CN104926634B - 一种从新鲜明日叶中提取异补骨脂查尔酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从新鲜明日叶中提取异补骨脂查尔酮的方法，其工艺流程为：新鲜明日叶→打浆制浆→脱除叶绿素→石灰水除鞣质→酯碱液两相萃取，除去脂溶性杂质→大孔树脂吸附→水洗脱除糖类物质→醇水梯度洗脱，得到异补骨脂查尔酮粗品→二次重结晶，最终得到纯度为75％以上的异补骨脂查尔酮精制品。本发明具有产率高、反应时间短、生产工艺无污染，且无副产物产生等特点；所得产物成分单一、纯度高，在抗肿瘤、抗糖尿病、降血脂、降血压、抗菌、抗炎等生物活性领域的研究具有重要的应用和学术价值，尤其是对研究查尔酮药学的构效关系具有关键的作用。

Description

一种从新鲜明日叶中提取异补骨脂查尔酮的方法

技术领域

本发明涉及一种异补骨脂查尔酮的制备方法，尤其涉及一种从新鲜明日叶中提取异补骨脂查尔酮的方法。

背景技术

明日叶，又名长寿草、长寿菜等,原产于日本伊豆、八丈诸岛，属原生芹科多年生草本植物，因其具有今日采剪，明日就长出新芽的极强生长能力，故而获得明日叶之称。

在日本著《大和本草》(1709年)和《重订本草纲目启蒙》(1844年)中均有明日叶可强壮身体、保健益寿之功效的记载。我国名医李时珍早在《本草纲目》(1593年)中将明日叶谓之“滨海当归”，明确其味甘、辛，性温，归肝、心、大肠经。

近十多年来的国内外研究发现，明日叶含有10多种矿物元素、16种人体所必需的氨基酸，以及丰富的叶绿素、黄酮泛酸、胆碱、芸香苷等活性物质；食用明日叶对风湿痛、糖尿病、脂肪肝、肝硬化、动脉硬化、高血压等多种疾病有一定预防和治疗作用。

国内近2-3年来，已有种植明日叶和生产明日叶茶、胶囊、饮片等保健品，以及面条、甜点等食品的宣传报道。

国内外已有大量研究证明，明日叶安全无毒，是一种市场前景光明的天然药物资源，目前已成为国内外在天然植物化学物与药草领域中的一大研究热点。

查尔酮是一类含有二苯基丙烯酮结构及其衍生物的化合物，在明日叶的根、茎、叶中均有较高含量，其中以根部的含量最为丰富。目前在明日叶中已分离鉴定出8种查尔酮类物质。

查尔酮类物质分子结构柔性较大，易与受体结合，能表现出多方面生物活性，也是一种重要的有机药中间体。国内外均有研究报道，明日叶查尔酮类物质具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤、降血脂、降血压等多种生物活性，其中以对肿瘤细胞的抑制作用特别引人关注；有体外研究报道，查尔酮能够诱发人类神经母细胞瘤细胞(IMR-32)的细胞凋亡，抑制其生长，且随着浓度升高其抑制率也随之提高。

还有研究报道，查尔酮对HL-60、CRL1579、A549/AZ521等人类肿瘤细胞株均有细胞毒性作用，抑制其生长增殖。体内动物实验则显示，查尔酮对小鼠皮肤癌、腹水瘤、肝癌等肿瘤均有良好的抑制作用。有研究认为，明日叶查尔酮的抑瘤机制，可能是通过调控caspase-3、Bax[30]以及DJ-1[31]等蛋白的表达，从而引发肿瘤细胞的凋亡来实现的。肿瘤血管生成与肿瘤的生长进展有密切关系，以肿瘤血管生成为靶向是目前肿瘤治疗的一种重要手段，但至今尚未见有关于明日叶查尔酮对肿瘤血管生成影响作用的研究报道。

化学工作者经过多年不断的努力尝试，目前已建立了CS羟醛缩合反应、过渡金属催化的C-C偶联反应以及催化羰基化反应等查尔酮化学合成方法，但此类方法有着合成路线较长、副产物多、收率低、反应时间长、有污染、难获得高纯度成分等突出缺点，距真正实现该法工业化生产查尔酮类物质仍有较大距离。

所以，目前查尔酮的获得还是从明日叶干粉或者新鲜叶茎中提取，并获得了一定规模的生产。

在已有的技术中，所获得的查尔酮产品为明日叶全酮产品，然而在明日叶中已知有8种查尔酮类衍生物，单一的查尔酮，尤其是异补骨脂查尔酮的制备方法目前未见有报道。

单一组份的异补骨脂查尔酮，对于在抗肿瘤、抗糖尿病、降血脂、降血压、抗菌、抗炎等生物活性领域具有重要的应用和学术价值，尤其是对研究查尔酮药学的构效关系，具有关键作用。

