CN110122327B - 一种矾根花序轴离体再生体系建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种矾根花序轴离体再生体系建立的方法，其特征在于，包括下述步骤：外植体的选取与消毒、愈伤组织的诱导分化、不定芽增殖、根的诱导、炼苗、组培苗移栽，本申请方法能够大量获得矾根无菌苗，解决矾根快速繁殖的问题，一个培养周期内，扩繁300倍以上，成活率也获得98.71%，增殖率和移栽成活率的提高大大填补了市场空白，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及矾根（Heuchera micrantha)组织培养的繁殖方法，属于草本观赏植物种苗繁殖的技术领域，具体涉及一种矾根花序轴离体再生体系建立的方法。
背景技术
矾根（Heuchera micrantha)又名珊瑚铃，为虎耳草科矾根属多年生草本花卉。浅根性。叶基生，阔心型，长20-25cm，深紫色，在温暖地区常绿，花小，钟状，花径0.6-1.2cm，红色，两侧对称，喜半荫，耐全光；园林中多用于林下花境，地被，庭院绿化等等。花期4-10月。是理想的宿根花境材料。也是近些年从国外引入的多年生宿根花卉。其园艺品种繁多，叶色丰富多彩，且不同的季节、环境和温度下叶片的颜色还会有丰富的变化，是理想的宿根花境材料。目前，矾根植物深受家庭园艺小型花卉爱好者的喜爱，部分品种的电商销售供不应求。此外，在园林中也有用于林下花境、地被、庭院绿化等，是优良的荫生环境宿根彩叶花卉。
矾根自然生长在湿润多石的高山或悬崖旁。性耐寒，喜阳耐阴。在肥沃、排水良好，富含腐殖质的土壤上生长良好。喜中性偏酸、疏松肥沃的壤土，适宜生长在湿润但排水良好、半遮阴的土壤中，忌强光直射。幼苗长势较慢，成苗后生长旺盛，是少有的彩叶阴生地被植物，矾根植物喜半荫，耐全光，耐低温，忌过度潮湿，适宜在我国北方种植，南方种植多数品种存在着越夏困难的问题（黄少玲，汪华清，周意峰等，2016，矾根在东莞地区引种驯化过程中的夏季适应性研究，热带林业，44(4):4-7）。但矾根植物品种众多，在华东地区也有适宜粗放管理的品种，如花毯、鸡尾酒、饴糖、黑曜石等。而其中“花毯”品种的适应性最佳，叶片为绿色，在逆境或秋冬季节转换时叶片又呈红色。较之其他华东地区适生品种，“花毯”更加符合园林园艺设计师的需求。
目前，矾根植物的繁殖方式有叶插、分株和组培方式，但前2种方式繁殖速度较慢，不能满足市场需求。梁芳等采用的分株繁殖，成活率不到50%（5种宿根花卉品种生长习性评价及栽培研究，草原与草坪，2009(6) ：43-46）。因此，建立组织培养快速繁殖体系是解决优良品种种苗短缺的最有效途径。矾根属植物的组织培养，已见有报道，但外植体多数选择新芽或腋芽茎段等，孙国峰等研究培养的银王子品种继代繁殖率达15-20倍（矾根杂种‘银王子＇的组织培养和快速繁殖，植物生理学通讯，2007，43(3):500-500）；章志红等研究培养的紫宫殿品种继代繁殖率达9.3倍（美洲矾根品种紫宫殿组织培养与离体快繁研究，江苏农业科学，2011，(5):69-71）；陈宏等研究培养的‘brownies’品种继代繁殖率仅3.5倍，且玻璃化严重，有效芽少（矾根的组织培养与快速繁殖，上海农业学报，2011，27(4):80-82）。矾根“花毯”品种的快繁体系尚未见有报道。组培快繁体系受母本外植体限制，外植体简单消毒后污染率过高，过度消毒又易形成褐变，无菌系建立比较困难。
综上，以花序轴为外植体，建立矾根品种花毯的离体再生快繁体系，为解决花毯种苗短缺的重要途径之一，对矾根的开发和推广利用都具有着非常重要的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是公开了以矾根花序轴为外植体的离体再生体系建立。
本发明的目的是为了建立矾根品种花毯组织培养繁殖体系。
为了达到上述目的，本发明提供了一种矾根品种“花毯”花序轴离体再生体系建立的方法，为解决该技术采用如下的技术方案：
（1）外植体的选取与消毒：选取生长20d左右的矾根品种“花毯”花序轴作为外植体，冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为：用清水冲洗干净，然后用安利洗涤剂漂洗一次，摇床上振荡15-20min；流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒10-20s，立即倒入0.1％的升汞消毒12min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min，将消毒完毕的花序轴切割为2cm长的小段。
（2）愈伤组织的诱导：取步骤（1）中处理得到的外植体小段，以斜面放置方式接种于诱导培养基（事先将培养基倒斜面）中进行愈伤组织的诱导，培养温度为25±2℃，首先在黑暗中培养10d，然后进行光照培养25d；所述光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述诱导培养基为MS+6-BA0.6mg/L+IBA0.02mg/L，pH值为5.8-6.0；
