CN103548559A - 一种高效获取蛹虫草有效接种体的菌种分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效获取蛹虫草有效接种体的菌种分离方法，其特征在于，采用热激法处理子实体。与传统分离平板相比，本发明分离平板气生菌丝减少，菌丝致密，生长快。暗培养结束后，光照培养转色快，颜色深。菌丝易发生扭结，在平板上易形成原基。栽培试验表明，与传统分离菌种相比，本发明分离菌种在栽培瓶中子实体原基出现早，子实体形态与亲本一致，生长整齐，变异程度低。本发明操作简单易行，分离效果好，平板菌落有效接种物部分易识别。分离菌种稳定性强，变异少。传代次数比传统方法增加。

Description

一种高效获取蛹虫草有效接种体的菌种分离方法

技术领域

本发明涉及蛹虫草栽培技术领域，具体涉及一种蛹虫草菌种及遗传特性保持的方法。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris(L.Fr)Link)，又名蚕虫草、北冬虫夏草，属子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、球壳目(Sphaeriales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps(Fr.)Link)真菌。蛹虫草是虫草属真菌的模式种，在自然界多寄生多种鳞翅日昆虫的幼虫和蛹上。

近年来，研究表明，人工栽培的蛹虫草化学成分及药理作用与冬虫夏草相似，但价格却远远低于冬虫夏草，因此，蛹虫草的开发应用具有极大的潜在市场。

人工培养蛹虫草是解决野生虫草来源不足的良好途径，相关的研究很多，然而人工培养过程中菌种退化现象严重是制约产业化开发的一大瓶颈。影响人工培养蛹虫草菌种退化的因素很多，简单的可以分成两的大类，一类是菌株的遗传特性造成菌种的退化(内因)。一类是培养条件、操作环节、环境因素导致的菌种退化(外因)。

在实际的蛹虫草规模化生产的菌种分离和筛选过程中，最常采用的是组织分离法。组织分离法就是指通过子实体组织分离获得纯菌丝的方法。食用菌的子实体实际上就是菌丝体的纽结物，它具有很强的再生能力。因此，只要切取一小块子实体组织，把它移植到培养基上，就能获取纯粹的菌丝体。

组织分离培养，从生物学的角度来看，乃是一种无性繁殖，是从组织—菌丝—组织—菌丝周而复始的循环过程，遗传变异小，但在无性繁殖过程中可能产生自然变异和突变，但组织分离产生的变异不很大，是一种累积、渐进的过程，变异是绝对的，稳定是相对的。组织分离法还会因取样时子实体发育的不同时期和部位，以及个人的经验和技巧而产生不同的结果。

组织分离法取样位置不同遗传特性产生区别的一个典型事例是：香菇同一菌种子实体菇肉、菇柄组织分离物与菌丝体间既保持了遗传物质相对稳定性和遗传性状的稳定性(DNA相似性在88%以上)，存在着相对的遗传变异，虽然变异极为细微，但是预示着一种潜在必然趋势，反映了累积、渐进的漫长过程，这是由于内、外因造成的，但主要是由于遗传型的变异造成的，育种工作者不应忽略这种变异的存在，因为这很可能是造成某些菌种退化和变异的原因所在（香菇子实体组织分离物与菌丝体的遗传相关性，上海农业学报，1997，13(4)：85～88）。

1999年上海农科院“北冬虫夏草子实体人工高产栽培技术及其工厂化生产研究”，首次向国内外真菌学界提供了“Cordyceps militaris”菌株有性结构的细胞学证据。证明了子实体外层内的双核细胞为有效接种体，子实体的薄壁细胞为无效接种体。

常规的蛹虫草组织分离方法取得分离组织块后，往往是子实体外层的表面的薄壁组织细胞和疏松组织细胞先增殖，随后是子实体外层内的双核细胞增殖。因此造成了常规组织分离法获得的蛹虫草平板菌落可育菌丝部分和不可育菌丝很难区分，界限不明显，最终表现为蛹虫草菌种的不稳定。

发明内容

本发明的目的就是利用热激法使外层组织细胞蛋白变性，阻止不可育部分组织细胞的增殖，只让能形成有效接种体部分的组织细胞增殖，从而使蛹虫草平板菌落可育菌丝部分和不可育菌丝明显可以区分，使蛹虫草菌种稳定遗传。

为实现上述目的，本发明具体地包括如下内容：

1、子实体亲本的选择：

选取正在栽培瓶中生长中后期的没有受到污染的，子实体生长迅速、条形整齐，粗细均匀、颜色橘红、子囊果尚未发育的栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。在无菌条件下，用镊子夹取头顶部2-3cm，放入干热灭菌后的培养皿内，待处理。

2、子实体亲本的处理：

方法一：用镊子夹住用来组织分离的子实体，在65-85℃的无菌水（此无菌水事先在121℃，20min高温高压灭过菌）中停留0.5-2.0秒（温度越高时间越短，表层细胞受损而保护内层细胞），然后迅速转入到冰箱冷藏室冷藏的4℃的无菌水（此无菌水事先在121℃，20min高温高压灭过菌）中停留2-5分钟，然后取出放置于干热灭菌的内置吸水滤纸的培养皿内，待用。

