CN104086445B - 一种盐酸溴己新及制剂有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种盐酸溴己新及制剂有关物质的检测方法，对其中存在的主要杂质Ⅰa或杂质Ⅰb进行含量测定，同时将它们在盐酸溴己新杂质测定中作为对照品应用，有利于控制与提高盐酸溴己新及制剂的产品质量，提高患者用药安全性。

Description

一种盐酸溴己新及制剂有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及一种祛痰药盐酸溴己新及制剂有关物质的检测方法。
背景技术
盐酸溴己新，英文名称：BromhexineHydrochloride，化学名称：N-甲基-N环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐，结构式为：
盐酸溴己新临床应用广泛，用于治疗慢性支气管炎、哮喘等痰粘不易咳出的患者。肠胃吸收快而完全，口服0.5-3小时达到峰值。
盐酸溴己新有多种合成路线，其中包括：以邻甲苯胺为原料，首先溴化生成2，4-二溴-6-甲苯胺，与乙酐反应使氨基乙酰化，生成N，N-二乙酰基-2，4-二溴-6甲基苯胺；使氨基得以保护，然后再一次溴化生成N，N-二乙酰基-2，4-二溴-6-溴甲基苯胺；与N-甲基环己胺缩合到N，N-二乙酰基-2，4-二溴-6-(N-甲基)环己胺甲基苯胺。最后用盐酸水解去乙酰基并成盐得成品。
现有合成方法中，所得盐酸溴己新均含有相关的杂质，主要的杂质如下：
杂质A：2-氨基-3,5-二溴苄醇2-amino-3,5-dibromophenyl)methanol
杂质B：2-氨基-3,5-二溴苯甲醛2-amino-3,5-dibromobenzaldehyde,
杂质C：N-(2-氨苄基)-N-甲基环己烷N-(2-aminobenzyl)-N-methylcyclohexanamine
杂质D：N-(2-氨基-5-溴代苄基)-N-甲基环己烷N-(2-amino-5-bromobenzyl-N-methylcyclohexanamine
杂质E：(3RS)-6,8-二溴-3-环己基-3-甲基-1,2,3,4-四氢化喹唑啉-3-ium(3RS)-6,8-dibromo-3-cyclohexyl-3-methyl-1,2,3,4-tetrahydroquinazolin-3-ium
从合成工艺分析，上述杂质均为工艺杂质(合成中间体及副产物)。
现有盐酸溴己新有关物质的相关检测方法有：
1.ChP2010：HPLC法，C18，柱温：40℃，流动相：0.1％磷酸二氢钾缓冲液(0.5mol/L氢氧化钠调节pH7.0)－乙腈(20︰80)，波长：245nm，记录时间：3tR，进样量：10μl，溶液：2.5mg/ml及5μg/ml(0.2％)甲醇溶液，限度：单杂≤0.2％，总杂≤0.3％。
2.EP8.0/BP2013/IP2010药典：HPLC法，C18，120×4.6mm×3μm，流动相：0.05％磷酸缓冲液(三乙胺调节pH7.0)－乙腈(20︰80)，流速：1.0ml/min，波长：248nm，记录时间：2.5tR，系统：主峰11min，杂质RRT分别为杂质A约0.1、杂质B约0.2、杂质C约0.4、杂质D约0.5，杂质C与主峰分离度≥12.0，进样量：10μl，溶液：5mg/ml及5μg/ml(0.1％)甲醇溶液，限度：单杂≤0.2％(超过0.1％杂质不得过1个)，总杂≤0.3％(忽略限0.05％)。
3.JP16：避光操作，HPLC法，C18，150×5mm×5μm，柱温：40℃，流动相：0.1％磷酸二氢钾缓冲液(0.5mol/L氢氧化钠调节pH7.0)－乙腈(20︰80)，波长：245nm，记录时间：3tR，系统：主峰约6min，硫酸丁酚胺与API分离度不小于7.0，进样量：5μl，溶液：5mg/ml(甲醇)及10μg/ml(0.2％，流动相)，限度：单杂≤0.20％。
4.CN103499647A公开了盐酸溴己新葡萄糖注射液有关物质的检测方法：HPLC法，AIItimaTMC18，250×4.60mm×5μm，柱温：30℃，流动相：磷酸盐缓冲液〔0.02mol/L磷酸二氢钾溶液加0.1％(v/v)三乙胺溶液，用冰醋酸调节pH为3.3〕－乙腈(72︰28)，流速：1.0ml/min，波长：249nm，进样量：20μl。
