CN103635572A - 植物细胞分化促进剂 - Google Patents

Abstract

本发明的课题是提供植物细胞分化促进剂，该植物细胞分化促进剂促进由愈伤组织向正常的不定胚的分化，或促进由植物切片向不定根或不定芽的分化，作为结果可以稳定地获得再生植物体，本发明提供含有本发明的特定的酮醇脂肪酸、或其衍生物作为有效成分的植物分化促进剂。

Description

植物细胞分化促进剂

技术领域

本发明涉及植物细胞分化促进剂，其包含碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸，所述碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸(以下称为特定的酮醇脂肪酸)中，构成羰基的碳原子与结合有羟基的碳原子处于α位的位置。本发明进一步涉及由愈伤组织或植物切片制成再生植物体的制成方法，其包含添加特定的酮醇脂肪酸的步骤。

背景技术

利用了植物体所具有的分化全能性的组织培养技术在以均质的优良克隆的增产、脱毒植物的再生、新品种制成为目的的育种中已经变得不可或缺。通过使用植物体的组织培养技术，使愈伤组织增殖，接着对增殖组织改变培养基中的生长素(auxin)和细胞因子的浓度比，从而可以使其向不定芽或不定根进行器官分化，或经由不定胚而得到再生植物体。然而，已知这些组织培养技术受到所用的基本培养基和/或碳源、植物激素、盐类的种类、浓度或者培养温度等的影响，稳定地由愈伤组织诱导不定胚、不定芽、和/或不定根经常是困难。

通过应用组织培养技术，可以进行向高等植物导入外来基因的转化和/或细胞融合。例如，农杆菌转化法中，进行以下过程：使植物片或愈伤组织感染农杆菌后，移至包含筛选用抗生素的再分化培养基进行培养，在筛选导入了外来基因的细胞的同时使其再分化。此时，根据植物种类不同，有时虽然植物细胞内导入了外来基因，但由于再分化能力低而得不到转化体。另外，在利用远缘的组合的细胞融合杂种的制成中，还存在即使得到了融合细胞，也由于再分化能力低而在中途阶段一方的染色体脱落，不能再分化成完全的植物体这样的问题。因此，转化和/或细胞融合的技术中，由愈伤组织向植物体的再分化效率是重要的。

到目前为止，为了高效且短时间地使其再分化，提出了数个方案。例如，日本特开平5-219851号公报中报告了将用添加了马铃薯提取物的愈伤组织增殖培养基培养而得的不定胚样的愈伤组织移植到降低了主要无机盐类浓度的再分化培养基中的禾本科植物的再生方法；日本特开平6-153730号公报中报告了使增殖了的愈伤组织某种程度干燥然后移植到再分化培养基，进行静置培养的灯芯草的愈伤组织再分化法；日本特开2000-217457号公报中报告了置床于含有细胞分裂素系的植物激素的进行了pH值调整的合成培养基进行培养的洋麻的愈伤组织再分化方法；日本特开2000-270854号公报中报告了将补血草的植物体的一部分用含有毒莠定的培养基进行培养，诱导愈伤组织，进行培养增殖，然后将其愈伤组织用含有细胞分裂素的培养基进行培养的制作再分化植物体的方法。进而，日本特开平5-49470号公报、日本特开平10-191966号公报、及日本特开平10-229875号公报中公开了培养属于肠杆菌属、芽孢杆菌属或者绿脓杆菌属的微生物，从该培养液提取的植物愈伤组织细胞分化剂。

然而，这些方法均限定了品种和/或生理的要素，并且其效果难以说是充分的。

另一方面，本申请发明者们发现，作为碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸的、构成羰基的碳原子与结合有羟基的碳原子处于α位的位置的、碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸，特别是9-羟基-10-氧代-12(Z),15(Z)-十八碳二烯酸具有花芽形成促进作用、进而具有植物赋活作用(日本特开平11-29410号公报及日本特开2001-131006号公报)。

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题是提供植物细胞分化促进剂，该植物细胞分化促进剂促进由愈伤组织向正常的不定胚、不定根、或不定芽的分化，或促进由植物切片向不定根或不定芽的分化，作为结果可以稳定地获得再生植物体。另外，本发明的课题是提供促进由从植物体的一部分诱导而得的愈伤组织向不定胚、不定根、或不定芽的分化，或由植物切片向不定根或不定芽的分化，高效地获得再生植物体的方法。

用于解决课题的方法

对于作为植物激素的一种的特定的酮醇脂肪酸，本发明者对于其效果进行了深入研究，结果令人惊讶地发现，在由愈伤组织向不定胚的诱导工序中，特定的酮醇脂肪酸促进由愈伤组织向正常的不定胚的诱导，从而完成了本发明。

