5和第一反向链6、第四正向链3和第四反向链4、第四反向链4和第一正向链5或者第四正向链3和第一反向链6的成环过程与此相同，在聚合酶的催化作用下，以成环的第一正向链5和第一反向链6作为模板进行延长扩增，得到第二反向链10和第二正向链9(见图9)。此外，第一正向链5的5'末端和3'末端互补成环后，在聚合酶的催化下，第一正向链5作为模板进行延长扩增，得到第二正向链ABCA1B1C1A(图中未示)；第一反向链6的5'末端和3'末端互补成环后，在聚合酶的催化下，第一反向链6作为模板进行延长扩增，得到第二反向链A1B1C1ABCA1(图中未示)，且扩增原理与第一正向链5和第一反向链6成环后的扩增原理相同。
将第二反向链10和第二正向链9解链，解链后的第二反向链10和第二正向链9可以作为下一个延长扩增反应的模板进行扩增(见图10)，得到第二反向链10和第二正向链9的互补链(见图11)，并循环进行，使得靶核苷酸在恒温的条件下不断延长，完成靶核苷酸扩增。由第一正向链5的5'末端和3'末端互补成环、第一反向链6的5'末端和3'末端互补成环得到的第二正向链和第二反向链的扩增过程与第二反向链10和第二正向链9的扩增原理相同。
具体地，当靶核苷酸为DNA链时，等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，即Bst酶。
具体地，当靶核苷酸为RNA链时，等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶和反转录聚合酶。
具体地，等温扩增反应液中包括解链温度调节剂，解链温度调节剂为甜菜碱、二甲基亚砜、脯氨酸或甲酰胺。
优选地，解链温度调节剂为甜菜碱，该甜菜碱的浓度为1.0M。
具体地，恒温的温度为60-65℃。
具体地，在正向引物F和反向引物Rq中，A片段和A1片段的长度均小于B片段和C片段的长度。
本发明实施例提供的等温扩增反应液的总体积为50μL(包括样本体积)，该等温扩增反应液包括10×Bst酶Buffer 1×，dNTPs的终浓度为0.3mM，MgSO4的终浓度为8.0mM，甜菜碱的终浓度为1.0M，溶剂为无菌水，该等温扩增反应液总体积为50μL(包括样本体积)。此外，该等温扩增反应液还可以包括核酸释放剂、阴性质控品和样本标准品。
其中，1、核酸释放剂由终浓度为0.03％的Triton-X 100(聚乙二醇辛基苯基醚)、终浓度为0.04％的NP-40(壬基酚聚氧乙烯(40)醚)和终浓度为0.01M的Tris-HCL，溶剂为无菌水组成，Tris-HCL的pH值为8.3。
2、阴性质控品为不含乙肝基因的阴性血清。具体地，取不含乙肝基因的阴性血清，吸取该溶液于离心管中，混匀，直接吸取混匀后的液体5μL作模板。
3、样本标准品为样本标准品含有乙肝基因的核苷酸片段的样本。取含乙肝基因的样本100μL加入等体积的核酸释放剂，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取离心后的上清液用分光光度计测A260定量。该样本标准品用于制备标准曲线，以便于对乙肝基因进行定量检测。
进一步地，样本标准品包括：样本标准品1，含有1.0×10-23mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品2，含有1.0×10-22mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品3，含有1.0×10-21mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品4，含有1.0×10-20mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品5，含有1.0×10-19mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品6，含有1.0×10-18mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品7，含有1.0×10-17mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
具体地，样本标准品为含有乙肝的样本的非传染性DNA片段，乙肝样本经核酸释放剂提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10-17mol，-20℃保存。贮存浓度为1.0×10-17mol，使用前用无菌生理盐水或0.01mol/L PBS缓冲液(phosphate buffer solution，磷酸缓冲液)进行10倍梯度的系列稀释，其中PBS缓冲液的pH值为7.4。样本标准品的工作浓度依次为1.0×10-17mol，1.0×10-18mol，1.0×10-19mol，1.0×10-20mol，1.0×10-21mol，1.0×10-22mol和1.0×10-23mol，使用前，经5000rmp离心10s，取离心后的上清液作为模板，适用仪器：恒温金属浴、水浴锅以及任何一种能恒温的PCR仪器等。
