CN103664562B - 一种快速从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，属于天然产物分离纯化技术领域。本发明方法包括：将适量新鲜明日叶粉碎、匀浆，得到匀浆液；向匀浆液中加入复合酶并充分搅拌，过滤收集滤液，得滤液一；向滤液一中加入四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液，常温萃取1～2h，过滤收集滤液，得滤液二；将滤液二采用聚酰胺色谱柱进行层析分离、用乙醇洗脱、低压干燥后，得到查尔酮。本发明选用复合酶及非挥发性四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液有效替代传统挥发性有机溶剂的使用，最大程度地消除了挥发性有机溶剂的危害，消除了安全隐患。本方法制备得到的查尔酮纯品，其纯度为96%以上，得率为93%以上。

Description

一种快速从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法

技术领域

本发明属于天然产物分离纯化技术领域，具体涉及一种从新鲜明日叶中清洁化、快速提取查尔酮的方法。

背景技术

查尔酮（chalcone）是指一类分子中含有1,3-二苯基丙烯酮结构的天然化合物，在甘草、红花等多种药用植物的根、叶和皮中大量存在，其分子结构柔性较大，可与多种受体结合，表现出多方面的生物活性,已见诸报道的有抗肿瘤、抗寄生虫、抗HIV、抗菌、抗炎、抗血小板凝集等作用。

明日叶（Angelica keiskei Koidzumi）又名明日草、明月草、八丈草等，原产日本八丈岛、三浦两半岛等近海地方，是一种芹科草本植物，其具有抗衰老、降血糖、降血压、抗肿瘤等多重功效。明日叶中主要含有黄酮类及香豆素类化合物成分，其中黄酮类化合物则以查尔酮成分居多。作为一种含量丰富的天然查尔酮良好植物资源，国内外对于明日叶查尔酮的提取利用均有研究报道。

目前现有技术中从明日叶中提取查尔酮的方法主要为有机溶剂热浸法，提取溶剂多为甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，通过上述溶剂多次浸提得到粗提物后进行层析纯化而得查尔酮。例如：专利CN201010299189.0采用干叶为原料，经乙醇、乙酸乙酯、氯仿-甲醇混合液的多次萃取和两次柱分离得到查尔酮，该方法不仅有机溶剂数量多、用量大，而且两次柱分离使得产率低，耗时多、效率低；专利CN201010127425.0采用干明日叶粉为原料，经异戊醇、丙酮、氯仿、异丙醚等有机溶剂萃取、重结晶而得查尔酮，在该生产过程中选用了易燃易爆的丙酮、氯仿、异丙醚等有机溶剂，不仅污染大，而且安全隐患大；专利CN201110218657.1采用石油醚、丙酮、乙酸乙酯及其硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸钾等无机盐萃取制备查尔酮，不仅流程长、有机溶剂多，而且大量含磷废水排放还会造成水体富营养化；发明专利CN200910266615.8直接采用鲜明日叶为原料，简化了工艺步骤，但制备过程仍采用了乙酸乙酯、乙氰、二甲基亚砜等有机溶剂，污染问题仍没有得到解决。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提出了一种从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，本发明提取方法中没有采用有机溶剂，而且通过本方法制备得到的查尔酮纯品，经实验证实纯度达96%以上，得率达93%以上。

本发明技术方案包括：

一种从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，所述方法包括以下步骤：

a、将适量新鲜明日叶粉碎、匀浆，得到匀浆液；

b、向上述匀浆液中加入复合酶并充分搅拌，复合酶与所述新鲜明日叶的重量比为0.1～5：100，控制pH为5.0～6.0、温度为35～40℃、酶解40～60min，过滤收集滤液，得滤液一；

c、向所述滤液一中加入四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液，常温萃取1～2h，过滤收集滤液，得滤液二；

d、将步骤c所得滤液二过聚酰胺色谱柱进行层析分离、用乙醇洗脱，在55～60℃低压干燥后，即得查尔酮。

作为本发明的一个优选方案，上述步骤b中复合酶由纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶组成，上述纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶三者的质量比为5～8：2～5：1～2。

更进一步的，上述步骤c中，四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液与滤液一的体积比为2.5～3.5：1。

上述纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶三种组分的质量比为7：3：2。

上述步骤a中，加入水进行匀浆，水的加入量为新鲜明日叶体积的3～5倍。

上述步骤d层析分离中流速控制在1.5～2.0mL/min。

本发明所带来的有益技术效果：

（1）本发明以新鲜明日叶为原料，通过添加复合酶制剂有效降解细胞壁组织，大大降低了提取温度、相对缩短了提取时间，节能减排效果十分显著；由于该复合酶中包括植酸酶，有效降解明日叶细胞壁中的由半纤维素、植酸与钙镁离子形成的复合网状结构组织，不仅使得提取率提高，而且更有利于查尔酮的浓缩、纯化、缩短工艺流程、提高生产效率。