本发明还涉及以含有该特定的酮醇脂肪酸、或其衍生物作为有效成分为特征的植物细胞分化促进剂，以及通过使用该特定的酮醇脂肪酸或其衍生物的再生植物体的制成方法。

更具体地，本申请包含以下发明。

[1]植物细胞分化促进剂，其包含碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸，所述碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸中，构成羰基的碳原子与结合有羟基的碳原子处于α位的位置。

[2]根据[1]所述的植物细胞分化促进剂，所述酮醇脂肪酸中，碳之间的双键存在1～6处，但是，该双键数不超过酮醇脂肪酸的碳键数。

[3]根据[1]或[2]所述的植物细胞分化促进剂，所述酮醇脂肪酸的碳原子数为18，且碳之间的双键存在2处。

[4]根据[1]～[3]的任一项所述的植物细胞分化促进剂，所述酮醇脂肪酸是9-羟基-10-氧代-12(Z),15(Z)-十八碳二烯酸(以下，称为KODA)。

[5]根据[1]～[4]的任一项所述的植物细胞分化促进剂，所述植物细胞分化促进剂促进由植物的愈伤组织向不定胚、不定根、或不定芽的分化。

[6]根据[1]～[4]的任一项所述的植物细胞分化促进剂，所述植物细胞分化促进剂促进由植物切片向不定芽或不定根的分化。

[7]根据[1]～[4]的任一项所述的植物细胞分化促进剂，所述植物细胞分化促进剂促进经由不定胚、不定根、或不定芽向再生植物体的分化。

[8]再生植物体的制成方法，是由愈伤组织制成再生植物体的制成方法，其中，包括以下工序：在将传代培养基中维持的愈伤组织移植到再分化培养基的3周前至移植后2周的期间，对愈伤组织施用[1]～[4]的任一项所述的植物细胞分化促进剂。

[9]根据[8]的再生植物体的制成方法，所述期间是移植到再分化培养基的2周前至移植到再分化培养基后1周的期间。

[10]使用[9]所述的再生植物体的制成方法制成的再生植物体。

[11]植物培养用培养基，其包含[1]～[4]的任一项所述的植物细胞分化促进剂。

发明的效果

通过将本发明的植物细胞分化促进剂施用(滴加)于作为脱分化了的细胞的块的愈伤组织，从而发挥向正常的不定胚的诱导能力。用于诱导不定胚分化的通用条件尚未确立，多数情况下，通过将愈伤组织用包含生长素的培养基进行培养后，移至不含生长素或生长素浓度低的培养基中来诱导不定胚分化，但即使是由同一个体、同一组织获得的愈伤组织，根据愈伤组织的状态不同，不定胚诱导能力、诱导效率也有较大差异，不稳定。因此，通过使用本发明的植物细胞分化促进剂，可以提高并稳定不定胚分化的效率。

附图说明

图1是显示诱导由苞叶芋属(Spathiphyllum)的愈伤组织向不定胚的分化时KODA的效果的图。与对照区相比，在2周后施用了KODA的处理区回收了较多的不定胚。

图2是显示诱导由苞叶芋属的愈伤组织向不定胚的分化时KODA的效果的坐标图。显示KODA的施用时期影响不定胚分化的诱导。

图3是显示诱导由苞叶芋属的愈伤组织向不定胚的分化时KODA的浓度对再分化效率的影响的图。

图4是将作为图3的结果的再分化了的植物体数作为坐标图表示而得的图。显示在各浓度，与对照相比，再分化了的植物体数增加。

图5是显示在KODA处理区地上部及地下部的生长变好的图。

图6是将作为图5的结果的再分化的植物体分为地上部和地下部，使将其干燥后测定的重量的比较作为坐标图表示而得的图。显示与对照相比，通过KODA处理而重量增加。

具体实施方式

本发明涉及植物细胞分化促进剂，其特征在于，包含特定的酮醇脂肪酸、或其衍生物作为有效成分。优选本发明的植物细胞分化促进剂促进由愈伤组织向不定胚的正常分化。愈伤组织分化成不定胚后，进一步分化成再生植物体。因此，通过促进由愈伤组织向正常的不定胚的分化，最终可以高效地获得再生植物体。