具体地，正向引物F分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的终浓度均为1μM，反向引物Rq为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的终浓度均为1μM。
采用上述等温扩增反应液在恒温金属浴上检测的方法，具体如下：
(1)乙肝样本采集：样本均来源于武汉大学人民医院，其中6个为经检测已知的阳性样本，2个为经检测已知的阴性样本。
乙肝样本处理：取含乙肝病毒的样本100μL加入等体积的核酸释放剂，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取离心后的上清液用分光光度计测A260定量，即为处理后的样本。
(2)甲肝样本采集：样本均来源于武汉大学人民医院，其中4个为经检测已知的阳性样本，4个为经检测已知的阴性样本。
甲肝样本处理：取含甲肝病毒的200μl样本上清液进行核酸提取。采用商品化的RNA提取试剂盒提取样本，具体操作方法参见该试剂盒说明书。取提取后的RNA用分光光度计测A260/A280定量，即为处理后的样本。且在扩增之前进行反转录反应。
(3)丙肝样本采集：样本均来源于武汉大学人民医院，其中4个为经检测已知的阳性样本，4个为经检测已知的阴性样本。
丙肝样本处理：取含丙肝病毒的200μl样本上清液进行核酸提取。采用商品化的RNA提取试剂盒提取样本，具体操作方法参见该试剂盒说明书。取提取后的RNA用分光光度计测A260/A280定量，即为处理后的样本，且在扩增之前进行反转录反应。
(4)加样：向装有等温扩增反应液的反应管中分别加入处理后的样本(样本为乙肝样本、甲肝样本或丙肝样本)、阴性质控品和样本标准品5μL，等温扩增反应液总体积(包括样本体积)与处理后的样本、阴性质控品、样本标准品的体积比为10：1：1：1，经5000rpm离心10s。
(5)扩增：将各反应管放入恒温扩增仪器的反应槽内，设置基因种类、样本名称及类型，定义样本孔：阴性质控品为NTC；样本标准品为Unknown。
按表3提供的扩增程序进行扩增：
表3为扩增反应扩增程序
在扩增程序结束后采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在5μL上述反应溶液中加入1μL 6×buffer，然后上样于2％琼脂糖凝胶(1×TAE)，在100V下电泳0.5小时，采用10μL Takara的DL2000作为Marker进行分子大小标记。
(6)分析判断：
反应液A、反应液B和反应液C区别在于引物不同，反应液A为普通引物，反应液B和反应液C为本发明提供的能够高效扩增的引物，有特征性条带的为阳性，无特征性条带的为阴性，具体结果参见图12-图14，反应液A电泳结果见图12，泳道1为DL 2000的Marker，泳道2为HBV DNA(-)，泳道3为HBVDNA(1×10-17mol)，具体的，可以看出没有A与A1的互补，则不产生特征性条带，由此可见本发明提供的引物具有高灵敏度。反应液B电泳结果见图13，泳道1为反应液B，甲肝病毒(Hapatitis A virus，HAV)DNA(1×10-15mol)，泳道2为反应液B，丙肝病毒(Hepatitis C virus，HCV)DNA(1×10-15mol)，泳道3为反应液B，HBV DNA(-)，泳道4为DL 2000的Marker，泳道5为反应液B，乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)DNA(1×10-18mol),泳道6为反应液B，HBV DNA(1×10-19mol)，泳道7为反应液B，HBV DNA(1×10-20mol)；可以看出A与A1的互补，有利于产生特征性条带。反应液B电泳结果见图14，泳道1为HBV DNA(-)，泳道2为HBV DNA(1×10-23mol)，泳道3为HBV DNA(1×10-22mol)，泳道4为HBV DNA(1×10-21mol)，泳道5为DL 2000的Marker。其中，只有图12的泳道3和图13的泳道1、2加入了较高浓度阳性样本，但是无特征性条带，由此可见，本发明提供的引物具有高特异性。需要说明的是，由第一正向链5和第一反向链6分别自身互补成环、以及第一正向链5和第一反向链6互补成环会得到三种不同结构的第二正向链和第二反向链，分别为ABCA1B1C1A、A1B1C1ABCA1和ABCA1CBA，扩增出的核苷酸链的长度一致。只要有一种结构的第二正向链和第二反向链扩增就能够实现检测靶核苷酸序列的目的，且这三种不同结构的第二正向链和第二反向链能够同时扩增，进一步加快了检测速率。
此外，本实施例中的A片段与A1片段互补，所以正向引物F的5'末端和反向引物Rq的5'末端分别连接有A1片段，其反应原理与本实施例相同。
实施例三