（2）由纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶组成的复合酶的使用，生物化学作用省去了丙酮、氯仿、异丙醚、石油醚、乙酸乙酯、异戊醇、乙氰、二甲基亚砜等有毒或易燃易爆有机溶剂的多级萃取步骤，也避免了采用含磷无机盐的富营养化污染等问题。

（3）四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑的使用，其pH值符合本发明复合酶的最佳pH作用条件范围（pH为5.0～6.0），能够与复合酶协同使用，四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液较强的极性与明日叶中查尔酮的极性更为接近，选择性更好，同时也排除了提取物中更多的杂质成分，能够显著提升查尔酮的提取率，并有利于明日叶中查尔酮的后续分离提纯；另外，非挥发性四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液作为一种新型绿色萃取剂用于分离过程中，能够有效替代传统挥发性有机溶剂的使用，最大程度地消除了挥发性有机溶剂的危害，消除了安全隐患，实现了常温一步萃取，节省能源，大大缩短了工艺流程，提高生产效率2-3倍，达到了清洁化、快速提取查尔酮的目的。

（4）使用聚酰胺色谱柱分离查尔酮选择性更高、与前序工艺配合分离效果更好，得率更高，而且操作简单，成本低廉，更加适合工业化生产。通过本发明方法制备得到的查尔酮纯品经实验证实纯度在96%以上，得率在93%以上。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步说明：

图1为本发明吸光度(A)与查尔酮标准品溶液浓度间(C)的线性关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步清楚、完整的说明。

本发明中所涉及的原料和设备均可通过商业渠道购买得到，本发明纤维素酶购自潍坊康地恩生物科技有限公司，酶活为3,000U/g；葡聚糖酶购自青岛蔚蓝生物集团有限公司，酶活为20,000U/g；植酸酶购自潍坊康地恩生物科技有限公司，酶活为50,000U/g。

本发明复合酶由纤维素酶、葡聚糖酶与植酸酶组成。复合酶中纤维素酶、葡聚糖酶与植酸酶的质量比为5～8：2～5：1～2，对于本发明复合酶的组成及配比，做了如下对比实验--复合酶协同效果对比实验：

1）取新鲜明日叶作为原料，先简单切割，然后加入新鲜明日叶体积3-5倍的水，进行匀浆，将匀浆液倒入萃取罐；

2）向上述匀浆液中加入复合酶并充分搅拌，复合酶与所述新鲜明日叶的重量比为0.1～5：100，控制pH为5.0～6.0、温度35～40℃、酶解40～60min，过滤、收集得到滤液一；

3）向上述滤液一中加入四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液，四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液与滤液一的体积比为2.5～3.5：1，常温萃取1～2h，过滤、收集得到滤液二；

4）取步骤3）所得滤液二，过聚酰胺色谱柱进行层析分离，流速控制在1.5～2.0ml/min；用40%～60%（v/v）的乙醇洗脱；在55～60℃低压干燥后，即得查尔酮。

本发明实验设置分别设置了以下5组：

A组-只添加纤维素酶；

B组-只添加葡聚糖酶；

C组-只添加植酸酶；

D组-只添加纤维素酶及葡聚糖酶；

E组-添加纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶，即本发明的复合酶，且各组分的质量比为5～8：2～5：1～2。

分别对A组、B组、C组、D组和E组实验得到的查尔酮的得率及纯度进行测定，结果如表1所示：

表1

处理组	查尔酮得率/%	查尔酮样品纯度/%
			A组	66.57%	89.25%
B组	52.36%	88.21%
			C组	45.12%	87.67%
D组	76.91%	90.33%
			E组	93.33%	96.74%

表1结果表明，本发明复合酶在得率和纯度上都具有最好的效果，协同效果明显。

实施例1：

本发明，一种快速从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，包括以下步骤：

步骤一：制备复合酶，按照纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶的质量比为8：2：1称量并配制，备用；

步骤二：称取新鲜明日叶1kg，先切割粉碎，然后加入3倍体积的水，进行匀浆；将匀浆液倒入萃取罐；

步骤三：向萃取罐中加入1g步骤一制备得到的复合酶，搅拌均匀；调节pH为5.0，在35℃条件下酶解40min；过滤，收集滤液为滤液一；

步骤四：向滤液一中加入四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液，四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液与滤液一的体积比为2.5：1，常温萃取1h，过滤并收集滤液，得滤液二；

步骤五：将滤液二过聚酰胺色谱柱进行层析分离，流速设定为1.5ml/min；用40%（v/v）的乙醇溶液洗脱，得查尔酮乙醇溶液；

步骤六：将上述查尔酮乙醇溶液在55℃真空干燥，即得明日叶查尔酮纯品，共28.29g。

实施例2：

本发明，一种快速从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，包括以下步骤：

步骤一：制备复合酶，按照纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶的质量比为7：3：2称量并配制，备用；

