CN105613046A - 杏鲍菇原始母种的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种杏鲍菇原始母种的制作方法。本发明先是进行杏鲍菇原始母种的培养，再进行杏鲍菇原始母种的提纯；包括以下步骤，杏鲍菇原始母种的培养：A、挑选种菇B、准备用具C、冲洗种菇D、接种E、封口装袋F、恒温培养G、筛选提纯用种；杏鲍菇原始母种提纯的具体步骤如下：I、切杏鲍菇菌丝尖端J、分离出带有菌丝尖端及培养基块K、分皿L、封口并标记M、培养K、提纯复壮O、选种。本发明提供一种适合工厂化运用的杏鲍菇原始母种的制作方法，提高了菌种抗杂能力、提高了杏鲍菇子实体的产量和品质、保证了杏鲍菇子实体产量和质量的稳定性。

Description

杏鲍菇原始母种的制作方法

技术领域

本发明涉及食用菌原始母种制备方法领域，特别是指一种杏鲍菇原始母种的制作方法。

背景技术

我国食用菌总产量、年产值逐年增长，是全球最大的食用菌生产消费国，占世界年总产量的70％，成为我国农业领域仅次于粮、油、果、菜的第五大作物。其中，杏鲍菇是一种大型肉质伞菌，又名刺芹侧耳，是近年来开发栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种。杏鲍菇营养丰富，富含蛋白质、碳水化合物、多糖、维生素及钙、镁、铜、锌等矿物质，可以提高人体免疫功能，对人体具有抗癌、降血脂、润肠胃以及美容等作用。由于其具有营养丰富、口感好、货架期长、易工厂化栽培等特点，近年来受到国内外消费者和投资者的普遍欢迎，具有很好的发展潜力。

目前我国对于，食用菌工厂化生产发展迅速，在生产过程中，对于菌种的重要性是第一位的。而我国工厂化杏鲍菇生产量在总产量中迅速增加，而市场对高品质的杏鲍菇需求也在逐年增加，由于受投资水平、技术水平、研发水平的限制，工厂化杏鲍菇生产随着菌种的逐年使用，生物转化率逐渐降低、抗杂能力下降、产量和品质逐渐降低、生产成本步步攀升，大部分杏鲍菇工厂的菌种制作和引种都是很不规范，尤其是原始母种，造成种子质量不稳定，菌种退化现象严重，生物转化率下降严重，极易造成杂菌污染。现有技术中有“一种杏鲍菇母种驯化方法201210353266.5”发明专利申请，只简单披露了母种的纯化过程，没有将母种的培养和纯化全过程进行控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合工厂化运用的杏鲍菇原始母种的制作方法，提高了菌种抗杂能力、提高产量和品质、保证了产量和质量的稳定性。

本发明提出一种杏鲍菇原始母种的制作方法，先是进行杏鲍菇原始母种的培养，再进行杏鲍菇原始母种的提纯；包括以下步骤，

杏鲍菇原始母种的培养：

A、挑选种菇：从疏过蕾1-2天的育菇房，挑选多个六成熟，有本品种典型性状，健壮、美观、无病虫害的菇子10-20个作为种菇，采摘的时候戴上无菌手套，采摘后放到无菌塑料袋里面，并封严实袋口；

B、准备用具：把种菇、经过检测无菌的PDA培养皿、无菌水及全部操作用具灭菌后放入消过毒的超净工作台里面；

C、冲洗种菇：在无菌、正压的情况下，戴上无菌手套用无菌水把种菇逐个冲洗干净，分开放到超净工作台上，开紫灯消毒30分钟后，再开洁净正压风，把种菇表面的水分吹干、备用；

D、接种：戴上无菌手套，把杏鲍菇一分为二的切开，并在菌盖和菌柄处用无菌手术刀切取菌种块，用无菌的接种勾，转入无菌的PDA培养皿中心，每个种菇取两块，转接到两个无菌的培养皿之中；

E、封口装袋：用封口膜把接完种的PDA培养皿边缘封口并标记，再装入密封的无菌袋；

F、恒温培养：消毒培养箱，将装袋后的PDA培养皿，放到恒温培养箱里，温度调到25±0.5℃，进行黑暗、避光无风或弱风培养4-8天；

G、筛选提纯用种：培养期间，每天观察培养皿的生产参数，对于1个种菇转接的两个培养皿，都表现最佳的生长参数，则选为提纯的原始母种；

杏鲍菇原始母种提纯的具体步骤如下：

H、制作PDA培养皿，皿内的培养基清晰、偏干、无杂质、整个培养基厚度，均匀一致控制在3.0±0.5mm；

I、切杏鲍菇菌丝尖端：将把长满培养皿1/2的杏鲍菇菌种、全部操作器具放到经过紫外灭菌的超净工作台或生物安全柜里面，进行紫外或紫外加臭氧机避光灭菌20-40min；关闭紫外灯和臭氧机，开正压风，用无菌刀片快速切杏鲍菇菌丝尖端1±0.5mm，一个培养皿切10-12个这种长度的尖端，切完后盖上培养皿盖子；