在其他方式中，本发明的植物细胞分化促进剂促进器官分化。作为器官分化的例子，可列举向不定器官、例如不定芽和/或不定根的分化。本发明的植物细胞分化促进剂促进由愈伤组织向不定器官的正常分化、或者由植物体的一部分向不定器官、例如不定根和/或不定芽的正常分化。在由愈伤组织分化成不定器官、例如不定芽和/或不定根的情况下，愈伤组织经由不定芽或不定根进一步分化成再生植物体。在由植物体的一部分分化不定芽或不定根的情况下，通过从植物体的一部分出现不定芽或不定根来获得再生植物体。

进一步在其他方式中，本发明涉及由愈伤组织或植物体的一部分制成再生植物体的制成方法，其包括将含有上述细胞分化促进剂的溶液施用于愈伤组织或植物体的一部分进行培养的步骤。优选在由愈伤组织制成再生植物体的制成方法中，上述细胞分化促进剂如下施用：在从移至再分化培养基的3周前到移植后2周的期间，对愈伤组织滴加1次或多次。更优选在向再分化培养基移植的2周前到移植后1周的期间对愈伤组织施用1次或多次。在由植物体的一部分制成再生植物体的制成方法中，可以通过将植物体的一部分切下后立即将切口浸泡于包含上述细胞分化促进剂的溶液中来施用。还可以取代对愈伤组织和/或植物体直接施用包含细胞分化促进剂的溶液，而在添加了该细胞分化促进剂的培养基中培养愈伤组织或植物的一部分。

本发明的植物细胞分化促进剂所含的特定的酮醇脂肪酸是碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸，是在同一分子内具有醇的羟基和酮的羰基的脂肪酸。

特定的酮醇脂肪酸优选构成羰基的碳原子与结合有羟基的碳原子处于α位或γ位的位置，特别优选为α位。另外，特定的酮醇脂肪酸优选碳之间的双键存在0～6处(但是，该双键数不超过酮醇脂肪酸的碳键数)。

另外，优选特定的酮醇脂肪酸的碳原子数为18，且碳之间的双键存在1～2处。

作为特定的酮醇脂肪酸的具体例，可列举例如，9-羟基-10-氧代-12(Z),15(Z)-十八碳二烯酸[以下，有时也称为特定的酮醇脂肪酸(I)或KODA]、13-羟基-12-氧代-9(Z),15(Z)-十八碳二烯酸[以下，有时也称为特定的酮醇脂肪酸(II)]、13-羟基-10-氧代-11(E),15(Z)-十八碳二烯酸[以下，有时也称为特定的酮醇脂肪酸(III)]、9-羟基-12-氧代-10(E),15(Z)-十八碳二烯酸[以下，有时也称为特定的酮醇脂肪酸(IV)]、9,15,16-羟基-10-氧代-12(Z)-十八碳单烯酸、9,15-羟基-10-氧代-16-氯-十八碳单烯酸、9,16-羟基-10-氧代-15-氯-十八碳单烯酸等。

以下，记载特定的酮醇脂肪酸(I)～(IV)的化学结构式。

关于其他特定的酮醇脂肪酸的化学结构式以及这些特定的酮醇脂肪酸的合成法，如专利文献9所公开。

已经显示特定的酮醇脂肪酸、特别是KODA是对牵牛花、莴苣、蚕豆、洋桔梗(トルコギキョウ)、仙客来、毛地黄、菊、天竺葵、报春花(Primulamalacoides)、四季海棠(Begonia semperflorens)、康乃馨、稻及草莓具有成长调节效果、成长促进效果、休眠抑制效果这样的植物赋活效果(专利文献9)，是对植物种通用性高的物质。

一般关于植物激素，已知生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯、脱落酸这样的有限数的植物激素根据其作用部位带来各种效果。例如生长素促进茎、幼叶鞘的成长，但抑制根、侧芽的成长，并且促进花芽、果实的发达。另一方面细胞分裂素抑制茎和根的伸长，但在本叶、子叶等中促进细胞的扩大。本发明的特定的酮醇脂肪酸也根据其作用部位发挥各种效果。日本特开平11-29410号公报及日本特开2001-131006号公报中记载了本发明的特定的酮醇脂肪酸发挥花芽形成、植物成长促进、成长调节效果、休眠抑制效果这样的各种效果。本申请发明基于除了这些效果之外，发现了特定的酮醇脂肪酸促进由愈伤组织向正常不定胚分化的效果。

由于已知本发明的特定的酮醇脂肪酸对多个种类的植物种具有其成长调节效果、成长促进效果、休眠抑制效果，因而考虑对于由愈伤组织向正常不定胚分化的促进效果也具有通用性。因此，本发明的特定的酮醇脂肪酸的促进由愈伤组织向正常不定胚分化的效果不限于下述的实施例所记载的苞叶芋属、长命草(滨海前胡，Peucedanum japonicum)、烟草。