如何从新鲜明日叶中，制取(分离出)单一组份的异补骨脂查尔酮，以供进一步研究查尔酮药学的构效关系使用，进而为更好地研究其抗肿瘤、抗糖尿病、降血脂、降血压、抗菌、抗炎等生物活性领域的作用和功效奠定基础，已经成为本领域技术人员渴望解决的一个前沿性的重要课题。

发明内容

本发明的目的就是提出一种从新鲜明日叶中提取异补骨脂查尔酮的方法，其工艺流程短、产率高、反应时间短、生产工艺无污染，且无副产物产生，可以从新鲜明日叶中有效分离出单一组分的异补骨脂查尔酮，并且所制得的异补骨脂查尔酮纯度可达75％以上。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是，一种从新鲜明日叶中提取异补骨脂查尔酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将新鲜明日叶打浆、制取浆液；并按体积比1:7的比例，将所制取的浆液与醇-水溶液混合，升温到72℃，搅拌浸取3h后过滤，得滤液A；

其中，醇-水溶液是按醇与水的体积比为17-21:2的比例配制的；

(2)按体积比1:0.5-2的比例，将滤液A与有机溶剂混合，搅拌3h，静置分层，取水醇相B，以除去叶绿素杂质；

(3)按体积比1:0.1-0.5的比例，将水醇相B与饱和石灰水混合，反应1-3h，后过滤得滤液C，以除去鞣质及其他碱溶性杂质；

(4)按体积比1:0.3-1的比例，将滤液C与乙酸乙酯、碳酸二甲酯或甲酸乙酯混合，再加入质量百分比浓度为10％碱液，摇荡4h，得水相D，以除去脂溶性杂质；

(5)将所得到的水相D，经大孔树脂分离柱置换反应1-3h，水洗以除去水溶性小分子，得到溶液E；

再使用按醇与水的体积比为17-21:2的比例配制的醇-水溶液，对所得到的溶液E进行梯度洗脱，得到洗脱液；

将所获得的洗脱液蒸发、烘干，得到异补骨脂查尔酮粗品；

(6)将所得异补骨脂查尔酮粗品用甲醇、乙醇或正丁醇溶解，重结晶两次，即得到异补骨脂查尔酮精制品。

上述技术方案直接带来的技术效果是，选用新鲜明日叶直接打浆，比用明日叶干叶或干粉，可以省却烘干、溶胀、渗透、扩散等步骤，并且萃取溶剂可快速渗透入植物细胞溶出酮类物质，进而可以缩短工艺流程、减少工艺步骤，降低工艺控制难度，节省能源、提高生产效率；

上述技术方案中，19:2的醇水比更接近所提取异补骨脂查尔酮的分子极性，使得异补骨脂查尔酮的选择性溶出率更高；

上述技术方案中，用正己烷除叶绿素、饱和石灰水除鞣质，乙酸乙酯除去脂溶性物质，再经大孔树脂吸附脱洗除去糖类等杂质，最后经重结晶纯化得到异补骨脂查尔酮，其所获的的异补骨脂查尔酮成品纯度高，成分单一。

需要说明的是，上述技术方案中，将明日叶中的查尔酮全酮成分中，提取出单一组分的异补骨脂查尔酮的技术难点在于，查尔酮全酮中，含有大量叶绿素、鞣质、糖、酯等，这些物质均为醇溶性物质，经醇萃取出来后，很难进行有效分离，所以很难得到较为纯净的查尔酮。正因为如此，目前已有的各种查尔酮醇法提取技术，得到的都是混合物，根本无法获取成分单一、纯度较高的异补骨脂查尔酮纯净物。

优选为，上述大孔树脂分离柱所用大孔树脂为AB8、D101或D140。

该优选技术方案直接带来的技术效果是，大孔吸附树脂是通过物理吸附从溶液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离提纯的目的。其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐类及强离子、低分子化合物存在的影响，在水和有机溶剂中可吸附溶剂而膨胀。其中，AB8、D101或D140大孔树脂的比表面大、孔径适宜，对糖、生物碱、黄酮等均具有良好的吸附能力。

特别是，AB8树脂是一种球状、弱极性聚合物吸附剂，其比表面大、孔径适宜，对异补骨脂查尔酮有较好的选择吸附性能，而对他查尔酮衍生物以及糖类、盐类等水溶性小分子则吸附性很弱。

进一步优选，上述醇-水溶液是甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇的水溶液。

该优选技术方案直接带来的技术效果是，甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇等常见醇原料易于获取，且成本相对低廉。

其中，考虑到工艺控制的简便、成本的进一步降低等因素，上述醇-水溶液最好是选用乙醇进行配制。这样，更有利于后期的快速洗脱，因为，乙醇可直接食用，即便存在少许残留，也不会影响产品的安全性。