（3）愈伤组织的分化：将步骤（2）中诱导得到的愈伤组织，诱导25d后，在外植体上切下，接入分化培养基进行不定芽分化，培养温度为25±2℃；光照时间14h/d，光照强度2500lx；所述分化培养基为N6+CPPU 0.3mg/L+IBA0.01mg/L，pH值为5.8-6.0；
（4）不定芽的继代增殖：将诱导得到的不定芽切割后，每芽带0.3cm左右茎段和3-4片叶片，接入继代增殖培养基中进行继代培养25d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500lx；所述继代增殖培养基为MS＋6-BA0.2mg/L，pH值为5.8-6.0；
（5）根的诱导：将步骤（3）中继代增殖得到的试管苗接入生根培养基中进行生根培养15d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000lx；所述生根培养基为MS+2.0mg/L IBA，pH值为5.8-6.0；待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。
(6) 将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，将根浸泡在复合微生物制剂中，15min。
所述复合微生物制剂为，短小芽孢杆菌发酵液：发根植物单胞菌发酵液：假丝酵母菌发酵液：产黄纤维单胞菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠重量比＝3：4：4：3：1：2
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为ATCC700814；
所述发根植物单胞菌（Agrobacterium rhizogenes）为ATCC11325;
所述假丝酵母菌具体为假丝酵母菌（Candida utilis）为ATCC No.22023;
所述产黄纤维单胞菌（cellulomonas flavigena）为ATCC No.482；
首先将短小芽孢杆菌：发根植物单胞菌：假丝酵母菌：产黄纤维单胞菌发分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到107个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例3：4：4：3混合，按照重量配比添加草炭、磷酸氢二钠即得。
（7）炼苗后移栽入扦插基质中，所述扦插基质优选为：按照2：2：1的体积比例将泥炭土、蛭石和珍珠岩混匀，地上部分喷洒0.1％的多菌灵，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射。
对于本发明的进一步改进在于，所述步骤（1）中外植体的选取及选取时间：以生长20d左右的花序轴为外植体，在诱导35后即可有效获得分化的愈伤组织，数量多且生长迅速；在该时间点进行外植体选取和消毒，污染率大大降低。
本发明矾根品种“花毯”花序轴离体再生体系建立的方法具有以下优点：
1 外植体的选择与消毒处理，本申请发明人经过大量创造性劳动及多因子实验，全面改进现有技术中的操作参数，发现，按照常规的消毒方式即清洗－酒精消毒－升汞消毒－无菌水冲洗，存在一定的污染率，而采用本申请的操作过程中外植体部位和采集时间，不仅取得了理想的灭菌效果，还能够保证诱导培养所需的外植体数。花序轴组织的细胞分化能力强于腋芽、叶柄等材料，生长20d的花序轴优于其他时间点采集的花序轴外植体材料。
2 外植体的放置方式：放置方式的不同导致培养效果不同，斜面培养基上放置的外植体愈伤形成早，数量多，增长极快，显著优于平面培养基放置的花序轴。
3组织培养方法其步骤都具有相似性，其结果却具有显著的不同，本领域公知组织培养方法一般分为暗培养和光培养两个阶段，暗培养一般是诱导愈伤组织，光培养诱导分化。暗培养要求避光，其实是防止迅速分裂的愈伤细胞老化，本申请发明人经过反复实验得出，矾根品种花毯先经过一段时间的暗培养，使外植体迅速分裂，然后光诱导培养，其萌发率最高，愈伤出芽更加迅速，缩短组培时间。
4本领域公知，对于植物组培领域研究如何利用植物组织分化再生植株，提高植物的繁殖数量，是科学家研究重要的技术重点也是技术难点，而激素种类及激素浓度使用范围，培养基类型更是重中之重，本申请发明人经过大量创造性劳动，筛选的到最佳的矾根品种“花毯”诱导培养基、增殖培养基及生根培养基的成分及激素组合，不仅诱导、增殖效果明显，且出芽时间大大缩短，仅25d就能生长愈伤，再诱导25的即可出不定芽，且增殖、生根效果显著。
5本发明复合微生物制剂为专门针对矾根品种生根的营养制剂，其经过大量的调研及实验，短小芽孢杆菌：发根植物单胞菌：假丝酵母菌：产黄纤维单胞菌形成一个良好的微生态系统，浸泡后带入基质中构建有利于植物生长，改善植物根际营养环境，其代谢还能加强土壤有机物的分解，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，微生物分泌根系促生素和抑菌素能够呵护幼苗根系感染腐霉根腐病、疫霉根腐病、细菌性根腐病和茎基腐病及立枯病、猝倒病等苗期病害，磷酸氢二钠不断供给营养，维持苗壮势头，极大的提高植株的适应性，提高整个成活率，草炭通气性好、吸附能力强，保水保肥，有利于微生物活动，增强生物性能，富含有机质、腐殖酸及其他营养成分，单因子试验验证，经过本申请微生物制剂处理后，成活率较空白对照组提高27.1%，以专利申请2016109144036中复合微生物制剂为对照，本申请成活率较之提高了13.3%。