J、分离出带有菌丝尖端及培养基块：把切分过的菌种培养皿，用很薄的无菌刀片，分离出切好的菌丝尖端，同时要切下菌丝尖端所依附的培养基块并分离出来，二者合称为菌种块；

K、分皿：把经过检测无菌的培养皿、杏鲍菇菌种、全部操作器具在超净工作台或生物安全柜里面进行第二次紫外或紫外加臭氧机灭菌30-40min，戴上无菌手套，用接种勾把分离出的菌种块，勾取移动到空白培养皿的中央，一个菌种块放一个空白培养皿；

L、封口并标记：把转接有菌种的培养皿封口并贴好标签，放到密封的无菌塑料袋中；

M、培养：把培养皿放到26±1℃的恒温培养箱里面，进行黑暗、避光、无风或弱风培养8-12天；

N、提纯复壮：每天观察记录菌丝的各项生长指标，当菌丝长满培养皿1/2-2/3的时候，选出优势的2个培养皿作为下次提纯复壮的出发菌种，按照上面方法，对菌丝尖端切取，重复上述H至N步骤3-8次；

O、选种：对经过提纯，表现非常优良的菌丝进行镜检、病毒检测、出菇试验，对三个指标都表现达标、出菇试验指标最优的菌种选作原始母种保藏。

优选地，在“B、准备用具”步骤中的全部操作用具包括灭过菌的手术刀、接种勾、无菌烧杯、酒精灯、酒精棉球、无菌手套、火机。

所述“G、筛选提纯用种”步骤中，所述生长参数包括培养皿的污染情况、菌种块萌发的快慢、长满培养皿时间、菌丝浓密度、菌丝光泽度、菌丝粗壮度、菌丝生长速度、菌丝边缘整齐程度、菌丝伸展度、菌丝生长势、。

“I、切杏鲍菇菌丝尖端”步骤中全部操作器具包括酒精灯、体式显微镜、灭过菌的手术刀、无菌手套、火机、酒精棉球；“K、分皿”步骤中全部操作器具酒精灯、酒精棉球、无菌手套、接种勾。

“K、观察并提纯复壮”步骤中，各项生长指标包括菌丝萌发的时间、菌丝长速、菌丝健壮度、菌丝光亮度、菌丝伸展度、菌丝粗细程度、菌丝边缘整齐度，菌丝整体长势。

所述“D、接种”、“E、封口装袋”、“J、分离出带有菌丝尖端菌种块”、“K、分皿”、“L、封口并标记”步骤中，应在超净工作台或生物安全柜内，距酒精灯火焰周围5cm的范围内操作。

所述“D、接种”步骤中，在菌盖和菌柄处用切取菌种块为4mm×4mm；“J、分离出带有菌丝尖端及培养基块”步骤中，所述培养基块的块径为3-4mm。

本发明的有益效果是；采用最优部位定点取菌种块，保证了原始母体的活力，即“D、接种”步骤中在种菇的菌盖和菌柄处切菌种块，菌盖和菌柄处的组织块更嫩，含的营养物质更多，更有利于菌丝萌发和培养健壮的菌丝体。

采用超短切取杏鲍菇菌丝尖端技术，现有技术中切取杏鲍菇菌丝尖端为2-3mm，而本发明开创性地采取切取1mm菌丝尖端，能使菌丝生产更快、生长势更强、生长潜力充分发挥出来。

杏鲍菇原始母种提纯过程中采用二次灭菌技术，即在“I、切杏鲍菇菌丝尖端；”和“K、分皿；”步骤中两次对超净工作台内的培养皿、操作器具进行紫外结合臭氧消毒，彻底地灭菌，保证菌种块不受杂菌感染，因为切杏鲍菇菌丝尖端的过程中主要是在超净工作台内，在体式显微镜的载物镜上进行的，主要超净工作台的窗口在操作过程中开的正压风小，正压风如太大会影响要切割操作，在操作过程中容易有不洁净的空气进入，同时这个动作要快，所以在做完这个程序的基础上，移出体式显微镜，再对其超净工作台内进行紫外结合臭氧消毒。