作为施用本发明的植物细胞分化促进剂的植物，可列举被子植物(双子叶植物、单子叶植物)、蕨类和裸子植物。例如被子植物中，作为双子叶植物，可以例示例如，包含牵牛属植物(牵牛花)、打碗花属植物(日本打碗花(Calystegia japonica)、打碗花(Calystegia hederacea)、肾叶打碗花(Calystegia soldanella))、番薯属植物(厚藤、番薯)、菟丝子属植物(日本菟丝子、南方菟丝子)的旋花科植物、石竹属植物、繁缕属植物、米努草属植物、卷耳属植物、漆姑草属植物、无心菜属植物、种阜草属植物、孩儿参属植物、硬骨草属植物、大爪草属植物、拟漆姑属植物、蝇子草属植物、剪秋罗属植物、女娄菜属植物、狗筋蔓属植物等石竹科植物、以及木麻黄科植物、三白草科植物、胡椒科植物、金粟兰科植物、杨柳科植物、杨梅科植物、胡桃科植物、桦木科植物、壳斗科植物、榆科植物、桑科植物、荨麻科植物、川苔草科植物、山龙眼科植物、铁青树科植物、檀香科植物、桑寄生科植物、马兜铃科植物、大花草科植物、蛇菰科植物、蓼科植物、藜科植物、苋科植物、紫茉莉科植物、假繁缕科植物、商陆科植物、番杏科植物、马齿苋科植物、木兰科植物、昆栏树科植物、连香树科植物、睡莲科植物、金鱼藻科植物、毛茛科植物、木通科植物、小檗科植物、防己科植物、腊梅科植物、樟科植物、罂粟科植物、山柑科植物、十字花科植物、茅膏菜科植物、猪笼草科植物、景天科植物、虎耳草科植物、海桐花科植物、金缕梅科植物、悬铃木科植物、蔷薇科植物、豆科植物、酢浆草科植物、牻牛儿苗科植物、亚麻科植物、蒺藜科植物、芸香科植物、苦木科植物、楝科植物、远志科植物、大戟科植物、水马齿科植物、黄杨科植物、岩高兰科植物、马桑科植物、漆树科植物、冬青科植物、卫矛科植物、省沽油科植物、茶茱萸科植物、槭树科植物、七叶树科植物、无患子科植物、清风藤科植物、凤仙花科植物、鼠李科植物、葡萄科植物、杜英科植物、椴树科植物、锦葵科植物、梧桐科植物、猕猴桃科植物、山茶科植物、藤黄科植物、沟繁缕科植物、柽柳科植物、堇菜科植物、刺篱木科植物、旌节花科植物、西番莲科植物、秋海棠科植物、仙人掌科植物、瑞香科植物、胡颓子科植物、千屈菜科植物、石榴科植物、红树科植物、八角枫科植物、野牡丹科植物、菱科植物、柳叶菜科植物、小二仙草科植物、杉叶藻科植物、五加科植物、伞形科植物、山茱萸科植物、岩梅科植物、山柳科植物、鹿蹄草科植物、杜鹃花科植物、紫金牛科植物、报春花科植物、白花丹科植物、柿科植物、山矾科植物、安息香科植物、木犀科植物、醉鱼草科植物、龙胆科植物、夹竹桃科植物、萝藦科植物、花荵科植物、紫草科植物、马鞭草科植物、唇形科植物、茄科植物(茄子、番茄等)、玄参科植物、紫葳科植物、胡麻科植物、列当科植物、苦苣苔科植物、狸藻科植物、爵床科植物、苦槛蓝科植物、透骨草科植物、车前科植物、茜草科植物、忍冬科植物、五福花科植物、败酱科植物、川续断科植物、葫芦科植物、桔梗科植物、菊科植物等。

同样地，作为单子叶植物，可以例示例如，包含紫萍属植物(紫萍)和浮萍属植物(浮萍、品藻)的浮萍科植物、包含卡特兰属植物、兰属植物、石斛属植物、蝴蝶兰属植物、万代兰属植物、兜兰属植物、文心兰属植物等的兰科植物、香蒲科植物、黑三棱科植物、眼子菜科植物、茨藻科植物、冰沼草科植物、泽泻科植物、水鳖科植物、霉草科植物、禾本科植物(稻、大麦、小麦、黑麦、玉米等)、莎草科植物、棕榈科植物、天南星科植物、谷精草科(ほしぐさ科)植物、鸭跖草科植物、雨久花科植物、灯心草科植物、百部科植物、百合科植物(石刁柏等)、石蒜科植物、薯蓣科植物、鸢尾科植物、芭蕉科植物、姜科植物、美人蕉科植物、水玉簪科植物等。