方法二：用镊子夹住用来组织分离的子实体，在75%酒精中停留30-120秒，然后迅速转入到无菌水中洗涤三遍，然后取出放置于干热灭菌的内置吸水滤纸的培养皿内，待用。

方法三：将少量95%酒精倒入到培养皿中，点燃，用镊子夹住用来组织分离的子实体在蓝色火焰上来回过1-3次，然后迅速转入到冰箱冷藏室冷藏的4℃的无菌水（此无菌水事先在121℃，20min高温高压灭过菌）中停留2-5分钟，然后取出放置于干热灭菌的内置吸水滤纸的培养皿内，待用。

3、组织培养：

将上述处理过的子实体切段为2-4mm，放置在PDA平板上培养即可。

本发明方法具有如下优点：

与传统分离平板相比，本发明分离平板气生菌丝减少，菌丝致密，生长快。暗培养结束后，光照培养转色快，颜色深。菌丝易发生扭结，在平板上易形成原基。

栽培试验表明，与传统分离菌种相比，本发明分离菌种在栽培瓶中子实体原基出现早，子实体形态与亲本一致，生长整齐，变异程度低。

本发明操作简单易行，分离效果好，平板菌落有效接种物部分易识别。分离菌种稳定性强，变异少。传代次数比传统方法增加。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一、实验时间：2012年4月：

二、实验材料和设计：

1、菌种：蛹虫草菌株购自中国科学院微生物所，编号PRB.1235。菌种A采用传统方法分离获得；菌种B采用如下方法处理分离获得：

用镊子夹住用来组织分离的子实体，在80℃无菌水中停留1.5秒，然后迅速转入到冰箱冷藏室冷藏的4℃的无菌水中停留2min处理。

2、液体摇瓶用培养基：去皮土豆300克（煮汁）、葡萄糖10克、蛋白胨2克、磷酸二氢钾0.5克、硫酸镁1克、水1000毫升，pH自然。

3、子实体生产营养液：黄豆2%、葡萄糖1%、奶粉5%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.05%、维生素B110mg∕1000ml的比例配成营养液，调整pH在5.6～7.2。

4、采用PP料制成的培养盒（高10CM，上底直径12cm，下底直径8cm）。每盒大米40克和营养液56克分装混合，灭菌接种。

5、暗培养管理

培养室适宜温度为（18～25）℃，湿度为（70～85）%，应避光培养（7～8）天。菌丝布满表面后开始通风培养。

6、子实体培养

在按种后待菌丝布满整个瓶面并深扎到瓶底，开始见光，但避免太阳光直射。若培养室光线太暗，可补充日光灯照。菌丝见光后，在培养料表面或四周见有桔黄色色素形成，并出现米粒状的桔黄色菌蕾，菌蕾伸长后即成为子实体。子实体培育阶段，温度应为（20～23）℃，超过25℃生长缓慢，湿度应提高到（80～85）%。超过27℃菌丝萎缩不能出菌束。在子实体培养后期，逐渐加大室内空气的流通和交换，培养室培养阶段若发现污染应立即清除。

7、采收：

采收后A菌种平均鲜重达到28.7克/瓶。采收后B菌种平均鲜重达到31.8克/瓶。

实施例2

基本操作同实施例1，不同在于菌种B采用如下方法处理分离获得：

用镊子夹住用来组织分离的子实体，在75%酒精中停留60秒，然后迅速转入到无菌水中洗涤三遍。

采收后A菌种平均鲜重达到28.5克/瓶。采收后B菌种平均鲜重达到32.3克/瓶。

实施例3

基本操作同实施例1，不同在于菌种B采用如下方法处理分离获得：

将少量95%酒精倒入到培养皿中，点燃，用镊子夹住用来组织分离的子实体在蓝色火焰上来回过1-3次，然后迅速转入到冰箱冷藏室冷藏的4℃的无菌水中停留4分钟。

采收后A菌种平均鲜重达到27.8克/瓶。采收后B菌种平均鲜重达到33.6克/瓶。

以上实施例表明：本发明操作简单易行，分离效果好，平板菌落有效接种物部分易识别。不但分离菌种稳定性强，而且比传统分离方法还达到了增产的效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种高效获取蛹虫草有效接种体的菌种分离方法，其特征在于，采用热激法处理子实体。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，处理子实体的具体步骤为：子实体在65-85℃的无菌水中停留0.5-2.0秒，然后迅速转入到冰箱冷藏室冷藏的4℃的无菌水中停留2-5分钟。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于，处理子实体的具体步骤为：子实体在75%酒精中停留30-120秒，然后迅速转入到无菌水中洗涤三遍。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于，处理子实体的具体步骤为：将少量酒精点燃，子实体在蓝色火焰上来回过1-3次，然后迅速转入到冰箱冷藏室冷藏的4℃的无菌水中停留2-5分钟。