采用黑暗无风培养技术，“F、恒温培养”步骤中，恒温培养箱里为黑暗、避光无风或弱风环境，因为菌丝体的营养生长阶段不需要光照，光照会抑制菌丝的伸长生长，不利于菌丝体内营养的积累，在菌丝培养阶段在一定的氧气情况下，空间内的空气越静越有利于萌发和减少感染污染，培养温度在25℃左右，这个偏高点的温度，能加快菌丝的生长速度，更有利于提纯过程中获得更纯的杏鲍菇母种。“M、培养”步骤中，26±1℃的恒温培养箱能使菌丝的加速生长，使菌丝顶端的纯度更高，更好的提纯到高纯度的杏鲍菇菌种。“I、切杏鲍菇菌丝尖端”步骤中，要在快速切取菌丝尖端，能减少菌丝在体视显微镜下暴露的时间，开正压风，能最大程度地减少杂菌感染。

“D、接种”、“E、封口装袋”、“J、分离出带有菌丝尖端菌种块”、“K、分皿”、“L、封口并标记”等多个步骤操作，都在距酒精灯火焰周围5cm的范围内，能减少杂菌感染。

通过试验确定了原始母种的制作、提纯工艺，通过完善和创新杏鲍菇原始母种的制作、纯化工艺参数，使工厂化生产的杏鲍菇，产量高、质量稳定，抗污染能力强，始终保持种子最原始的种性，不退化、不变异、不老化，能够缩短菌种菌龄。这种工艺能方便和规范大、中型杏鲍菇瓶栽和袋栽公司原始母种的生产和使用，为杏鲍菇菌种的纯度和种性提供了有效保障。

经过对比试验，提纯的菌种与对照的普通菌种相比有以下优势；

(1)在母种培养阶段，提纯的菌种其菌丝的浓密度、整齐度、光泽度优于对照，同时提纯菌种的长满试管的菌龄在17天，生产上常用菌种的菌龄在20天，提纯异常试管母种的比率比对照异常管的比率低8％左右。

(2)在原种培养阶段，提纯菌种的菌丝，其颜色比对照更洁白，更有光泽，其生长势比对照更强，长满菌种瓶的菌龄在15天左右，对照菌种一般在17天左右。

(3)在栽培种阶段，提纯菌种长满栽培瓶的时间是16天左右，对照长满瓶的菌龄在18天左右。

(4)在生产瓶培养阶段，在相同培养条件下提纯菌种长满生产瓶的时间一般在22天，对照的长满瓶的时间在24天；其感染率提纯的一般在0.2‰，对照的一般在0.4‰。

(5)在育菇和采菇阶段，提纯的比对照的一般情况下快1天左右的时间，生长的菇更健壮和紧密，品质比对照好，在产量上面，提纯的每瓶成品菇产量比对照每瓶成品菇产量平均高14克，提高每瓶产量在8％左右，现在生产8万瓶的量，每天可以增收1120公斤，每公斤瓶栽成品菇的价格一般在9元左右，每天公司可以增收1万元。

具体实施方式

实施例一本实施例提出一种杏鲍菇原始母种的制作方法，先是进行杏鲍菇原始母种的培养，再进行杏鲍菇原始母种的提纯；包括以下步骤，

杏鲍菇原始母种的培养：

A、挑选种菇：从疏过蕾1-2天的育菇房，挑选多个六成熟，有本品种典型性状，健壮、美观、无病虫害的菇子10-20个作为种菇，采摘的时候戴上无菌手套，采摘后放到无菌塑料袋里面，并封严实袋口；

B、准备用具：把种菇、经过检测无菌的PDA培养皿、无菌水及灭过菌的手术刀、接种勾、无菌烧杯、酒精灯、酒精棉球、无菌手套、火机等全部操作用具灭菌后放入消过毒的超净工作台里面；

C、冲洗种菇：在无菌、正压的情况下，戴上无菌手套用无菌水把种菇逐个冲洗干净，分开放到超净工作台上，开紫灯消毒30分钟后，再开洁净正压风，把种菇表面的水分吹干、备用；

D、接种：戴上无菌手套，把杏鲍菇一分为二的切开，并在菌盖和菌柄处用无菌手术刀切取4mm×4mm菌种块，用无菌的接种勾，转入无菌的PDA培养皿中心，每个种菇取两块，转接到两个无菌的培养皿之中；