作为使用本发明的植物细胞分化促进剂的植物，可考虑上述植物，特别优选对介由种子的繁殖困难的植物使用本发明的植物细胞分化促进剂。作为具体例，可列举兰、百合、蒜、花木、麻疯树、芦荟、龙舌兰、漆树、散尾葵、龙血树、霸王铁兰(xerographica)、鹅掌藤、郁金香、竹棕、爱之蔓、榕树、喜林芋、常春藤、天使泪(Soleirolia soleirolii)、草胡椒、绿萝、南洋参、球兰、龟背竹、铁线藤、紫竹梅、パキア、络石、嫣红蔓、冷水花、网纹草、一品红、竹芋、木槿、叶子花、新娘草、秋海棠、瓜栗、榕树、薛荔、垂榕、椰子类、丝兰等。另外，在优良性状的个体的营养繁殖时本技术也是有用的。对此时的植物种不限制。

特定的酮醇脂肪酸可以根据所使用的植物的种类来选择使用浓度。在通过将包含植物细胞分化促进剂的溶液直接滴加于愈伤组织来施用的情况下，该溶液包含0.01ppm～10ppm的浓度的特定的酮醇脂肪酸。关于优选特定的酮醇脂肪酸的浓度范围，可以取组合了作为下限值为0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、及0.3ppm中的任一者、和作为上限值为0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、7.0、及10ppm的中的任一者的任意范围(但是，下限值不超过上限值)。更优选特定的酮醇脂肪酸以0.1ppm～3ppm的浓度使用，进一步优选以0.03ppm或0.3ppm的浓度使用。只要是本领域技术人员就可以根据植物种进行简单的实验来确定最适浓度。在添加到培养基中的情况下，将特定的酮醇脂肪酸添加到培养基中使其为上述浓度范围即可。

在本发明的再分化植物体的制作方法中使用的愈伤组织是由植物体的一部分诱导而得的，既可以是转化系的，还可以是通过细胞融合而得的。由植物体的一部分诱导愈伤组织可以使用现有公知的方法。即，通过在用于植物组织培养的培养基、例如MS培养基(Murashige和Skoog的培养基)、LS培养基(Linsmaier和Skoog的培养基)、Gamborg’s B5培养基、White培养基、ニッチ培养基、KNUDSON C培养基、SB培养基、R2培养基、N6培养基、Tuleeke培养基等基本培养基中加入蔗糖等营养源，并在其中加入植物激素、例如2,4-二氯苯氧基乙酸等生长素、激动素、苄基腺嘌呤等细胞分裂素等而调制的固体培养基或者液体培养基中培养植物体的一部分，从而可以获得愈伤组织。诱导愈伤组织的培养条件可以在光存在下或者不存在下、在15～35℃静置或者振荡培养。

诱导的愈伤组织可以移植到传代培养基中培养，也可以直接移植到后述的再分化培养基中。传代培养基是用于以未分化的状态维持愈伤组织、使其增殖的培养基，可以是一般使用的任意的传代培养基。例如，传代培养基是在上述基本培养基中添加了糖类、无机盐、维生素、生长素、根据需要的细胞分裂素、氨基酸等的培养基，可以使用固体培养基，但优选液体培养基。愈伤组织的传代培养基也有时与愈伤组织的诱导培养基相同。培养条件与愈伤组织诱导培养条件同样。愈伤组织的传代优选每1～4周进行。

再分化培养基是指使维持未分化状态的愈伤组织经由不定胚、不定根、或不定芽而分化成再生植物体的培养基。作为本发明中使用的再分化培养基，可使用现有公知的培养基，例如，在上述基本培养基中添加了糖类、无机盐、维生素、及根据需要的生长素、细胞分裂素、氨基酸等的培养基。培养基可以使用固体培养基或者液体培养基。作为调制固体培养基时的胶凝剂，可列举琼脂、结冷胶等。培养条件优选在光存在下、在15～35℃静置培养。

本发明的植物细胞分化促进剂可以通过添加到传代培养基和/或再分化培养基中、或滴加到固体培养基上的愈伤组织中来使用。该植物细胞分化促进剂在用于固体培养基的情况下，可以通过预先包含在固化之前的液体培养基中，也可以通过涂布在固体培养基的表面上来添加。