步骤二：称取新鲜明日叶1kg，先切割粉碎，然后加入3倍体积的水，进行匀浆；将匀浆液倒入萃取罐；

步骤三：向萃取罐中加入50g步骤一制备得到的复合酶，搅拌均匀；调节pH为6.0，在40℃条件下酶解60min；过滤，收集滤液为滤液一；

步骤四：向滤液一中加入四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液，四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液与滤液一的体积比为3.5：1，常温萃取2h，过滤并收集滤液，得滤液二；

步骤五：将滤液二过聚酰胺色谱柱进行层析分离，流速设定为2.0ml/min；用60%（v/v）的乙醇溶液洗脱，得查尔酮乙醇溶液；

步骤六：将上述查尔酮乙醇溶液在60℃真空干燥，即得明日叶查尔酮纯品，共29.51g。

实施例3：

本发明，一种快速从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，包括以下步骤：

步骤一：制备复合酶，按照纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶的质量比为5：5：1.5称量并配制，备用；

步骤二：称取新鲜明日叶1kg，先切割粉碎，然后加入5倍体积的水，进行匀浆；将匀浆液倒入萃取罐；

步骤三：向萃取罐中加入20g步骤一制备得到的复合酶，搅拌均匀；调节pH为6.0，在38℃条件下酶解50min；过滤，收集滤液为滤液一；

步骤四：向滤液一中加入四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液，四氯合铝酸（1-乙基-3-甲基）咪唑溶液与滤液一的体积比为3：1，常温萃取1.5h，过滤并收集滤液，得滤液二；

步骤五：将滤液二过聚酰胺色谱柱进行层析分离，流速设定为1.5ml/min；用50%（v/v）的乙醇溶液洗脱，得查尔酮乙醇溶液；

步骤六：将上述查尔酮乙醇溶液在60℃真空干燥，即得明日叶查尔酮纯品，共29.14g。

本发明查尔酮得率和纯度的测定：

1、查尔酮得率

查尔酮得率K按下式计算：

$K=\frac{m}{W}\×100\%$

式中，m-1Kg新鲜明日叶制得查尔酮样品重量（g），W-新鲜明日叶查尔酮检测含量值（30.35g/1Kg新鲜明日叶）。

2、查尔酮标准曲线的建立

精确称取1.0g查尔酮标准品（美国Sigma公司，纯度＞99%），用无水甲醇定容到10mL容量瓶中；用无水甲醇稀释该标准品溶液，分别制得浓度为0.0005～0.005mg/mL的查尔酮标准品溶液；用紫外-可见分光光度计在310nm条件下测其吸光值，建立吸光度(A)与查尔酮标准品溶液浓度间(C)的线性关系，如图1所示，得回归方程为：A=150.22C+0.0519，R²=0.9995。

3、查尔酮纯度检测

本方法采用分光光度法检测制备的查尔酮样品纯度。精确称取一定量制备的查尔酮纯品样品，用无水甲醇溶解得浓度为C_P的溶解液；吸取1mL溶解液，并于10mL容量瓶中用无水甲醇定容，后在310nm处测吸光度，按下式计算其纯度：

$P=\frac{(A-0.0519)\×10}{150.22\×C_P}\×100\%$

经计算及检测，本发明实施例1～3制备得到的明日叶查尔酮的得率和纯度见表2所示：

表2

样品	复合酶配比	查尔酮得率	查尔酮样品纯度
				实施例1	8：2：1	93.21%	96.43%
实施例2	7：3：2	97.23%	97.75%
				实施例3	5：5：1.5	96.01%	96.97%

由表2可见：本发明方法获得的查尔酮的得率和纯度都满足了生产的要求，且实施例2中各工艺参数条件最优。

需要说明的是，在本说明书的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式，或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

a、将适量新鲜明日叶粉碎、匀浆，得到匀浆液；

b、向上述匀浆液中加入复合酶并充分搅拌，复合酶与所述新鲜明日叶的重量比为0.1～5：100，控制pH为5.0～6.0、温度为35～40℃、酶解40～60min，过滤收集滤液，得滤液一；所述复合酶由纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶组成，所述纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶的质量比为5～8：2～5：1～2；

c、向所述滤液一中加入四氯合铝酸(1-乙基-3-甲基)咪唑溶液，常温萃取1～2h，过滤收集滤液，得滤液二；

d、将步骤c所得滤液二过聚酰胺色谱柱进行层析分离、用乙醇洗脱，在55～60℃低压干燥后，即得查尔酮。

2.根据权利要求1所述的一种从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，其特征在于：所述步骤c中，四氯合铝酸(1-乙基-3-甲基)咪唑溶液与滤液一的体积比为2.5～3.5：1。

3.根据权利要求1所述的一种从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，其特征在于：所述纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶三者的质量比为7：3：2。

4.根据权利要求2或3所述的一种从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，其特征在于：所述步骤a中，加入水进行匀浆，水的加入量为新鲜明日叶体积的3～5倍。

5.根据权利要求4所述的一种从新鲜明日叶中提取查尔酮的方法，其特征在于：所述步骤d层析分离中流速控制在1.5～2.0mL/min。