本发明实施例与实施例二的区别为反向引物的5'末端连接有A1片段。
本发明实施例提供了一种扩增靶核苷酸的方法，具体扩增方法为：提供靶核苷酸，该靶核苷酸包括互补的正向链1’和反向链2’，正向链1’包括B片段和C片段，反向链2’包括B1片段和C1片段，正向引物F1的5'末端连接有A片段，反向引物Rq1的5'末端连接有A1片段，A片段与A1片段互补。
正向引物F1的5'末端和反向引物Rq1的5'末端分别连接有A片段和A1片段(见图15)，正向引物F1和反向引物Rq1可以为反应液C中的正向引物F1和反向引物Rq1，反应液C中的正向引物F1和反向引物Rq1加入等温扩增反应液，使得正向链1’和反向引物Rq1互补并进行扩增，反向链2’和正向引物F1互补并进行扩增(见图16)，并得到5'末端具有A片段的第三正向链1a、以及5'末端具有A1片段的第三反向链2a(见图17)。
第三正向链1a和反向引物Rq1互补并进行扩增，第三反向链2a和正向引物F1互补并进行扩增(见图18)，得到第四正向链3a和第四反向链4a(见图19)，第四正向链3a与反向引物Rq1互补并进行扩增，第四反向链4a和正向引物F1互补并进行扩增(见图20)，得到两端均具有A片段的第一正向链5a、以及两端均具有A1片段的第一反向链6a(见图21)，其中，第一正向链5a与第四正向链3a的序列相同，第一反向链6a与第四反向链4a的序列相同。
正向链1’和反向链1’分别扩增后，得到第一正向链5a和第一反向链6a，第一正向链5a的两端均具有A片段，第一反向链6a的两端均具有A1片段，的两端均互补形成环链(见图22)。
本实施例中以第一正向链5a和第一反向链6a举例说明其成环过程，容易知道，该第一正向链5a和第一反向链6a、第四正向链3a和第四反向链4a、第四反向链4a和第一正向链5a或者第四正向链3a和第一反向链6a的成环过程与此相同，在聚合酶的催化作用下，以成环的第一正向链5a和第一反向链6a作为模板进行延长扩增，得到第二反向链10a和第二正向链9a(见图23)。
第二反向链10a和第二正向链9a解链，解链后的第二反向链10a和第二正向链9a可以作为下一个延长扩增反应的模板进行扩增(见图24)，得到第二反向链10a和第二正向链9a的互补链(见图25)，并循环进行，使得靶核苷酸在恒温的条件下不断延长，完成靶核苷酸扩增。
具体地，当靶核苷酸为DNA链时，等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，即Bst酶。
具体地，当靶核苷酸为RNA链时，等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶和反转录聚合酶。
具体地，等温扩增反应液中包括解链温度调节剂，解链温度调节剂为甜菜碱、二甲基亚砜、脯氨酸或甲酰胺。
优选地，解链温度调节剂为甜菜碱，该甜菜碱的浓度为1.0M。
具体地，恒温的温度为60-65℃。
具体地，在正向引物F1和反向引物Rq1中，A片段和A1片段的长度小于B片段和C片段的长度。
本发明实施例提供的等温扩增反应液的总体积为50μL(包括样本体积)，该等温扩增反应液包括10×Bst酶Buffer 1×，dNTPs的终浓度为0.3mM，MgSO4的终浓度为8.0mM，甜菜碱的终浓度为1.0M，溶剂为无菌水，该等温扩增反应液总体积为50μL(包括样本体积)。此外，该等温扩增反应液还可以包括核酸释放剂、阴性质控品和样本标准品。
其中，1、核酸释放剂由终浓度为0.03％的Triton-X 100(聚乙二醇辛基苯基醚)、终浓度为0.04％的NP-40(壬基酚聚氧乙烯(40)醚)和终浓度为0.01M的Tris-HCL，溶剂为无菌水组成，Tris-HCL的pH值为8.3。
2、阴性质控品为不含乙肝基因的阴性血清。具体地，取不含乙肝基因的阴性血清，吸取该溶液于离心管中，混匀，直接吸取混匀后的液体5μL作模板。
3、样本标准品为样本标准品含有乙肝基因的核苷酸片段的样本。取含乙肝基因的样本100μL加入等体积的核酸释放剂，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取离心后的上清液用分光光度计测A260定量。该样本标准品用于制备标准曲线，以便于对乙肝基因进行定量检测。
进一步地，样本标准品包括：样本标准品1，含有1.0×10-23mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品2，含有1.0×10-22mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品3，含有1.0×10-21mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品4，含有1.0×10-20mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品5，含有1.0×10-19mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品6，含有1.0×10-18mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