通过在包含本发明的植物细胞分化促进剂的传代培养基或再分化培养基上培养愈伤组织，或通过将本发明的植物细胞分化促进剂滴加到愈伤组织中，从而可以促进由愈伤组织形成正常的不定胚。另外，也有时通过在包含本发明的植物细胞分化促进剂的传代培养基或再分化培养基上培养愈伤组织，或通过将本发明的植物细胞分化促进剂滴加到愈伤组织中，来促进不定根或不定芽的形成。由愈伤组织形成不定胚、不定根、不定芽的哪一者，依赖于培养基中生长素与细胞分裂素量的比率，一般如果生长素量多则观察到不定根分化，如果细胞分裂素量多则观察到不定芽分化，如果使生长素量极端低下则形成不定胚。分化的不定胚、及不定芽均可以分化成再生植物体。归纳以上内容，本发明的植物细胞分化促进剂可以说是愈伤组织的分化促进剂。并且，由于添加至包含在现有的由愈伤组织的不定胚诱导中使用的生长素、细胞分裂素这样的植物激素的培养基中促进分化，因而也可以说是植物细胞分化促进辅助剂、愈伤组织的分化促进辅助剂。

另一方面，本发明的植物细胞分化促进剂可以促进由植物切片分化不定器官、特别是分化不定根和/或不定芽。因此，本发明的植物细胞分化促进剂可以在微繁殖法中使用，可以作为植物切片的发芽促进剂或发根促进剂使用。作为使用本发明的植物细胞分化促进剂的植物切片，可列举植物体的任意一部分，例如，叶、茎、根等，也可以在从植物体切下的侧芽等的发根促进中使用。

本发明的植物细胞分化促进剂可以通过在从移至再分化培养基的3周前至移植到再分化培养基后2周的期间添加到传代培养基或再分化培养基中，从而发挥其分化促进作用。更优选可以通过向再分化培养基移植的2周前到移植后1周的期间添加到传代培养基或再分化培养基中，从而发挥其分化促进作用。

本发明的植物细胞分化促进剂优选与在植物组织培养中一般使用的植物激素一起使用。作为与本发明的植物细胞分化促进剂一起使用的植物激素，可列举生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯、脱落酸等，优选生长素、细胞分裂素。

在本发明的其他方式中，本发明还涉及包含特定的酮醇脂肪酸的培养基。本发明的培养基优选为包含特定的酮醇脂肪酸的愈伤组织的传代培养基或再分化培养基。这些培养基除了包含特定的酮醇脂肪酸以外，与一般使用的愈伤组织的传代培养基或再分化培养基相同。作为一般使用的愈伤组织的传代培养基或再分化培养基的基本培养基，可列举MS培养基、LS培养基、N6培养基、Gamborg’s B5培养基、White培养基、ニッチ培养基、KNUDSON C培养基、SB培养基、R2培养基、Tuleeke培养基等，在这些基本培养基中进一步加入生长素及细胞分裂素而制成传代培养基，使生长素量降低或完全去除、并使细胞分裂素量变化，从而制成再分化培养基。这些培养基可以是液体培养基或固体培养基。

作为本说明书中使用的生长素，可列举吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸、萘氧基乙酸、苯基乙酸、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、及2,4,5-三氯苯氧基乙酸(2,4,5-T)等。作为本说明书中使用的细胞分裂素，可列举玉米素、苄基腺嘌呤及噻苯隆等。

作为本发明的植物细胞分化促进剂所含的特定的酮醇的具体例的9-羟基-10-氧代-12(Z),15(Z)-十八碳二烯酸(KODA)，可以使用从作为浮萍科植物的一种的浮萍中提取而获得的提取法来制造。作为其他制造方法，还可以使用依据植物体内的脂肪酸代谢途径使9位特异性脂加氧酶(LOX)、丙二烯氧化物合酶(AOS)这样的酶作用于作为不饱和脂肪酸的α-亚麻酸(一般名：顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)而得到的酶法、及运用通常公知的化学合成法而得到的化学合成法来制造KODA。关于这些制造方法，在日本特开平11-29410号公报及日本特开2001-131006号公报中具体记载。

以下，通过实施例更详细地说明本发明，但这些实施例对本发明的范围没有任何限制。

实施例

实施例1：由苞叶芋属培养苗的愈伤组织的诱导

作为苞叶芋属(品种Double Take)的培养苗，使用在加入于旭テクノグラス社制的植栽盒(内容积300ml)的MS培养基(Murashige和Skoog的培养基)中添加蔗糖3％、琼脂(和光纯药社、东京、日本)0.8％并将pH值调整为5.8而得的固体培养基上，在明处(光合成光量子束密度5.7μmole/m²/sec、16小时日长)、25℃的条件下进行传代维持的培养苗。