目前盐酸溴己新片质量标准仅收载于ChP2010和IP2010，两者均有“有关物质”检查项，具体测定方法如下：
1.ChP2010：HPLC法，C18，柱温：40℃，流动相：0.1％磷酸二氢钾缓冲液(0.5mol/L氢氧化钠调节pH7.0)－乙腈(20︰80)，波长：245nm，记录时间：3tR，进样量：10μl，溶液：2.5mg/ml及25μg/ml(1.0％)甲醇溶液，限度：总杂≤1.0％。
2.IP2010药典：HPLC法，C18，120×4.6mm×3μm，流动相：0.05％磷酸缓冲液(三乙胺调节pH7.0)－乙腈(20︰80)，流速：1.0ml/min，波长：248nm记录时间：2.5tR，进样量：10μl，分离度溶液：0.5mg/ml杂质C+0.5mg/mlAPI混合溶液，溶液：5mg/ml及5μg/ml(0.1％)甲醇溶液，相对保留时间：主峰11min，各已知杂质RRT分别为：杂质A、杂质B、杂质C、杂质D分别约为0.1、0.2、0.4、0.5，系统适用性：杂质C与主峰分离度≥12.0，限度：单杂≤0.2％(超过0.1％杂质不得过1个)，总杂≤0.3％(忽略限0.05％)。
本发明在制备盐酸溴己新的过程中，发现了两种结构未知的主要杂质：分别为杂质Ⅰa和杂质Ⅰb，
本发明对这两种杂质进行了结构确认，同时对其进行含量测定，并以此两种杂质为质量控制指标，结果大大提高了盐酸溴己新产品的质量，提高患者用药安全性。
发明内容
本发明提供一种盐酸溴己新的检测方法。
本发明所述的盐酸溴己新，可以采用以下方法进行合成：
1、邻氨基苯甲酸甲酯为起始原料经溴化反应生成3,5-二溴邻氨基苯甲酸甲酯。
2、3,5-二溴邻氨基苯甲酸甲酯经还原反应生成3,5-二溴邻氨基苯甲醇。
3、3,5-二溴邻氨基苯甲醇与N-甲基环己胺缩合反应生成N-甲基-N环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺。
4、N-甲基-N环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺与盐酸反应生成盐酸溴己新。
详细的反应步骤见实施例。
在中国的企业中，大部分盐酸溴己新的合成采用的都是上述方法，因合成工艺过程的副反应，可能存在一些结构不为人知的杂质。为此，本发明人对盐酸溴己新产品进行了多次检测，意外发现两种新的杂质，且含量较高。
本发明发现的两种杂质分别为Ⅰa和杂质Ⅰb，结构式如下：
本发明对杂质Ⅰa(即合成路线中的5a)进行合成及对杂质进行核磁共振光谱(lH-NMR，l3C-NMR)及质谱(MS)结构确认，具体如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.33(d,J＝2.3Hz,1H),6.91(d,J＝2.2Hz,1H),5.46(s,2H),3.59(s,2H),2.41(t,J＝10.8Hz,1H),2.11(s,3H),1.80(d,J＝10.3Hz,4H),1.64(d,J＝12.8Hz,1H),1.37–1.03(m,5H).
13CNMR(400MHz,CDCl3)δ143.65(s),130.28(s),128.95(s),125.69(s),121.38(s),109.62(s),61.87(s),57.85(s),36.36(s),28.17(s),26.26(s),25.90(s).
本发明对杂质Ⅰb(即合成路线中的5b)进行合成及对杂质进行核磁共振光谱(lH-NMR，l3C-NMR)及质谱(MS)结构确认，具体如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.31(d,J＝2.2Hz,1H),7.01(d,J＝2.0Hz,1H),5.41(s,2H),3.59(s,2H),2.41(t,J＝10.8Hz,1H),2.11(s,3H),1.80(d,J＝10.4Hz,4H),1.61(t,J＝16.7Hz,1H),1.38–1.03(m,5H),
13CNMR(400MHz,CDCl3)δ142.94(s),130.98(s),130.04(s),126.20(s),119.84(s),107.65(s),61.86(s),57.59(s),36.36(s),28.14(s),26.25(s),25.88(s).