进一步优选，上述有机溶剂为正己烷、氯仿或丙酮。

该优选技术方案直接带来的技术效果是，正己烷、氯仿或丙酮均可有效将叶绿素成分溶解萃取出来，其中，相对而言，三者之中优选为正己烷，这主要考虑到的是，正己烷的刺激性气味相对较小、毒性相对较低，这样更便于生产过程中操作环境的保护，并可降低安全生产防护成本和危险源控制难度，进一步降低生产成本。

进一步优选，上述碱液为碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液或氨水。

该优选技术方案直接带来，碳酸氢钠、氢氧化钠或氨水均与水互溶，且均对脂溶性杂质具有良好的溶解性能。其中，相对而言碳酸氢钠的碱性比氢氧化钠弱，反应过程更平缓，无氨水的挥发性和刺激性气味，更易于生产过程的工艺控制和安全防范。

综上所述，本发明相对于现有技术，具有工艺流程短、对异补骨脂查尔酮选择性强、反应时间短、生产工艺无污染，且无副产物产生，所得到的异补骨脂查尔酮成分单一、纯度高(可达75％以上)等有益效果。

附图说明

图1为实施例1所制得的异补骨脂查尔酮精制品在熔点仪下的照片(放大倍数为20倍)；

图2为实施例1本发明所制得的异补骨脂查尔酮精制品的紫外光谱图；

图3为芦丁标准品的HPLC谱图；

图4为实施例1所制得的异补骨脂查尔酮精制品的HPLC谱图；

图5为实施例1所制得的异补骨脂查尔酮精制品的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

(1)将1Kg新鲜明日叶打浆，按浆液与醇-水溶液的体积比为1:7的比例混合，其中，乙醇与水的体积比为19:2，升温到72℃搅拌浸取3h后过滤，得7.5L滤液A。

(2)将A和正己烷按体积比1:1比例混合，搅拌3h，除去叶绿素杂质，静置分层，取7L水醇相B。

(3)将B和饱和石灰水按体积比1:0.3比例混合反应2h，除去鞣质及其他碱溶性杂质，过滤得8.5L滤液C。

(4)将C与乙酸乙酯按体积比1:0.5比例混合，再加入10％碳酸氢钠1.5L摇荡4h，除去脂溶性杂质，得9.6L水相D。

(5)将D上大孔树脂AB8分离柱置换反应1.5h，水洗除去糖类等水溶性小分子，最后用19:2醇水体系洗脱得液体6.8L，蒸发、烘干，得到20.6g异补骨脂查尔酮粗品E。

(6)将E用甲醇溶解，重结晶两次，得到12.4g异补骨脂查尔酮精制品(计算出的提取率为1.24％)。

实施例2

(1)将1Kg新鲜明日叶打浆，按浆液与醇-水溶液的体积比为1:7的比例混合，其中，甲醇与水的体积比为17:2，升温到72℃搅拌浸取3h后过滤，得7L滤液A。

(2)将A和氯仿按体积比1:0.5比例混合，搅拌3h，除去叶绿素杂质，静置分层，取7L水醇相B。

(3)将B和饱和石灰水按体积比1:0.1比例混合反应1h，除去鞣质及其他碱溶性杂质，过滤得8L滤液C。

(4)将C与碳酸二甲酯按体积比1:0.3比例混合，再加入10％氢氧化钠1.5L摇荡4h，除去脂溶性杂质，得9.1L水相D。

(5)将D上大孔树脂D101分离柱置换反应1.5h，水洗除去糖类等水溶性小分子，最后用17:2醇水体系洗脱得液体6.2L，蒸发、烘干，得到15.1g异补骨脂查尔酮粗品E。

(6)将E用甲醇溶解，重结晶两次，得到8.3g异补骨脂查尔酮精制品(计算出的提取率为0.83％)。

实施例3

(1)将1Kg新鲜明日叶打浆，按浆液与醇-水溶液的体积比为1:7的比例混合，其中，正丁醇与水的体积比为21:2，升温到72℃搅拌浸取3h后过滤，得8.2L滤液A。

(2)将A和丙酮按体积比1:2比例混合，搅拌3h，除去叶绿素杂质，静置分层，取7.7L水醇相B。

(3)将B和饱和石灰水按体积比1:0.5比例混合反应3h，除去鞣质及其他碱溶性杂质，过滤得8.7L滤液C。

(4)将C与甲酸乙酯按体积比1:1比例混合，再加入10％氨水1.5L摇荡4h，除去脂溶性杂质，得9.1L水相D。

(5)将D上大孔树脂D140分离柱置换反应1.5h，水洗除去糖类等水溶性小分子，最后用21:2醇水体系洗脱得液体7.6L，蒸发、烘干，得到17.1g异补骨脂查尔酮粗品E。