在用0.8％琼脂固化的MS培养基中添加蔗糖(3％)、2,4-二氯苯氧基乙酸(4ppm)、苄基腺嘌呤(BA)(0.2ppm)、酪蛋白的酸水解物(100ppm)、5mM的2-吗啉乙磺酸一水合物(MES)而制成愈伤组织诱导及增殖用的培养基(以下，称为“传代培养基”)(pH值5.8)。由培养4周的培养苗，以从植株剥下叶鞘的方式进行采样，将包含剥离部分的约2cm的切片(叶鞘基部)作为外植片。将该外植片置床于加入了愈伤组织传代培养基(50ml)的植栽盒中。在25℃、暗处条件下培养8周，结果在置床切片的剥离部分诱导了愈伤组织。将这些愈伤组织以每0.2g/容器传代至传代培养基中，培养1个月，从而筛选出胚性愈伤组织。胚性愈伤组织每4周向传代培养基进行传代，从而可以在保持不定胚诱导能力的状态下维持2年。

在加入有含蔗糖(1％)、果糖(1.1％)、BA(0.1ppm)、MES(5mM)的MS液体培养基(pH值5.8)(以下，称为“再分化培养基”)160ml的500ml三角烧瓶中置床胚性愈伤组织各0.05g，在25℃、明处(16小时日长、光合成光量子束密度22.8μmole/m2/sec)进行6周浸透培养(80转/分钟)，得到不定胚。将这些不定胚以各0.2g置床于加入了含蔗糖(3％)且用琼脂(0.8％)固化的MS培养基(pH值5.8，以下称为“发芽培养基”)(50ml)的植栽盒中，在25℃、明处(16小时日长、光合成光量子束密度5.7μmole/m2/sec)进行8周培养，结果不定胚发芽而得到完全的植物。

实施例2：由苞叶芋属的愈伤组织的不定胚分化诱导中的KODA的影 响

将在传代培养基中维持的胚性愈伤组织在新的传代培养基中进行传代培养，于1周(7天)后、2周(14天)后、3周(20天)后在愈伤组织中滴加KODA的3ppm水溶液。从传代开始起3周后，将培养的愈伤组织置床于液体的再分化培养基中，6周后回收分化的不定胚(图1)，进行脱水，测定脱水后的不定胚重量。将不定胚置床于发芽培养基，数出所得的发芽体的数。结果示于表1。从测定结果计算出每1g脱水后的不定胚重量对应的发芽体数(图2)。与对照区相比，1周后处理区与对照区相比未见增減，2周后处理区增加最多，3周后处理区比2周后处理区减少。考虑KODA对愈伤组织的不定胚诱导效果具有施用时期特异性。

表1.KODA处理对由愈伤组织的发芽体的诱导的影响

实施例3：苞叶芋属的由愈伤组织的不定胚分化诱导中的KODA浓度 的影响

将在传代培养基中维持的胚性愈伤组织置床于新的再分化培养基，2周后，滴加0.03ppm、0.3ppm、3ppm的KODA水溶液，8周后记录正常再生的植物体的数。虽然在全部的试验区再生出植物体，但发现大量具有严重的胁迫症状(细叶)的植物体(图3)。这些显示严重的胁迫症状的植物体不计入正常再生的植物体数中。在对照区，显示胁迫症状的植物体的数多，作为结果，正常再生的植物体数少。结果示于图4。

实施例4：KODA对由长命草(滨海前胡)的愈伤组织的再分化的影响

将冲绳县与那国岛产的滨海前胡(Peucedanum japonicum)种子播种于人工土壤(Metro-Mix360,Sun Grow Horticulture Canada Ltd.)，在20℃、12小时光照期的条件下使其发芽。2个月后，拔出幼植物体，仅将地上部用水充分洗涤，用70％乙醇(10秒)、次氯酸钠(ナカライテスク)10倍稀释液(7分钟)消毒后，用纯水淋洗4次。切下叶柄部分，无菌地切成约5mm的长度，植入到用0.7％琼脂的凝胶化了的含2,4-二氯苯氧基乙酸(0.022mg/L)和激动素(10.75mg/L)的MS培养基(和光纯药)(用0.7％琼脂固体化)中。叶柄组织在25℃、12小时的光照期的条件下培养2个月，包含不完全的叶状组织的绿化组织块增殖。2个月后，在1μM的KODA(KODA处理区)或水(对照区)中浸泡绿化组织块，置床于添加了吲哚乙酸(IAA)至浓度为0.1ppm、0.5ppm、1ppm、并添加了苄基腺嘌呤(BA)至浓度为2ppm的MS培养基(用0.7％琼脂固体化)中。结果示于表2。正如由表可明确的那样，由浸泡于KODA液中的绿化组织块得到了大量的再分化植物体，但在对照区(水)仅在吲哚乙酸1.0ppm＋苄基腺嘌呤2.0ppm条件下得到了少量的再分化植物体。

表2.