本发明对杂质Ⅰa和杂质Ⅰb进行研究，确定为高效液相测定图谱中相对主峰保留时间约为0.89的杂质。经Q-tof分析及该杂质的裂解途径与盐酸溴己新比较，确定为苯环上一个“溴取代基”被“氯取代基”替换，为合成反应副产物，但因两者在HPLC的图谱上显示为同一峰，因此，本发明人在以下的实验中将该单一峰定为杂质I。
为控制盐酸溴己新原料产品中上述两种杂质的含量，需要对两种杂质进行含量测定。为此，本发明提出了两种杂质的检测方法，所述的检测方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液的配制：取本品，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含2.5mg的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，精密量取杂质Ⅰa和杂质Ⅰb纯品，加甲醇稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照溶液。
或，用自身对照法：精密量取供试品溶液适量，加甲醇稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照溶液。
步骤3，取对照溶液10μl，注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％。
步骤4，精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
步骤5，根据色谱图，计算杂质Ⅰa和杂质Ⅰb的含量。
上述高效液相色谱法色谱条件如下：固定相为C18；柱温为40℃；0.1％磷酸二氢钾缓冲液(0.5mol/L氢氧化钠调节pH7.0)－乙腈(20︰80)为流动相，检测波长为245nm。
线性关系及校正因子考察证明：盐酸溴己新和各已知杂质A、B、C、D及杂质Ⅰ的线性关系均良好，和已知杂质的校正因子均＜1.0，故不再进行校正因子的计算，而采用自身对照法测定。
对于盐酸溴己新的制剂，本发明也提供了一种方法，如对于片剂或注射剂，测定方法主要包括供试品溶液的配制，方法为，将片剂研磨成细粉，称取细粉适量(其中含有盐酸溴己新约50mg)，置20ml量瓶中，加甲醇适量超声使盐酸溴己新溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
其他步骤和盐酸溴己新原料的检测方法相同。
对于注射剂，方法为，取注射剂(其中含有盐酸溴己新约50mg)，置20ml量瓶中，加甲醇适量超声使盐酸溴己新溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
其他步骤和盐酸溴己新原料的检测方法相同。
本发明的检测方法是经过实验获得的，实验过程如下：
一、色谱条件确立
ChP2010和EP8.0、BP2013、IP2010及JP16流动相基本一致，故分别配制各已知杂质溶液及混合标准溶液(供试品溶液中加各已知杂质)，采用ChP系统考察各已知杂质，同时按EP方法配制系统适用性溶液考察分离度，结果见表1，图1。
表1：按ChP2010方法试验的各杂质溶液及混标溶液色谱参数
结论：杂质A、B、C、D、E、杂质Ⅰa及杂质Ⅰb均能与主峰相分离，且分离度均能达到要求；杂质Ⅰa及杂质Ⅰb在液相色谱中呈现同一个峰。
依照EP配制系统适用性溶液，依法测定，结果见表2及图2。
表2：按EP方法试验的系统适用性结果
上述结果表明，采用ChP2010方法，各杂质间及主峰与杂质间分离度均良好，故采用ChP2010方法进行有关物质检查。
二、系统适用性溶液
通过我们的研究表明，在溴己新原料中杂质Ⅰ(试验过程中也曾命名为杂质Ⅰa、杂质Ⅰb)的含量最高，因此以此作为系统适用性溶液，结果见表3，图3。
表3：系统适用性溶液依ChP2010方法试验的系统适用性结果
上述结果表明，采用ChP2010方法，溴己新杂质Ⅰa与主峰间分离度符合规定，在混合杂质HPLC色谱图中，杂质Ⅰa的RRT为0.89，为与主峰最靠近的已知杂质。
三、检测波长
EP8.0/BP2013/IP2010采用248nm为测定波长，而ChP及JP采用245nm为测定波长，已对同一批样品供试品溶液(批号：Q02131113)，分别于245nm及248nm波长处测定，结果一致，故拟定标准测定波长同ChP2010。
表4：不同检测波长下测定的含量
RRT 245nm测定结果 248nm测定结果
0.24 0.003％ 0.003％
0.52 0.008％ 0.007％
0.58 0.008％ 0.006％
0.89 0.030％ 0.028％
总杂 0.049％ 0.043％
四、浓度的确定
ChP为2.5mg/ml，进样10μl(JP为5mg/ml，进样5μl)，而EP等为5mg/ml，进样量均10μl。对各杂质定量限进行考察，结果见表5，表6。