样本标准品7，含有1.0×10-17mol乙肝的样本的非传染性DNA片段。
具体地，样本标准品为含有乙肝的样本的非传染性DNA片段，乙肝样本经核酸释放剂提取DNA，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10-17mol，-20℃保存。贮存浓度为1.0×10-17mol，使用前用无菌生理盐水或0.01mol/L PBS缓冲液(phosphate buffer solution，磷酸缓冲液)进行10倍梯度的系列稀释，其中PBS缓冲液的pH值为7.4。样本标准品的工作浓度依次为1.0×10-17mol，1.0×10-18mol，1.0×10-19mol，1.0×10-20mol，1.0×10-21mol，1.0×10-22mol和1.0×10-23mol，使用前，经5000rmp离心10s，取离心后的上清液作为模板，适用仪器：恒温金属浴、水浴锅以及任何一种能恒温的PCR仪器等。
采用上述等温扩增反应液在恒温金属浴上检测的方法，具体如下：
(1)乙肝样本采集：样本均来源于武汉大学人民医院，其中6个为经检测已知的阳性样本，2个为经检测已知的阴性样本；(2)乙肝样本处理：取含乙肝的样本100μL加入等体积的核酸释放剂，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取离心后的上清液用分光光度计测A260定量，即为处理后的样本。
(2)加样：向装有等温扩增反应液的反应管中分别加入处理后的样本、阴性质控品和样本标准品5μL，等温扩增反应液总体积(包括样本体积)与处理后的样本、阴性质控品、样本标准品的体积比为10：1：1：1，经5000rpm离心10s。
(3)扩增：将各反应管放入恒温扩增仪器的反应槽内，设置基因种类、样本名称及类型，定义样本孔：阴性质控品为NTC；样本标准品为Unknown。
按表3提供的扩增程序进行扩增：
表3为扩增反应扩增程序
在扩增程序结束后采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，在5μL上述反应溶液中加入1μL 6×buffer，然后上样于2％琼脂糖凝胶(1×TAE)，在100V下电泳0.5小时，采用10μL Takara的DL2000作为Marker进行分子大小标记。
(4)分析判断：
反应液A、反应液B和反应液C区别在于引物不同，反应液A为普通引物，反应液B和反应液C为本发明提供的能够高效扩增的引物，有特征性条带的为阳性，无特征性条带的为阴性，具体结果参见图26，反应液C电泳结果见图26，泳道1为DL 2000的Marker，泳道2为HBV DNA(1×10-21mol)，泳道3为HBV DNA(1×10-22mol)，泳道4为HBV DNA(1×10-23mol)，泳道5为HBVDNA(-)。具体的，可以看出没有A与A1的互补，则不产生特征性条带，由此可见本发明提供的引物具有高灵敏度，可以看出A与A1的互补，有利于产生特征性条带。
需要说明的是，在实施例三中，以反向引物的5'末端包括A片段为例对本发明提供的扩增靶核苷酸的方法进行了详细说明，可以理解地，正向引物的5'末端可以包括A1片段，反向引物的5'末端可以包括A片段且反应原理与本实施例相同。
本发明实施例提供的引物，由于A片段与A1片段互补，这能够避免引物在扩增过程中产生假阳性，有利于产生特征性条带，该特征性条带是通过正向链和反向链的5'末端和3'末端分别通过A片段和A1片段互补形成环链，并进行高效环形扩增并不断延长靶核苷酸片段，从而高效率的加长重复片段，利用该新型引物与核苷酸结合扩增出两端相同或互补的序列，该相同或互补的序列与另一条互补链互补成环，周而复始地不断延长扩增，与现有技术相比检测效率至少提高了20倍，即提高了灵敏度。
本发明实施例提供的靶核苷酸扩增方法，该扩增方法是一种快速灵敏的核酸扩增技术(Quick and Sensitive Nucleic acid Amplication Technology，QSN)，能够超灵敏检测各种基因，具有实用性广、灵敏度高、特异性高和节约时间与成本等优点。在引物扩增时，仅通过Bst酶催化即可扩增互补链，而且，若以RNA为模板，则需要先反转录成DNA之后再进行扩增即可，且通过简单的酶就能够实现高度扩增核酸的反应，能够用于检测如RNA类的丙型肝炎病毒等、DNA类的乙型肝炎病毒等以及能够用于检测各种基因或基因突变，且引物具有高特异性及高灵敏度的特点。该核苷酸检测方法在检测时可以有效的避免了假阳性，同时引物能够在序列互补链成环后，该引物能够高效进行环形扩增并不断延长靶核苷酸片段，并与靶核苷酸结合扩增出两端相同或互补的核苷酸区，该相同或互补的核苷酸区与另一条互补链互补成环，周而复始地不断延长扩增，高效进行环形扩增并不断延长靶核苷酸片段，从而高效率的加长重复片段，从而提高了扩增的效率，与现有技术相比，本发明提供的检测效率至少提高了20倍，即提高了灵敏度，同时，其扩增过程在变性反应过程中无需的温度变化，从而节省了PCR过程中温度变化的大量时间，且全程的反应条件均在恒温条件下进行(无需温度控制)，进而避免了温度变化，实验仪器只需要一个恒温箱或者水浴锅，而不需要昂贵的PCR仪器。同时，本发明提供的检测方法能够快速有效的检测出靶核苷酸是否扩增，且检测成本低、所用试剂简单，以乙肝病毒定性检测为例，本发明实施例提供的靶核苷酸扩增方法，能够超灵敏检测各种基因，例如适用于RNA和DNA类产品的定性检测以及突变检测。