E、封口装袋：用封口膜把接完种的PDA培养皿边缘封口并标记，再装入密封的无菌袋；

F、恒温培养：消毒培养箱，将装袋后的PDA培养皿，放到恒温培养箱里，温度调到25±0.5℃，进行黑暗、避光无风或弱风培养4-8天；

G、筛选提纯用种：培养期间，每天观察培养皿的生产参数，对于1个种菇转接的两个培养皿，都表现最佳的生长参数，则选为提纯的原始母种；

杏鲍菇原始母种提纯的具体步骤如下：

H、制作PDA培养皿，皿内的培养基清晰、偏干、无杂质、整个培养基厚度，均匀一致控制在3.0±0.5mm；

I、切杏鲍菇菌丝尖端：将把长满培养皿1/2的杏鲍菇菌种、酒精灯、体式显微镜、灭过菌的手术刀、无菌手套、火机、酒精棉球等全部操作器具放到经过紫外灭菌的超净工作台或生物安全柜里面，进行紫外或紫外加臭氧机避光灭菌20-40min；关闭紫外灯和臭氧机，开正压风，用无菌刀片快速切杏鲍菇菌丝尖端1±0.5mm，一个培养皿切10-12个这种长度的尖端，切完后盖上培养皿盖子；

J、分离出带有菌丝尖端及培养基块：把切分过的菌种培养皿，用很薄的无菌刀片，分离出切好的菌丝尖端，同时要切下菌丝尖端所依附的培养基块并分离出来，二者合称为菌种块，培养基块的块径为3-4mm。；

K、分皿：把经过检测无菌的培养皿、杏鲍菇菌种、酒精灯、酒精棉球、无菌手套、接种勾等全部操作器具在超净工作台或生物安全柜里面进行第二次紫外或紫外加臭氧机灭菌30-40min，戴上无菌手套，用接种勾把分离出的菌种块，勾取移动到空白培养皿的中央，一个菌种块放一个空白培养皿；

L、封口并标记：把转接有菌种的培养皿封口并贴好标签，放到密封的无菌塑料袋中；

M、培养：把培养皿放到26±1℃的恒温培养箱里面，进行黑暗、避光、无风或弱风培养8-12天；

N、提纯复壮：每天观察记录菌丝的各项生长指标，当菌丝长满培养皿1/2-2/3的时候，选出优势的2个培养皿作为下次提纯复壮的出发菌种，按照上面方法，对菌丝尖端切取，重复上述H至N步骤3-8次；

O、选种：对经过提纯，表现非常优良的菌丝进行镜检、病毒检测、出菇试验，对三个指标都表现达标、出菇试验指标最优的菌种选作原始母种保藏。

所述“G、筛选提纯用种”步骤中，所述生长参数包括培养皿的污染情况、菌种块萌发的快慢、长满培养皿时间、菌丝浓密度、菌丝光泽度、菌丝粗壮度、菌丝生长速度、菌丝边缘整齐程度、菌丝伸展度、菌丝生长势。“K、观察并提纯复壮”步骤中，各项生长指标包括菌丝萌发的时间、菌丝长速、菌丝健壮度、菌丝光亮度、菌丝伸展度、菌丝粗细程度、菌丝边缘整齐度，菌丝整体长势。

所述“D、接种”、“E、封口装袋”、“J、分离出带有菌丝尖端菌种块”、“K、分皿”、“L、封口并标记”步骤中，应在超净工作台或生物安全柜内，距酒精灯火焰周围5cm的范围内操作。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种杏鲍菇原始母种的制作方法，其特征在于，先是进行杏鲍菇原始母种的培养，再进行杏鲍菇原始母种的提纯；包括以下步骤，

杏鲍菇原始母种的培养：

A、挑选种菇：从疏过蕾1-2天的育菇房，挑选多个六成熟，有本品种典型性状，健壮、美观、无病虫害的菇子10-20个作为种菇，采摘的时候戴上无菌手套，采摘后放到无菌塑料袋里面，并封严实袋口；

B、准备用具：把种菇、经过检测无菌的PDA培养皿、无菌水及全部操作用具灭菌后放入消过毒的超净工作台里面；

C、冲洗种菇：在无菌、正压的情况下，戴上无菌手套用无菌水把种菇逐个冲洗干净，分开放到超净工作台上，开紫灯消毒30分钟后，再开洁净正压风，把种菇表面的水分吹干、备用；

D、接种：戴上无菌手套，把杏鲍菇一分为二的切开，并在菌盖和菌柄处用无菌手术刀切取菌种块，用无菌的接种勾，转入无菌的PDA培养皿中心，每个种菇取两块，转接到两个无菌的培养皿之中；

E、封口装袋：用封口膜把接完种的PDA培养皿边缘封口并标记，再装入密封的无菌袋；

F、恒温培养：消毒培养箱，将装袋后的PDA培养皿，放到恒温培养箱里，温度调到25±0.5℃，进行黑暗、避光无风或弱风培养4-8天；

G、筛选提纯用种：培养期间，每天观察培养皿的生长参数，对于1个种菇转接的两个培养皿，都表现最佳的生长参数，则选为提纯的原始母种；

杏鲍菇原始母种提纯的具体步骤如下：

H、制作PDA培养皿，皿内的培养基清晰、偏干、无杂质、整个培养基厚度，均匀一致控制在3.0±0.5mm；

I、切杏鲍菇菌丝尖端：将把长满培养皿1/2的杏鲍菇菌种、全部操作器具放到经过紫外灭菌的超净工作台或生物安全柜里面，进行紫外或紫外加臭氧机避光灭菌20-40min；关闭紫外灯和臭氧机，开正压风，用无菌刀片快速切杏鲍菇菌丝尖端1±0.5mm，一个培养皿切10-12个这种长度的尖端，切完后盖上培养皿盖子；

J、分离出带有菌丝尖端及培养基块：把切分过的菌种培养皿，用很薄的无菌刀片，分离出切好的菌丝尖端，同时要切下菌丝尖端所依附的培养基块并分离出来，二者合称为菌种块；

K、分皿：把经过检测无菌的培养皿、杏鲍菇菌种、全部操作器具在超净工作台或生物安全柜里面进行第二次紫外或紫外加臭氧机灭菌30-40min，戴上无菌手套，用接种勾把分离出的菌种块，勾取移动到空白培养皿的中央，一个菌种块放一个空白培养皿；

L、封口并标记：把转接有菌种的培养皿封口并贴好标签，放到密封的无菌塑料袋中；

M、培养：把培养皿放到26±1℃的恒温培养箱里面，进行黑暗、避光、无风或弱风培养8-12天；

N、提纯复壮：每天观察记录菌丝的各项生长指标，当菌丝长满培养皿1/2-2/3的时候，选出优势的2个培养皿作为下次提纯复壮的出发菌种，按照上面方法，对菌丝尖端切取，重复上述H至N步骤3-8次；

O、选种：对经过提纯，表现非常优良的菌丝进行镜检、病毒检测、出菇试验，对三个指标都表现达标、出菇试验指标最优的菌种选作原始母种保藏。

2.根据权利要求1所述的杏鲍菇原始母种的制作方法，其特征在于，在“B、准备用具”步骤中的全部操作用具包括灭过菌的手术刀、接种勾、无菌烧杯、酒精灯、酒精棉球、无菌手套、火机。

3.根据权利要求1所述的杏鲍菇原始母种的制作方法，其特征在于，所述“G、筛选提纯用种”步骤中，所述生长参数包括培养皿的污染情况、菌种块萌发的快慢、长满培养皿时间、菌丝浓密度、菌丝光泽度、菌丝粗壮度、菌丝生长速度、菌丝边缘整齐程度、菌丝伸展度、菌丝生长势、。

4.根据权利要求1所述的杏鲍菇原始母种的制作方法，其特征在于，“I、切杏鲍菇菌丝尖端”步骤中，全部操作器具包括酒精灯、体式显微镜、灭过菌的手术刀、无菌手套、火机、酒精棉球；“K、分皿”步骤中全部操作器具酒精灯、酒精棉球、无菌手套、接种勾。

5.根据权利要求1所述的杏鲍菇原始母种的制作方法，其特征在于，“K、观察并提纯复壮”步骤中，各项生长指标包括菌丝萌发的时间、菌丝长速、菌丝健壮度、菌丝光亮度、菌丝伸展度、菌丝粗细程度、菌丝边缘整齐度，菌丝整体长势。

6.根据权利要求1所述的杏鲍菇原始母种的制作方法，其特征在于，所述“D、接种”、“E、封口装袋”、“J、分离出带有菌丝尖端菌种块”、“K、分皿”、“L、封口并标记”步骤中，应在超净工作台或生物安全柜内，距酒精灯火焰周围5cm的范围内操作。

7.根据权利要求1所述的杏鲍菇原始母种的制作方法，其特征在于，所述“D、接种”步骤中，在菌盖和菌柄处用手术刀切取菌种块大小为边长在4±1mm的立方体；“J、分离出带有菌丝尖端及培养基块”步骤中，所述培养基块的边长为3-4mm。