表5：各已知杂质的定量限
结论：ChP2010版方法灵敏度已很高，完全能满足有关物质的检测。
表6：不同浓度测定的有关物质含量
结论：5mg/ml与2.5mg/ml的检测浓度对测定结果无影响，因此按照ChP2010版方法，浓度为2.5mg/ml，进样10μl。
五、强制降解试验
取本品11份，每份约50mg，分别置20ml量瓶中，各加甲醇适量，振摇使溶解。分别进行如下方法处理：
⑴未破坏样品，按正常有关物质检查方法新鲜配制供试品溶液；
⑵加入1mol/L盐酸溶液0.5ml，放置2小时，加碱中和至中性再加甲醇稀释至刻度作为酸破坏供试品溶液；
⑶加入1mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，放置2小时，加酸中和至中性再加甲醇稀释至刻度作为碱破坏供试品溶液；
⑷加入30％过氧化氢溶液2ml，放置2小时，加甲醇稀释至刻度作为氧化破坏供试品溶液；
⑸加甲醇稀释至刻度，在80℃水浴中放置2h，作为热破坏供试品溶液；
⑹加甲醇稀释至刻度，在4500Lx光照强度下放置40h，作为光破坏供试品溶液；
⑺加入20μl的30％H2O2，加甲醇稀释至刻度，在4500Lx光照强度下放置40h，作为光氧破坏供试品溶液；
⑻加甲醇稀释至刻度，在紫外灯光下放置40h，作为紫外光破坏供试品溶
⑼加入20μl的30％H2O2，加甲醇稀释至刻度，在紫外灯光照强度下放置40h，作为紫外光氧破坏供试品溶液；
⑽加甲醇稀释至刻度，在太阳照射下放置2h，作为太阳光破坏供试品溶液；
⑾加入20μl的30％H2O2，加甲醇稀释至刻度，在太阳光照射下放置2h，作为太阳光氧破坏供试品溶液；
上述溶液，各进样10μl测定，见图4～14。结果表明，上述HPLC法能使盐酸溴己新破坏的降解产物与主峰均能获得良好的分离并得到有效检测，物料基本质量守恒。
结论：本品仅对太阳光照射比较敏感，产生一个比较明显的杂质，其余条件下均比较稳定。产生的杂质均与主峰分离度良好。
六、线性关系及校正因子考察
分别取盐酸溴己新及各已知杂质适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成系列线性溶液5％～120％(以0.2％限度为100％)，分别取上述线性溶液各进样10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为x轴，峰面积为y轴，进行线性回归，结果见表7。盐酸溴己新和各已知杂质的线性关系均良好。
表7：已知杂质和盐酸溴己新的HPLC线性
名称 线性方程 相关系数(r) 线性范围(μg/ml)
盐酸溴己新 y＝13.917x+0.7397 0.9995 0.25～6.08
杂质A y＝21.366x+1.5964 0.9996 0.22～5.30
杂质B y＝26.542x+1.1902 0.9996 0.29～6.88
杂质C y＝17.779x+0.6474 0.9995 0.23～5.55
杂质D y＝20.189x+3.1066 0.9985 0.47～5.61
杂质Ⅰa y＝14.497x+0.6512 0.9994 0.30～7.13
表8各已知杂质校正因子
名称 线性方程斜率 校正因子
盐酸溴己新 13.917 /
杂质A 21.366 0.65
杂质B 26.542 0.52
杂质C 17.779 0.78
杂质D 20.189 0.69
杂质Ⅰa 14.497 0.96
从上述数据可知，已知杂质的校正因子均＜1.0，故不再进行校正因子的计算，而采用自身对照法测定，更严格地控制了产品质量。
说明：杂质E配制成溶液后极不稳定，故未进行线性及回收率考察。
七、重复性试验
取盐酸溴己新原料(批号：Q02131113)约25mg，6份，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇震摇溶解，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，依法测定，计算各杂质含量。结果见表9。
表9：盐酸溴己新原料药有关物质检查重复性试验结果
结论：重复性符合规定
八、准确度实验
分别取盐酸溴己新的原料药(批号：Q02131113)250mg共9份，分别置不同100ml量瓶中，分别加各已知杂质贮备溶液0.25、0.5和0.75ml各3份，各加甲醇稀释至刻度，摇匀，制备成低、中、高三种浓度的供试品溶液(50％，100％和150％，以0.2％限度为100％)，依法测定，计算回收率，结果见表10。
表10：盐酸溴己新原料药有关物质检查回收率试验结果
结论：各已知杂质的回收率在80～120％范围内，RSD小于10％，回收率良好。
九、溶液稳定性考察