具体实施方式
实施例一
外植体筛选实施例：
1、外植体在培养基中的放置方式筛选
对于大小、生长状态相近的外植体花序轴，其放置方式的不同也导致培养效果不同。斜面放置的外植体出芽早，数量多，增长极快，而平面放置的花序轴则几乎没有芽点分化的出现，且放置35d以上则逐渐趋于褐化或干枯。
表1
2、培养基筛选实施例
愈伤途径的离体再生体系建立过程中，愈伤组织分化的成功是再生体系的关键步骤。愈伤分化率直接影响着再生组培体系是否可行。愈伤分化培养基由基本培养基和激素种类及浓度搭配对愈伤分化的程度和分化率有着非常大的相关性。本发明尝试了不同基本培养基和CPPU、BA与IBA的不同浓度配比，对矾根分化程度的影响见表2。从表2可以看出，N6+CPPU 0.3mg/L+IBA0.01mg/L上的矾根愈伤组织分化率最高，为最佳愈伤分化培养基。
表2
| 基础培养基种类 | 激素组合mg/L | 愈伤分化时间 | 愈伤分化率% |
| MS | BA0.3+IBA0.01 | 45 | 54.91 |
| MS | CPPU0.3+IBA0.01 | 40 | 69.76 |
| MS | CPPU0.3+IBA0.10 | 55 | 62.34 |
| N6 | BA0.3+IBA0.01 | 30 | 74.54 |
| N6 | CPPU0.3+IBA0.01 | 25 | 89.19 |
| N6 | CPPU0.3+IBA0.10 | 35 | 71.04 |
实施例二
1、外植体的选取与消毒：选取生长20d左右的花序轴作为外植体，冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为：用清水冲洗干净，然后用安利洗涤剂漂洗一次，摇床上振荡15-20min；流水冲洗20-30min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒10-20s，立即倒入0.1％的升汞消毒12min，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5min，将消毒完毕的花序轴切割为2cm长的小段，共接入花序轴小段50个。
2、愈伤组织的诱导：取步骤（1）中处理得到的外植体小段，以斜面放置方式接种于诱导培养基（事先将培养基倒斜面）中进行愈伤组织的诱导，培养温度为25±2℃，首先在黑暗中培养10d，然后进行光照培养25d；所述光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述诱导培养基为MS+6-BA0.6mg/L+IBA0.02mg/L，pH值为5.8-6.0。培养25d后，共有42个外植体两端长处绿色愈伤组织。
3、愈伤组织的分化：将步骤（2）中诱导得到的愈伤组织，诱导25d后，在外植体上切下，分割后，接入分化培养基进行不定芽分化，培养温度为25±2℃；光照时间14h/d，光照强度2500lx；所述诱导培养基为N6+CPPU 0.3mg/L+IBA0.01mg/L，pH值为5.8-6.0；接入分化培养基的愈伤小块共200块，愈伤组织培养50d后，愈伤分化率达94.5%，每块愈伤可分化不定芽5-8个。
4、不定芽的继代增殖：将诱导得到的不定芽切割后，每芽带0.3cm左右茎段和3-4片叶片，接入继代增殖培养基中进行继代培养25d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500lx；所述继代增殖培养基为MS＋6-BA0.2mg/L，pH值为5.8-6.0； 培养35d后，每茎段可增殖出不定芽12-14个。
5、根的诱导：将步骤（3）中继代增殖得到的试管苗接入生根培养基中进行生根培养15d，即可在茎段基部或腋芽处长出不定根，根数10-20条不等，继续培养15d后，不定根会长满瓶底，部分为气生根。培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000lx；所述生根培养基为MS+2.0mg/L IBA，pH值为5.8-6.0；待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。
6、将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，将根浸泡在复合微生物制剂中，15min，所述复合微生物制剂为，短小芽孢杆菌发酵液：发根植物单胞菌发酵液：假丝酵母菌发酵液：产黄纤维单胞菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠重量比＝3：4：4：3：1：2
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为ATCC700814；
