CN103896997B - 一种肉苁蓉中毛蕊花糖苷的分离纯化方法 - Google Patents
一种肉苁蓉中毛蕊花糖苷的分离纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种肉苁蓉中毛蕊花糖苷的分离纯化方法,所述方法步骤如下:将新鲜肉苁蓉切片,用沸水或饱和蒸汽烫熟,粉碎后用乙醇提取三次,提取液浓缩除去乙醇,浓缩液加水稀释过滤,滤液上大孔吸附树脂或聚酰胺树脂吸附,乙醇洗脱,收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液浓缩并喷雾干燥得毛蕊花糖苷粗品,含量为60%以上,将粗品用水溶解,再上大孔吸附树脂或聚酰胺树脂吸附,乙醇洗脱,收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液浓缩并喷雾干燥得毛蕊花糖苷精品,含量95%以上。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种植物中有效成分的提取方法,特别涉及一种肉苁蓉中毛蕊花糖苷的分离纯化方法。
二、技术背景
肉苁蓉有沙漠人参的美誉,是历代中医补肾壮阳的药物。肉苁蓉是寄生草本植物,新疆、内蒙古、甘肃、青海等地都有野生的肉苁蓉生长,而且已经可以人工种植,该植物多寄生于生长在沙漠、沙地、沙丘、盐碱地等地区的红柳、梭梭的根部,药用部位取未开花的埋在地下的肉质茎。《中国药典》2010版收载的肉苁蓉为列当科植物CistanchedeserticolaY.C.Ma和管花肉苁蓉Cistanchetubulosa(Schrenk)Wight干燥带鳞叶的肉质茎。本草纲目曰:“肉苁蓉气温、味干咸无毒,主五劳七伤,补中、除寒热痈,养五脏,壮阳,益精气”,“久服轻身,除膀胱邪气腰痛,止痢,益髓,悦颜色,延年,大补壮阳”,《神农本草》将肉苁蓉列为上品。现代科学研究表明,肉苁蓉含有多糖、苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、木质素等化学成分,特别是苯乙醇苷中的毛蕊花糖苷具有治疗慢性肾小球肾炎等多种医药用途,从肉苁蓉中提取分离高含量的毛蕊花糖苷用于药物开发具有重要意义。
国内已经申请的从肉苁蓉中提取分离毛蕊花糖苷的专利有:1.中山大学等申请的《一种生产毛蕊花糖苷单体化合物的方法》,专利申请号为200910041647.8;2.中山大学等申请的《一种毛蕊花糖苷单体化合物的生产方法》,专利申请号为200910041641.0;3.中山大学等申请的《一种利用生物催化转化生产毛蕊花糖苷的方法》,专利申请号为200910041559.8;4.《一种采用固定化酶生产毛蕊花糖苷的方法》,专利申请号为200910041643.X;5.《一种利用新鲜肉苁蓉生产毛蕊花糖苷的方法》,专利申请号为200910041646.3;6.《一种新鲜肉苁蓉经生物催化转化生产毛蕊花糖苷的方法》,专利申请号为200910041649.7。以上专利中的制备方法都是要先通过β-葡萄糖苷酶经生物催化转化的方法将肉苁蓉中的松果菊苷转化为毛蕊花糖苷,再用工业色谱法进行纯化,不但制备工艺复杂,而且生物催化转化用的催化剂β-葡萄糖苷酶价格昂贵,难以买到,不适合工业化大生产。我们开发的工艺只需将提取液直接上大孔树脂或聚酰胺树脂进行纯化,含量就可以达到95%以上。
毛蕊花糖苷,英文名:Acteoside,分子结构式如下:
化学式:C29H36O15,分子量:624.59,CAS号:61276-17-3