取供试品溶液(批号：Q02131113)，分别于0、4、8、10、12、24小时进行有关物质测定，结果见表11，可见供试品溶液在12小时内基本稳定。
表11：供试品溶液稳定性
(h) 最大单杂(％) 杂质总量(％)
0 0.029 0.097
4 0.032 0.108
8 0.031 0.097
10 0.031 0.107
12 0.032 0.111
24 0.030 0.114
JP规定避光操作，室内环境条件供试品溶液稳定，但破坏试验显示，本品在太阳照射下放置2h，杂质明显增加，故进行有关物质测定应避光操作。
十、耐用性考察
(a)柱温改变
表12：不同柱温条件下耐用性考察结果
(b)流速改变
表13：不同流速条件下耐用性考察结果
(C)检测波长改变
表14：不同检测波长条件下耐用性考察结果
结论：本法耐用性较好。
(d)色谱柱改变
各国药典均采用C18柱，但国外药典的色谱柱规格均比较特殊，而ChP未规定色谱柱。现分别采用国内常规色谱柱(4.6mm及5μm)250mm(AgilentECLIPSExdB-C18)及150mm柱(kromasil100-5及AgilentZorboxSB-C18)对EP系统适用性溶液及混供试品溶液进行考察，结果见表15-16。
表15：按ChP2010方法试验的各杂质溶液及混标溶液色谱参数
结论：色谱柱耐用性较好。
表16：不同色谱柱有关物质测定结果(批号Q02131113)
结果表明，不同色谱柱测定同一批产品有关物质没有明显差异。
以下为盐酸溴己新片有关物质检查方法验证：
十二、强制降解试验
本品细粉适量(约相当于盐酸溴己新50mg)5份(批号：120350)，分别置20ml量瓶中，加甲醇适量超声使盐酸溴己新溶解，分别进行如下方法处理：
用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为未破坏供试品溶液；
加入1mol/L盐酸溶液0.5ml，放置4小时，加碱中和至中性再加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为酸破坏供试品溶液；
加入1mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，放置4小时，加酸中和至中性再加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为碱破坏供试品溶液；
加入30％过氧化氢溶液2ml，放置2小时，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为氧化破坏供试品溶液；
直接取未破坏供试品溶液，在4500Lx光照强度下放置2h，作为光破坏供试品溶液；
上述溶液，各进样10μl测定，见图1～5。
色谱柱：Kromasil100-5C18，4.6×150，5μm
结果：上述HPLC法能使盐酸溴己新片破坏的降解产物与主峰均能获得良好的分离并得到有效检测。
十三、重复性试验
取盐酸溴己新片(批号：120350)适量(约相当于盐酸溴己新25mg)，6份，精密称定，分别置10ml量瓶中，加甲醇震摇溶解，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；分别取上述溶液各进样10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算各杂质含量。结果见表17。
表17：盐酸溴己新片有关物质检查重复性试验结果
结果：精密度较好。
十四、准确度试验
分别取盐酸溴己新片适量(约相当于250mg，批号为：120350)共9份，分别置100ml量瓶中，分别加各已知杂质贮备溶液0.25、0.50和0.75ml各3份(同盐酸溴己新)，各加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为低、中、高浓度的供试品溶液(50％，100％和150％，以0.2％的限度为100％)，依法测定，计算每份的回收率，结果见表18。
表18：盐酸溴己新片有关物质检查回收率试验结果
结果：各已知杂质的回收率在80～120％范围内，RSD小于10％，回收率良好。十五、溶液稳定性考察
取“重复性试验”项下的一份供试品溶液，放置24h小时，取不同时间依法测定，杂质无明显变化，表明在24小时内供试品溶液稳定。
十六、耐用性考察
分别对柱温、流速及检测波长进行了细微的改变，分别进样系统适用性溶液、原料供试品溶液及对照溶液，结果如下：
(a)柱温改变
表19：不同柱温条件下耐用性考察结果
(b)流速改变
表20：不同流速条件下耐用性考察结果
(C)检测波长改变
表21：不同检测波长条件下耐用性考察结果
(d)色谱柱改变