所述发根植物单胞菌（Agrobacterium rhizogenes）为ATCC11325;
所述假丝酵母菌具体为假丝酵母菌（Candida utilis）为ATCC No.22023;
所述产黄纤维单胞菌（cellulomonas flavigena）为ATCC No.482；
所述复合微生物制剂的制备方法为：首先将短小芽孢杆菌：发根植物单胞菌：假丝酵母菌：产黄纤维单胞菌发分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到107个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例3：4：4：3混合，按照重量配比添加草炭、磷酸氢二钠即得。
然后移栽入扦插基质中，所述扦插基质优选为：按照2：2：1的体积比例将泥炭土、蛭石和珍珠岩混匀，地上部分喷洒0.1％的多菌灵，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射。培养15d后，生根率达到100%，成活率达98.71%。
采用本发明离体再生建立方法，能够大量获得矾根无菌苗，解决矾根快速繁殖的问题，通过对最佳外植体、诱导激素水平、生根菌剂的筛选，能够使得一个培养周期内，扩繁300倍以上，生根率达到100%，成活率也获得98.71%，增殖率和移栽成活率的提高大大填补了市场空白，具有广阔的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种矾根花序轴离体再生体系建立的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
（1）外植体的选取与消毒：选取矾根花序轴作为外植体消毒处理；
（2）愈伤组织的诱导：取步骤（1）中处理得到的外植体小段，以斜面放置方式接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为25±2℃，暗培养10d，然后进行光照培养25d；所述诱导培养基为MS+6-BA0.6mg/L+IBA0.02mg/L，pH值为5.8-6.0；
（3）愈伤组织的分化：将步骤（2）中诱导得到的愈伤组织，诱导25d后，切下，接入分化培养基进行不定芽分化，培养温度为25±2℃；所述分化培养基为N6+CPPU 0.3mg/L+IBA0.01mg/L，pH值为5.8-6.0；
（4）不定芽的继代增殖：将步骤（3）得到的不定芽切割后，接入继代增殖培养基中进行继代培养25d，培养温度为25±2℃；所述继代增殖培养基为MS＋6-BA0.2mg/L，pH值为5.8-6.0；
（5）根的诱导：将步骤（4）中继代增殖得到的试管苗接入生根培养基中进行生根培养15d，培养温度为25±2℃；所述生根培养基为MS+2.0mg/L IBA，pH值为5.8-6.0；
(6) 将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，将根浸泡在复合微生物制剂中15min后，然后移栽入扦插基质中；
所述复合微生物制剂为，短小芽孢杆菌发酵液：发根植物单胞菌发酵液：假丝酵母菌发酵液：产黄纤维单胞菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠重量比＝3：4：4：3：1：2；
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为ATCC No.700814；
所述发根植物单胞菌（Agrobacterium rhizogenes）为ATCC No.11325；
所述假丝酵母菌（Candida utilis）为ATCC No.22023；
所述产黄纤维单胞菌（cellulomonas flavigena）为ATCC No.482。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合微生物制剂的制备方法为：首先将短小芽孢杆菌：发根植物单胞菌：假丝酵母菌：产黄纤维单胞菌发分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到107个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例3：4：4：3混合，按照重量配比添加草炭、磷酸氢二钠即得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒处理具体步骤为用清水冲洗干净，然后用洗涤剂漂洗一次，流水冲洗后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒10-20s，立即倒入0.1％的升汞消毒12min，最后用无菌水洗涤并振荡，将消毒完毕的花序轴切割为2cm长的小段。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扦插基质为：按照2：2：1的体积比例将泥炭土、蛭石和珍珠岩混匀制备。
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