本发明实施例提供的检测靶核苷酸序列扩增的方法能够快速有效的检测出靶核苷酸是否扩增。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种引物，其特征在于，所述引物适用于扩增靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补，所述正向引物的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
2.一种非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
提供靶核苷酸，所述靶核苷酸包括互补的正向链和反向链，所述正向链包括B片段和C片段，所述反向链包括B1片段和C1片段；
加入所述正向引物、所述反向引物和等温扩增反应液，使得所述正向链和所述反向引物互补并进行扩增，所述反向链和所述正向引物互补并进行扩增；
所述正向引物的5'末端包括A片段，所述正向引物的3'末端包括所述B片段，所述反向引物的5'末端包括所述A片段或A1片段，所述反向引物的3'末端包括C1片段，所述A片段与所述A1片段互补，所述B片段与所述B1片段互补，所述C片段与所述C1片段互补，所述正向引物的序列如序列表中SEQ IDNO.2所示，所述反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示，所述靶核苷酸的序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；
所述正向链和所述反向链分别扩增后，得到第一正向链和第一反向链，当所述反向引物的5'末端包括所述A片段时，所述第一正向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一反向链的两端分别具有所述A片段和所述A1片段，所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的3'末端和5'末端分别通过所述A片段和所述A1片段互补形成环链，所述第一正向链的5'末端和3'末端互补成环，所述第一反向链的5'末端和3'末端互补成环；当所述反向引物的5'末端包括A1片段时，所述第一正向链的两端均具有所述A片段，所述第一反向链的两端均具有所述A1片段，所述A片段和所述A1片段互补配对，使所述第一正向链的5'末端和3'末端与所述第一反向链的5'末端和3'末端均互补形成环链；
所述第一正向链和所述第一反向链在互补后，在聚合酶的催化下，所述第一正向链和所述第一反向链作为模板进行延长扩增，得到第二反向链和第二正向链；
将所述第二反向链和第二正向链解链，解链后的所述第二反向链和第二正向链作为下一个延长扩增反应的模板进行扩增，分别得到所述第二反向链和所述第二正向链的互补链，并循环进行，使得所述靶核苷酸在恒温的条件下不断延长，完成所述靶核苷酸的扩增。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述靶核苷酸为RNA链时，所述等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶和反转录聚合酶。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述靶核苷酸为DNA链时，所述等温扩增反应液包括嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述恒温的温度为60-65℃。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述等温扩增反应液中包括解链温度调节剂，所述解链温度调节剂为甜菜碱、二甲基亚砜、脯氨酸或甲酰胺。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述正向引物和所述反向引物中，所述A片段的长度小于所述B片段和所述C片段的长度。