实施例5：KODA对从烟草的愈伤组织的再分化的影响

将烟草(Nicotiana tabacum)种子用70％乙醇洗净后，用5％次氯酸钠及0.05％Tween20的杀菌溶液进行3分钟表面杀菌，用灭菌水洗净5次。洗净后，在KODA水溶液(100μM)中进行浸渍处理，在添加蔗糖3％、琼脂(和光纯药社)0.8％、2,4-二氯苯氧基乙酸(关东化学株式会社)(3ppm)、激动素(ナカライテスク株式会社)(0.1ppm)并将pH值调整为5.7而得的固体MS培养基(和光纯药社)中，置床洗净后的种子，在16小时光照期、25℃的条件下进行3周愈伤组织诱导。

去除进行了愈伤组织诱导后的烟草的由种子发芽而生长的地上部，仅将愈伤组织化了的根部在100μM的KODA水溶液(KODA处理区)或水(对照区)中进行浸渍处理，在装入于塑料皿中的在MS培养基中添加蔗糖3％、琼脂(和光纯药社)0.8％、1-萘乙酸(ナカライテスク株式会社)(0.2ppm)、6-苄基腺嘌呤(ナカライテスク株式会社)(2ppm)并将pH值调整为5.7而得的固体再分化培养基上，在16小时光照期、25℃的条件下进行地上部的再分化诱导。关于在地上部再分化培养基中的培养，在培养2周后移至新的固体再分化培养基中，进行共计4周地上部再分化诱导。进行地上部再分化诱导，将所得的地上部用手术刀切除。将该切除的地上部在100μM的KODA水溶液(KODA处理区)或水(对照区)中进行浸渍处理，置床于在放入于アズワン株式会社制培养瓶CB-3中的、用0.8％琼脂固化的MS培养基中加入蔗糖(3％)并调整为pH值5.7的MS培养基(100mL)中，在16小时光照期、25℃的条件下进行4周地下部的再分化培养。培养结束后，从培养瓶中取出植物体，除去多余的培养基，拍摄所得的培养株的全体像，结果示于图5。另外，拍摄后，仅挑选正常个体，分割地上部和地下部。分割的生物体样品进行冻结干燥，除去水分后测定重量(图6)。

在组织培养中，经常出现个体再生时出现萎化等的异常个体的情况，因此，在再分化个体中，进行对照区和KODA区的正常个体数的比较。其结果是，在对照区正常个体为全体的30％，与此相对，在KODA处理区正常个体为全体的60％为正常个体。接着通过个体的干燥重量来比较再分化个体的生长(图6)。对于地上部，在显著性水平5％没有显著性差异，但在平均值比较中重量明显呈增加倾向。另外对于地下部，在显著性水平5％确认了显著性差异，显著地促进了地下部的生长是明确的。由以上可明确，在组织培养个体中，KODA有在经由植物的愈伤组织的个体再分化中使正常化率上升的倾向，另外，有显著促进再分化个体的、主要是根的生长的趋势。

Claims (8)

1.植物细胞分化促进剂，其包含碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸，所述碳原子数为4～24的酮醇脂肪酸中，构成羰基的碳原子与结合有羟基的碳原子处于α位的位置。

2.根据权利要求1所述的植物细胞分化促进剂，所述酮醇脂肪酸中，碳之间的双键存在1～6处，但是，该双键数不超过酮醇脂肪酸的碳键数。

3.根据权利要求1或2所述的植物细胞分化促进剂，所述酮醇脂肪酸的碳原子数为18，且碳之间的双键存在2处。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的植物细胞分化促进剂，所述酮醇脂肪酸是9-羟基-10-氧代-12(Z),15(Z)-十八碳二烯酸。

5.根据权利要求1～4的任一项所述的植物细胞分化促进剂，所述植物细胞分化促进剂促进由植物的愈伤组织向不定胚、不定根、或不定芽的分化。

6.根据权利要求1～4的任一项所述的植物细胞分化促进剂，所述植物细胞分化促进剂促进由植物切片向不定芽或不定根的分化。

7.再生植物体的制成方法，是由愈伤组织制成再生植物体的制成方法，其中，包括以下工序：在将传代培养基中维持的愈伤组织移植到再分化培养基的3周前至移植后2周的期间，对愈伤组织施用权利要求1～4的任一项所述的植物细胞分化促进剂。

8.植物培养用培养基，其包含权利要求1～4的任一项所述的植物细胞分化促进剂。

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