(6)将E用甲醇溶解，重结晶两次，得到9.3g异补骨脂查尔酮精制品(计算出的提取率为0.93％)。

选取实施例1为代表性实施例，对所制得的产品分别进行熔点测定、紫外光谱分析、HPLC色谱分析和质谱分析。产品的检验情况及检验结果如下：

1、熔点的测定

取异补骨脂查尔酮精制品晶体在玻璃片上展开，置于熔点仪下，如图1所示，异补骨脂查尔酮精制品晶体在1:20倍率下，为针状晶体；

当加热温度至123℃时晶体开始熔化，晶体完全熔化为126℃。

2、紫外光谱

异补骨脂查尔酮精制品晶体的紫外最大吸收峰有两个：λmax＝243，λmax＝386。

3、红外光谱分析

如图2所示，从红外光谱图可看出：在1716，1617处有吸收，说明该物质含有羰基C＝O,3363处的吸收证明含有羟基，在1513处有吸收，说明含双键基团，在2926处有吸收，证明含有Ph-0键，以上特征峰与异补骨脂查尔酮结构相呼应。

4、高效液相色谱分析

图3为芦丁标准品的HPLC谱图；图4为异补骨脂查尔酮精制品样品HPLC谱图。

说明：芦丁标准品样品为黄酮衍生物纯品，将异补骨脂查尔酮精制品样品HPLC谱图与芦丁标准品的HPLC谱图进行对比，是为了更加形象直观。

如图3、图4所示，黄酮类物质的出峰时间在4.5min附近,异补骨脂查尔酮精制品样品在1.5到8.5min有11个峰，说明含有包括查尔酮在内的黄酮类物质。

5、质谱分析

如图5所示，异补骨脂查尔酮精制品样品的分子离子峰，m/z为330，这与文献中异补骨脂查尔酮的质谱数据相吻合。

6、纯度分析

取100mg异补骨脂查尔酮精制品样品溶解在50mL甲醇中，配成浓度为2mg/mL的溶液，测定波长为500nm时溶液的吸光度记为A对应芦丁标准曲线，得到实际查尔酮的浓度为1.5mg/mL，所制得的异补骨脂查尔酮样品的纯度为77.1％。

采用上述同样的检测方法，分别对实施例2、3所制得的异补骨脂查尔酮精制品进行熔点和纯度检测，所得结果如下：

实施例2所制得的异补骨脂查尔酮精制品经检测，熔点为120-125℃，纯度为75.7％；实施例3所制得的异补骨脂查尔酮精制品经检测，所制得的异补骨脂查尔酮精制品的熔点为121-126，纯度为75.3％。这进一步证明，本发明的方法，适用于从新鲜明日叶中提取单一组分、纯度较高的异补骨脂查尔酮。

Claims (2)

1.一种从新鲜明日叶中提取异补骨脂查尔酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将新鲜明日叶打浆、制取浆液；并按体积比1:7的比例，将所制取的浆液与醇-水溶液混合，升温到72℃，搅拌浸取3h后过滤，得滤液A；

其中，醇-水溶液是按醇与水的体积比为17-21:2的比例配制的；

(2)按体积比1:0.5-2的比例，将滤液A与有机溶剂混合，搅拌3h，静置分层，取水醇相B，以除去叶绿素杂质；

(3)按体积比1:0.1-0.5的比例，将水醇相B与饱和石灰水混合，反应1-3h，后过滤得滤液C，以除去鞣质及其他碱溶性杂质；

(4)按体积比1:0.3-1的比例，将滤液C与乙酸乙酯、碳酸二甲酯或甲酸乙酯混合，再加入质量百分比浓度为10％碱液，摇荡4h，得水相D，以除去脂溶性杂质；

(5)将所得到的水相D，经大孔树脂分离柱置换反应1-3h，水洗以除去水溶性小分子，得到溶液E；

再使用按醇与水的体积比为17-21:2的比例配制的醇-水溶液，对所得到的溶液E进行梯度洗脱，得到洗脱液；

将所获得的洗脱液蒸发、烘干，得到异补骨脂查尔酮粗品；

(6)将所得异补骨脂查尔酮粗品用甲醇、乙醇或正丁醇溶解，重结晶两次，即得到异补骨脂查尔酮精制品；

上述大孔树脂分离柱所用大孔树脂为AB8、D101或D140；

上述醇-水溶液是甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇的水溶液；

上述有机溶剂为正己烷、氯仿或丙酮。

2.根据权利要求1所述的从新鲜明日叶中提取异补骨脂查尔酮的方法，其特征在于，所述碱液为碳酸氢钠溶液、氢氧化钠溶液或氨水。