8.一种非诊断目的的检测如权利要求2所述的靶核苷酸扩增的方法，其特征在于，在所述等温扩增反应液中添加检测试剂，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的靶核苷酸，若电泳结果得到清晰明亮的特征性条带，则靶核苷酸已扩增；若未出现特征性条带，则靶核苷酸未扩增。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410381499.5A CN104195135B (zh) | 2014-08-05 | 2014-08-05 | 一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410381499.5A CN104195135B (zh) | 2014-08-05 | 2014-08-05 | 一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104195135A CN104195135A (zh) | 2014-12-10 |
| CN104195135B true CN104195135B (zh) | 2017-01-11 |
Family
ID=52080503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410381499.5A Active CN104195135B (zh) | 2014-08-05 | 2014-08-05 | 一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104195135B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104745689A (zh) * | 2015-01-30 | 2015-07-01 | 湖北永邦医疗科技有限公司 | 一种用于检测百日咳杆菌的引物、探针和试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103173557A (zh) * | 2013-04-08 | 2013-06-26 | 上海邃志生物科技有限公司 | 一组用于人类亲子鉴定的多重pcr引物组合及检测方法 |
| CN103255227A (zh) * | 2013-05-30 | 2013-08-21 | 上海快灵生物科技有限公司 | 引物介导环化的恒温核酸滚环扩增方法及试剂盒 |
| CN103484564A (zh) * | 2013-07-23 | 2014-01-01 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种高灵敏度检测和鉴定人冠状病毒的方法 |
-
2014
- 2014-08-05 CN CN201410381499.5A patent/CN104195135B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103173557A (zh) * | 2013-04-08 | 2013-06-26 | 上海邃志生物科技有限公司 | 一组用于人类亲子鉴定的多重pcr引物组合及检测方法 |
| CN103255227A (zh) * | 2013-05-30 | 2013-08-21 | 上海快灵生物科技有限公司 | 引物介导环化的恒温核酸滚环扩增方法及试剂盒 |
| CN103484564A (zh) * | 2013-07-23 | 2014-01-01 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种高灵敏度检测和鉴定人冠状病毒的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FQ-PCR同步检测HTLV-I及HTLV-II方法的建立及临床应用;陈琦 等;《武汉大学学报（医学版）》;20120930;第33卷(第5期);667-672 * |
| Multiple strategies to improve sensitivity, speed and robustness of isothermal nucleic acid amplification for rapid pathogen detection;Tong et al.;《BMC Biotechnology》;20110511;1-7 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104195135A (zh) | 2014-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BR112020026306A2 (pt) | Métodos de amplificação, sistemas e diagnósticos baseados em sistema efeitor crispr | |
| CN104862419B (zh) | 一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN107109497A (zh) | 通过实时PCR从细胞裂解物定量HBV cccDNA的高通量新方法 | |