各国药典均采用C18柱，但国外药典的色谱柱规格均比较特殊，而ChP未规定色谱柱。现分别采用国内常规色谱柱(4.6mm及5μm)250mm(AgilentECLIPSExdB-C18)及150mm柱(kromasil100-5及AgilentZorboxSB-C18)对EP系统适用性溶液及混供试品溶液进行考察，结果见表22-23。
表22：按ChP2010方法试验的各杂质溶液及混标溶液色谱参数
结论：色谱柱耐用性较好。
表23：不同色谱柱有关物质测定结果(批号Q02131113)
结果表明，不同色谱柱测定同一批产品有关物质没有明显差异。
附图说明
图1：依ChP2010版标准混标溶液HPLC图
图2：依EP8.0配制标准系统适用性溶液HPLC图
图3：依ChP2010方法试验的系统适用性溶液HPLC图
图4：盐酸溴己新未破坏HPLC图
图5：盐酸溴己新酸破坏HPLC图
图6：盐酸溴己新碱破坏HPLC图
图7：盐酸溴己新氧化破坏HPLC图
图8：盐酸溴己新热破坏HPLC图
图9：盐酸溴己新光破坏HPLC图(光照箱)
图10：盐酸溴己新光破坏HPLC图(紫外灯)
图11：盐酸溴己新光破坏HPLC图(太阳光照射2h)
图12：盐酸溴己新光破坏HPLC图(可见光+20μl的30％H2O2)
图13：盐酸溴己新光破坏HPLC图(紫外灯+20μl的30％H2O2)
图14：盐酸溴己新光破坏HPLC图(太阳光照射2h+20μl的30％H2O2)
图15：依ChP2010版标准混标溶液HPLC图
图16：盐酸溴己新有关物质测定0.1％对照溶液HPLC图
图17：盐酸溴己新有关物质测定HPLC图
图18：盐酸溴己新(批号：Q02131116)有关物质测定HPLC图
图19：盐酸溴己新(批号：20130801M)有关物质测定HPLC图
图20：盐酸溴己新片未破坏HPLC图
图21：盐酸溴己新片酸破坏HPLC图
图22：盐酸溴己新片碱破坏HPLC图
图23：盐酸溴己新片氧化破坏HPLC图
图24：盐酸溴己新片光破坏HPLC图(光照箱)
图25：依ChP2010版标准混标溶液HPLC图
图26：盐酸溴己新片有关物质测定0.2％对照溶液HPLC图
图27：盐酸溴己新片有关物质测定溶剂HPLC图
图28：盐酸溴己新片(批号：120350)有关物质测定HPLC图
图29：盐酸溴己新片(批号：26111001)有关物质测定HPLC图
图30：盐酸溴己新片(批号：140202)有关物质测定HPLC图
具体实施方式
实施例是对本发明的进一步解释与说明，不意味以任何方式限制本发明的范围。
以下为盐酸溴己新有关物质检查方法实施例：
实施例1盐酸溴己新的合成
1.溴化工段
(1)原铺料投料配比
原辅料名称 规格、型号 数量/kg
邻氨基苯甲酸甲酯 ≥98％，工业级 53～55
1,2-二氯乙烷 ≥99％，工业级 100+200+40
溴素 ≥99％，工业级 59.5～60.5(2瓶)
双氧水 ≥27.5％，工业级 46
液碱 ≥31％，工业级 3～8
(2)工艺过程
向洁净的溴化锅中加入二氯乙烷，邻氨基苯甲酸甲酯，内温控制45℃以下，缓慢均匀滴加溴素。滴加溴素完毕，内温控制45～55℃，缓慢均匀滴加双氧水，恒温50±5℃反应2小时。然后滴加液碱，停搅拌，静止分层，有机液转移至还原锅中。
2.还原工段
(1)原铺料投料配比
原辅料名称 规格、型号 数量/kg
无水氯化钙 ≥99％，工业级 66
酒精 ≥95％，工业级 80/370
催化剂 ≥99％，工业级 4
四氢硼钾 ≥97％，工业级 48
盐酸 15％ 246
液碱 ≥31％，工业级 37～45
水 自来水 180+370
(2)工艺过程
向氯化钙桶中加水180kg，加无水氯化钙，搅拌溶解备用；减压回收还原锅中二氯乙烷至尽，趁热向还原釜抽入酒精，搅拌10分钟至全溶解，内温控制30～35℃，搅拌下加入四氢硼钾，内温控制45～55℃，缓慢均匀滴加氯化钙溶液。滴毕，升温回流5小时，减压回收稀乙醇至尽，冷却至内温＜40℃，缓慢加入15％盐酸，继续冷却至内温＜10℃，放料过滤，水洗至近中性；向还原釜中加水370kg，搅拌下加入还原物滤饼，搅拌10分钟，冷却下滴加液碱，滴加完毕，搅拌10分钟，放料过滤，水洗至近中性，甩干，干燥，约得还原物95kg，mp152～154。
3.缩合----成盐工段
(1)原铺料投料配比
原辅料名称 规格、型号 数量/kg
还原物 合格品，自产 2批
N-甲基环己胺 ≥99％，工业级 200～216
甲苯 ≥99％，工业级 5
冰醋酸 ≥99％，工业级 85～92
丙酮 ≥99％，工业级 270+50
盐酸 15％ 200
(2)工艺过程
在洁净干燥的搪玻璃电加热缩合锅内加入还原物、冰乙酸，N-甲基环己胺，开启搅拌，合上电加热电源进行加热。内温达到146～148℃时开始回流分水，分水过程中内温缓慢上升，最后达到175～180℃，锅内基本分不出水为止，反应结束，物料转移至成盐结晶锅；
蒸馏回收溶剂，减压脱尽前沸，开夹套冷却水进行冷却，内温＜30℃时，加入丙酮，然后缓慢加入15％盐酸，调节溶液PH为1～2，加毕后搅拌10分钟，冰盐水冷却至10℃左右，结晶15小时；放料过滤，丙酮淋洗，滤饼经80℃真空干燥，得盐酸溴己新粗品约220～240kg。
4、脱色精制工段
(1)原铺料投料配比
原辅料名称 规格、型号 数量/kg
粗品 合格品，自产 50Kg
乙醇 ≥95％，药用 600±5Kg
活性炭 药用 2.5Kg
盐酸 CP 适量
在1000L脱色精制锅中，加入550±5Kg95％乙醇，搅拌下加入盐酸溴己新粗品50Kg、用适量盐酸调节溶液pH＝2～3，加热溶解后复测溶液pH＝2～3不变。然后加活性炭2.5Kg，加热升温至回流，保温回流1小时。回流结束，趁热过滤至结晶锅，过滤结束用50Kg95％乙醇洗涤脱色锅、过滤器及管路，洗液并入结晶锅内。冷却至锅内温10℃左右，料液过滤，滤饼用95％乙醇洗涤，充分甩干，在回转真空干燥器中进行干燥，干燥温度80℃，真空度-0.08Mpa左右，干燥5-8小时，得精制品约45-47kg，精制母液可回收盐酸溴己新粗品，回收乙醇经蒸馏处理检测合格后套用。
实施例2盐酸溴己新原料有关物质测定
1.取盐酸溴己新原料约25mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇震摇溶解，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
2.精密量取适量，加甲醇稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照溶液。
3.取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％。
4.精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。计算各杂质含量。
色谱条件：固定相为C18；柱温为40℃；0.1％磷酸二氢钾缓冲液(0.5mol/L氢氧化钠调节pH7.0)－乙腈(20︰80)为流动相，检测波长为245nm。
将收集到的不同生产厂家各3批市场样品，按上述方法测定，结果见表17，代表性图谱见图16～19。
表24不同厂家盐酸溴己新有关物质测定结果
实施例3盐酸溴己新片有关物质测定
1.取本品细粉适量(约相当于盐酸溴己新50mg)，置20ml量瓶中，加甲醇适量超声使盐酸溴己新溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇稀释制成每1ml中含盐酸溴己新5μg的溶液，作为对照溶液。
2.照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％。
3.精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
色谱条件：同上
将收集到的不同生产厂家各3批样品，依法测定，结果见表23，代表性图谱见图26～30。
表25：不同厂家盐酸溴己新片有关物质测定结果
批号 杂质Ⅰ 最大单一杂质 总杂
120350 0.013 0.016 0.064
120339 0.019 0.024 0.078
B01130108 0.028 0.021 0.095
26111001 0.092 0.019 0.17
26111201 0.07 0.011 0.1
140202 0.031 0.022 0.08
140142 0.028 0.021 0.071
140143 0.029 0.027 0.083
120350 0.01 0.01 0.05
120339 0.02 0.01 0.09
B01130108 0.04 0.02 0.1
26111001 0.09 0.09 0.25
26111201 0.07 0.02 0.11
140202 0.03 0.02 0.08
140142 0.03 0.02 0.07
140143 0.03 0.03 0.08
实施例4杂质Ⅰa或Ⅰb(N-甲基-N-环己基-2-氨基-3-氯-5-溴苯甲胺或N-甲基-N-环己基-2-氨基-3-溴-5-氯苯甲胺)的合成
(1)化合物2a(2b)的制备
将1a(1b)(9.28g，50mmol)溶于300mL的氯仿中，降温至0度，滴加液溴(8.8g，55mmol)，加完后在20度下搅拌过夜，有白色固体析出。过滤，干燥滤饼得到粗品2a(2b)12.5g。
(2)化合物3a(3b)的制备
将2a(2b)(12g，34.7mmol)加入到180ml无水THF中，N2保护下降温至0度，分批加入四氢铝锂(2.64g，69.4mmol)，室温搅拌1小时，TLC显示反应完全，滴加15ml乙酸乙酯淬灭反应，搅拌半小时后过滤，浓缩滤液，得到10g白色粉末(含有少量无机盐)。
(3)化合物4a(4b)的制备
将3a(3b)(5.5g，23.2mmol)加入到30ml无水DCM中，加入二氯亚砜(1.5ml，21mmol)，室温搅拌2小时，减压浓缩干，得到6g白色固体。
注：不要水洗，否则会水解回去。
(4)化合物5a(5b)的制备
将N-甲基环己基胺(9g，79.5mmol)溶解到100mlDCM中，降温至-10度，分批加入4a(4b)(4g，15.7mmol)，室温搅拌过夜。浓缩后柱层析分离(PE:EA＝200:1)得到产物,浅黄色固体。
注：4a(4b)不能加太快，否则会出现2分子4a(4b)与N-甲基环己基胺反应。

Claims (9)

1.结构如下的化合物，其化学名称为N-甲基-N-环己基-2-氨基-3-氯-5-溴苯甲胺
2.权利要求1的化合物在盐酸溴己新杂质测定中作为对照品的应用。
3.一种盐酸溴己新原料中杂质的测定方法，其特征在于，包括使用权利要求1的化合物作为对照品。
4.根据权利要求3的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，供试品溶液的配制：取盐酸溴己新原料，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中含2.5mg的溶液，作为供试品溶液；
步骤2，精密量取杂质Ⅰa和杂质Ⅰb纯品，加甲醇稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照溶液；
或，用自身对照法：精密量取供试品溶液适量，加甲醇稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照溶液；
步骤3，取对照溶液10μl，注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％；
步骤4，精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍；
步骤5，根据色谱图，计算杂质Ⅰa和杂质Ⅰb的含量；
上述高效液相色谱法色谱条件如下：固定相为C18；柱温为40℃；0.1％磷酸二氢钾缓冲液－乙腈为流动相，检测波长为245nm，其中，磷酸二氢钾缓冲液用0.5mol/L氢氧化钠调节至pH7.0，磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的比例是20：80
其中，杂质Ib是
5.一种盐酸溴己新制剂中杂质的测定方法，包括使用权利要求1的化合物作为对照品。
6.根据权利要求5的测定方法，包括以下步骤：
(1)取盐酸溴己新制剂适量，粉碎后取相当于盐酸溴己新50mg的粉末，置20ml量瓶中，加甲醇适量超声使盐酸溴己新溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液；
(2)精密量取杂质Ⅰa和杂质Ⅰb纯品，加甲醇稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照溶液；
或，用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，加甲醇稀释制成每1ml中含盐酸溴己新5μg的溶液，作为对照溶液；
(3)照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％；
(4)精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
(5)根据色谱图，计算杂质Ⅰa和杂质Ⅰb的含量；
其中，杂质Ib是
7.一种盐酸溴己新片剂或注射剂中杂质的测定方法，包括使用权利要求1的化合物作为对照品。
8.根据权利要求7的测定方法，包括以下步骤：
(1)取盐酸溴己新片剂适量，粉碎后取相当于盐酸溴己新50mg的粉末，置20ml量瓶中，加甲醇适量超声使盐酸溴己新溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液；
(2)精密量取杂质Ⅰa和杂质Ⅰb纯品，加甲醇稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照溶液；
或，用自身对照法：精密量取适量供试品溶液，加甲醇稀释制成每1ml中含盐酸溴己新5μg的溶液，作为对照溶液；
(3)照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％；
(4)精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
(5)根据色谱图，计算杂质Ⅰa和杂质Ⅰb的含量；
其中，杂质Ib是
9.根据权利要求4,6,8任何一项所述测定方法，其特征在于，杂质Ⅰa或杂质Ⅰb的主峰相对保留时间为0.89。
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