三、发明内容
本发明的目的是提供一种从肉苁蓉中分离纯化毛蕊花糖苷的方法,该方法制备工艺简单,产品含量高,成本低,适合于工业化生产。
本发明的制备方法包括以下步骤:
1)将肉苁蓉切片;
2)用沸水或饱和蒸汽烫熟;
3)用乙醇提取,提取液浓缩除去乙醇,浓缩液加水稀释,过滤;
4)滤液上大孔吸附树脂或聚酰胺树脂吸附,用乙醇洗脱,收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液浓缩,干燥得毛蕊花糖苷粗品;
5)将粗品用水溶解,再上大孔吸附树脂或聚酰胺树脂吸附,乙醇洗脱,收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液浓缩,干燥得毛蕊花糖苷精品。
其中,
步骤1)中所述的肉苁蓉的切片厚度为1mm-20mm。
步骤2)中所述烫熟时间为1-60分钟,优选10-30分钟,如用蒸汽蒸30分钟;
步骤3)所述乙醇提取是回流提取或超声提取;提取次数为1-3次,提取时间为1-3小时,每次提取乙醇加入量为生药重量的2-10倍(v/w)(举例:1克生药加入2-10ml的乙醇进行提取),所述乙醇浓度是0%-95%(v/v);优选乙醇浓度是0%,80%,95%。所述加水量是浓缩液的2倍-25倍,优选10倍-25倍。
步骤4)所述大孔树脂,型号选自:D101,AB-8,HPD100,HPD-200,HPD-200A,HPD-400,HPD-400A,HPD600,HPD750,优选大孔树脂型号选自:D101,AB-8,HPD100,HPD200A,HPD400。所述聚酰胺树脂,目数为:20目-200目;所述乙醇浓度是0%-95%(v/v);优选乙醇浓度是30-60%。
步骤5)所述大孔树脂,型号为:D101,AB-8,HPD100,HPD-200,HPD-200A,HPD-400,HPD-400A,HPD600,HPD750,优选大孔树脂型号选自:D101,AB-8,HPD100,HPD200A,HPD400。所述聚酰胺树脂,目数为:20目-200目;所述乙醇浓度是0%-95%(v/v)优选乙醇浓度是30-60%。
优选的本发明第一次过树脂采用大孔树脂或聚酰胺树脂,第二次过树脂采用不同的树脂,如第一次若采用了聚酰胺树脂,则第二次采用大孔树脂,若第一次采用了大孔树脂,则第二次采用聚酰胺树脂。
和现有技术相比,本发明的优点如下:
1.本发明不使用价格昂贵、来源困难的β-葡萄糖苷酶作为酶解试剂,工艺路线更简洁,更容易实现工业化生产。
2.采用本发明制备的毛蕊花糖苷含量比现有技术制备的毛蕊花糖苷含量高,能够满足申报新药对含量的要求。
为检测毛蕊花糖苷含量,本发明提供了一种毛蕊花糖苷的检测方法:
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定。
1.所用仪器和设备
Agilent1260高效液相色谱仪(配有:四元泵、标准型自动进样器、柱温箱、AgilentDAD检测器);电子天平(感量0.0001g);超声波清洗仪;玻璃回流装置;电热恒温水浴锅;玻璃仪器(各规格移液管或移液器、各规格容量瓶等);
2.所需试剂和药品
毛蕊花糖苷(含量≥98%);甲醇、乙腈为色谱纯,水为超纯水。
3.溶液配制
标准溶液:称取毛蕊花糖苷对照品5.0mg,置于10mL的容量瓶中,用洗脱剂定容至刻度,作为对照品储备液。
样品溶液:精密称取一定质量的样品置于容量瓶中,以洗脱液溶解定容,配制成一定浓度的样品溶液,使之峰面积在线性范围之内。
4.测定步骤
4.1.色谱条件
色谱柱:AgilentZORBAXEclipsePlusC18(4.6mm×250mm,5μm);柱温:20℃;流动相:乙腈、水梯度洗脱,洗脱程序见下表;流速:1mL/min;检测波长:334nm。
表1洗脱程序
4.2.标准曲线的绘制
精密毛蕊花糖苷储备液0.2mL,用高效液相自动进样器分别进样2、4、6、8、10、12uL,以峰面积对进样质量进行线性回归,绘制标准曲线。
4.3.样品含量测定
将样品过0.45um微孔滤膜,进样10uL,得出峰面积,以外标法测定样品溶液中毛蕊花糖苷的含量。
4.4.计算公式
样品中毛蕊花糖苷(g/100g)的浓度计算公式为:
C(g/100g)=(Cx×V)×100/Ms
式中:Cx—样品溶液中毛蕊花糖苷的浓度(mg/mL);
V—样品溶液体积,mL;
Ms—样品重量(mg)。
四、具体实施方式:
通过实例继续进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。
实施例一
将200公斤新鲜肉苁蓉(毛蕊花糖苷折干含量为5.2%)切片,厚度为8mm,投入1000公斤沸水中,加热回流提取2小时,按以上方法再提取两次,合并三次水提液,上HPD400大孔树脂柱吸附,先用水洗去多糖等大极性杂质,然后用40%乙醇洗脱,液相跟踪,合并毛蕊花糖苷含量高的组分,浓缩干燥得毛蕊花糖苷粗品3.4公斤,液相色谱检测含量为62.2%。
将毛蕊花糖苷粗品加10倍水溶解,再上100目的聚酰胺树脂柱吸附,用50%乙醇洗脱,液相跟踪,合并毛蕊花糖苷含量高的洗脱液组分,浓缩干燥得毛蕊花糖苷1.9公斤,液相色谱检测含量为95.7%。
实施例二
将200公斤新鲜肉苁蓉(毛蕊花糖苷折干含量为5.2%)切片,厚度为3mm,投入提取罐中,从罐底通蒸汽30分钟将其蒸熟,加95%乙醇800公斤,超声提取1.5小时,提取三次,合并三次提取液,减压浓缩至无乙醇味,加水1000公斤,过滤,上HPD200A大孔树脂柱吸附,先用水洗去杂质,再用30%乙醇洗脱,液相跟踪合并毛蕊花糖苷含量高的洗脱组分,浓缩干燥得毛蕊花糖苷粗品3.2公斤,液相检测含量为68.6%。
将毛蕊花糖苷粗品加12倍水溶解后上聚酰胺树脂吸附,用45%乙醇洗脱,液相跟踪,合并含量高的组分减压浓缩干燥得毛蕊花糖苷1.8公斤,液相检测含量为96.4%。
实施例三
将200公斤新鲜肉苁蓉(毛蕊花糖苷折干含量为5.2%)切片,厚度为2mm,投入提取罐中,用饱和蒸汽蒸熟,加80%乙醇1000公斤,回流提取2小时,提取三次,合并提取液减压浓缩至无乙醇味,加水800公斤过滤,滤液上聚酰胺树脂吸附,先用水洗掉杂质,然后用50%乙醇洗脱,液相跟踪,毛蕊花糖苷含量高的组分合并,减压浓缩干燥得毛蕊花糖苷粗品3.5公斤,液相检测含量为61.8%。
将毛蕊花糖苷粗品加12倍水溶解后上AB-8大孔树脂柱吸附,用40%乙醇洗脱,合并毛蕊花糖苷含量高的洗脱组分,减压浓缩干燥得毛蕊花糖苷1.9公斤,液相检测含量为95.5%。
实施例四
将200公斤新鲜肉苁蓉(毛蕊花糖苷折干含量为5.2%)切片,厚度为5mm,投入提取罐中,用饱和蒸汽蒸熟,加1000公斤水回流提取2小时,提取三次,合并提取液过滤,滤液上聚酰胺树脂吸附,先用水洗掉杂质,然后用60%乙醇洗脱,液相跟踪,毛蕊花糖苷含量高的组分合并,减压浓缩干燥得毛蕊花糖苷粗品3.6公斤,液相检测含量为61.2%。
将毛蕊花糖苷粗品加10倍水溶解后上D101大孔树脂柱吸附,用50%乙醇洗脱,合并毛蕊花糖苷含量高的洗脱组分,减压浓缩干燥得毛蕊花糖苷1.8公斤,液相检测含量为96.3%。
Claims (6)
1.一种肉苁蓉中毛蕊花糖苷的分离纯化方法,所述方法步骤如下:
1)将肉苁蓉切片;
2)用沸水或饱和蒸汽烫熟;
3)用乙醇提取,提取液浓缩除去乙醇,浓缩液加水稀释,过滤;
4)滤液上大孔吸附树脂吸附,用乙醇洗脱,收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液浓缩,干燥得毛蕊花糖苷粗品;
5)将粗品用水溶解,再上聚酰胺树脂吸附,乙醇洗脱,收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液浓缩,干燥得毛蕊花糖苷精品;
或者,所述方法步骤如下:
1)将肉苁蓉切片;
2)用沸水或饱和蒸汽烫熟;
3)用乙醇提取,提取液浓缩除去乙醇,浓缩液加水稀释,过滤;
4)滤液上聚酰胺树脂吸附,用乙醇洗脱,收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液浓缩,干燥得毛蕊花糖苷粗品;
5)将粗品用水溶解,再上大孔吸附树脂吸附,乙醇洗脱,收集富含毛蕊花糖苷的洗脱液浓缩,干燥得毛蕊花糖苷精品,
其中,步骤1)中所述的肉苁蓉的切片厚度为1mm-20mm;步骤2)中所述的用沸水或饱和蒸汽烫熟的时间为1分钟-60分钟;步骤3)中所述提取用乙醇浓度为0%-95%,提取方式为超声波提取或热回流提取,
其中,步骤4)和步骤5)中所述大孔树脂型号选自:D101,AB-8,HPD100,HPD-200,HPD-200A,HPD-400,HPD-400A,HPD600,HPD750,所述聚酰胺树脂为20目-200目,洗脱用乙醇的浓度为0%-95%。
2.根据权利要求1的分离纯化方法,其特征在于,步骤2)中所述烫熟时间为10-30分钟;步骤3)所述乙醇提取是回流提取或超声提取;提取次数为1-3次,每次提取时间为1-3小时,每次提取乙醇加入量为生药重量的2-10倍,乙醇浓度是0%-95%。
3.根据权利要求1的分离纯化方法,其特征在于,步骤3)所述乙醇提取,乙醇浓度选自0%,80%,95%。
4.根据权利要求1的分离纯化方法,其特征在于,步骤4)和步骤5)所述大孔树脂型号选自:D101,AB-8,HPD100,HPD200A,HPD400,所述乙醇浓度是30-60%。
5.根据权利要求1的分离纯化方法,其特征在于,
将200公斤新鲜肉苁蓉切片,厚度为3mm,投入提取罐中,从罐底通蒸汽30分钟将其蒸熟,加95%乙醇800公斤,超声提取1.5小时,提取三次,合并三次提取液,减压浓缩至无乙醇味,加水1000公斤,过滤,上HPD200A大孔树脂柱吸附,先用水洗去杂质,再用30%乙醇洗脱,液相跟踪合并毛蕊花糖苷含量高的洗脱组分,浓缩干燥得毛蕊花糖苷粗品,
将毛蕊花糖苷粗品加12倍水溶解后上聚酰胺树脂吸附,用45%乙醇洗脱,液相跟踪,合并含量高的组分减压浓缩干燥得毛蕊花糖苷。
6.根据权利要求1的分离纯化方法,其特征在于,
将200公斤新鲜肉苁蓉切片,厚度为5mm,投入提取罐中,用饱和蒸汽蒸熟,加1000公斤水回流提取2小时,提取三次,合并提取液过滤,滤液上聚酰胺树脂吸附,先用水洗掉杂质,然后用60%乙醇洗脱,液相跟踪,毛蕊花糖苷含量高的组分合并,减压浓缩干燥得毛蕊花糖苷粗品,
将毛蕊花糖苷粗品加10倍水溶解后上D101大孔树脂柱吸附,用50%乙醇洗脱,合并毛蕊花糖苷含量高的洗脱组分,减压浓缩干燥得毛蕊花糖苷。
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