| CN105018646B (zh) | 一种检测牛流行热病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN102021249B (zh) | 反转录-环介导等温扩增检测猪流行性腹泻的引物组 | |
| CN103667514B (zh) | 一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN101712973B (zh) | 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法 | |
| CN109182481B (zh) | 一种高通量检测多种靶基因的方法 | |
| CN101624636A (zh) | 传染性脾肾坏死病毒的lamp-lfd检测方法 | |
| CN102827929A (zh) | 一种核酸检测方法 | |
| CN108913811A (zh) | 乙肝病毒核酸的快速扩增方法 | |
| CN109136410A (zh) | 猫泛白细胞减少症病毒lamp检测引物组、试剂盒以及检测方法 | |
| CN102146479A (zh) | 用于精神分裂症、双相情感障碍和重性抑郁症关联基因检测的引物、探针及其试剂盒及制备方法 | |
| CN103388033A (zh) | 一种肠道病毒71型(ev71)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| Wang et al. | Asymmetric polymerase chain reaction and loop-mediated isothermal amplification (AP-LAMP) for ultrasensitive detection of microRNAs | |
| CN116356079A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 | |
| CN105779644A (zh) | 人巨细胞病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN104321443A (zh) | Hev测定 | |
| CN110438260A (zh) | 一种非洲猪瘟病毒核酸试纸条检测试剂盒 | |
| CN108130385A (zh) | 一种人巨细胞病毒核酸检测试剂盒 | |
| CN104195135B (zh) | 一种引物、非诊断目的的扩增靶核苷酸的方法及非诊断目的的检测靶核苷酸扩增的方法 | |
| CN103276091A (zh) | 一种检测hiv前病毒dna的试剂盒 | |
| CN105002169A (zh) | 3型鸭肝炎病毒荧光定量rt-lamp检测试剂盒及其应用和方法 | |
| CN102212615A (zh) | 基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法 | |
| CN103789447B (zh) | 一种5′端tRNA半分子检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Tang Jingfeng Inventor after: Luo Hong Inventor after: Wang Weixu Inventor before: Liu Yingle Inventor before: Luo Hong Inventor before: Tang Jingfeng |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160817 Address after: 430223 Hubei city of Wuhan province East Lake Development Zone Road University Science Park of Wuhan University Hongye Building five floor Applicant after: Wuhan Biotech Gene Engineering Co., Ltd. Address before: Hubei Development Zone, Wuhan University, Wuhan science and Technology Park, 3S geo spatial information industry base, No. three, block 4, No. 1, block 24# Applicant before: WUHAN HAIDIKE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |